CN102060699B - 用于固相合成核酸的接头和载体 - Google Patents

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Abstract

用于固相合成核酸的接头和载体.提供了通用接头，其能够合成在3’末端具有磷酸基团的核酸，携带该接头的通用载体，和利用该通用载体的核酸合成方法。提供了一种用于固相合成核酸的接头，其含有通过下式至少一种表示的化合物，其中每个符号是如在说明书中定义的。

Description

用于固相合成核酸的接头和载体
技术领域
本发明涉及用于固相合成核酸的接头，携带该接头的用于固相合成的载体和利用该载体的核酸制备方法。
背景技术
对于化学合成核酸例如DNA、RNA等等，广泛采用利用亚磷酰胺法的固相合成工艺。在固相亚磷酰胺法中，通常通过以下步骤合成核酸。
首先，将待合成核酸3’末端的核苷通过3’-OH基团与切割接头(例如琥珀酰基团)形成酯键，以便首先在用于固相合成的载体上携带核苷(核苷接头)。然后，将携带核苷接头的用于固相合成的载体置于反应柱中，然后将反应柱设置在自动化核酸合成仪上。
其后，根据自动化核酸合成仪的合成计划通常在反应柱中进行包括以下步骤的合成反应：
(1)用酸例如三氯乙酸/二氯甲烷溶液等等对带保护基团的核苷的5’-OH基团进行脱保护的步骤；
(2)用脱保护的5’-OH基团在存在活化剂(四唑等等)时偶联核苷亚磷酰胺(核酸单体)的步骤；
(3)用乙酸酐等等为未反应的5’-OH基团加帽的步骤；和
(4)用含水碘等等氧化亚磷酸盐的步骤。
通过重复合成循环，进行从3’末端至5’末端方向的寡核苷酸延伸反应，合成具有期望序列的核酸。
最后，用氨水、甲胺溶液等等水解切割接头，以从用于固相合成的载体切割合成的核酸(非专利文献1)。
如上述，当施行以上提及的合成时，必需首先经由切割接头在用于固相合成的载体上携带3’末端的核苷(原材料)。而且，3’末端会随着期望合成的核酸的序列变化。在DNA寡核苷酸的情况下，dA，dG，dC，dT这四种是必要的，在RNA的情况下，rA，rG，rC，rU这四种是必要的。为了合成经修饰的寡核苷酸，先前携带经修饰的核苷的用于固相合成的载体是必要的，这使得工艺变得复杂。
为了解决上述问题，已经开发了用于固相合成的携带通用接头的载体(通用载体)作为接头，以连接固相载体和原材料，替代目前为止通常使用的核苷-琥珀酰接头等等。利用通用载体，与期望合成的核酸的3’末端核酸的核苷或者核苷酸的种类无关，工艺包括在与常规自动化核酸合成相同的步骤中使3’末端的核苷亚磷酰胺反应以启动合成，和在合成期望的核酸后，通过与常规方法类似的方法从用于固相合成的载体切割核酸。如上所述制备携带不同核苷-接头的用于固相合成的载体不是必需的。
曾经提出了一些通用载体，其为期望待合成的核酸的3’末端提供-OH基团(专利文献1-4和非专利文献2和3)。这些通用载体的结构具有两个相邻碳原子，一个碳原子与-OH基团键合成为核酸合成的起点，另一个碳原子与基团连接(例如-OH基团，-NH2基团，-SH基团)在除去保护基团后成为亲核基团。当在核酸合成后通过氨水等等切割核酸时，这些亲核基团的保护基团也被解离以攻击3’末端磷，磷酸基团被从3’末端切割以形成环磷酸。全部都用于合成在3’末端具有-OH基团的核酸。
另外，已经提出一些通用载体用于在期望合成的核酸的5’末端或者3’末端提供磷酸基团。例如专利文献5和非专利文献4公开了一种通用的接头能够合成在5’末端具有磷酸基团的核酸，一种携带该通用接头的通用载体，和一种利用该通用载体合成核酸的方法。
因为在5’末端或者3’末端具有磷酸基团的核酸可以广泛地用于多种生物化学领域例如核酸的化学键反应，利用末端磷酸基团的核酸修饰，核酸的结构研究等等，它是非常有用的。鉴于这样的情况，期望一种通用接头能够合成在5’末端或者3’末端具有磷酸基团的核酸和携带该接头的通用载体。
