CN107383246A - 一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了核酸固相有机合成技术领域的一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体包括聚苯乙烯载体、3‑氨基‑1‑(4，4’‑二甲氧三苯甲基)‑1，‑2‑丙乙醇间臂和琥珀酸键，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法具体步骤如下：S1：氨甲基聚苯乙烯载体的合成；S2：3‑氨基‑1‑(4，4’‑二甲氧三苯甲基)‑1，‑2‑丙乙醇间臂的合成；S3：氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联；S4：载体合成性能的检测，满足了不同核酸序列的合成需求，载体合成条件温和，载量可达到80umol/g，明显高于传统CPG载体的载量，具有高载量、通用性及较好的合成性能等优点，具有替代传统CPG载体的潜能。
Description
技术领域
本发明涉及核酸固相有机合成技术领域，具体为一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法。
背景技术
核酸固相有机合成是将固相合成和亚磷酰胺法相结合，借助于专业的DNA/RNA合成仪在固相载体上依次按照核酸序列进行偶联，实现快速、高效、稳定的核酸合成，由于固相有机合成具有自动化程度高，产物量大，没有序列限制、合成产物易进行化学修饰等优点，因此是目前获得大量核酸最主要的途径之一。
目前大多数核酸固相载体均是在可控孔度玻璃(CPG)上连接目核酸的起始核苷单体，以提供核酸序列合成的活性位点，进行核酸序列的合成，如Sigma公司的核酸合成系列载体就是将CPG与核苷单体通过琥珀酸键连接得到的，CPG上核苷单体作为合成核酸序列的起始核苷单体，CPG作为一种无机硅氧基载体，具有表面易衍生、反应活性较高等优点，但其表面富含羟基，亲水性较强，且羟基保护基在合成过程中易脱落，一定程度上影响了核酸的合成效率和质量。
聚苯乙烯是一种性能优异的有机载体，MoCollum等利用甲基聚苯乙烯偶联核苷单体琥珀酸衍生物作为固相载体进行核酸的合成，取得了较好的效果，聚苯乙烯载体表面疏水，经无水有机溶剂淋洗能彻底出去表面的残留水分，减少水分对核酸合成的干扰，其表面氨基衍生后活性位点相对较少，核酸合成过程中不易产生错误序列，产物纯度较高，因此更适合核酸的固相合成。
固相载体与起始核苷单体间需要通过间臂偶联，除琥珀酸键外，还有其他的一些化学间臂也能用于连接载体和起始核苷单体，如Alul等和Pon等分别采用乙二酰键和苯二酚-O，O’-乙酰乙酸键作为连接间臂，得到了不同的CPG固相有机合成载体，这些传统化学间臂制备的载体根据连接的起始核苷单体(A，U，C，G)分为不同种类，要满足不同序列的合成要求，需要准备四种固相载体，增加了实验成本和工作量，鉴于上述提到的问题，本发明设计一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法，以解决上述提到的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体包括聚苯乙烯载体、3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂和琥珀酸键，所述聚苯乙烯载体通过琥珀酸键与3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂连接。
优选的，所述聚苯乙烯载体采用粒径为100um，氨基载量为0.715mmol/g。
优选的，所述3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的4，4’-二甲氧三苯甲基载量为80umol/g。
一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法具体步骤如下：
S1：氨甲基聚苯乙烯载体的合成：称取1.0-1.2g聚苯乙烯载体、1.2-1.6mmolN-氯甲基邻苯二甲酰亚12-16mL二氯甲烷加入茄形瓶中，搅拌12-18min，加入催化剂在45℃下搅拌5-7h，反应结束后，分别用0.1mol/L盐酸的N，N’-二甲基甲酰胺溶液，N，N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷和甲醇淋洗载体，然后再真空下干燥1-3h，干燥后的载体加入20mL5％肼的乙醇溶液中，回流反应5h，然后用乙醇、甲醇淋洗，再次真空干燥氨甲基聚苯乙烯载体备用；
S2：3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的合成：量取30mmol3-氨基-1，2-丙乙醇加入30mL三氟乙酸甲酯中，室温下搅拌10-14h，反应结束后蒸馏出去三氟乙酸甲酯，然后再剩余产物中加入100mL甲苯，回流除水，得无色油状产物3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇，然后量取5mmol3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇加入到20mL无水吡啶中，搅拌10-12min，在搅拌的同时加入4-6mmolDMT-CL，然后加入2mL甲醇终止反应，蒸馏除去溶剂，剩余物加入50mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液和纯水洗涤乙酸乙酯，收集有机相，加入10g污水硫酸钠搅拌2h除水，然后过滤除去硫酸钠，蒸发出去乙酸乙酯，得到淡黄色油状产物，然后将产物用硅胶柱色谱纯化，然后用0.1％吡啶和0-2％甲醇的二氯甲烷溶液为有机相进行阶梯洗脱，得到淡黄色油状产物3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后称取2g-3g的3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后将其加入到75mL9mol/L氨的甲醇溶液中，室温下搅拌反应过夜，在进行蒸干处理，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇备用；
