TW201920228A - 用於製備伊美司他之改進的方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及使用每循環3個步驟的固相支持物結合法來製備端粒酶抑制劑伊美司他(imetelstat)之方法，該固相支持物結合法包括以下步驟：將支持物結合的寡核苷酸的3’-胺基基團進行去保護、與5’-亞磷醯胺進行偶合、並且用醯基二硫化物進行硫化，其特徵在於在每個循環中沒有用於防止未反應的3'-胺基寡核苷酸基團在隨後的循環期間反應的另外的封端步驟。

Description

用於製備伊美司他之改進的方法

本發明涉及使用每循環3個步驟的固相支持物結合法來製備端粒酶抑制劑伊美司他(imetelstat)之方法，該固相支持物結合法包括以下步驟：將支持物結合的寡核苷酸的3’-胺基基團進行去保護、與5’-亞磷醯胺進行偶合、並且用醯基二硫化物進行硫化，其特徵在於在每個循環中沒有用於防止未反應的3'-胺基寡核苷酸基團在隨後的循環期間反應的另外的封端步驟。

伊美司他(SEQ ID NO：1)係與棕櫚醯脂質部分共價連接的N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸，並且已經作為化合物(1F)描述於WO-2005/023994中。伊美司他的鈉鹽用作有效的且特異性的端粒酶抑制劑，並且可以用於治療端粒酶介導的障礙(例如癌症)，包括以下障礙：例如骨髓纖維化(MF)、骨髓增生異常綜合症(MDS)和急性骨髓性白血病(AML)。

伊美司他鈉的結構如下所示：

伊美司他的結構也可以表示如下

LPT基團代表與N3’→P5’硫代磷醯胺基酸酯寡核苷酸共價連接的棕櫚醯脂質。十三個核苷酸的鹼基序列如下：TAGGGTTAGACAA，並且由鹼基B₁至B₁₃表示。該結構的-NH-P(=S)(OH)-和-O-P(=S)(OH)-基團可以以鹽的形式存在。應當 理解的是即使沒有具體指出，主題化合物的鹽形式也由在此描述的結構所涵蓋。

伊美司他鈉也可以表示如下：

-NH-P(=S)(OH)-基團和胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶鹼基可以以之後在說明書的附圖中使用的其他互變異構排列存在。應當理解的是即使沒有具體指出，主題化合物的所有互變異構形式都由其中描述了化合物的一種可能的互變異構形式的結構所涵蓋。

在WO-2005/023994中使用的製備作為化合物(1F)的伊美司他的合成方案描述於方案1和方案2中。該寡核苷酸的合成係使用固相亞磷醯胺方法實現的，其中所有反應都發生在固相支持物上。伊美司他的合成在裝載有3-棕櫚醯胺-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀醯基丙二醇的可控多孔玻璃(LCAA-CPG)上進行。藉由在活化劑的幫助下添加受保護的核苷5'-亞磷醯胺，從5'至3'末端組裝寡核苷酸。每個延伸循環由以下4個不同的、高度可控的步驟組成：去保護、亞醯胺偶合、硫化和封端步驟。

方案1：伊美司他合成方案循環1

在方案1中，固相支撐的合成開始於從與固相支持物連接的棕櫚醯胺丙二醇去除酸不穩定的4,4-二甲氧基-三苯甲基(DMT)保護基團。將第一亞磷醯胺核苷酸與支持物偶合，然後使用0.1M苯乙醯基二硫化物(PADS)在乙腈和2,6-二甲基吡啶(1：1比例)的混合物中的溶液來硫化磷光體(phosphor)。然後應用封端步驟以防止任何未反應的固相支持物起始材料在以下反應循環中與亞磷醯胺核苷酸偶合。使用THF/異丁酸酐/2,6-二甲基吡啶的18：1：1混合物進行封端。

在固相支持物上的第一循環後，藉由支持物結合的寡核苷酸的3’-胺基基團與對應於如方案2所描述的序列中的下一個所需核苷酸的受保護的核苷酸亞磷醯胺單體的過量溶液進行反應來實現鏈延伸。

