UA125185C2 - Improved process for preparing imetelstat - Google Patents
Improved process for preparing imetelstat Download PDFInfo
- Publication number
- UA125185C2 UA125185C2 UAA201912225A UAA201912225A UA125185C2 UA 125185 C2 UA125185 C2 UA 125185C2 UA A201912225 A UAA201912225 A UA A201912225A UA A201912225 A UAA201912225 A UA A201912225A UA 125185 C2 UA125185 C2 UA 125185C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- protected
- disulfide
- imetelstat
- stage
- formula
- Prior art date
Links
- 229950004291 imetelstat Drugs 0.000 title claims abstract description 33
- LVZYXEALRXBLJZ-ISQYCPACSA-N f60ne4xb53 Chemical compound N1([C@@H]2O[C@@H]([C@H](C2)NP(O)(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)NP(S)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)N)COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)OCC(O)CNC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)C=CC(N)=NC1=O LVZYXEALRXBLJZ-ISQYCPACSA-N 0.000 title claims abstract description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 claims abstract description 32
- -1 acyl disulfide Chemical compound 0.000 claims abstract description 29
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 105
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 39
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-Lutidine Substances CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 33
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 30
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 26
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- IXGZXXBJSZISOO-UHFFFAOYSA-N s-(2-phenylacetyl)sulfanyl 2-phenylethanethioate Chemical compound C=1C=CC=CC=1CC(=O)SSC(=O)CC1=CC=CC=C1 IXGZXXBJSZISOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 10
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 7
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- ITQTTZVARXURQS-UHFFFAOYSA-N 3-methylpyridine Chemical compound CC1=CC=CN=C1 ITQTTZVARXURQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 claims description 3
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MIUOBAHGBPSRKY-UHFFFAOYSA-N 5-(4-nitrophenyl)-2h-tetrazole Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1C1=NNN=N1 MIUOBAHGBPSRKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XVVLITRCMAVPPY-UHFFFAOYSA-N 5-thiophen-2-yl-2h-tetrazole Chemical compound C1=CSC(C2=NNN=N2)=C1 XVVLITRCMAVPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 2
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- AOJFQRQNPXYVLM-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=[NH+]C=C1 AOJFQRQNPXYVLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JRCNAWZQCXFNJL-UHFFFAOYSA-N s-(4-chlorobenzoyl)sulfanyl 4-chlorobenzenecarbothioate Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(=O)SSC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 JRCNAWZQCXFNJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GUFGNMICNIJBSE-UHFFFAOYSA-N s-(4-methoxybenzoyl)sulfanyl 4-methoxybenzenecarbothioate Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)SSC(=O)C1=CC=C(OC)C=C1 GUFGNMICNIJBSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UWPBXMRGXGXWMM-UHFFFAOYSA-N s-(4-methylbenzoyl)sulfanyl 4-methylbenzenecarbothioate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(=O)SSC(=O)C1=CC=C(C)C=C1 UWPBXMRGXGXWMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UAKSUXAKLJZQAE-UHFFFAOYSA-N s-(4-nitrobenzoyl)sulfanyl 4-nitrobenzenecarbothioate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1C(=O)SSC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UAKSUXAKLJZQAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- YYWLHHUMIIIZDH-UHFFFAOYSA-N s-benzoylsulfanyl benzenecarbothioate Chemical group C=1C=CC=CC=1C(=O)SSC(=O)C1=CC=CC=C1 YYWLHHUMIIIZDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940123582 Telomerase inhibitor Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003277 telomerase inhibitor Substances 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 238000006642 detritylation reaction Methods 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- LSACYLWPPQLVSM-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid anhydride Chemical compound CC(C)C(=O)OC(=O)C(C)C LSACYLWPPQLVSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- IEVORMRANFJJFR-NMZIRJKDSA-A imetelstat sodium Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].N1([C@@H]2O[C@@H]([C@H](C2)NP([O-])(=S)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)NP([S-])(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)N)COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)N[C@H]2C[C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=S)OCC(O)CNC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)C=CC(N)=NC1=O IEVORMRANFJJFR-NMZIRJKDSA-A 0.000 description 4
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 4
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 4
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium group Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 201000003793 Myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229940125377 Selective β-Amyloid-Lowering Agent Drugs 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 235000006732 Torreya nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000111306 Torreya nucifera Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006243 acrylic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000008301 phosphite esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000008039 phosphoramides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Processes Specially Adapted For Manufacturing Cables (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Даний винахід відноситься до способу одержання інгібітора тіломерази іметелстату із застосуванням способу зв'язування на твердофазном носії з З стадіями в циклі, який включає стадії зняття захисту з 3'-аміногрупи пов'язаного з носієм олігонуклеотиду, зв'язування з 5'- фосфорамідитом і сульфуризацію з ацилдисульфідом, що характеризується відсутністю додаткової стадії кепування в кожному циклі, яку застосовують для запобігання вступу в реакцію непрореагувавших 3'-аміноолігонуклеотидних груп під час наступних циклів.The present invention relates to the method of obtaining the telomerase inhibitor imetelstat using the method of binding on a solid-phase carrier with three stages in the cycle, which includes the stages of deprotection from the 3'-amino group of the oligonucleotide bound to the carrier, binding to the 5'- phosphoramidite and sulfurization with acyl disulfide, characterized by the absence of an additional capping stage in each cycle, which is used to prevent unreacted 3'-amino oligonucleotide groups from reacting during subsequent cycles.
Рівень технікиTechnical level
Іметелстат (5БЕО ІЮ МО: 1) являє собою М3'-Ре' тіофосфорамідатний олігонуклеотид, що ковалентно зв'язаний з пальмітоїлліпідним фрагментом і описаний у М/0-2005/023994 як сполука (1Е). Натрієва сіль іметелстату діє як потужний та специфічний інгібітор тіломерази та може бути використана для лікування порушень, опосередкованих тіломеразою, наприклад, раку, включаючи такі захворювання, як мієлофіброз (МЕ), мієлодиспластичні синдроми (МОБ) та гострий мієлолейкоз (АМІ.).Imetelstat (5BEO IU MO: 1) is a M3'-Re' thiophosphoramidate oligonucleotide covalently linked to a palmitoyl lipid fragment and described in M/0-2005/023994 as compound (1E). Imetelstat sodium acts as a potent and specific telomerase inhibitor and can be used to treat telomerase-mediated disorders such as cancer, including diseases such as myelofibrosis (ME), myelodysplastic syndromes (AMD) and acute myelogenous leukemia (AML).
Структура іметелстату натрію показана нижче:The structure of imetelstat sodium is shown below:
ІAND
- г Я хн ях он яку я а в и и ОК В чне ок о ЕН 5 ) я. св бота ко ЩЕ г ще КО я я що АЖ ме- г I хнях он яку я а в и и ОК В чне ок О EN 5 ) i. sv bota ko SCHE g still KO i i what AJ me
Е ЗвE Zv
Й ле Шин 7 яв КВ к. 7 х, Ме ня в Е І а ї нн А ІНН . пров Б кс Ж к - 8 І я х нк 5 В ше 7 оо МонаY le Shin 7 yav KV k. 7 x, Me nya v E I a i nn A INN . prov B ks Zh k - 8 I kh nk 5 V she 7 oo Mona
Н ЛИN LI
І ОЗ КВ. в Б виAnd OZ KV. in B you
Кв но З пай х з й Е А ще рОАХ м в ее и НН левів 7 я прю не К. Н щ ще т е ви о» де твKv no Z pai x z y E A still rOAH m v ee i NN leviv 7 i pry ne K. N sh still te vi o» de tv
Що не хи ик вно В ТЕН ки й ки да Я ще М вуWhat is not kh ik vno V TEN ki and ki da I still M vu
В шк еншнье М що ЖЕО щаIn the school M that ZEO shcha
Й | | Й зд й жене гсяНОи р іметепстаї натрю номAnd | | And the wife of HsyaNOy rimetepstai natryu nom
Же у Сех зи оч НSame in Seh zi och N
І мМ. ОК ба їх КкAnd mm. OK ba their Kk
ЧО,what
ІAND
Структура іметелстату також може бути представлена, як показано нижче іметенстатThe structure of imetelstat can also be represented as below imetenstat
Ве т ВюгА 8 Г | Й ВачтА ВиVe t VyugA 8 G | And watch you
Мвт в Ва 0 ВогА сон | рн | В. - Віз г АMwt in Va 0 VogA son | pH | V. - Viz Mr. A
Цій | ви 68 ! !This | you are 68! !
МО пра вве Ї з тимін ! он ! - бут А х вденін рон ВизА 0 б егуднія - їй Ва Сх цИТОЗИНMO pra vve I with thymin! he! - but A x vdenin ron VyzaA 0 b egudniya - her Va Sh cyTOZIN
У йIn
ШМАТ «СНУ (ЄНУна с МОНУ (ОНОНІ-СМУ:SHMAT "SNU (ENU) with MONU (ONONI-SMU:
Група ГРТ являє собою пальмітоїлліпід, ковалентно пов'язаний з М3--РБ5 тіофосфор- амідатом олігонуклеотиду. Послідовність основ з тринадцяти нуклеотидів являє собою наступну: ТАйССТТАСАСАА і представлена основами від В: до Віз. Групи -МН-Р(-5ХОН)- і -О-The HRT group is a palmitoyl lipid covalently linked to the M3-RB5 thiophosphoramidate oligonucleotide. The sequence of bases of thirteen nucleotides is as follows: TYSSTTASASAA and is represented by the bases B: to Wiz. Groups -MH-P(-5KHON)- and -O-
РІ-5БХОН)-вказаної структури можуть знаходитися у сольовій формі. Зрозуміло, що сольові форми сполукиза даним винаходом охоплені зображеними в даному документі структурами, навіть якщо це конкретно не зазначено.RI-5BHON) of the specified structure can be found in salt form. It is understood that the salt forms of the compounds of the present invention are encompassed by the structures depicted herein, even if not specifically stated.