S3：氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联：称取步骤S1中的氨甲基聚苯乙烯载体1.0-1.2g，0.6-0.8g琥珀酸酐，然后加入混合溶液中，在室温下震荡过夜，然后将反应后的载体分别用5mL吡啶和5mL四氢呋喃淋洗，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体，然后将琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体悬浮于0.8mLN-甲基咪唑、0.5mL2，6-二甲基吡啶和8.2mL四氢呋喃、5mL吡啶、10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，与2.5mmol3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇、3mmol1-羟基苯丙三唑、3mmolN，N’-二环已基碳二亚胺、7.5mL吡啶混合，在20℃下振荡反应过夜，然后收集载体，并通过5mL乙腈淋洗，然后将载体悬浮于1mL三乙胺、1mL水、3mL乙腈的混合溶液中，室温下振荡反应45min后，用10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，然后称取0.42g干燥后的载体悬浮于6mL2，6-二甲基吡啶和7mL四氢呋喃的混合溶液中，加入甲酸和乙酸酐混合溶液进行甲酰化，室温振荡反应过夜，用10mL乙腈淋洗载体，真空干燥2h，得到目标产物聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体；
S4：载体合成性能的检测：采用分光光度法检测DMT的载量。
优选的，所述步骤S1中催化剂为0.6mL的0.6mol/L三氯化铁-二苯甲酮的二氯甲烷溶液。
优选的，所述步骤S2中得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇为无色油状产物。
优选的，所述步骤S3中的混合溶液为5mL吡啶、0.8mLN-甲基咪唑和4.2mL四氢呋喃的混合溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体及其制备方法，将氨基衍生物的聚苯乙烯载体与3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂通过琥珀酸键连接，满足了不同核酸序列的合成需求，载体合成条件温和，载量可达到80umol/g，明显高于传统CPG载体的载量，具有高载量、通用性及较好的合成性能等优点，具有替代传统CPG载体的潜能。
附图说明
图1为本发明结构示意图；
图2为本发明工作流程图；
图3为本发明氨甲基聚苯乙烯载体的合成的化学方程式图；
图4为本发明3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的合成的化学方程式图；
图5为本发明氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联的化学方程式图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本发明提供一种技术方案：一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体包括聚苯乙烯载体、3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂和琥珀酸键，所述聚苯乙烯载体通过琥珀酸键与3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂连接。
其中，所述聚苯乙烯载体采用粒径为100um，氨基载量为0.715mmol/g，所述3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的4，4’-二甲氧三苯甲基载量为80umol/g。
实施例一
一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法具体步骤如下：
S1：氨甲基聚苯乙烯载体的合成：称取1.0g聚苯乙烯载体、1.2mmolN-氯甲基邻苯二甲酰亚12mL二氯甲烷加入茄形瓶中，搅拌12min，加入催化剂在45℃下搅拌5h，催化剂为0.6mL的0.6mol/L三氯化铁-二苯甲酮的二氯甲烷溶液，反应结束后，分别用0.1mol/L盐酸的N，N’-二甲基甲酰胺溶液，N，N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷和甲醇淋洗载体，然后再真空下干燥1h，干燥后的载体加入20mL5％肼的乙醇溶液中，回流反应5h，然后用乙醇、甲醇淋洗，再次真空干燥氨甲基聚苯乙烯载体备用；
S2：3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的合成：量取30mmol3-氨基-1，2-丙乙醇加入30mL三氟乙酸甲酯中，室温下搅拌10-14h，反应结束后蒸馏出去三氟乙酸甲酯，然后再剩余产物中加入100mL甲苯，回流除水，得无色油状产物3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇，然后量取5mmol3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇加入到20mL无水吡啶中，搅拌10min，在搅拌的同时加入4mmolDMT-CL，然后加入2mL甲醇终止反应，蒸馏除去溶剂，剩余物加入50mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液和纯水洗涤乙酸乙酯，收集有机相，加入10g污水硫酸钠搅拌2h除水，然后过滤除去硫酸钠，蒸发出去乙酸乙酯，得到淡黄色油状产物，然后将产物用硅胶柱色谱纯化，然后用0.1％吡啶和0-2％甲醇的二氯甲烷溶液为有机相进行阶梯洗脱，得到淡黄色油状产物3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后称取2g的3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后将其加入到75mL9mol/L氨的甲醇溶液中，室温下搅拌反应过夜，在进行蒸干处理，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇备用，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇为无色油状产物；