在方案2中，描述了鏈延伸方法的第一循環，該方法藉由以下實現：支持物結合的寡核苷酸(a)的3’-胺基基團的去保護，然後是支持物結合的寡核苷酸(b)的3’-胺基基團與對應於伊美司他的序列中的下一個所需核苷酸的5’-亞磷醯胺單體的過量溶液進行偶合反應。偶合反應之後是支持物結合的寡核苷酸(c)的磷光體的硫化和封端步驟(參見方案3)以防止任何未反應的固相支持物起始材料(b)在以下反應循環中與5'-亞磷醯胺核苷酸偶合。將方案2的反應循環重複12次，然後用乙醇和濃氨的1：1混合物來處理固相支持物結合的寡核苷酸，然後進行HPLC純化以獲得伊美司他。

使用THF/異丁酸酐/2,6-二甲基吡啶的18：1：1混合物進行封端步驟，以在偶合步驟後將任何剩餘的具有一級3'-胺基基團的固相支持物結合的寡核苷酸(b)轉化為具有受保護的(或“封端的”)3'-胺基基團的寡核苷酸(e)，以防止一級3'-胺基在下一個反應循環中與亞磷醯胺核苷酸偶合。

WO-01/18015在實例3中公開了SEQ ID No.2(其係一種N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸)和製備該寡核苷酸之方法，該方法涵蓋封端步驟。

Herbert B-S等人討論了GRN163的脂質修飾(Oncogene[致癌基因](2005)24,5262-5268)。

Makiko Horie等人討論了靶向人端粒酶RNA亞基的2’-O,4’-C-乙烯-橋接的核酸寡核苷酸的合成和特性(Nucleic Acids Symposium Series[核酸研討會叢刊](2005)49,171-172)。

揭露於WO-01/18015和WO-2005/023994中的固相支持物結合法中的偶合反應包括封端步驟，以防止支持物結合的寡核苷酸上的任何未反應的一級3'胺基基團在隨後的循環中反應。

現在出人意料地發現，如先前技術所描述的封端步驟的使用係多餘的，並且與先前技術使用特定封端步驟的4步驟循環相比，可以使用沒有另外的封端步驟的3步驟循環以幾乎相同的產率和純度來製備伊美司他。藉由將循環步驟的數目減少22%(從54個步驟減少到42個步驟)並因此減少過程時間，從每個循環中消除封端步驟有益於整個過程。此外，由於循環步驟的減少，溶劑消耗也減少了，這使得過程更環保。

每當術語“封端步驟”用於全文時，都旨在定義另外的化學方法步驟，其中固相支持物結合的寡核苷酸上的游離一級3'-胺基基團被轉化為取代的二級或三級3'-胺基基團，該二級或三級3'-胺基基團在接著發生的偶合步驟中不能參與與受保護的3'- 胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基-亞磷醯胺單體的偶合反應。

在一個實施例中，本發明涉及合成具有以下式的寡核苷酸N3’→P5’硫代磷醯胺酯之方法

該方法包括a)提供與具有式(A)之固相支持物附接的第一3'-胺基保護的核苷酸，其中PG係酸不穩定的保護基團；

b)將受保護的3'-胺基基團去保護，以形成游離3'-胺基基團；

c)將該游離3'-胺基基團與受保護的具有式(B’_n)之3'-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體進行反應，以形成核苷間N3’→P5’-亞磷醯胺鍵，其中n=2；

d)使用醯基二硫化物來硫化核苷間亞磷醯胺基團，以形成N3’→P5’硫代磷醯胺酯；e)按依次順序重複11次去保護步驟b)，與受保護的具有式(B’_n)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基-亞磷醯胺單體進行的偶合步驟c)，其中單體(B’_n)中受保護的核苷鹼基B'在相應的11個偶合步驟中依次是受保護的核鹼基B₃至B₁₃，和硫化步驟d)；f)去除該酸不穩定的保護基團PG；和g)將伊美司他從固相支持物上裂解並去保護；其特徵在於，在該等反應步驟a)至e)中的任一個中都沒有進行另外的封端步驟。

在一個實施例中，本發明涉及合成具有以下式的N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸伊美司他之方法