[现有技术]
[专利文献]
专利文献1：US-B-5681945
专利文献2：US-B-6653468
专利文献3：WO2005/049621
专利文献4：US-A-2005/0182241
专利文献5：US-B-5959090
[非专利文献]
非专利文献1：Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry(2000)
非专利文献2：Bio Techniques，22，752-756(1997)
非专利文献3：Tetrahedron，57，4977-4986(2001)
非专利文献4：Tetrahedron Letters，27：4705-4708(1986)
发明内容
本发明解决的问题
本发明目的是提供一种通用接头能够合成在3’末端具有磷酸基团的核酸，一种携带该接头的通用载体，和利用该通用载体合成核酸的方法。
特别的，本发明目的是提供一种用于固相合成的载体，其能够通用地以高纯度合成在3’末端具有磷酸基团的核酸，其不需要预先携带经修饰的核苷的用于固相合成的载体，即使在合成经修饰的寡核苷酸时。
解决问题的手段
因此，本发明提供以下。
[1]一种用于固相合成核酸的接头，其包含由下式的至少一种表示的化合物
其中
X是由酸解离的羟基保护基团，
L是由碱切割的连接部分，和
R1、R2、R3和R4各自独立地是氢原子，碳数目为1～6的烷基基团，碳数目为1～6的烷氧基基团，碳数目为1～6的烷基氨基基团，或者卤素原子。
[2]根据上述[1]所述的用于固相合成核酸的接头，其中L是琥珀酰基团。
[3]根据上述[1]或[2]所述的用于固相合成核酸的接头，其中X是二甲氧基三苯甲基基团。
[4]一种用于固相合成核酸的载体，其包含由下式的至少一种显示的结构
其中
X是由酸解离的羟基保护基团，
L是由碱切割的连接部分，和
R1、R2、R3和R4各自独立地是氢原子、碳数目为1～6的烷基基团，碳数目为1～6的烷氧基基团，碳数目为1～6的烷基氨基基团，或者卤素原子。
[5]根据上述[4]所述的用于固相合成核酸的载体，其中L是琥珀酰基团。
[6]根据上述[4]或[5]所述的用于固相合成核酸的载体，其中X是二甲氧基三苯甲基基团。
[7]根据上述[4]～[6]任一项所述的用于固相合成核酸的载体，其中Sp是包括多孔合成聚合物颗粒或者多孔玻璃颗粒的固相载体。
[8]一种制备核酸的方法，其包括在根据上述[4]～[7]任一项所述的用于固相合成核酸的载体上进行核酸合成反应的步骤。
[9]上述[8]的制备方法，其中所述核酸合成反应是通过固相亚磷酰胺方法进行的。
发明效果
本发明用于固相合成核酸的接头是一种通用接头，本发明携带该接头的用于核酸合成的载体是一种通用载体。本发明的携带该接头的用于核酸合成的载体不需要携带期望合成的核酸的3’末端核苷酸的用于固相合成的载体，并且可以以高纯度合成在3’末端中引入具有磷酸基团的核酸。它不需要预先携带具有经修饰的核苷的用于固相合成的载体，即使在合成经修饰的寡核苷酸时，并且能够以高纯度合成在3’末端中引入磷酸基团的核酸。
因此，本发明的用于核酸合成的载体优选被用来自动合成在3’末端具有磷酸基团的核酸。而且，利用本发明的用于核酸合成的载体的核酸制备方法不需要单独引入磷酸基团到合成核酸的3’末端中，这与常规方法不同。
附图说明
图1显示在实施例2(A)、比较实施例1(B)、实施例3(C)和比较实施例2(D)中获得的DNA寡核苷酸溶液的HPLC图表。
图2显示在实施例5(A)、比较实施例3(B)、实施例6(C)和比较实施例4(D)中获得的DNA寡核苷酸溶液的HPLC图表。
具体实施方式