S3：氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联：称取步骤S1中的氨甲基聚苯乙烯载体1.0g，0.6g琥珀酸酐，然后加入混合溶液中，混合溶液为5mL吡啶、0.8mLN-甲基咪唑和4.2mL四氢呋喃的混合溶液，在室温下震荡过夜，然后将反应后的载体分别用5mL吡啶和5mL四氢呋喃淋洗，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体，然后将琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体悬浮于0.8mLN-甲基咪唑、0.5mL2，6-二甲基吡啶和8.2mL四氢呋喃、5mL吡啶、10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，与2.5mmol3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇、3mmol1-羟基苯丙三唑、3mmolN，N’-二环已基碳二亚胺、7.5mL吡啶混合，在20℃下振荡反应过夜，然后收集载体，并通过5mL乙腈淋洗，然后将载体悬浮于1mL三乙胺、1mL水、3mL乙腈的混合溶液中，室温下振荡反应45min后，用10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，然后称取0.42g干燥后的载体悬浮于6mL2，6-二甲基吡啶和7mL四氢呋喃的混合溶液中，加入甲酸和乙酸酐混合溶液进行甲酰化，室温振荡反应过夜，用10mL乙腈淋洗载体，真空干燥2h，得到目标产物聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体；
S4：载体合成性能的检测：采用分光光度法检测DMT的载量。
实施例二
一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法具体步骤如下：
S1：氨甲基聚苯乙烯载体的合成：称取1.1g聚苯乙烯载体、1.4mmolN-氯甲基邻苯二甲酰亚14mL二氯甲烷加入茄形瓶中，搅拌15min，加入催化剂在45℃下搅拌6h，催化剂为0.6mL的0.6mol/L三氯化铁-二苯甲酮的二氯甲烷溶液，反应结束后，分别用0.1mol/L盐酸的N，N’-二甲基甲酰胺溶液，N，N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷和甲醇淋洗载体，然后再真空下干燥2h，干燥后的载体加入20mL5％肼的乙醇溶液中，回流反应5h，然后用乙醇、甲醇淋洗，再次真空干燥氨甲基聚苯乙烯载体备用；
S2：3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的合成：量取30mmol3-氨基-1，2-丙乙醇加入30mL三氟乙酸甲酯中，室温下搅拌10-14h，反应结束后蒸馏出去三氟乙酸甲酯，然后再剩余产物中加入100mL甲苯，回流除水，得无色油状产物3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇，然后量取5mmol3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇加入到20mL无水吡啶中，搅拌11min，在搅拌的同时加入5mmolDMT-CL，然后加入2mL甲醇终止反应，蒸馏除去溶剂，剩余物加入50mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液和纯水洗涤乙酸乙酯，收集有机相，加入10g污水硫酸钠搅拌2h除水，然后过滤除去硫酸钠，蒸发出去乙酸乙酯，得到淡黄色油状产物，然后将产物用硅胶柱色谱纯化，然后用0.1％吡啶和0-2％甲醇的二氯甲烷溶液为有机相进行阶梯洗脱，得到淡黄色油状产物3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后称取2.5g的3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后将其加入到75mL9mol/L氨的甲醇溶液中，室温下搅拌反应过夜，在进行蒸干处理，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇备用，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇为无色油状产物；