該方法包括a)提供與具有式(A)之固相支持物附接的第一3'-胺基保護的核苷酸，其中PG係酸不穩定的保護基團；

b)將受保護的3'-胺基基團去保護，以形成游離3'-胺基基團；

c)將該游離3'-胺基基團與受保護的具有式(B’_n)之3'-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體進行反應，以形成核苷間N3’→P5’-亞磷醯胺鍵，其中在n=2的情況下，B’_n係受保護的A；

d)使用醯基二硫化物來硫化核苷間亞磷醯胺基團，以形成N3’→P5’硫代磷醯胺酯；e)按依次順序重複11次去保護步驟b)，與受保護的具有式(B’_n)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基-亞磷醯胺單體進行的偶合步驟c)，其中單體(B’_n)之核苷鹼基B'係受保護的B，除了當B係胸腺嘧啶之外，並且其中B_n在相應的11個偶合步驟中依次是核鹼基B₃至B₁₃，和硫化步驟d)；f)去除該酸不穩定的保護基團PG；和g)將伊美司他從固相支持物上去保護並裂解；其特徵在於，在該等反應步驟a)至e)中的任一個中都沒有進行另外的封端步驟。

在一個實施例中，本發明涉及合成具有以下式的N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸伊美司他之方法

該方法包括a)提供與具有式(A)之固相支持物附接的第一受保護的3'-胺基核苷酸，其中PG係酸不穩定的保護基團；

b)將PG保護的3'-胺基核苷酸去保護，以形成具有式(A’)之游離3'-胺基核苷酸；

c)將該游離3'-胺基核苷酸與受保護的3'-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體(B’_n)偶合，以形成核苷間N3’→P5’-亞磷醯胺鍵，其中在n=2的情況下，B’_n係受保護的A；

d)使用醯基二硫化物硫化N3’→P5’-亞磷醯胺鍵，以形成核苷間N3’→P5’硫代磷醯胺酯鍵；e)按依次順序重複11次：去保護步驟b)；與受保護的3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基-亞磷醯胺單體(B’_n)進行的偶合步驟c)，其中單體(B’_n)之核苷鹼基B'係受保護的B，除了當B係胸腺嘧啶之外，並且其中B_n在相應的11個偶合步驟中依次是核鹼基B₃至B₁₃；和硫化步驟d)；以生產與固相支持物附接的受保護的N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸伊美司他；f)從受保護的N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸伊美司他中去除3’-末端酸不穩定的保護基團PG；和g)將受保護的N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸伊美司他從固相支持物上去保護並裂解，以產生伊美司他；其特徵在於，在該等反應步驟a)至e)中的任一個中都沒有進行另外的封端步驟。

本發明可以使用多種固相支持物，該等固相支持物包括但不限於，例如由可控多孔玻璃(CPG)製成的微粒、高度交聯的聚苯乙烯、裝載有交聯聚苯乙烯支持物的混合可控多孔玻璃、丙烯酸共聚物、纖維素、尼龍、葡聚糖、乳膠、聚丙烯醛等。

與具有式(A)

的固相支持物附接的3'-胺基保護的核苷酸可以如WO-2005/023994中所揭露的進行製備，其中裝載有3-棕櫚醯胺-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀醯基丙二醇的可控多孔玻璃已經與受保護的具有式(B’₁)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體偶合，

其中PG係酸不穩定的保護基團。合適的酸不穩定的3’-胺基保護基團PG係，但不限於，例如三苯基甲基(即三苯甲基或Tr)、對茴香基二苯基甲基(即單-甲氧基三苯甲基或MMT)、和二-對茴香基苯基甲基(即二甲氧基三苯甲基或DMT)。

受保護的具有式(B’_n)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體具有3'-胺基保護基團PG，該3'-胺基保護基團PG係一酸不穩定的基團，例如三苯基甲基(即三苯甲基或Tr)、對茴香基二苯基甲基(即單甲氧基三苯甲基或MMT)、或二-對茴香基苯基甲基(即二甲氧基三苯甲基或DMT)。此外，核苷鹼基B’受鹼不穩定保護基團(胸腺嘧啶除外)的保護。

將核苷酸單體B’₁和B’₂至B’₁₃在13個偶合步驟中依次使用，這13個偶合步驟開始於提供裝載有3-棕櫚醯胺-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀醯基丙二醇並與核苷酸單體B’₁偶合的固相支持物，並且然後是12個去保護、偶合和硫化反應的循環(其中使用核苷酸單體B’₂至B’₁₃)。