Іметелстат натрію також можна представити наступним чином:Imetelstat sodium can also be presented as follows:
Мох - Ве ВечА 5. | Вог А ВухоMoss - Ve VechA 5. | Vog A Vuho
Баттотио но пе Вз Ван Віз А ше -- | бух Ват А рок щі і Вас Ї з тимінBattotio no pe Vz Van Wiz A she -- | buh Vat A rok shchi and Vas Y with timin
Ме ше ! -- Ву т Ах аденін . й пиа Ва А (З г гувнім - «ля Ваг (3 Сх цитозиН онMe she! -- Wu t Ah adenine . y pia Va A (Z g guvnim - "lya Vag (3 Сх цитозиН on
МАТ сне Онана С МСНУ НОМ СНУMAT sne Onana S MSNU NOM SNU
Група -МН-Р/-5ХОН)- і основи тиміну, аденіну, гуаніну та цитозину можуть зустрічатися в інших таутомерних конфігураціях, які застосовуються на фігурах опису. Зрозуміло, що всі таутомерні форми досліджуваної сполуки охоплені структурою, де описана одна можлива таутомерна форма сполуки, навіть якщо конкретно не зазначено.The group -MH-P/-5KHON)- and the bases of thymine, adenine, guanine and cytosine can occur in other tautomeric configurations, which are used in the figures of the description. It is understood that all tautomeric forms of the test compound are covered by the structure where one possible tautomeric form of the compound is described, even if not specifically stated.
Попередній рівень технікиPrior art
Схема синтезу, що застосовується у М/О-2005/023994 для одержання іметелстату як сполуки (1), описана на Схемі 1 і Схемі 2. Синтез цього олігонуклеотиду досягається із застосуванням твердофазної фосфорамідитної методології в якій всі реакції відбуваються на твердофазному носії. Синтез іметелстату здійснюється на склі з контрольованим розміром пор (І САА-СРС), завантаженому З-пальмітоїламідо-1-0-(4,4"-диметокситритил)-2-0- сукциніллропандіолом. Олігонуклеотид збирається від 5' до 3 кінця шляхом додавання захищених нуклеозид-5'-фосфор-амідитів за сприяння активатора. Кожен цикл подовження складається з 4 окремих, чітко контрольованих стадій: зняття захисту, зв'язування амідиту, сульфуризації і стадії кепування.The synthesis scheme used in M/O-2005/023994 to obtain imetelstat as compound (1) is described in Scheme 1 and Scheme 2. The synthesis of this oligonucleotide is achieved using a solid-phase phosphoramidite methodology in which all reactions take place on a solid-phase support. The synthesis of imetelstat is carried out on glass with a controlled pore size (I CAA-SPC) loaded with 3-palmitoylamido-1-0-(4,4"-dimethoxytrityl)-2-0-succinylropanediol. The oligonucleotide is assembled from the 5' to the 3 end by adding of activator-assisted protected nucleoside-5'-phospho amidites.Each elongation cycle consists of 4 distinct, well-controlled steps: deprotection, amidite binding, sulfurization, and a capping step.
Схема 1: іметелстат схема синтезу цикл 1Scheme 1: imetelstat synthesis scheme cycle 1
М сив о І з му пов ко ЦИ ЩІК. З якM siv o I z m u pov ko TSI CHIK. With how
Ея ква и зи ру з ій пет,Eya kwa i zi ru z iy pet,
Се ї5 (З нку ї соте, дев у жкSe i5 (Z nku i sote, dev in zhk
Е ї У й 59E and U and 59
Цикл свнтезу 2-1 х в.The svnthesis cycle is 2-1 x c.
Я Я ї. Зняття захистуI I eat Removal of protection
М у І ки їх ; Ше ки чем х и н «САЛА ко ва гу в г. томи Ні ово Є Й нн і і рено ит, АХ ХК ї о он ч бен кір ОО Шок що с с ї В и - і Мои Ек 5M u I ki them; She ky chem kh i n "SALA kova gu in g. tomy Ni ovo E Y nn i i reno it, AH ХK і o on ch ben kir OO Shok s s і V y - i Moy Ek 5
Непроревгувнвці 7 М | чоNeprorevguvnvtsi 7 M | what
МА, кеповані 4. Кепування 2. Зв'язування | МнMA, capped 4. Capping 2. Binding | Mn
ЖК. бейм / Фосфорамідні ї І 7 ен нд ел о я ФІ с іResidential complex beim / Phosphoramidny i 7 en nd el o i FI s i
СУ В ке є Кая сао ї у в ге шк ен еще Я п о а ве у Кк я В яоьолАВВЕ Ве «с УSU V ke is Kaya sao i u v ge shk en yet I p o a ve u Kk i V yaoylAVVE Ve «s U
Ї су ФОМИ ща "у « МНЕ й ав З МИ зе ри (оз очи зом ще МмнтЕI su FOMY scha "in " ME and av Z MY zery (oz eyes zom still MmntE
З. СульфуризаціяZ. Sulfurization
На Схемі 1 синтез на твердофазному носії починається з видалення кислото-лабільної захисної групи 4,4-диметокси-тритилу (ОМТ) з пальмітоїламідопропандіолу, зв'язаного з твердофазним носієм. Фосфорамідит першого нуклеотиду зв'язується з носієм з подальшою сульфуризацією фосфору із застосуванням 0.1 М розчину фенілацетил дисульфіду (РАЮ5) в суміші ацетонітрилу та 2,б-лютидину (співвідношення 1:1). Потім застосовують стадію кепування для запобігання зв'язування будь-якого непрореагувавшого вихідного матеріалу на твердофазному носії з фосфорамідитом нуклеотиду в наступних циклах реакції. Кепування проводиться із застосуванням суміші 18:1:1 ТГФ / ізомасляний ангідрид / 2,6-лютидин.In Scheme 1, solid-state synthesis begins with the removal of the acid-labile 4,4-dimethoxytrityl (OMT) protecting group from solid-state-bound palmitoylamidopropanediol. The phosphoramidite of the first nucleotide is bound to the carrier with subsequent sulfurization of phosphorus using a 0.1 M solution of phenylacetyl disulfide (PAY5) in a mixture of acetonitrile and 2,b-lutidine (ratio 1:1). A capping step is then used to prevent binding of any unreacted starting material on the solid-phase support to the nucleotide phosphoramidite in subsequent reaction cycles. Capping is carried out using a mixture of 18:1:1 THF / isobutyric anhydride / 2,6-lutidine.
Після першого циклу на твердофазному носії, подовження ланцюга досягається реакцією 3'- аміногрупи пов'язаного 3 носієм олігонуклеотиду із надлишком розчину захищеного нуклеотидного фосфорамідитного мономеру, що відповідає наступному потрібному нуклеотиду у послідовності, як зображено на Схемі 2.After the first cycle on the solid-state support, chain elongation is achieved by reaction of the 3'-amino group of the 3-support-linked oligonucleotide with an excess solution of the protected nucleotide phosphoramidite monomer corresponding to the next required nucleotide in the sequence, as depicted in Scheme 2.
Схема 2: іметелстат схема синтезу цикл 2-13Scheme 2: imetelstat synthesis scheme cycle 2-13
М ви що а Ї М ті г мим з ее ЗЕM you what a Y M those g mym with her ZE
С с яе сис і 5 З з у міри Шок ним, сти оS s her sis and 5 Z s in measure Shock him, sti o
КК т вх МК их Я з о АХ Моє дн В й У нЕтудний цикл я їв) Мн й і : їв м т іKK t vh MK ih I z o AH My day V y U nEtudy cycle I ate) Mn y i : yiv m t i
ТК тречня ; і Кз / - Й пбтеруєтх а чад яЗмд: ; н ї / х.Кязування | пізня в і яTC Trechenya; and Kz / - Y pbterueth a chad yaZmd: ; n y / h. Orders | late in and I
У Я. кепування ; ШИКIn Ya. capping; CHIC
Н «восфорамідихN "phosphoramides".
М ї в н ДН Ї Ге сокуM i v n DN Y Gesoku
КОМ за са ак Я Мена не жKOM for sa ak Ya Mena not the same
ШІ Бв ! ба ТМ, кош я Ех Може я ВAI Bv! ba TM, kosh I Eh Maybe I V
М -о рах ПО Ко ї гній З; еуйьфуризація р нед ЗКУ УК УТ Уют іа 2 талі о В Сея еM -o rak PO Ko i dung Z; euyfurization r ned ZKU UC UT Uyut ia 2 tali o V Seya e
Га їх Сех шк Н ж, їх «і КН МО" в МтHa their Seh shk N same, their "and KN MO" in Mt
На Схемі 2 зображений перший цикл способу подовження ланцюга, який досягається зняттям захисту 3'-аміногрупи олігонуклеотиду, пов'язаного з носієм, (а) з подальшою реакцією зв'язування 3'-аміногрупи пов'язаного з носієм олігонуклеотиду (Б) з надлишком розчину 5'- фосфорамідитного мономеру, що відповідає наступному потрібному нуклеотиду у послідовності іметелстату. Наступною за реакцією зв'язування відбувається сульфуризація фосфору пов'язаного з носієм олігонуклеотиду (с) і стадія кепування (див. Схему 3) для запобігання зв'язування будь-якого непрореагувавшого вихідного матеріалу на твердофазному носії (Б) з 5'- фосфорамідитом нуклеотиду в наступних циклах реакції. Цикл реакції по Схемі 2 повторюють 12 разів перед обробкою пов'язаного з твердофазним носієм олигонуклеотиду сумішшю 1: 1 етанолу і концентрованого аміаку з подальшим очищенням за допомогою ВЕРХ з одержанням іметельстата.Scheme 2 shows the first cycle of the chain elongation method, which is achieved by deprotection of the 3'-amino group of the carrier-linked oligonucleotide (a) followed by the reaction of binding the 3'-amino group of the carrier-linked oligonucleotide (B) with excess solution of 5'- phosphoramidite monomer corresponding to the next required nucleotide in the sequence of imetelstat. The binding reaction is followed by sulfurization of the phosphorus of the support-bound oligonucleotide (c) and a capping step (see Scheme 3) to prevent binding of any unreacted starting material on the solid-phase support (B) to the 5' phosphoramidite of the nucleotide in subsequent reaction cycles. The reaction cycle according to Scheme 2 is repeated 12 times before treating the oligonucleotide bound to the solid-phase carrier with a 1:1 mixture of ethanol and concentrated ammonia followed by HPLC purification to obtain imetelstat.
Схема ЗScheme Z
І. «КНУ Я, «ни мохи ай Но ке - в се ія п !I. "KNU Ya, "ni mohy ay No ke - v se iya p !
Стадія кепування із застосуванням суміші 18:1:1 ТГФф / ізомасляний ангідрид / 2,6-лютидин проводиться для перетворення будь-якого, що залишився після стадії зв'язування пов'язаного з твердофазним носієм олігонуклеотиду (Б) з первинною 3'-аміногрупою, в олігонуклеотид (є) із захищеною (або "керованою") 3'-аміногрупою, щоб запобігти зв'язування первинної 3'- аміногрупи з фосфорамідитом нуклеотиду в наступних циклах реакції.A capping step using a mixture of 18:1:1 THF / isobutyric anhydride / 2,6-lutidine is carried out to convert any remaining after the solid-phase carrier-bound oligonucleotide (B) binding step to the primary 3'-amino group , into an oligonucleotide(s) with a protected (or "controlled") 3'-amino group to prevent binding of the primary 3'-amino group to the nucleotide phosphoramidite in subsequent cycles of the reaction.