S3：氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联：称取步骤S1中的氨甲基聚苯乙烯载体1.1g，0.7g琥珀酸酐，然后加入混合溶液中，混合溶液为5mL吡啶、0.8mLN-甲基咪唑和4.2mL四氢呋喃的混合溶液，在室温下震荡过夜，然后将反应后的载体分别用5mL吡啶和5mL四氢呋喃淋洗，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体，然后将琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体悬浮于0.8mLN-甲基咪唑、0.5mL2，6-二甲基吡啶和8.2mL四氢呋喃、5mL吡啶、10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，与2.5mmol3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇、3mmol1-羟基苯丙三唑、3mmolN，N’-二环已基碳二亚胺、7.5mL吡啶混合，在20℃下振荡反应过夜，然后收集载体，并通过5mL乙腈淋洗，然后将载体悬浮于1mL三乙胺、1mL水、3mL乙腈的混合溶液中，室温下振荡反应45min后，用10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，然后称取0.42g干燥后的载体悬浮于6mL2，6-二甲基吡啶和7mL四氢呋喃的混合溶液中，加入甲酸和乙酸酐混合溶液进行甲酰化，室温振荡反应过夜，用10mL乙腈淋洗载体，真空干燥2h，得到目标产物聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体；
S4：载体合成性能的检测：采用分光光度法检测DMT的载量。
实施例三
一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法具体步骤如下：
S1：氨甲基聚苯乙烯载体的合成：称取1.2g聚苯乙烯载体、1.6mmolN-氯甲基邻苯二甲酰亚16mL二氯甲烷加入茄形瓶中，搅拌18min，加入催化剂在45℃下搅拌7h，催化剂为0.6mL的0.6mol/L三氯化铁-二苯甲酮的二氯甲烷溶液，反应结束后，分别用0.1mol/L盐酸的N，N’-二甲基甲酰胺溶液，N，N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷和甲醇淋洗载体，然后再真空下干燥3h，干燥后的载体加入20mL5％肼的乙醇溶液中，回流反应5h，然后用乙醇、甲醇淋洗，再次真空干燥氨甲基聚苯乙烯载体备用；
S2：3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的合成：量取30mmol3-氨基-1，2-丙乙醇加入30mL三氟乙酸甲酯中，室温下搅拌14h，反应结束后蒸馏出去三氟乙酸甲酯，然后再剩余产物中加入100mL甲苯，回流除水，得无色油状产物3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇，然后量取5mmol3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇加入到20mL无水吡啶中，搅拌12min，在搅拌的同时加入6mmolDMT-CL，然后加入2mL甲醇终止反应，蒸馏除去溶剂，剩余物加入50mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液和纯水洗涤乙酸乙酯，收集有机相，加入10g污水硫酸钠搅拌2h除水，然后过滤除去硫酸钠，蒸发出去乙酸乙酯，得到淡黄色油状产物，然后将产物用硅胶柱色谱纯化，然后用0.1％吡啶和0-2％甲醇的二氯甲烷溶液为有机相进行阶梯洗脱，得到淡黄色油状产物3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后称取3g的3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后将其加入到75mL9mol/L氨的甲醇溶液中，室温下搅拌反应过夜，在进行蒸干处理，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇备用，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇为无色油状产物；
S3：氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联：称取步骤S1中的氨甲基聚苯乙烯载体1.2g，0.8g琥珀酸酐，然后加入混合溶液中，混合溶液为5mL吡啶、0.8mLN-甲基咪唑和4.2mL四氢呋喃的混合溶液，在室温下震荡过夜，然后将反应后的载体分别用5mL吡啶和5mL四氢呋喃淋洗，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体，然后将琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体悬浮于0.8mLN-甲基咪唑、0.5mL2，6-二甲基吡啶和8.2mL四氢呋喃、5mL吡啶、10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，与2.5mmol3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇、3mmol1-羟基苯丙三唑、3mmolN，N’-二环已基碳二亚胺、7.5mL吡啶混合，在20℃下振荡反应过夜，然后收集载体，并通过5mL乙腈淋洗，然后将载体悬浮于1mL三乙胺、1mL水、3mL乙腈的混合溶液中，室温下振荡反应45min后，用10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，然后称取0.42g干燥后的载体悬浮于6mL2，6-二甲基吡啶和7mL四氢呋喃的混合溶液中，加入甲酸和乙酸酐混合溶液进行甲酰化，室温振荡反应过夜，用10mL乙腈淋洗载体，真空干燥2h，得到目标产物聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体；
S4：载体合成性能的检测：采用分光光度法检测DMT的载量。
根据实施例一、二、三的实验结果总结得出：最佳实施方案为实施例二。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，其特征在于，该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体包括聚苯乙烯载体、3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂和琥珀酸键，所述聚苯乙烯载体通过琥珀酸键与3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂连接。