此处所用术语“核酸”指的是一种直链化合物(寡核苷酸)，其中核苷酸经由磷酸二酯键连接，并且被认为包括DNA，RNA等。所述核酸可以为单链或双链。因为它允许利用核酸合成仪的有效合成，核酸优选是单链的。在本说明书中“核酸不仅包括含有嘌呤碱基例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)等等和嘧啶碱基例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)等等的寡核苷酸，而且还包括含有其它经修饰的杂环碱基的经修饰的寡核苷酸。
所述核酸的核苷酸长度并无特别限定，所述核酸优选为2-200核苷酸长度。若核酸过长，则所得核酸的产率和纯度降低。
在本说明书中“接头”是指一种分子，那经由共价键连接两个物质，接头连接固相载体和核酸。
本发明的用于固相合成核酸的接头是由下式表示的。
其中：
X是通过酸解离的羟基保护基团。保护基团的实例包括三苯甲基基团(Tr)、单甲氧基三苯甲基基团(MMTr)、二甲氧基三苯甲基基团(DMTr)等等。这些保护基团可以利用质子酸例如三氯乙酸、二氯乙酸等等的二氯甲烷或者甲苯溶液解离。因为用酸脱保护是容易的，因此最优选使用DMTr。
L是通过碱切割的连接部分(linkage moiety)，它的实例包括但不限于琥珀酰基团(琥珀酰接头)、Q接头(Pon et al.，Nucleic Acids Res.，27，1531(1999))等等。优选使用琥珀酰接头。这些连接部分可以被容易地通过用氨水、氨水/甲胺混合物等等水解来切割，寡核苷酸是在完成自动合成之后从用于固相合成的载体切割的。也就是说，在X位置制造具有合成的寡核苷酸键的分子时，认为L从本发明的用于固相合成核酸的接头切割，所述接头是通过上述提及的化学式显示的，同时由于在邻位或者对位产生的“O-”亲核反应，从合成寡核苷酸释放本发明的接头，从而获得在3’末端具有磷酸基团的合成寡核苷酸。随后描述此类本发明通用载体的反应。
R1，R2，R3和R4各自独立地是氢原子、碳数目为1～6的烷基、碳数目为1～6的烷氧基、碳数目为1～6的烷基氨基基团或者卤素原子。碳数目为1～6的烷基的实例包括甲基基团、乙基基团、正丙基基团、异丙基基团、正丁基基团、异丁基基团、仲丁基基团、叔丁基基团、正戊基基团、异戊基基团、仲戊基基团、叔戊基基团、己基基团等等。其中，甲基基团或者乙基基团是优选的。碳数目为1～6的烷氧基包括甲氧基基团、乙氧基基团、丙氧基基团、异丙氧基基团、丁氧基基团、戊氧基基团、己氧基基团等等。其中，甲氧基是优选的。碳数目为1～6的烷基氨基基团的实例包括甲基氨基基团、二甲基氨基基团、乙基氨基基团、二乙基氨基基团、丙基氨基基团、二丙基氨基基团、异丙基氨基基团、二异丙基氨基基团等等。其中，二甲基氨基基团是优选的。另外，卤素原子的实例包括氯、氟、溴、碘等等。其中，氯或者氟是优选的。
本发明的用于固相合成核酸的固相载体携带上述提及的本发明的并且通过以下化学式表示的用于固相合成核酸的接头
其中X和L，和R1、R2、R3和R4为上述所定义的。
Sp是固相载体。固相载体不受特别限定只要过量使用的试剂可以被容易地通过洗涤除去，例如玻璃多孔载体、多孔合成聚合物载体例如聚乙烯载体、丙烯酰胺载体等等，等等可以被提及。
在本发明的优选实施方案中，在上述提及的式中，Sp是玻璃多孔载体。这里，“玻璃多孔载体”是指一种多孔载体，其含有玻璃作为构成的成分，它的实例包括但不限于粒状形状的多孔玻璃颗粒(CPG)等等。更具体地说，作为上述CPG，具有长链氨基烷基间隔的CPG固相载体(LCAA-CPG固相载体)是优选使用的，和进一步为了合成长链核苷酸，使用具有优选20-400nm更优选50-200nm最优选100nm的CPG孔的CPG。
在本发明的另一个优选实施方案中，在上述提及的式中，Sp是聚乙烯载体。这里“聚乙烯载体”是一种固相载体，其由含有下列结构单元的共聚物组成：通过以下式表示的(A)：