可以藉由用酸性溶液(例如在二氯甲烷或甲苯中的二氯乙酸)進行處理來去除3’-胺基保護基團PG。

在受保護的具有式(B’_n)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基-胺基亞磷醯胺單體中的核苷鹼B’受在步驟g)中被去除的鹼不穩定保護基團的保護。用於核苷鹼基腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤的合適的鹼不穩定保護基團係例如醯基基團，如乙醯基、苯甲醯基、異丁醯基、二甲基-甲脒基(formamidinyl)或二苄基甲脒基。在寡核苷酸合成中使用的反應條件下，胸腺嘧啶核苷鹼基不需要保護。此類受保護的具有式(B’_n)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體(具有受酸不穩定基團保護基團PG所保護的3'-胺基和受鹼不穩定保護基團所保護的核苷鹼基B’)係可商購的或可以如WO-2006/014387中所描述製備。

偶合步驟c)藉由將受保護的具有式(B_n)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體的溶液和活化劑的溶液(或含有亞磷醯胺單體(B_n)和活化劑的溶液)添加到含有與固體支持物共價附接的(寡)核苷酸的游離胺基基團的反應容器中來進行。然後藉由機械渦旋、用惰性氣體噴射等方法混合該混合物。可替代的，可以使單體和活化劑的一種或多種溶液流過含有具有游離3'-胺基基團的固相支持物的(寡)核苷酸的反應容器(或柱)。單體和活化劑可以被預先混合、在合適的合成器的閥塊中混合、在預活化容器中混合、並且如果需要可以預先平衡，或者它們可以被單獨添加到反應容器中。

用於本發明的活化劑的實例係，但不限於，四唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、5-(4-硝基-苯基)四唑、5-(2-噻吩基)-1H-四 唑、三唑、氯化吡啶鎓等。合適的溶劑係乙腈、四氫呋喃、二氯甲烷等。實際上，乙腈係寡核苷酸合成的常用溶劑。

用於在步驟d)中使用的硫化劑係溶解在溶劑中的醯基二硫化物。領域已知的醯基二硫化物係例如二苯醯基二硫化物、雙(苯基乙醯基)二硫化物(PADS)、雙(4-甲氧基苯甲醯基)二硫化物、雙(4-甲基苯甲醯基)二硫化物、雙(4-硝基苯甲醯基)二硫化物和雙(4-氯苯甲醯基)二硫化物。

苯基乙醯基二硫化物(PADS)係一種硫化反應常用的試劑，它最好在鹼性溶液中“老化”以獲得最佳的硫化活性(Scotson J.L.等人，Org.Biomol.Chem.[有機生物分子學化學]，第14卷，10840-10847,2016)。用於PADS的合適溶劑係例如鹼性溶劑(例如像3-甲基吡啶或2,6-二甲基吡啶)與共溶劑(例如乙腈、甲苯，1-甲基-吡咯啶酮或四氫呋喃)的混合物。鹼性溶劑的量相對於共溶劑的量可以是任何比例，包括1：1比例。取決於要轉化成其相應硫代磷酸酯的亞磷酸酯，“新鮮的”和“老化的”PADS都可以使用，但是“老化的”PADS已經顯示出提高硫化速率和效率。“老化的”PADS溶液係在硫化反應中使用前保持一段時間的新鮮製備的PADS溶液。老化時間可以從幾小時到48小時變化，並且技術人員可以藉由分析硫化反應的產率和純度來確定最佳老化時間。

為了製備根據本發明的伊美司他，使用在乙腈和2,6-二甲基吡啶(較佳的是以1：1的比例)的混合物中的PADS溶液，其中老化時間為4小時至14小時。已經發現，當使用2,6-二甲基吡啶時，限制2,3,5-三甲基吡啶(其通常作為2,6-二甲基吡啶中的雜質發現)的量低於0.1%可以提高硫化效率，並且較少觀察到不希望的磷光體氧化。

在步驟g)中，將伊美司他從固相支持物上去保護並裂解。去保護包括去除核苷酸鹼基上的β-氰乙基基團和鹼不穩定保護基團。這可以藉由用鹼性溶液(例如乙腈中的二乙胺(DEA) 溶液)處理，然後用溶解在醇(例如乙醇)中的氨水處理來進行。

本發明的反應步驟a)至f)在10℃至40℃的溫度範圍內進行。更較佳的是，該等反應在從15℃至30℃的受控溫度下進行。具體地說，本發明的反應步驟b)在15℃至30℃的溫度範圍內進行；更具體地是在17℃至27℃的溫度範圍內進行。具體地說，本發明的反應步驟d)在17℃至25℃的溫度範圍內進行；更具體地是在18℃至22℃的溫度範圍內進行；甚至更具體地是在19℃下進行。其中將伊美司他從固相支持物上去保護並裂解的步驟g)在從30℃至60℃的溫度範圍內進行。取決於所使用的設備和具體的反應條件，技術人員可以確定上述範圍內的每個步驟a)至g)之最佳反應溫度。