МУО-01/18015 розкриває у Прикладі З з 5ЕО ІО Ме 2 М3--РБ' тіофосфорамідатний олігонуклеотид і спосіб одержання цього олігонуклеотиду, який включає стадію кепування.MUO-01/18015 discloses in Example C with 5EO IO Me 2 M3--RB' thiophosphoramidate oligonucleotide and a method of obtaining this oligonucleotide, which includes a capping stage.
У Негтбреті В-5 вї аіІ. обговорюється ліпідна модифікація ЧАМ163 (Опсодепе (2005) 24, 5262- 5268).In Negtbret V-5, you are aiI. lipid modification of ЧАМ163 is discussed (Opsodepe (2005) 24, 5262-5268).
У МакКіко Ногіє єї аі. обговорюється синтез і властивості олігонуклеотидів, що містять нуклеїнові кислоти з 2-0, 4"-С-етиленовимі містиковим зв'язком, спрямованих на субодиницюIn McKiko Nogier eyii ai. the synthesis and properties of oligonucleotides containing nucleic acids with a 2-0, 4"-C-ethylene mystical bond directed at the subunit are discussed
РНКтіломерази людини (Мисівїс Асідаз Бутровішт Зегевз (2005) 49, 171-172).Human RNAtilomerase (Mysivys Acidaz Butrovisht Zegevs (2005) 49, 171-172).
Опис винаходуDescription of the invention
Реакція зв'язування в способі, пов'язаному з твердофазним носієм, розкритому у УМО- 01/18015 ії М/О-2005/023994, включає стадію кепування для запобігання вступу в реакцію будь- яких непрореагувавших первинних 3'-аминогрупп на пов'язаному з носієм олігонуклеотидіThe binding reaction in the method associated with a solid-phase carrier disclosed in UMO-01/18015 and M/O-2005/023994 includes a capping step to prevent any unreacted primary 3'-amino groups from reacting with the carrier-bound oligonucleotide
Зо протягом наступних циклів.From during the following cycles.
У даний час несподівано було виявлено, що застосування стадії кепування, як описано у попередньому рівні техніки, є зайвим і що іметелстат може бути одержаний із застосуванням 3-х стадійного без додаткової стадії кепування з майже однаковим виходом і чистотою у порівнянні з попереднім рівнем техніки з 4-х стадійним циклом, в якому застосовується вказана стадія кепування. Усунення стадії кепування з кожного циклу приносить користь загальному способу за рахунок скорочення кількості стадій циклів на 22 95 (з 54 до 42 стадій) і, отже, скорочення часу способу. Також витрата розчинника зменшується за рахунок скорочення стадій циклів, що робить процес більш екологічним.It has now been unexpectedly discovered that the use of a capping step as described in the prior art is redundant and that imetelstat can be prepared using a 3-step without an additional capping step with almost the same yield and purity compared to the prior art with 4-stage cycle, in which the specified stage of capping is used. Eliminating the capping stage from each cycle benefits the overall method by reducing the number of cycle stages by 22 95 (from 54 to 42 stages) and, therefore, reducing the method time. Also, solvent consumption is reduced due to the reduction of cycle stages, which makes the process more environmentally friendly.
У даному документі, де використовується термін "стадія кепування", він визначає додаткову стадію хімічного способу, в якій первинна вільна 3'-аминогрупа на пов'язаному з твердофазним носієм олігонуклеотиді перетворюється на заміщену вторинну або третинну 3'-аміногрупу, яка не здатна брати участь в реакції зв'язування із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М,In this document, where the term "capping step" is used, it defines an additional step in the chemical process in which the primary free 3'-amino group on the oligonucleotide bound to the solid-phase support is converted to a substituted secondary or tertiary 3'-amino group that is not capable of taking participation in the binding reaction with protected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-M,
М-діїзопропіламіно-фосфорамідитим мономером на наступній стадії зв'язування.M-diisopropylamino-phosphoramid monomer at the next stage of binding.
В одному варіанті здійснення, даний винахід відноситься до способу синтезу М3'-»РБ' тіофосфорамідату олігонуклеотиду формули іматенстат сш о Ве т бо А й і ' Вісі | Ве А Вір це оон ад Ві ж ВизА о -6 | Веб 0 Вата вою Ва В Ш оIn one embodiment, the present invention relates to a method of synthesis of M3'-»RB' thiophosphoramidate oligonucleotide of the formula imatenstat ssh o Ve t bo A i i ' Axis | Ve A Vir ce oon ad Vi same VyzA o -6 | Web 0 Wattage Wa V Sh o
ПИ Важ ТетимінPI Vazh Tetymin
ОН І жрннй а зе й су ге Ву А х аденінON I zhrnny a ze y su ge Vu A h adenin
Мне ВазА бе туанінMne VazA be tuanin
М «Ма Ви 000 С цитознн о в ер еснНученьх с -МСНУ НО ст їй спосіб включає: а) забезпечення першого 3'-амінозахищеного нуклеотиду, приєднаного до твердофазного носія формули (А), де РО являє собою кислото-лабільну захисну групу; іо еренияThe method includes: a) provision of the first 3'-amino-protected nucleotide attached to the solid-phase carrier of the formula (A), where PO is an acid-labile protective group; io herenia
Мои в пре щаMine in the prescha
НвNv
З . ще . . ще . р) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи з утворенням вільної 3'-аміногрупи;With more . . more . p) deprotection from the protected 3'-amino group with the formation of a free 3'-amino group;
Я. - зу ; бі В кін ВYa. - zu; bi V kin V
КК с ВМ М ев Хе 5 моя в. саKK with VM M ev Khe 5 my v. with
МОкооєеу а в ї ІЕх І щи чMOkooeeu and in her IEh I shchi h
ВН. с) введення в реакцію вільної 3'-аміногрупи із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-VN. c) introduction into the reaction of a free 3'-amino group with a protected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-
М, М-діїзопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'ї), де п-2 з утворенням 10 міжнуклеозидного М3'--Р5'-фосфорамідитного зв'язку;M, M-diisopropylaminophosphoramidite monomer of the formula (B'), where n-2 with the formation of 10 internucleoside M3'--P5'-phosphoramidite bond;
В ге ще --й мономер іїю во пIn this case, the monomer in p
Я) сульфуризацію міжнуклеозидної фосфорамідитної групи із застосуванням ацилдисульфіду з утворенням М3'-»Р5' тіофосфорамідату; е) повторення 11 разів у послідовному порядку стадії зняття захисту б), стадії зв'язування с) 15 із захищеним //3'-амінонуклеозид-5'-0-ціаноетил-М, М-діїзопропіламіно-фосфорамідитним мономером формули (В'я), де захищена нуклеозидна основа В' в мономері (В'ї) являє собою послідовно захищену нуклеооснову від Вз до Віз на відповідних 11 стадіях зв'язування, і стадії сульфуризації 4);I) sulfurization of the internucleoside phosphoramidite group using acyl disulfide with the formation of M3'-»P5' thiophosphoramidate; f) repetition 11 times in sequential order of the stage of deprotection b), the stage of binding c) 15 with the protected //3'-aminonucleoside-5'-0-cyanoethyl-M,M-diisopropylamino-phosphoramidite monomer of the formula ), where the protected nucleoside base B' in the monomer (B') is a sequentially protected nucleoside from Bz to Bz at the corresponding 11 stages of binding, and stages of sulfurization 4);
І) видалення кислото-лабільної захисної групи РО; і 20 9) зняття захисту та відщеплення іметелстату з твердофазного носія який характеризується тим, що на будь-якій зі стадій реакції а) -є) додаткову стадію кепування не проводять.I) removal of the acid-labile protective group RO; and 20 9) deprotection and cleavage of imetelstat from a solid-phase carrier, which is characterized by the fact that no additional capping stage is carried out at any of the reaction stages a) - g).
В одному варіанті здійснення, даний винахід відноситься до способу синтезу М3--РБ тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату формули інетевстатIn one embodiment, the present invention relates to a method for the synthesis of M3-RB thiophosphoramidate of the oligonucleotide imetelstat of the formula inetevstat
Ву т Вуд А в. | Вус А Вваа песен о Ва ВХ Ще АЖWu t Wood A v. | Vus A Vvaa songs about Va VH Also AJ
БТ мі ев г й | Ка ав Ві А св | ; | Іо - НУ Ві - й і Ми : : Ве і я-о Ге Ве т Те тимінBT mi ev g y | Ka av Vi A sv | ; | Io - NU You - y and We : : Ve and I-o Ge Ve t Te timin
Че | я-7й Ву т А х аденін (МН; Ва А (З « тувнів - щ1В Ву С в цЦИТОЗИН їх ї З В ке к хижої чат в Це «дну Єви МОНУ НОВ ОН: спосіб включає: а) забезпечення першого 3'-амінозахищеного нуклеотиду, приєднаного до твердофазного носія формули (А), де РСї являє собою кислото-лабільну захисну групу; же М и їх іі КЗ що КОКО Ще що ца й Те Й бChe | I-7th Vu t A h adenine (MN; Va A (Z « tuvniv - sh1V Vu S v ccytosin their i Z V ke k khizhoi chat v This "dnu Eve MONU NOV ON: the method includes: a) provision of the first 3'- of an amino-protected nucleotide attached to a solid-phase support of the formula (A), where RSi is an acid-labile protecting group; and
Мо й вен -е ЇД ях р) зняття захисту із захищеної 3'-аміногрупи з утворенням вільної 3'-аміногрупи;Mo y ven -e YID yah p) removal of protection from the protected 3'-amino group with the formation of a free 3'-amino group;
ЯI
Ж же КіSo Ki
ЗТНПИШШХ с Ї її " й че Во 5ЗТНПИШШХ с І іє " и че Во 5
МЕ йME and
Мен З в. (ТАЗ ее ша й чну с) введення в реакцію вільної 3'-аміногрупи із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-0-ціаноетил-Maine Z v. (TAZ ee sha y chnu s) introduction into the reaction of a free 3'-amino group with a protected 3'-aminonucleoside-5'-0-cyanoethyl-
М, М-діїізопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'яї), де В'яї з п-2 являє собою захищений А, з утворенням міжнуклеозидного М3'-Р5-фосфорамідитного зв'язку; г. Гек ЗИ сM, M-diisopropylaminophosphoramidite monomer of the formula (Vyai), where Vyai from n-2 is a protected A, with the formation of an internucleoside M3'-P5-phosphoramidite bond; Hek ZY village
Кг з ой ОТ ее 15 . . Й . .Kg z oi OT ee 15. . Y. .