和/或它的取代的衍生物作为结构单元。结构单元(a)的取代的衍生物的实例包括一种化合物，其中一个或者更多个氢原子包含于结构单元(a)中(包括苯环的氢原子)，其被下列取代：碳数目为1～6的烷基(例如，甲基基团、乙基基团、正丙基基团、异丙基基团、正丁基基团、异丁基基团、仲丁基基团、叔丁基基团、正戊基基团、异戊基基团、仲戊基基团、叔戊基基团)、卤素原子、氨基基团、羟基、羧基、砜基基团、氰基基团、甲氧基基团、硝基基团、乙烯基基团等等。取代基优选是氨基基团或者羟基基团。取代基的位置不受特别限定，优选是相对于苯环上主链的对位。结构单元(A)的优选取代衍生物是在下式中显示的羟基苯乙烯结构单元(B)。
相对于构成聚乙烯载体的共聚物中包含的结构单位总数，结构单元(A)和/或它的取代衍生物的量不受特别限定，通常是50至100重量％，优选60至100重量％。
可与上述提及结构单元(A)共聚的单体化合物的具体的实例包括但不限于苯乙烯；核心烷基取代的苯乙烯例如邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三甲基苯乙烯、和对叔丁基苯乙烯等等；α-烷基取代的苯乙烯例如α-甲基苯乙烯、α-甲基-对甲基苯乙烯等等；核心卤代苯乙烯例如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙烯、溴苯乙烯等等；烷基卤苯乙烯例如氯甲基苯乙烯、氟甲基苯乙烯等等；羟基苯乙烯；羟甲基苯乙烯；苯甲酸乙酯；苯乙烯磺酸钠；氰基苯乙烯；甲氧基苯乙烯；乙氧基苯乙烯；丁氧基苯乙烯；硝基苯乙烯酰氧基苯乙烯例如乙酰氧基苯乙烯、苯甲酰氧基等等，等等。进一步实例包括但不限于(甲基)丙烯酸烷酯单体例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯等等，乙烯基氰单体例如丙烯腈、甲基丙烯腈、乙基丙烯腈等等，等等。
在本发明的另一个实施方案中，在上述提及的式中，Sp可以是固相载体，由下列构成：苯乙烯-羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物颗粒(JP-A-2005-097545，JP-A-2005-325272和JP-A-2006-342245)或苯乙烯-(甲基)丙烯腈-羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(JP-A-2008-074979)，除了上述提及的结构单位(A)和(B)外，具有由以下式表示的二乙烯基苯结构单元(C)：
等等。另外，上述提及二乙烯基苯结构单元(C)中的一个或者更多个氢原子包括苯环的氢原子)可以被下列取代：碳数目为1～6的烷基(例如甲基基团、乙基基团、正丙基基团、异丙基基团、正丁基基团、异丁基基团、仲丁基基团、叔丁基基团、正戊基基团、异戊基基团、仲戊基基团叔戊基基团)、卤素原子、氨基基团、羟基基团、羧基基团、砜基基团、氰基基团、甲氧基基团、硝基基团、乙烯基基团等等。优选取代基是氨基基团或者羟基基团。
在上述提及的式中，当Sp是包含上述苯乙烯-(甲基)丙烯腈-羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的固相载体时，(甲基)丙烯腈的结构单元可以含有丙烯腈和甲基丙烯腈的每一个或者两者。当相对于苯乙烯-(甲基)丙烯腈羟基苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的结构单元总数，(甲基)丙烯腈的结构单元的量过高或者过低时，膨胀率会随着有机溶剂的种类而变化。因此，该量优选为2-11毫摩尔/g。