在延伸循環中的每個步驟之後，將固相支持物用溶劑(例如乙腈)沖洗，為下一個反應做準備。

在步驟g)之後，以其銨鹽形式獲得粗伊美司他，然後將該粗伊美司他藉由使用聚合樹脂或二氧化矽基樹脂、藉由製備型反相高效液相色譜(RP-HPLC)進行純化，以得到三乙胺形式的純化的伊美司他。添加過量的鈉鹽，並且然後藉由透析過濾使溶液脫鹽，從而得到伊美司他鈉，然後將該伊美司他鈉凍乾以去除水。

實驗部分

“室溫”或“環境溫度”典型地在21℃-25℃之間。

實驗1(無封端步驟)

製備所有的試劑和起始材料溶液，包括在甲苯中的3%二氯乙酸(DCA)、在乙腈中的0.5M 5-(乙硫基)-1H-四唑、在乙腈中的0.15M的具有式(B’_n)之所有4個核苷酸單體、在乙腈和2,6-二甲基吡啶的1：1混合物中的0.2M苯基乙醯基二硫化物(PADS)、和在乙腈中的20% DEA(二乙胺)。

使用重複合成循環在5'至3'的方向上進行寡核苷酸合成，該重複合成循環由在環境溫度下進行的去三苯甲基化、然後是偶合以及硫化組成。

柱(直徑：3.5cm)填充有固體支持物，該固體支 持物裝載有3-棕櫚醯胺-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀醯基丙二醇(基於400μmol/g的容量的3.5mmol)、並與核苷酸單體B’₁偶合。使用在甲苯中的3%二氯乙酸(DCA)(量：在每個去三苯甲基化步驟中為在6.5柱體積至13.4柱體積之間)實現去三苯甲基化，並用乙腈(量：5個柱體積)洗滌固體支持物結合的核苷酸。藉由按順序將0.5M 5-(乙硫基)-1H-四唑在乙腈中的溶液和0.15M具有式(B’_n)之下一個核苷酸單體(該單體溶於乙腈)泵送通過管柱來實現與下一個具有式(B’_n)之核苷酸單體偶合。將柱用乙腈(量：2個管柱體積)洗滌。然後藉由將在乙腈和2,6-二甲基吡啶的1：1混合物中的0.2M苯基乙醯基二硫化物(PADS)泵送通過管柱來進行硫化，然後用乙腈(量：5個管柱體積)洗滌該柱。

將去三苯甲基化的合成循環、與具有式(B’_n)之下一個核苷酸單體偶合、和硫化重複12次，然後使用在甲苯中的3%二氯乙酸(DCA)(量在6.5個管柱體積和13.4個管柱體積之間)進行去三苯甲基化。

完成合成循環後，將固體支持物上的粗寡核苷酸在55℃的溫度下用二乙胺(DEA)溶液處理，然後用氫氧化銨溶液：乙醇(3：1體積比)處理。將反應混合物在55℃下老化4小時至24小時、冷卻至室溫，並將漿液過濾以去除聚合支持物。將包含處於其銨形式的伊美司他的溶液進行實驗3的HPLC分析程序。

實驗2(有封端步驟)

製備所有的試劑和起始材料溶液，包括在甲苯中的3%二氯乙酸(DCA)、在乙腈中的0.5M 5-(乙硫基)-1H-四唑、在乙腈中的0.15M的具有式(B’_n)之所有4個核苷酸單體、在乙腈和2,6-二甲基吡啶的1：1混合物中的0.2M苯基乙醯基二硫化物(PADS)、在乙腈中作為封端劑A的20% N-甲基咪唑(NMI)、在乙腈和2,6-二甲基吡啶的1：1混合物中作為封端劑B的異丁酸酐、和在乙腈中的20% DEA。