Я) сульфуризацію міжнуклеозидної фосфорамідитної групи із застосуванням ацилдисульфіду для утворення М3'- Ре тіофосфорамідату; е) повторення 11 разів у послідовному порядку стадії зняття захисту б), стадії зв'язування с) із захищеним /3'-амінонуклеозид-5'і-О-ці«аноетил-М, М-діїзопропіламіно-фосфорамідитним мономером формули (В'я), де нуклеозидна основа В' в мономері (В'я) являє собою захищений В, за виключенням випадку, коли В являє собою тимін, і де Ви являє собою наступну нуклеооснову від Вз до Візна відповідних 11 стадіях зв'язування, і стадії сульфуризації а);I) sulfurization of the internucleoside phosphoramidite group using acyl disulfide to form M3'-Re thiophosphoramidate; f) repeating 11 times in sequential order the deprotection stage b), the binding stage c) with the protected /3'-aminonucleoside-5'i-O-cycloaminoethyl-M,M-diisopropylamino-phosphoramidite monomer of the formula (B' i), where the nucleoside base B' in the monomer (Vya) is a protected B, except for the case when B is thymine, and where Vy is the next nucleobase from Bz to Wizn in the corresponding 11 stages of binding, and the stage sulfurization a);
І) видалення кислото-лабільної захисної групи РО; і д) зняття захисту та відщеплення відщеплення та зняття захисту іметелстату з твердофазного носія; який характеризується тим, що на будь-якій зі стадій реакції а) -є) додаткову стадію кепування не проводятьI) removal of the acid-labile protective group RO; and e) removal of protection and cleavage of cleavage and removal of protection of imetelstat from the solid-phase carrier; which is characterized by the fact that no additional capping stage is performed at any of the reaction stages a) -e).
В одному варіанті здійснення, даний винахід відноситься до способу синтезу М3- Р тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату формули іКелелет ше - Ве Вуха; пе о Ві В р пАяшеН ме ет : со ці. й | Ву кі Ві йIn one embodiment, the present invention relates to the method of synthesis of M3-P thiophosphoramidate oligonucleotide and metelstat of the formula iKelelet she - Ve Vukha; pe o Vi V r pAyasheN me et : so tsi. and | Wu ki Wee and
Ше ща» | ЩО ВихА й | в. ВедShe shcha" | WHAT VikhA and | in. Ved
ТКУ еоленюют сж Ж ся якоїTCU eoleniyut szh Zh sia which
ПИШИ Раб Ве т ТенWRITE Rab Ve t Ten
ОВ | ; о ЗЕ ЧОН ше БУТ 00 Ас аденівOV | ; o ZE Chong she BUT 00 As adeniv
ЕВ: н :EV: n:
КТ ОУН В ОВ ЧОНОН І ОНех спосіб включає: а) забезпечення першого 3'-амінозахищеного нуклеотиду, приєднаного до твердофазного носія формули (А), де РО являє собою кислото-лабільну захисну групу;KT OUN V OV CHONON I ONex method includes: a) provision of the first 3'-amino-protected nucleotide attached to the solid-phase carrier of the formula (A), where PO is an acid-labile protective group;
Кк Еш хи а ТВЕО ХО, щі г що ш й: й ;Kk Esh hi a TVEO HO, shchi g that sh y: y ;
Нештеци френя що В оNeshtetsi frenya that V o
Ум І б іMind I b i
ЯМ оYam Fr
Б) зняття захисту з РО-захищеного 3'-амінонуклеотиду з утворенням вільного 3'- амінонуклеотиду формули (А); це шоB) deprotection of the RO-protected 3'-aminonucleotide with the formation of a free 3'-aminonucleotide of formula (A); what's that
КАCA
М о АВ ех си й рф х х і. ка | несеM o AV eh sy y rf x x i. ka | carries
МНMN
15 . . . . . с) зв'язування вільного 3'-амінонуклеотиду із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-15. . . . . c) binding of the free 3'-aminonucleotide to the protected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-
М, М-діїізопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В'яї), де В'яї з п-2 являє собою захищений А, з утворенням міжнуклеозидного М3'-Р5-фосфорамідитного зв'язку; -M, M-diisopropylaminophosphoramidite monomer of the formula (Vyai), where Vyai from n-2 is a protected A, with the formation of an internucleoside M3'-P5-phosphoramidite bond; -
СВ що ані уся В о шоSV that not all V oh what
Ще еі затівакн В А що К 7 мономерI also noticed that K 7 is a monomer
НуWell
ЕчЗ а) сульфуризацію М3'-Р5'-фосфорамідитного зв'язку із застосуванням ацилдисульфіду для утворення міжнуклеозидного М3'--Ре' тіофосфорамідитного зв'язку; є) повторення 11 разів у послідовному порядку: стадії зняття захисту б), стадії зв'язування с) із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїзопропіламіно- фосфорамідитним мономером формули (В'я), де нуклеозидна основа В' в мономері (В'я) являє собою захищений В, за виключенням випадку, коли В являє собою тимін, і де Вп являє собою наступну нуклеооснову від Вз до Віз на відповідних 11 стадіях зв'язування, і стадіїй етапі сулфуризації а); з одержанням захищеного М3--РБ5 тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату, приєднаного до твердофазного носія; Її) видалення 3'-кінцевої кислото-лабільної захисної групиEchZ a) sulfurization of the M3'-P5'-phosphoramidite bond with the use of acyl disulfide to form an internucleoside M3'--Re' thiophosphoramidite bond; g) repeating 11 times in sequential order: deprotection stage b), binding stage c) with the protected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-M,M-diisopropylaminophosphoramidite monomer of the formula (B'a), where the nucleoside base B' in the monomer (B'a) is a protected B, except when B is thymine, and where Bp is the next nucleobase from Bz to Vz in the corresponding 11 stages of binding, and the step of sulfurization and); with the preparation of protected M3--RB5 thiophosphoramidate oligonucleotide imetelstat attached to a solid-phase carrier; Her) removal of the 3'-terminal acid-labile protective group
Ра із захищеного М3-РБ' тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату; і д) зняття захисту та відщеплення захищеного М3--»РБ тіофосфорамідату олігонуклеотиду іметелстату від твердого носія з одержанням іметелстату; який характеризується тим, що на будь-який зі стадій реакції а) -е) додаткову стадію кепування не проводять.Ra from protected M3-RB' thiophosphoramidate oligonucleotide imetelstat; and e) deprotection and cleavage of the protected M3--»RB thiophosphoramidate oligonucleotide of imetelstat from a solid support to obtain imetelstat; which is characterized by the fact that no additional capping stage is carried out for any of the reaction stages a) -e).
Згідно даному винаходу може застосовуватися широкий спектр твердофазних носіїв, включаючи, але не обмежуючись ними, такі, як мікрочастинки, виготовлені зі скла з контрольованим розміром пор (СРО), полістиролу з високим ступенем поперечної зшивки, гібридного скла з контрольованим розміром пор, завантаженого поперечно-зшитим полістирольним носієм, акрилових співполімерів, целюлози, нейлону, декстрану, латексу, поліакролеїну та тому подібного. 3'-амінозахищений нуклеотид, приєднаний до твердофазного носія формули (А) куA wide range of solid phase supports can be used according to the present invention, including, but not limited to, such as microparticles made of controlled pore size glass (CPO), highly cross-linked polystyrene, hybrid glass with controlled pore size loaded with cross- cross-linked polystyrene carrier, acrylic copolymers, cellulose, nylon, dextran, latex, polyacrolein and the like. 3'-amino-protected nucleotide attached to the solid-phase carrier of the formula (A) ku
Меси в ВНMasses in VN
ПКЕЕ 0PKEE 0
КН чо р В Ще т та ан в нах може бути одержаний так, як розкрито у МУО-2005/023994, де здійснювали зв'язування носія зі скла з контрольованим розміром пор, завантаженого З-пальмітоїламідо-1-0-(4,2- диметокситритил)-2-О-сукцинілпропандіолом, із захищеним 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М,КН чор В Хест та Ан в нах can be obtained as disclosed in MUO-2005/023994, where a support made of glass with a controlled pore size, loaded with Z-palmitoylamido-1-0-(4,2 - dimethoxytrityl)-2-O-succinylpropanediol, with protected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-M,
М-діїзопропіламінофосфорамідитним мономером формули (В':) ! яM-diisopropylaminophosphoramidite monomer of the formula (B':) ! I
ОА ВУ ше. ваг па ноOA VU she. wag pa no
Ме ї- ща , мономерів р у яму яPlace the monomers in the pit
НА ре де РО являє собою кислото-лабільну захисну групу. Придатні кислото-лабільній 3'-NA re de PO is an acid-labile protecting group. Suitable acid-labile 3'-
Зо амінозахисні групи Рі являють собою, але не обмежуються ними, наприклад, трифенілметил (тобто тритил або Ттг), п-анізилдифенілметил (тобто моно-метокситритил або ММТ) і ді-п- анізилфенілметил (тобто диметокситритил або ДМТ).Amino-protecting groups Ri include, but are not limited to, triphenylmethyl (i.e., trityl or Ttg), p-anisyldiphenylmethyl (i.e., mono-methoxytrityl or MMT), and di-p-anisylphenylmethyl (i.e., dimethoxytrityl or DMT).
Захищені 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїізопропіламінофосфорамідитні мономери формули (В'я) мають 3'-амінозахисну групу РО, яка являє собою кислотно-лабільну групу.таку як трифенілметил (тобто тритил або Ті), п-анізилдифенілметил (тобто монометокситритил абоProtected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-M,M-diisopropylaminophosphoramidite monomers of formula (B'a) have a 3'-amino protecting group RO, which is an acid-labile group, such as triphenylmethyl (ie, trityl or Ti) , p-anisyldiphenylmethyl (i.e. monomethoxytrityl or
ММТ) або ді-п-анізилфенілметил (тобто диметокситритил або ЮМТ). Крім того, нуклеозидна основа В' захищена осново-лабільною захисною групою (крім тиміну).MMT) or di-p-anisylphenylmethyl (ie dimethoxytrityl or UMT). In addition, the nucleoside base B' is protected by a base-labile protecting group (except for thymine).