在本发明的另一个优选实施方案中，在上述提及的式中，Sp是丙烯酰胺载体。更具体地说，在上述提及的式中，Sp可以是用于固相合成的载体，其除以上提及结构单位(A)和(C)之外，还含有进一步含有(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的芳香单乙烯化合物-二乙烯化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物。
在上述提及的式中，当Sp是包含上述芳香单乙烯化合物-二乙烯化合物-(甲基)丙烯酰胺衍生物共聚物的固相载体时，上述芳香单乙烯化合物不受特别限定。例如苯乙烯；核心烷基取代的苯乙烯例如邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2，4-二甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、三甲基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯；α-烷基取代的苯乙烯例如α-甲基苯乙烯、α-甲基-对甲基苯乙烯等等；核心卤代苯乙烯例如氯苯乙烯、二氯苯乙烯、氟苯乙烯、五氟苯乙烯、溴苯乙烯等等；烷基卤苯乙烯例如氯甲基苯乙烯、氟甲基苯乙烯等等；羟基苯乙烯；羟甲基苯乙烯；苯甲酸乙酯；苯乙烯磺酸钠；氰基苯乙烯；甲氧基苯乙烯；乙氧基苯乙烯；丁氧基苯乙烯；硝基苯乙烯；酰氧基苯乙烯例如乙酰氧基苯乙烯、苯甲酰氧基等等，等等可以被提及，优选苯乙烯。
上述(甲基)丙烯酰胺衍生物的实例包括但不限于-烷基(甲基)丙烯酰胺；N，N-二烷基(甲基)丙烯酰胺N-烷氧基(甲基)丙烯酰胺；2-(甲基)丙烯酰胺链烷磺酸；N-烷醇(甲基)丙烯酰胺例如N-亚甲醇(甲基)丙烯酰胺等等；丙烯酰胺；甲基丙烯酰胺；二丙酮丙烯酰胺；N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺；丙烯酰吗啉；N-苯氧甲基(甲基)丙烯酰胺等等。
另外，包含于上述N烷基(甲基)丙烯酰胺的烷基通常是碳数目为1～6的直链或者支链烷基，优选1-3。N-烷基(甲基)丙烯酰胺的实例包括N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-正丙基(甲基)丙烯酰胺、N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、N-叔丁基(甲基)丙烯酰胺、和N-月桂基(甲基)丙烯酰胺等等。
包含于上述N，N-二烷基(甲基)丙烯酰胺的两个烷基每一个通常为碳数目为1～6的直链或者支链烷基，优选1-3。N，N-二烷基(甲基)丙烯酰胺的实例包括N，N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二异丙基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二叔丁基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二月桂基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二叔辛基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二月桂基(甲基)丙烯酰胺、N，N-双环己基(甲基)丙烯酰胺等等。
包含于上述N-烷氧基(甲基)丙烯酰胺的烷氧基通常是碳数目为1～6的直链或者支链烷氧基，优选1-3。N-烷氧基(甲基)丙烯酰胺的实例包括N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-丙氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-丁氧基甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基乙基(甲基)丙烯酰胺、N-甲氧基丙基(甲基)丙烯酰胺、N-乙氧基丙基(甲基)丙烯酰胺、N-异丙氧乙基等等。