使用重複合成循環在5'至3'的方向上進行寡核苷酸合成，該重複合成循環由在環境溫度下進行的去三苯甲基化、然後是偶合以及硫化組成。

管柱(直徑：3.5cm)填充有固體支持物，該固體支持物裝載有3-棕櫚醯胺-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-琥珀醯基丙二醇(基於400μmol/g的容量的3.5mmol)、並與核苷酸單體B’₁偶合。使用在甲苯中的3%二氯乙酸(DCA)(量：在每個去三苯甲基化步驟中為在6.5柱體積至13.4柱體積之間)實現去三苯甲基化，並用乙腈(量：5個管柱體積)洗滌固體支持物結合的核苷酸。藉由按順序將0.5M 5-(乙硫基)-1H-四唑在乙腈中的溶液和0.15M具有式(B’_n)之下一個核苷酸單體(該單體溶於乙腈)泵送通過管柱來實現與下一個具有式(B’_n)之核苷酸單體偶合。將管柱用乙腈(量：2個柱體積)洗滌。然後藉由將在乙腈和2,6-二甲基吡啶的1：1混合物中的0.2M苯基乙醯基二硫化物(PADS)泵送通過管柱來進行硫化，然後用乙腈(量：5個管柱體積)洗滌該柱。

在硫化後進行封端步驟。在給定循環中的每個封端中使用37當量-47當量(eq.)的封端劑NMI，和9當量-11當量的封端劑B異丁酸酐(IBA)和1.4當量-1.8當量的2,6-二甲基吡啶。用單獨的泵以不同比例(例如50：50、35：65、65：35)，將封端劑A和B泵送通過管柱。

將去三苯甲基化的合成循環、與具有式(B’_n)之下一個核苷酸單體偶合和硫化、以及封端步驟重複12次，然後使用在甲苯中的3%二氯乙酸(DCA)(量在6.5個管柱體積和13.4個管柱體積之間)進行去三苯甲基化。

完成合成循環後，將固體支持物上的粗寡核苷酸在55℃的溫度下用二乙胺(DEA)溶液處理，然後用氫氧化銨溶液：乙醇(3：1體積比)處理。將反應混合物在55℃下老化4小時至24小時、冷卻至室溫，並將漿液過濾以去除聚合支持物。將包含處於其銨形式的伊美司他的溶液進行實驗3的HPLC分析程序。

實驗3：無封端與有封端的比較

藉由HPLC分析在實驗1和實驗2中獲得伊美司他。將具有13個核苷酸的所希望的全長寡核苷酸的量進行確定，並針對實驗1和實驗2列於下表中。此外，將短鏈體(shortmer)的總量，特別係12鏈體(12mer)進行確定，並針對實驗1和實驗2列於下表中。

HPLC分析方法：

管柱類型：Kromasil C18,3.5μm粒度，4.6 X 150mm

洗脫液：

A：14.4mM TEA/386mM HFIP(六氟異丙醇)/100ppm(w/v)Na₂EDTA於水中

B：含有5% IPA的50% MeOH、50% EtOH

梯度：

表：封端與無封端實驗(實驗1運行兩次，並將結果列為實驗1a和1b)。

實驗1和實驗2的HPLC分析表明，無封端實驗與封端實驗的產率和純度相當。

主峰%包括全長寡核苷酸+PO雜質+去嘌呤雜質。

PO雜質係包括一個或多個側氧基磷醯胺酯核苷間鍵而不包括硫代磷醯胺酯核苷間鍵的雜質。

溶劑用途和反應時間

使用0.45L乙腈/mmol製備封端劑A和封端劑B試劑，該封端劑A和封端劑B試劑對應於在製備試劑期間乙腈總用量的約25%。由於每個化學反應步驟之後是溶劑洗滌，在每個封端步驟之後，也進行溶劑洗滌，這相當於約40個柱體積的溶劑。考慮到對於給定的合成運行進行約212個柱體積的溶劑洗滌，將約19%的洗滌溶劑用於封端步驟。每個封端步驟需要3分鐘-6分鐘。這相當於總合成時間(包括13個循環和DEA處理)的約8%。

實驗4(去三苯甲基化溫度)

去三苯甲基化溫度在控制n-1和去嘌呤雜質方面具有影響。合成器入口處的解封溶液的溫度選擇在17.5℃和27℃之間(以3.5mmol規模)，並且對於所有去三苯甲基化步驟，選擇的溫度保持相同。乙腈洗滌也保持在解封溶液的相同溫度下。%脫嘌呤的雜質隨溫度線性增加，而n-1在較低溫度下較高。

實驗5(硫化步驟溫度)