, Ву Ве захищене А -Кки ТО. з захншена А Кі з захищена С ав нн В є захищена СЗ Ме» захищена А шов Ви Ва захищена З Й іх з захищена А жі З ш- жнонерії В'єх захищена 5 ! ПИ Ву Те тимін, Wu Ve is protected by A -Kky TO. z zahnshena A Ki z is protected S av nn V is protected SZ Me" is protected A shov You Va is protected Z Y ih z is protected A zhi Z shznonerii Vyeh is protected 5 ! PY Woo Tae Timing
НМ. во Взетї А « аденінNM. in Take A « adenine
Ве: захищена А (5 х ТуднінVe: protected A (5 x Tudnin
Во захищена С С « цитозинIt is protected by Cytosine
Нуклеотидні мономери В"': і В'» до В'їз застосовуються послідовно на 13 стадіях зв'язування, починаючи з забезпечення твердофазного носія, завантаженого З-пальмітоїламідо-1-О-(4,4- диметокситритил)-2-О-сукциніллропандіолом і зв'язування з нуклеотидним мономером В' і наступним циклом з 12 реакцій зняття захисту, реакції зв'язування та сульфуризації, в яких застосовуються нуклеотидні мономери від В'» до В'з.Nucleotide monomers B"': and B'" to Vyz are used sequentially in 13 stages of binding, starting with the provision of a solid-phase support loaded with 3-palmitoylamido-1-O-(4,4-dimethoxytrityl)-2-O- succinylropanediol and binding to the nucleotide monomer B' and the following cycle of 12 deprotection reactions, binding and sulfurization reactions, in which nucleotide monomers from B'" to B'3 are used.
З3З'--амінозахисну групу РО можна видалити, обробляючи кислим розчином таким як, наприклад, дихлороцтова кислота в дихлоорметані або толуені.The C3Z' amino protecting group of PO can be removed by treatment with an acidic solution such as, for example, dichloroacetic acid in dichloromethane or toluene.
Нуклеозидна основа В' в захищених 3'-амінонуклеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїзопропіл- амінофосфорамідитних мономерах формули (В'ї) захищена осново-лабільною захисною групою, яка видаляється на етапі 9). Придатними осново-лабільними захисними групами для нуклеозидної основи аденіну, цитозину або гуаніну є, наприклад, ацильні групи, такі як ацетил, бензоїл, ізобутирил, диметил-формамідиніл або дибензилформамідиніл. За умов реакції, що застосовуються в олігонуклеотидному синтезі, нуклеозидна основа тиміну не потребує захисту.Nucleoside base B' in the protected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-M,M-diisopropyl-aminophosphoramidite monomers of the formula (B') is protected by a base-labile protective group, which is removed in step 9). Suitable base-labile protecting groups for the nucleoside base of adenine, cytosine or guanine are, for example, acyl groups such as acetyl, benzoyl, isobutyryl, dimethylformamidinyl or dibenzylformamidinyl. Under the reaction conditions used in oligonucleotide synthesis, the thymine nucleoside base does not require protection.
Такі захищені 3'-аміно-нуїслеозид-5'-О-ціаноетил-М, М-діїзопропіламінофосфорамідитні мономери формули (В'я), що мають 3'-амінозахищену кислото-лабільну групу, захисну групу РО і нуклеозидну основу В' що захищена осново-лабільною захисною групою, є комерційно доступними або можуть бути одержані, як описано у УУМО-2006/014387.Such protected 3'-amino-nuisleoside-5'-O-cyanoethyl-M, M-diisopropylaminophosphoramidite monomers of the formula (B') having a 3'-amino-protected acid-labile group, a protecting group PO and a protected nucleoside base B' base-labile protecting group, are commercially available or can be obtained as described in UUMO-2006/014387.
Стадію зв'язування с) проводять додаванням розчину захищеного 3'-амінонуклеозид-5'-О- ціаноетил-М, М-дізопропіламінофосфорамідитного мономеру формули (Ви) і розчину активатора (або розчину, що містить фосфорамідитний мономер (Ви) й активатор) у реакційну посудину, що містить вільну аміногрупу (оліго)нуклеотиду, ковалентно приєднаного до твердого носія. Потім суміш змішують такими способами, як механічне вихрування, барботаж інертним газом і т.п. Як альтернатива, може бути зроблено так, щоб розчин(и) мономеру і активатора протікали через реакційну посудину (або колонку), що містить (оліго)дунуклеотид з вільною 3'- аміногрупою, нанесений на тверду фазу. Мономер й активатор можуть бути попередньо перемішані, змішані у клапанному блоці придатного синтезатора, змішані у посудині для попередньої активації та попередньо витримані, якщо потрібно, або вони можуть бути додані окремо у реакційну посудину.The binding stage c) is carried out by adding a solution of the protected 3'-aminonucleoside-5'-O-cyanoethyl-M, M-diisopropylaminophosphoramidite monomer of the formula (Vy) and a solution of the activator (or a solution containing a phosphoramidite monomer (Vy) and an activator) in a reaction vessel containing a free amino group of an (oligo)nucleotide covalently attached to a solid support. Then the mixture is mixed by such methods as mechanical vortexing, bubbling with inert gas, etc. Alternatively, the solution(s) of monomer and activator can be made to flow through a reaction vessel (or column) containing a (oligo)dinucleotide with a free 3'-amino group applied to the solid phase. The monomer and activator may be premixed, mixed in the valve block of a suitable synthesizer, mixed in a preactivation vessel, and preaged if desired, or they may be added separately to the reaction vessel.
Прикладами активаторів для застосування у винаході являються, але не обмежуюються ними, тетразол, 5-(етилтіо)-1ІН-тетразол, 5-(4-нітро-феніл)тетразол, 5-(2-тієніл)-1Н-тетразол, триазол, піридинію хлорид і тому подібне. Придатними розчинниками являються ацетонітрил, тетрагідрофуран, дихлорометан і тому подібне. На практиці ацетонітрил є широко застосовуваним розчинником для синтезу олігонуклеотиду.Examples of activators for use in the invention include, but are not limited to, tetrazole, 5-(ethylthio)-1H-tetrazole, 5-(4-nitro-phenyl)tetrazole, 5-(2-thienyl)-1H-tetrazole, triazole, pyridinium chloride and the like. Suitable solvents are acetonitrile, tetrahydrofuran, dichloromethane and the like. In practice, acetonitrile is a widely used solvent for oligonucleotide synthesis.
Реагент сульфуризації для застосування на стадії 4) являє собою ацилдисульфід, розчинений в розчиннику... Ацилдисульфіди, відомі в даній області техніки, являють собою-, наприклад, дибензоїлдисульфід, біс(фенілацетил)у дисульфід (РАЮОБ), біс(4-метоксибензоїл) дисульфід, біс(4-метилбензоїл) дисульфід, біс(4-нітробензоїл) дисульфід і біс(4-хлорбензоїл) дисульфід.Sulfurization reagent for use in stage 4) is an acyl disulfide dissolved in a solvent... Acyl disulfides known in this field of technology are, for example, dibenzoyl disulfide, bis(phenylacetyl)y disulfide (RAYUOB), bis(4-methoxybenzoyl) disulfide, bis(4-methylbenzoyl) disulfide, bis(4-nitrobenzoyl) disulfide, and bis(4-chlorobenzoyl) disulfide.
Фенілацетилдисульфід (РАЮ) є загальновживаним реагентом для реакцій сульфуризації, який найкращим чином слід "витримувати»хв основному розчині для одержання оптимальної активності сульфуризації (бсоїбзоп ..Ї. еї аІ., Ог9у. Віотої. Спет., мої. 14, 10840-10847, 2016).Phenylacetyldisulfide (PAY) is a widely used reagent for sulfurization reactions, which should best be "held" in the basic solution to obtain optimal sulfurization activity (bsoibzop ..Yi. ei aI., Og9u. Viotoi. Spet., my. 14, 10840-10847 , 2016).
Придатним розчинником для РАЮ5 являється, наприклад, суміш основного розчинника, такого як, наприклад, З-піколіну або 2,6-лютидину зі співрозчинником, таким як ацетонітрил, толуен, 1- метил-піролідинон або тетрагідрофуран. Кількість основного розчинника до кількості співрозчинника може бути у будь-якому співвідношенні, включаючи співвідношення 1:1.A suitable solvent for RAYU5 is, for example, a mixture of the main solvent, such as, for example, 3-picoline or 2,6-lutidine with a co-solvent, such as acetonitrile, toluene, 1-methyl-pyrrolidinone or tetrahydrofuran. The amount of main solvent to the amount of co-solvent can be in any ratio, including a 1:1 ratio.
Залежно від фосфітного складного ефіру, який повинен бути перетворений у відповідний тіофосфат, можна застосовувати як "свіжий", так і "витриманий" РАЮОБ5, однак показано, що "витримані" РАЮ покращують швидкість й ефективність сульфуризації. "Витримані" розчиниDepending on the phosphite ester that needs to be converted to the corresponding thiophosphate, both "fresh" and "aged" RAYUOB5 can be used, however, "aged" RAYU has been shown to improve the rate and efficiency of sulfurization. "Aged" solutions
РАО5 являють собою свіжоприготовлені розчини РАОБ, які витримувалися деякий час перед застосуванням в реакції сульфуризації. Час витримування може варьюватися від декількох годин до 48 годин, і кваліфікований фахівець може визначити оптимальний час витримування, аналізуючи реакцію сульфуризації на вихід і чистоту.РАО5 are freshly prepared solutions of РАОБ, which were kept for some time before use in the sulfurization reaction. The holding time can vary from a few hours to 48 hours, and a skilled artisan can determine the optimal holding time by analyzing the sulfurization response to yield and purity.
Для одержання іметелстату за даним винаходом, застосовується розчин РАЮ5 в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину, переважно у співвідношенні 1:1, з часом витримки від 4 до 14 годин. Виявлено, що при застосуванні 2,6-лютидину гранична кількість 2,3,5-колідину (який зазвичай виявляють в якості домішки в 2,6-лютидині) нижче 0,195 покращує ефективність сульфуризації, та спостерігають меншу кількість небажаного окиснення фосфору.To obtain imetelstat according to the present invention, a solution of RAYU5 is used in a mixture of acetonitrile and 2,6-lutidine, preferably in a ratio of 1:1, with a holding time of 4 to 14 hours. It was found that when using 2,6-lutidine, a cut-off amount of 2,3,5-colidine (which is usually detected as an impurity in 2,6-lutidine) below 0.195 improves the efficiency of sulfurization, and a lower amount of unwanted phosphorus oxidation is observed.