包含于上述2-(甲基)丙烯酰胺烷基磺酸中的链烷通常是碳数目为1～6的直链或者支链烷，优选1-3。2-(甲基)丙烯酰胺烷基磺酸的实例包括2-丙烯酰胺丙磺酸、2-丙烯酰胺-正丁烷磺酸、2-丙烯酰胺-正丁烷磺酸、2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸等等。
上述(甲基)丙烯酰胺衍生物优选是二丙酮丙烯酰胺、N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、N-甲氧基甲基(甲基)丙烯酰胺或者N，N-二甲基(甲基)丙烯酰胺。
来源于(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的典型结构单元包括以下结构单元。
在上述提及的式中，当Sp是丙烯酰胺固相载体并且来源于(甲基)丙烯酰胺衍生物单体的结构单元含量过小，则不能获得避免核酸合成量减少和合成纯度下降的影响。另一方面，当它过高，难以形成多孔树脂珠。因此，优选0.3-4毫摩尔/g，更优选0.4-3.5毫摩尔/g，进一步优选0.6-3毫摩尔/g。
用作本发明用于固相合成的载体的多孔颗粒优选是具有有助于核酸合成的官能团的多孔颗粒。“有助于核酸合成的官能团”是指官能团，其能够成为核酸合成的起点和能够被添加接头。特别地，氨基、羟基等等可以被提及。
有助于核酸合成的官能团含量不受特别限定。当官能团含量过小，则核酸产量减少，如果过高，则获得核酸的纯度降低。因此，优选10-2000微摩尔/g，更优选50-1000微摩尔/g，进一步优选100-800微摩尔/g。
当有助于核酸合成的官能团是羟基，则通过根据JIS K0070的滴定法测量本发明多孔颗粒羟基的量。具体地，通过添加吡啶至25g乙酸酐达到总量100毫升制备乙酰化试剂。将以上提及乙酰化试剂(0.5毫升)、吡啶(4.5毫升)和样品(大约0.5g)置于烧瓶中，并在95-100摄氏度下加热混合物2小时，以乙酰化羟基。然后，添加蒸馏水(1毫升)入烧瓶，将混合物受热以分解未被乙酰化消耗的乙酸酐为醋酸。通过酸碱滴定法测量醋酸的量，利用0.5摩尔/L的氢氧化钾含水溶液。分开的，以同样的方式执行空白测量，但是不添加样品。因为上述提及两个测量在数量方面的差异是样品羟基乙酰化消耗的乙酸酐的摩尔数(即样品羟基的量)，因此该数值除以样品重量，得到每1克样品的羟基的量。
与固相载体结合的接头的量不受特别限定。当接头含量过低，则核酸的产量降低。当接头含量过高，则获得的核酸的纯度趋向降低，获得核酸的核苷酸数量趋向降低。因此，优选在20-800微摩尔/g的范围内，更优选25-500微摩尔/g。
上述多孔固相载体的形状不受特别限定，可以是任何形状的平板、颗粒、纤维等等。因为合成反应容器的充填效率可以被增强，反应容器不容易破坏，因而优选具有颗粒形状的多孔合成聚合物。说明书中的术语“颗粒”不意味着精确球状的，而是意味着具有任何恒定的形状(例如大致球状例如椭圆球状的、多边形式的、圆柱形、无定形例如konpeito形式等等)。虽然多孔合成聚合物颗粒的一个颗粒的尺寸(体积)不受特别限定，当通过激光衍射(散射类型)测量多孔颗粒时得到的平均粒度小于1微米时，当将其包装在柱中时会出现不方便，在使用时反压力变成过高或者溶液输送速度下降。另一方面，当平均粒度大于1000微米时，载体颗粒之间的空隙变大，在具有预定体积的柱中有效包装载体颗粒变得困难。因此，优选1-1000微米，更优选5-500微米，进一步优选10-200微米。
虽然通过多点BET法测量的上述合成聚合物颗粒的比表面积不受特别限定，但当比表面积低于0.1平方米/g，则在有机溶剂中的膨胀率变低，合成反应趋向难以发生。另一方面，如果大于500平方米/g，则小孔隙尺寸变小，不能容易发生期望的反应，或者核苷酸长度倾向于低于期望的数目。尺寸变小，合成反应倾向于难以发生。因此，比表面积优选是0.1-500平方米/g，更优选10-300平方米/g，进一步优选50-200平方米/g。