在以下實驗中，針對不太有利的PO雜質(該等係發生磷光體氧化而不是硫化的雜質)的%，測試在硫化反應中使用的PADS溶液的溫度(RT意指室溫)。較低的溫度導致較低的PO%。

SEQ ID NO：1-伊美司他和伊美司他鈉

5’-R-TAGGGTTAGACAA-NH₂-3’

其中R代表棕櫚醯[(CH₂)₁₄CH₃]醯胺，其藉由胺基甘油接頭與N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸(NPS)連接的寡核苷酸的5'-硫代磷酸酯基團軛合。

<110> 比利時商健生藥品公司

<120> 用於製備伊美司地之改進的方法

<130> JAB6114PCT

<150> EP17180426.3

<151> 2017-07-10

<160> 1

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<222> 1..13

<223> /生物體="人工序列" /注意事項="合成寡核苷酸" /分子_類型="未指定DNA"

<400> 1

Claims (13)

1. 一種合成具有以下式的N3’→P5’硫代磷醯胺酯寡核苷酸伊美司他之方法， 該方法包括a)提供與具有式(A)之固相支持物附接的第一3'-胺基保護的核苷酸，其中PG係酸不穩定的保護基團； b)將受保護的3'-胺基基團去保護，以形成游離3'-胺基基團； c)將該游離3'-胺基基團與受保護的具有式(B’_n)之3'-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基亞磷醯胺單體進行反應，以形成核苷間N3’→P5’-亞磷醯胺鍵，其中在n=2的情況下，B’_n係受保護的A； d)使用醯基二硫化物來硫化核苷間亞磷醯胺基團，以形成N3’→P5’硫代磷醯胺酯；e)按依次順序重複11次去保護步驟b)，與受保護的具有式(B’_n)之3’-胺基核苷-5’-O-氰乙基-N,N-二異丙基胺基-亞磷醯胺單體進行的偶合步驟c)，其中單體(B’_n)之核苷鹼基B'係受保護的B，除了當B係胸腺嘧啶之外，並且其中B_n在相應的11個偶合步驟中依次是核鹼基B₃至B₁₃，和硫化步驟d)；f)去除該酸不穩定的保護基團PG；和g)將伊美司他從固相支持物上去保護並裂解；其特徵在於，在該等反應步驟a)至e)中的任一個中都沒有進行另外的封端步驟。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中將伊美司他進一步轉化為其鈉鹽。
3. 如申請專利範圍第1項或申請專利範圍第2項中任一項所述之方法，其中該醯基二硫化物選自二苯醯基二硫化物、雙(苯基乙醯基)二硫化物(PADS)、雙(4-甲氧基苯甲醯基)二硫化物、雙(4-甲基苯甲醯基)二硫化物、雙(4-硝基苯甲醯基)二硫化物和雙(4-氯苯甲醯基)二硫化物。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該醯基二硫化物係PADS。
5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中將PADS溶解在3-甲基吡啶或2,6-二甲基吡啶與共溶劑的混合物中，該共溶劑選自乙腈、甲苯、1-甲基吡咯啶酮和四氫呋喃。
6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中將PADS溶解在2,6-二甲基吡啶與乙腈的混合物中。
7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中將該PADS溶液在使用前老化4小時至14小時。
8. 如前述申請專利範圍項中任一項所述之方法，其中該酸不穩定的基團PG選自三苯基甲基、對茴香基二苯基甲基和二-對茴香基苯基甲基。
9. 如前述申請專利範圍項中任一項所述之方法，其中藉由用酸性溶液處理除去該酸不穩定保護基團PG。
10. 如前述申請專利範圍項中任一項所述之方法，其中具有式(B’_n)之單體中腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤鹼基上的鹼不穩定保護基團選自乙醯基、苯甲醯基、異丁醯基、二甲基甲脒基或二苄基甲脒基。
11. 如前述申請專利範圍項中任一項所述之方法，其中該偶合步驟c)使用活化劑進行，該活化劑選自四唑、5-(乙硫基)-1H-四唑、5-(4-硝基-苯基)四唑、5-(2-噻吩基)-1H-四唑、三唑、和氯化吡啶鎓。
12. 如前述申請專利範圍項中任一項所述之方法，其中步驟g)係藉由用鹼性溶液處理來進行。
13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該鹼性溶液係溶解在乙腈中的二乙胺或溶解在醇中的氨水、或兩者的組合。