На стадії 9) з іметелстату знімають захист і відщеплюють від твердофазного носія. Зняття захисту включає видалення В-ціаноетильних груп й осново-лабільних захисних груп на нуклеотидних основах. Це можна зробити обробкою основним розчином, таким як розчин діетиламіну (ОЕА) в ацетонітрилі, з подальшою обробкою водним аміаком, що розчинений в спирті, такому як етанол.At stage 9), protection is removed from imetelstat and separated from the solid-phase carrier. Deprotection includes removal of B-cyanoethyl groups and base-labile protecting groups on nucleotide bases. This can be done by treatment with a basic solution, such as a solution of diethylamine (OEA) in acetonitrile, followed by treatment with aqueous ammonia dissolved in an alcohol such as ethanol.
Стадії реакції а)-ї) даного винаходу проводяться в діапазоні температур від 10 "С до 40 "с.Reaction stages a)-i) of this invention are carried out in the temperature range from 10 °C to 40 °C.
Більше переважно, ці реакції проводять при контрольованій температурі в діапазоні від 15 "С до 30 "С. Зокрема, стадію реакції Б) у даному винаході проводять при контрольованій температурі в діапазоні від 15 "С до 30 "С; більше конкретно від 17 "С до 27 "С. Зокрема, стадію реакції а) у даному винаході проводять в діапазоні температур від 17 "С до 25 "С; більше конкретно від 18 С до 22 "С; ще більше конкретно при 19 "С. Стадію 9), в якій з іметелстату знімають захист і відщеплюють від твердофазного носія, проводять при температурі в діапазоні від 30 "С до 60"С. Залежно від обладнання та конкретних застосовуваних умов реакції, оптимальна температура реакції для кожної стадії а)-д) у вищезазначених діапазонах може бути визначена кваліфікованим фахівцем.More preferably, these reactions are carried out at a controlled temperature in the range from 15 "C to 30 "C. In particular, reaction stage B) in this invention is carried out at a controlled temperature in the range from 15 "C to 30 "C; more specifically from 17 "C to 27 "C. In particular, reaction stage a) in this invention is carried out in the temperature range from 17 "C to 25 "C; more specifically from 18 C to 22 "C; even more specifically at 19 "C. Stage 9), in which the protection is removed from imetelstat and separated from the solid-phase carrier, is carried out at a temperature in the range from 30 "C to 60 "C. Depending on the equipment and the specific reaction conditions used, the optimal reaction temperature for each stage a)-e) in the above ranges can be determined by the skilled person.
Після кожної стадії в циклі подовження, твердофазний носій промивають розчинником, наприклад, ацетонітрилом, при приготуванні до наступної реакції.After each step in the elongation cycle, the solid-phase support is washed with a solvent, for example, acetonitrile, in preparation for the next reaction.
Після стадії 9), неочищений іметелсотат одержують у формі амонієвої солі, яку потім очищають препаративною зворотно-фазовою високоефективною рідинною хроматографією (3Ф-ВЕРХ), застосовуючи полімерні смоли або смоли на основі кремнезему, щоб одержатиAfter step 9), crude imetelsotate is obtained as an ammonium salt, which is then purified by preparative reversed-phase high-performance liquid chromatography (3F-HPLC) using polymeric or silica-based resins to give
Зо очищений іметелстат у триетиламіновій формі. Додають надлишок натрієвої солі, а потім розчин знесолюють шляхом діафільтрації, одержуючи таким чином іметелстат натрію, який потім ліофілізують для видалення води.It is purified imetelstat in triethylamine form. An excess of sodium salt is added, and the solution is then desalted by diafiltration to give sodium imetelstat, which is then lyophilized to remove water.
Експериментальна частина "Кімнатна температура" або "температура навколишнього середовища" зазвичай становить 21-2576.The experimental part "Room temperature" or "ambient temperature" is usually 21-2576.
Експеримент 1 (відсутня стадія кепування)Experiment 1 (no capping stage)
Всі реагенти та розчини вихідного матеріалу готували, включаючи З 95 дихлороцтову кислоту (ОСА) в толуені, 0.5 М розчин 5-(етилтіо)-1Н-тетразолу в ацетонітрилі, 0.15 М розчин усіх 4 нуклеотидних мономерів формули (В'ї) в ацетонітрилі, 0.2 М розчин фенілацетил дисульфіду (РАЮ5Б) в суміші ацетонітрилу та 2,б-лютидину 1:1 і 20 95 розчин ДЕА (діетиламіну) в ацетонітрилі. щ-й тр ов і: а «бе дей фун З ше: 2 секAll reagents and starting material solutions were prepared, including C 95 dichloroacetic acid (OCA) in toluene, a 0.5 M solution of 5-(ethylthio)-1H-tetrazole in acetonitrile, a 0.15 M solution of all 4 nucleotide monomers of formula (B) in acetonitrile, 0.2 M solution of phenylacetyl disulfide (RAYU5B) in a mixture of acetonitrile and 2,b-lutidine 1:1 and 20 95 solution of DEA (diethylamine) in acetonitrile. sh-y tr ov i: a "be dey fun Z she: 2 sec
С Є Й р;S E Y r;
В, В'є, В'; й ці з У дя | А щі.V, Vie, V'; and these from U dya | And more.
ці і ї не ше о МК Мі цк От шо, ц ' ' ' ' ' че ча ім;tsi i yi ne she o MK Mi tsk Ot sho, ts ' ' ' ' ' che cha im;
В», В'в, В", В"ї2, В'їз итV", V'v, V", V"i2, Entry etc
Я шин я нейI'm a tire, I'm a tire
Ж щ ви р НО ме нет чн а - к ЕН Н Н НІЖ щ вы р NO me net ch a - k EN NN NO
П-я х ве ца а иP-ya x ve tsa a y
Й Б БУ БУ гж їY B BU BU gzh i
В'з В. А В'5 В'є о Урі ту не Канн її Срна 2 п в і се ше о ки че ожV'z V. A V'5 Vie o Uri tu ne Kann her Srna 2 p v i se she o ki che ozh
Й НМ о йAnd NM about and
Я й сб в ще | М й ву 7 що МО ' Ял о | шеI and Sat in still | M y vu 7 that MO ' Yal o | what
Вч М У. п МИ млVch M U. p MY Jr
ОЗ | иOZ | and
Уджкй Же й Ко г ЇUzhky Zhe and Ko g Y
ЗWITH
Синтез олігонуклеотиду проводили в напрямку від 5' до 3, використовуючи повторюваний цикл синтезу, що складається з детритилювання з подальшим зв'язуванням і сульфуризацією при температурі навколишнього середовища.Synthesis of the oligonucleotide was carried out in the direction from 5' to 3, using a repeating cycle of synthesis consisting of detritylation followed by binding and sulfurization at ambient temperature.
Колонку (діаметром: 3.5 см) заповнювали твердим носієм, завантаженим З-пальмітоїламідо- 1-0-(4,42-диметокситритил)-2-О-сукциніл пропандіолом (3.5 ммоль на основі ємності 400 цмоль/г), що зв'язувався з нуклеотидним мономером В'ї. Детритилювання здійснювали із застосуванням З 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки на кожній стадії детритилювання), і зв'язаний з твердим носієм нуклеотид, промивали ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки). Зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) було досягнуто шляхом закачування 0.5 М розчину 5-(етилтіо)-1 Н- тетразолу в ацетонітрилі та 0.15 М розчину наступного у послідовності нуклеотидного мономеру формули (В'я), розчиненого в ацетонітрилі, через колонку. Колонку промивали ацетонітрилом (кількість: 2 об'єми колонки). Потім сульфуризацію проводили закачуванням розчину 0.2 М феніл ацетил дисульфіду (РАЮ5) в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину 1:1 через колонку з подальшим промиванням колонки ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки).The column (diameter: 3.5 cm) was filled with a solid support loaded with 3-palmitoylamido-1-0-(4,42-dimethoxytrityl)-2-O-succinyl propanediol (3.5 mmol based on a capacity of 400 cmol/g), which bound with the nucleotide monomer Vy. Detritylation was carried out using C 95 dichloroacetic acid (OCA) in toluene (the amount was from 6.5 to 13.4 column volumes at each stage of detritylation), and the nucleotide bound to the solid support was washed with acetonitrile (amount: 5 column volumes) . Binding to the following nucleotide monomer of the formula (III) was achieved by injecting a 0.5 M solution of 5-(ethylthio)-1H-tetrazole in acetonitrile and a 0.15 M solution of the following nucleotide monomer of the formula (III) dissolved in acetonitrile, through the column. The column was washed with acetonitrile (amount: 2 column volumes). Sulfurization was then carried out by injecting a 0.2 M solution of phenyl acetyl disulfide (PAY5) in a 1:1 mixture of acetonitrile and 2,6-lutidine through the column followed by washing the column with acetonitrile (quantity: 5 column volumes).
У синтезі цикл детритилювання, зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) їі сульфуризацію повторювали 12 разів, з подальшим детритилюванням із застосуванням З 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки).In the synthesis, the cycle of detritylation, binding with the following nucleotide monomer of the formula (B) and sulfurization was repeated 12 times, followed by detritylation using 395 dichloroacetic acid (OCA) in toluene (the amount was from 6.5 to 13.4 column volumes) .
По завершенні циклу синтезу, неочищений олігонуклеотид на твердофазному носії обробляли розчином діетиламіну (ДЕА) з подальшою обробкою розчином гідроксид амонію: етанол (об'ємне співвідношення 3:1) при температурі 55 "С. Реакційну суміш витримували протягом 4-24 годин при 55"С, охолоджували до кімнатної температури, і суспензію фільтрували для видалення полімерного носія. Розчин, який включає іметелстат в його амонієвій формі, піддавали процедурі аналізу ВЕРХ згідно Експерименту 3.Upon completion of the synthesis cycle, the crude oligonucleotide on the solid-phase support was treated with a solution of diethylamine (DEA) followed by treatment with a solution of ammonium hydroxide: ethanol (volume ratio 3:1) at a temperature of 55 °C. The reaction mixture was kept for 4-24 hours at 55 °C. C, was cooled to room temperature, and the suspension was filtered to remove the polymer carrier. The solution, which includes imetelstat in its ammonium form, was subjected to the HPLC analysis procedure according to Experiment 3.