另外，通过水银渗入技术测量的上述合成聚合物颗粒的平均小孔隙尺寸不受特别限定。然而，当孔径过小，则合成反应的区域变小，不能容易发生期望的反应，或者核苷酸长度倾向于低于期望的数目。另一方面，当孔径过大，则作为反应区域的聚合体颗粒表面上的羟基和参与反应的物质之间的接触频率会降低以降低产量。因此，平均小孔隙尺寸优选是1-200nm，更优选5-100nm，更优选20-70nm。
在本发明固相载体的优选实施方案中，在上述提及的式中，Sp是低膨胀交联聚乙烯颗粒，其可以作为NittoPhase(注册商标)(NITTODENKO Co.，Ltd.制造)市售可得。优选使用利用NittoPhase(注册商标)的固相核酸合成方法，因为它显示出小的由于杂质的峰面积，并且保证了高产率和在从实验室规模和大规模合成系统的宽范围规模中的高纯度。
本发明的用于固相合成核酸的载体的制备方法
虽然本发明用于固相合成核酸的载体的制备方法不受特别限定，例如载体可以通过以下方法制备。
在邻位或者对位具有羟基和羟甲基基团的芳环化合物(例如2-羟苯基醇，4-羟苯基醇)与4，4’-二甲氧基三苯甲基氯化物等等反应以保护羟甲基基团。然后，将该化合物与琥珀酸酐连同三乙胺反应以将琥珀酰接头部分连接至羟基，然后将其与具有-OH基团或者-NH2基团的固相载体结合，得到本发明用于固相合成核酸的载体。
利用本发明用于固相合成核酸的载体合成核酸的方法
为了利用本发明的用于固相合成核酸的载体进行核酸合成，使用核酸自动合成仪，并且可以使用目前已知的各种合成法。在本说明书中，“核酸合成反应”特别地意思是构成核酸的核苷酸的延伸反应。因此，核苷酸被连续地结合到核苷，核苷酸或者寡核苷酸结合到固相载体，借此获得延伸的寡核苷酸。可以通过H-亚磷酸酯方法、磷酸酯方法、固相亚磷酰胺法等等执行核酸合成反应。其中，由于合成核酸的高容量和获得核酸的高纯度，固相亚磷酰胺法是优选的。
通过固相亚磷酰胺法的核酸合成反应的优选实施方案包括例如由下列各步骤组成的方法：
(a)将本发明的用于固相合成核酸的载体置于核酸自动合成仪反应柱中的步骤；
(b酸例如二氯乙酸溶液等等在反应柱中流动以除去羟甲基保护基团和洗涤载体的步骤；
(c)连续进行下列各个步骤的步骤：偶联以连接对应3’末端的核苷亚磷酰胺(通过四唑激活)到上述羟甲基基团，对未反应的羟基加帽，和氧化亚磷酸盐，重复一系列步骤直到获得目的序列；和
(d)在通过设备完成合成步骤后，将用于固相合成核酸的载体浸渍以切割连接部分，从而获得目的核酸。
作为上述制备方法的结果，发生以下式显示的化学反应，制备在3’末端具有磷酸基团的核酸。具体的，在利用用于固相合成核酸的载体(A)的核酸合成方法中(其显示于实施例1中作为本发明的优选实施方案)，发生以下式显示的化学反应，并且制备在3’末端具有磷酸基团的核酸。
另外，在利用用于固相合成核酸的载体(B)的核酸合成方法中(其显示于实施例4中作为本发明的优选实施方案)，发生以下式显示的化学反应，并且制备在3’末端具有磷酸基团的核酸。
用于本发明核酸制备方法的活化剂的实例包括但不限于1H-四唑、4，5-二氰基咪唑、5-乙硫基-1H-四唑、苯并咪唑 三氟甲基磺酸盐(BIT)、N-苯基苯并咪唑 三氟甲基磺酸盐、咪唑 三氟甲基磺酸盐(IMT)、N-PhIMP、5-硝基苯并咪唑 三氟甲基磺酸盐、三唑 三氟甲基磺酸盐、1-羟基苯并三唑(HOBT)、N-(氰基甲基)吡咯烷 四氟化碳等等。
实施例
在下文中通过参考实施例更详细地说明本发明，这些实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
用于核酸固相合成的载体(A)的制备