2.根据权利要求1所述的一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，其特征在于：所述聚苯乙烯载体采用粒径为100um，氨基载量为0.715mmol/g。
3.根据权利要求1所述的一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体，其特征在于：所述3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的4，4’-二甲氧三苯甲基载量为80umol/g。
4.一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，其特征在于：该种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法具体步骤如下：
S1：氨甲基聚苯乙烯载体的合成：称取1.0-1.2g聚苯乙烯载体、1.2-1.6mmolN-氯甲基邻苯二甲酰亚12-16mL二氯甲烷加入茄形瓶中，搅拌12-18min，加入催化剂在45℃下搅拌5-7h，反应结束后，分别用0.1mol/L盐酸的N，N’-二甲基甲酰胺溶液，N，N’-二甲基甲酰胺，二氯甲烷和甲醇淋洗载体，然后再真空下干燥1-3h，干燥后的载体加入20mL5％肼的乙醇溶液中，回流反应5h，然后用乙醇、甲醇淋洗，再次真空干燥氨甲基聚苯乙烯载体备用；
S2：3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇间臂的合成：量取30mmol3-氨基-1，2-丙乙醇加入30mL三氟乙酸甲酯中，室温下搅拌10-14h，反应结束后蒸馏出去三氟乙酸甲酯，然后再剩余产物中加入100mL甲苯，回流除水，得无色油状产物3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇，然后量取5mmol3-三氟乙酰胺-1，-2-丙乙醇加入到20mL无水吡啶中，搅拌10-12min，在搅拌的同时加入4-6mmolDMT-CL，然后加入2mL甲醇终止反应，蒸馏除去溶剂，剩余物加入50mL乙酸乙酯中，依次用饱和碳酸氢钠溶液和纯水洗涤乙酸乙酯，收集有机相，加入10g污水硫酸钠搅拌2h除水，然后过滤除去硫酸钠，蒸发出去乙酸乙酯，得到淡黄色油状产物，然后将产物用硅胶柱色谱纯化，然后用0.1％吡啶和0-2％甲醇的二氯甲烷溶液为有机相进行阶梯洗脱，得到淡黄色油状产物3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后称取2g-3g的3-三氟乙酰胺-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇，然后将其加入到75mL9mol/L氨的甲醇溶液中，室温下搅拌反应过夜，在进行蒸干处理，得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇备用；
S3：氨甲基聚苯乙烯载体与间臂的偶联：称取步骤S1中的氨甲基聚苯乙烯载体1.0-1.2g，0.6-0.8g琥珀酸酐，然后加入混合溶液中，在室温下震荡过夜，然后将反应后的载体分别用5mL吡啶和5mL四氢呋喃淋洗，得到琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体，然后将琥珀酰胺甲基聚苯乙烯载体悬浮于0.8mLN-甲基咪唑、0.5mL2，6-二甲基吡啶和8.2mL四氢呋喃、5mL吡啶、10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，与2.5mmol3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇、3mmol1-羟基苯丙三唑、3mmolN，N’-二环已基碳二亚胺、7.5mL吡啶混合，在20℃下振荡反应过夜，然后收集载体，并通过5mL乙腈淋洗，然后将载体悬浮于1mL三乙胺、1mL水、3mL乙腈的混合溶液中，室温下振荡反应45min后，用10mL乙腈淋洗，真空干燥2h，然后称取0.42g干燥后的载体悬浮于6mL2，6-二甲基吡啶和7mL四氢呋喃的混合溶液中，加入甲酸和乙酸酐混合溶液进行甲酰化，室温振荡反应过夜，用10mL乙腈淋洗载体，真空干燥2h，得到目标产物聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体；
S4：载体合成性能的检测：采用分光光度法检测DMT的载量。
5.根据权利要求4所述的一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中催化剂为0.6mL的0.6mol/L三氯化铁-二苯甲酮的二氯甲烷溶液。
6.根据权利要求4所述的一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中得到3-氨基-1-(4，4’-二甲氧三苯甲基)-1，-2-丙乙醇为无色油状产物。
7.根据权利要求4所述的一种聚苯乙烯基质核酸固相有机合成载体的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的混合溶液为5mL吡啶、0.8mLN-甲基咪唑和4.2mL四氢呋喃的混合溶液。
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| WO2020118655A1 (zh) * | 2018-12-14 | 2020-06-18 | 深圳华大生命科学研究院 | 核酸合成装置和纯化装置、其用途及核酸合成方法和纯化方法 |
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- 2017-08-28 CN CN201710747156.XA patent/CN107383246A/zh active Pending
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