Експеримент 2 (зі стадією кепування)Experiment 2 (with capping stage)
Всі реагенти та розчини вихідного матеріалу готували, включаючи З 95 дихлороцтову кислоту (ОСА) в толуенії, 0.5 М розчин 5-(етилтіо)-1Н-тетразолу в ацетонітрилі, 0.15 М розчин усіх 4 нуклеотидних мономерів формули (В'ї) в ацетонітрилі, 0.2 М розчин фенілацетилдисульфіду (РАЮ) в суміші ацетонітрилу та 2,б-лютидину 1:1, 20 95 розчин М- метилімідазолу (ММІ) в ацетонітрилі як реагент кепування А, ізомасляний ангідрид в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину 11 як реагент кепування В і 20 95 ДЕА в ацетонітрилі.All reagents and starting material solutions were prepared, including C 95 dichloroacetic acid (OCA) in toluene, a 0.5 M solution of 5-(ethylthio)-1H-tetrazole in acetonitrile, a 0.15 M solution of all 4 nucleotide monomers of the formula (B) in acetonitrile, 0.2 M solution of phenylacetyldisulfide (PAY) in a mixture of acetonitrile and 2,b-lutidine 1:1, 20 95 solution of M-methylimidazole (MMI) in acetonitrile as capping reagent A, isobutyric anhydride in a mixture of acetonitrile and 2,6-lutidine 11 as a reagent capping B and 20 95 DEA in acetonitrile.
Синтез олігонуклеотиду проводили в напрямку від 5' до 3, використовуючи повторюваний цикл - синтезу, що складається з детритилюванняї з подальшим зв'язуванням і сульфуризацією при температурі навколишнього середовища.Oligonucleotide synthesis was carried out in the direction from 5' to 3, using a repeating cycle - synthesis consisting of detritylation followed by binding and sulfurization at ambient temperature.
Колонку (діаметром: 3.5 см) заповнювали твердим носієм, завантаженим З-пальмітоїламідо- 1-0-(4,42-диметокситритил)-2-О-сукциніл пропандіолом (3.5 ммоль на основі ємності 400 цмоль/г), що зв'язувався з нуклеотидним мономером В'ї. Детритилювання здійснювали із застосуванням З 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки на кожній стадії детритилювання), і зв'язаний з твердим носієм нуклеотид, промивали ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки). Зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) було досягнуто шляхом закачування 0.5 М розчину 5-(етилтіо)-1 Н- тетразолу в ацетонітрилі та 0.15 М розчину наступного у послідовності нуклеотидного мономеру формули (В'я), розчиненого в ацетонітрилі, через колонку. Колонку промивали ацетонітрилом (кількість: 2 об'єми колонки). Потім сульфуризацію проводили закачуванням розчину 0.2 М феніл ацетил дисульфіду (РАЮ5) в суміші ацетонітрилу та 2,6-лютидину 1:1 через колонку з подальшим промиванням колонки ацетонітрилом (кількість: 5 об'ємів колонки).The column (diameter: 3.5 cm) was filled with a solid support loaded with 3-palmitoylamido-1-0-(4,42-dimethoxytrityl)-2-O-succinyl propanediol (3.5 mmol based on a capacity of 400 cmol/g), which bound with the nucleotide monomer Vy. Detritylation was carried out using C 95 dichloroacetic acid (OCA) in toluene (the amount was from 6.5 to 13.4 column volumes at each stage of detritylation), and the nucleotide bound to the solid support was washed with acetonitrile (amount: 5 column volumes) . Binding to the following nucleotide monomer of the formula (III) was achieved by injecting a 0.5 M solution of 5-(ethylthio)-1H-tetrazole in acetonitrile and a 0.15 M solution of the following nucleotide monomer of the formula (III) dissolved in acetonitrile, through a column. The column was washed with acetonitrile (amount: 2 column volumes). Sulfurization was then carried out by injecting a 0.2 M solution of phenyl acetyl disulfide (PAY5) in a 1:1 mixture of acetonitrile and 2,6-lutidine through the column followed by washing the column with acetonitrile (quantity: 5 column volumes).
Сульфуризація була наступною після стадії кепування У кожному кепуванні в заданому циклі застосовували 37-47 еквівалентів (екв.) реагенту кепування ММІ та 9-11 еквівалентів реагенту кепування В ізомасляного ангідриду (МА) та 1.4-1.8 еквівалентів 2,6-лютидину. Реагенти кепування А і В перекачували через колонку окремими насосами в різних співвідношеннях, таких як 50:50, 35:65, 65:35.Sulfurization followed the capping stage. In each capping cycle, 37-47 equivalents (equiv.) of capping reagent MMI and 9-11 equivalents of capping reagent B isobutyric anhydride (MA) and 1.4-1.8 equivalents of 2,6-lutidine were used. Capping reagents A and B were pumped through the column by separate pumps in different ratios such as 50:50, 35:65, 65:35.
У синтезі цикл детритилювання, зв'язування з наступним нуклеотидним мономером формули (В'ї) і сульфуризація, і стадію кепування повторювали 12 разів, з подальшимIn the synthesis, the cycle of detritylation, binding with the next nucleotide monomer of the formula (VI) and sulfurization, and the capping stage was repeated 12 times, followed by
Зо детритилюванням із застосуванням 3 95 дихлороцтової кислоти (ОСА) в толуені (кількість становила від 6.5 до 13.4 об'ємів колонки).With detritylation using 3 95 dichloroacetic acid (DHA) in toluene (the amount was from 6.5 to 13.4 column volumes).
По завершенні циклу синтезу, неочищений олігонуклеотид на твердофазному носії обробляли розчином діетиламіну (ДЕА) з подальшою обробкою розчином гідроксид амонію: етанол (об'ємне співвідношення 3:1) при температурі 55 "С. Реакційну суміш витримували протягом 4-24 годин при 55"С, охолоджували до кімнатної температури, і суспензію фільтрували для видалення полімерного носія. Розчин, який включає іметелстат в його амонієвій формі, піддавали процедурі аналізу ВЕРХ згідно Експерименту 3.Upon completion of the synthesis cycle, the crude oligonucleotide on the solid-phase support was treated with a solution of diethylamine (DEA) followed by treatment with a solution of ammonium hydroxide: ethanol (volume ratio 3:1) at a temperature of 55 °C. The reaction mixture was kept for 4-24 hours at 55 °C. C, was cooled to room temperature, and the suspension was filtered to remove the polymer carrier. The solution, which includes imetelstat in its ammonium form, was subjected to the HPLC analysis procedure according to Experiment 3.
Експеримент 3: порівняння за відсутності і наявності кепуванняExperiment 3: comparison in the absence and presence of capping
Іметелстат, одержаний в Експерименті 1 й Експерименті 2, аналізували за допомогою ВЕРХ.Imetelstat obtained in Experiment 1 and Experiment 2 was analyzed by HPLC.
Кількість необхідного повнорозмірного олігонуклеотиду, що має 13 нуклеотидів, визначили та навели в Таблиці нижче для Експерименту 1 й Експерименту 2. Крім того, загальна кількість короткого олігонуклеотида, зокрема з 12 нуклеотидів, була визначена та наведена в Таблиці нижче для Експерименту 1 й Експерименту 2.The amount of full-length oligonucleotide required, having 13 nucleotides, was determined and listed in the Table below for Experiment 1 and Experiment 2. In addition, the total amount of short oligonucleotide, specifically of 12 nucleotides, was determined and listed in the Table below for Experiment 1 and Experiment 2.
Спосіб аналізу ВЕРХ: тип колонки: Ктотавії С18, розмір частинок 3.5 мкм, 4.6 х 150 мм елюент:HPLC analysis method: column type: Ktotavia C18, particle size 3.5 μm, 4.6 x 150 mm eluent:
А: 14.4 мМ ТЕА/386 мМ НРЇР (гексафлуороізопропанол)/100 ррт (мас/об.) Маг?ЕеЕЮОТА у воді В: 95 Меон, 50 95 ЕЮН, що містить 5 95 ІПСA: 14.4 mM TEA/386 mM NRIR (hexafluoroisopropanol)/100 ppt (w/v) Mag?EeEHUOTA in water B: 95 Meon, 50 95 EUN containing 5 95 IPS
Градієнт: 50 нин нини шили 61142115 ни: пиши т Я ПОЛО ГПОGradient: 50 nyn nyny shily 61142115 ny: write t I POLO GPO
Таблиця експерименти за наявності кепуванням проти за відсутності кепування (Експеримент 1 проводили двічі і результати наведені як Експеримент Та і 16). тенненм СО 0 бненеяюх МИ й й 5. Короткий олігонуклеотид (12Table of experiments with capping versus no capping (Experiment 1 was performed twice and the results are shown as Experiments 1 and 16). tennenm СО 0 bneneyah MI y y 5. Short oligonucleotide (12
Експеримент Мо відсутність Основний пік, 90 й нуклеотидів) кепування кепування кепуванняMo experiment lack Main peak, 90th nucleotides) capping capping capping
Аналіз ВЕРХ Експерименту 1 і Експерименту 2 демонструє, що вихід і чистота є порівнянними в експерименті за відсутності кепування і в експерименті з кепуванням.HPLC analysis of Experiment 1 and Experiment 2 demonstrates that yield and purity are comparable in the no-capping experiment and in the capped experiment.
Основний пік, 96, включає повнорозмірний олігонуклеотид їж домішки РО ї депуриновані домішки.The main peak, 96, includes the full-length oligonucleotide and PO impurities and depurinated impurities.
РО домішки являють собою домішки, які включають один або більше оксофосфорамідатних міжнуклеозидних зв'язків замість тіофосфорамідатних міжнуклеозидних зв'язків.PO impurities are impurities that include one or more oxophosphoramidate internucleoside bonds instead of thiophosphoramidate internucleoside bonds.
Застосування розчинника та час реакції 0.45 л ацетонітрилу/ммоль застосовується для приготування реагенту кепування А та реагенту кепування В, що відповідає близько 25 95 загального використання ацетонітрилу під час приготування реагентів. Оскільки за кожною стадією хімічної реакції відбувалося промивання розчинником, після кожної стадії кепування також, відбувається промивання розчинником, що еквівалентно близько 40 об'ємам колонки розчинника. Враховуючи, що близько 212 об'ємів колонки промивального розчинника застосовувалося для заданого циклу синтезу, близько 19 95 промивального розчинника застосовувалося для стадій кепування. стадій кепування займала від З до б хвилин. Це відповідає близько 8 95 загального часу синтезу, включаючи 13 циклів і обробку ДЕА.Solvent Use and Reaction Time 0.45 L of acetonitrile/mmol is used to prepare Capping Reagent A and Capping Reagent B, which corresponds to about 25 95 of the total acetonitrile use during reagent preparation. Since each step of the chemical reaction was followed by a solvent wash, after each capping stage, there is also a solvent wash, which is equivalent to about 40 column volumes of solvent. Given that about 212 column volumes of wash solvent were used for a given synthesis cycle, about 19 95 wash solvent were used for capping steps. capping stages took from 3 to 2 minutes. This corresponds to about 8 95 total synthesis time, including 13 cycles and DEA processing.
Експеримент 4 (температура детритилювання)Experiment 4 (detritylation temperature)
Температура детритилювання впливає з точки зору контролю п-1 і депуринованих домішок.The temperature of detritylation affects from the point of view of control of n-1 and depurinated impurities.
Температуру деблокуючого розчину на вході в установку для синтезування вибирали від 17,5 до 27 "С (при загрузці 3,5 ммоль), і вибрану температуру утримували такою самою протягом всіх етапів детритилювання. При промиванні ацетонітрилом також утримували таку саму температуру деблокуючого розчину. 956 депуринованих домішок збільшувався лінійно в залежності від температури, в той час як п-1 був вище при більше низьких температурах.The temperature of the unblocking solution at the entrance to the synthesis unit was chosen from 17.5 to 27 "C (at a charge of 3.5 mmol), and the selected temperature was kept the same during all stages of detritylation. When washing with acetonitrile, the same temperature of the unblocking solution was also kept. 956 of depurinated impurities increased linearly depending on the temperature, while n-1 was higher at lower temperatures.
Експеримент 5 (температура стадії сульфуризації)Experiment 5 (temperature of the sulfurization stage)
В експериментах нижче досліджували вплив температури (НТ означає кімнатну температуру) використовуваного в реакціях сульфуризації розчину РАОБ5 на 95 менше бажанихIn the experiments below, the influence of the temperature (HT means room temperature) of the RAOB5 solution used in the sulfurization reactions was studied by 95% less than the desired
Зо домішок РО (вони являють собою домішки, в яких окиснення фосфору відбувається замість сульфуризації). Більш низькі температури призводять до більш низького 95 РО. в1111111111111111111117111111111111681From PO impurities (they are impurities in which phosphorus oxidation occurs instead of sulfurization). Lower temperatures result in a lower 95 RO. v11111111111111111111117111111111111681
ЗЕО ІО МО:1 - іметелстат і іметелстат натріюZEO IO MO:1 - imetelstat and imetelstat sodium
5-8-ТАааСТТАСАСАДА-МН»-3! де А являє собою пальмітоїл |(СНг).4СНз| амід, кон'югований за допомогою аміногліцеринового лінкеру з 5'-тіофосфатною групою М3--РБ' тіофосфорамідату (МР) - зв'язаного олігонуклеотиду.5-8-TAaaSTTASASADA-MN»-3! where A is palmitoyl |(CHg).4CHz| amide conjugated with the help of an aminoglycerin linker to the 5'-thiophosphate group M3--RB' of thiophosphoramidate (MR) - bound oligonucleotide.
Claims (13)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17180426 | 2017-07-10 | ||
| PCT/EP2018/068485 WO2019011829A1 (en) | 2017-07-10 | 2018-07-09 | Improved process for preparing imetelstat |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA125185C2 true UA125185C2 (en) | 2022-01-26 |
Family
ID=59313083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201912225A UA125185C2 (en) | 2017-07-10 | 2018-07-09 | Improved process for preparing imetelstat |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US11332489B2 (en) |
| EP (1) | EP3652187B1 (en) |
| JP (2) | JP7199410B2 (en) |
| KR (1) | KR20200035267A (en) |
| CN (1) | CN110891961B (en) |
| AU (2) | AU2018298658B2 (en) |
| BR (1) | BR112020000410A2 (en) |
| CA (2) | CA3195922A1 (en) |
| CL (1) | CL2020000054A1 (en) |
| CO (1) | CO2020000096A2 (en) |
| CY (1) | CY1125351T1 (en) |
| DK (1) | DK3652187T3 (en) |
| EA (1) | EA038579B1 (en) |
| ES (1) | ES2901099T3 (en) |
| HR (1) | HRP20211940T1 (en) |
| HU (1) | HUE056722T2 (en) |
| IL (1) | IL271388B (en) |
| LT (1) | LT3652187T (en) |
| MA (1) | MA49555A (en) |
| PL (1) | PL3652187T3 (en) |
| PT (1) | PT3652187T (en) |
| RS (1) | RS62705B1 (en) |
| SA (1) | SA520410996B1 (en) |
| SG (1) | SG11201912385VA (en) |
| SI (1) | SI3652187T1 (en) |
| TW (1) | TWI775895B (en) |
| UA (1) | UA125185C2 (en) |
| WO (1) | WO2019011829A1 (en) |
| ZA (1) | ZA201908452B (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021086753A1 (en) * | 2019-10-28 | 2021-05-06 | Geron Corporation | Amorphous solid succinylated 3-(fatty acid amido)-2-hydroxy-1-(protected hydroxy)-propane salts and methods of making the same |
| MX2022005007A (en) | 2019-10-28 | 2022-08-08 | Geron Corp | Crystalline solids of 3-palmitoyl-amido-1,2-propanediol and 3-palmitoyl-amido-2-hydroxy-1-dimethoxytriphenylmethylether-pro pane and methods of making and using the same. |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK1210357T3 (en) | 1999-09-10 | 2008-07-21 | Geron Corp | Oligonucleotide N3 '-P5' Thiophosphoramidates: Synthesis and Use thereof |
| DK3342425T3 (en) * | 2003-09-09 | 2020-03-16 | Geron Corp | MODIFIED OLIGONUCLEOTIDES FOR TELOMERASE INHIBITION |
| CA2571601C (en) * | 2004-07-02 | 2013-01-08 | Geron Corporation | Synthesis of protected 3'-amino nucleoside monomers |
| CN116440150A (en) | 2009-06-17 | 2023-07-18 | 冷泉港实验室 | Compositions and methods for modulating SMN2 splicing in a subject |
| JOP20200257A1 (en) * | 2014-05-01 | 2017-06-16 | Geron Corp | Oligonucleotide Compositions and Methods of Making the Same |
| WO2017223258A1 (en) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Biogen Ma Inc. | Synthesis of thiolated oligonucleotides without a capping step |
-
2018
- 2018-07-09 SG SG11201912385VA patent/SG11201912385VA/en unknown
- 2018-07-09 MA MA049555A patent/MA49555A/en unknown
- 2018-07-09 KR KR1020207003199A patent/KR20200035267A/en active IP Right Grant
- 2018-07-09 CN CN201880044657.4A patent/CN110891961B/en active Active
- 2018-07-09 CA CA3195922A patent/CA3195922A1/en active Pending
- 2018-07-09 PL PL18737621T patent/PL3652187T3/en unknown
- 2018-07-09 HU HUE18737621A patent/HUE056722T2/en unknown
- 2018-07-09 UA UAA201912225A patent/UA125185C2/en unknown
- 2018-07-09 PT PT187376215T patent/PT3652187T/en unknown
- 2018-07-09 TW TW107123644A patent/TWI775895B/en active
- 2018-07-09 US US16/623,984 patent/US11332489B2/en active Active
- 2018-07-09 CA CA3066968A patent/CA3066968C/en active Active
- 2018-07-09 BR BR112020000410-3A patent/BR112020000410A2/en active Search and Examination
- 2018-07-09 EP EP18737621.5A patent/EP3652187B1/en active Active
- 2018-07-09 RS RS20211534A patent/RS62705B1/en unknown
- 2018-07-09 ES ES18737621T patent/ES2901099T3/en active Active
- 2018-07-09 WO PCT/EP2018/068485 patent/WO2019011829A1/en unknown
- 2018-07-09 EA EA202090006A patent/EA038579B1/en unknown
- 2018-07-09 DK DK18737621.5T patent/DK3652187T3/en active
- 2018-07-09 HR HRP20211940TT patent/HRP20211940T1/en unknown
- 2018-07-09 JP JP2020500591A patent/JP7199410B2/en active Active
- 2018-07-09 LT LTEPPCT/EP2018/068485T patent/LT3652187T/en unknown
- 2018-07-09 SI SI201830496T patent/SI3652187T1/en unknown
- 2018-07-09 AU AU2018298658A patent/AU2018298658B2/en active Active
-
2019
- 2019-12-12 IL IL271388A patent/IL271388B/en unknown
- 2019-12-18 ZA ZA2019/08452A patent/ZA201908452B/en unknown
-
2020
- 2020-01-07 CO CONC2020/0000096A patent/CO2020000096A2/en unknown
- 2020-01-08 SA SA520410996A patent/SA520410996B1/en unknown
- 2020-01-08 CL CL2020000054A patent/CL2020000054A1/en unknown
-
2021
- 2021-12-14 CY CY20211101096T patent/CY1125351T1/en unknown
-
2022
- 2022-04-12 US US17/718,990 patent/US20230070069A1/en not_active Abandoned
- 2022-10-24 JP JP2022169927A patent/JP2022183382A/en active Pending
- 2022-12-23 AU AU2022291626A patent/AU2022291626A1/en active Pending
-
2023
- 2023-10-16 US US18/487,919 patent/US20240199672A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI801843B (en) | Processes for preparing oligomers | |
| JP2022525541A (en) | Techniques useful for oligonucleotide preparation | |
| KR20160078989A (en) | Cytidine-5-carboxamide modified nucleotide compositions and methods related thereto | |
| BR122021003805B1 (en) | MODIFIED PYRIMIDINES IN POSITION 5 | |
| TW201825506A (en) | Processes for preparing phosphorodiamidate morpholino oligomers | |
| BRPI0417830B1 (en) | methods for synthesizing a molecule comprising a functional portion operably linked to a coding oligonucleotide | |
| JP2007531794A (en) | Methods and reagents used for oligonucleotide synthesis and purification | |
| CN103068834A (en) | Phosphoramidites for synthetic rna in the reverse direction, efficient rna synthesis and convenient introduction of 3'-end ligands, chromophores and modifications of synthetic rna | |
| AU2022291626A1 (en) | Improved process for preparing imetelstat | |
| KR20190065341A (en) | Method of joining oligomeric compounds | |
| JP2000342265A (en) | Method for purifying oligonucleotides | |
| AU2002325599B2 (en) | Oligonucleotide analogues | |
| WO2004048376A1 (en) | Bicyclic naphthylidine nucleosides |