将2-羟基苯基醇(TOKYO CHEMICAL INDSUTRY Co.，Ltd.制造)溶解在吡啶中，添加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯，并将混合物在室温下反应22小时以通过二甲氧基三苯甲基基团(DMTr)保护羟基。其中羟甲基基团被DMTr保护的化合物的收率是41％。将得到的产物溶解在二氯甲烷中，添加琥珀酸酐和三乙胺，并将混合物在室温下反应29小时以得到其中琥珀酰基团的连接部分被结合的化合物。然后，将具有羟基的多孔聚乙烯固相载体(NittoPhase，NITTO DENKO Co.，Ltd.制造(注册商标))分散在乙腈中，并添加上述化合物、HBTU和N，N-二异丙基乙基胺。混合物在28摄氏度下反应23小时，以在固相载体上携带上述化合物。连续的，添加乙酸酐、N-甲基咪唑、吡啶、4-二甲基氨基吡啶和乙腈，将混合物在28摄氏度反应25小时，以为未反应的羟基加帽得到本发明的用于核酸合成的固相载体(A)，其是由下式表示的：
本发明的接头与如上述获得固相载体的结合量是32微摩尔/g。
实施例2
利用用于固相合成核酸的载体(A)合成5-mer胸腺密啶核苷
将在实施例1中制备的本发明用于核酸合成的固相载体(A)(31mg)包装在反应柱中，通过DMT-off(除去5’末端保护基团的方法)利用自动化DNA/RNA合成仪ABI 3400(Applied Biosystems制造)合成5-mer胸腺密啶核苷(5’-TTTTT-3’)(合成规模1微摩尔)。合成后，将结合DNA寡核苷酸的固相载体浸于30％氨水/乙醇(2∶1)中，在55摄氏度混合溶液14小时，以从固相载体切割DNA寡核苷酸。
实施例3
利用用于核酸固相合成的载体(A)合成20-mer DNA寡核苷酸
以与实施例2中相同的方法，通过DMT-off(合成规模1微摩尔)利用本发明的用于核酸合成的固相载体(A)合成20-mer DNA寡核苷酸(5’-ATA CCG ATT AAG CGA AGT TT-3’：SEQ ID NO：1)。合成后，从固相载体切割DNA寡核苷酸。
比较实施例1
利用结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的用于固相合成的载体合成5-mer 胸腺密啶核苷
以与实施例1中相同的方法，将可切割的接头DMT-dT-3’-琥珀酸酯(Beijing OM Chemicals制造)与市场上可买到的固相载体NittoPhase(注册商标)(NITTO DENKO Co.，Ltd.制造)结合。化合物与固相载体的结合量为38微摩尔/g。将固相载体(27mg)包装在反应柱中，以与实施例1中相同的方法，通过DMT-off合成5-mer DNA寡核苷酸(5’-TTTTT-3’)(合成规模1微摩尔)。合成后，从固相载体切割DNA寡核苷酸。
比较实施例2
利用结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的用于固相合成的载体合成20-mer DNA寡核苷酸
利用在比较实施例1制备的结合切割接头DMT-dT-3’-琥珀酸酯的固相合成载体通过DMT-off合成20-mer DNA寡核苷酸(5’-ATA CCGATT AAG CGA AGT TT-3’：SEQ ID NO：1)(合成规模1微摩尔)。合成后，从固相载体切割DNA寡核苷酸。
试验实施例1
通过高效液相色谱法(HPLC)测量在实施例2和3以及比较实施例1和2中获得的DNA寡核苷酸溶液(测量条件：柱；Clarity 3微米 Oligo-RP50×4.6mm(Phenomenex制造)，UV检测；260nm，缓冲液A；100mM TEAA(pH 7.0)，Buffer B；乙腈)。图1A-D显示每个HPLC图表。
另外，将在实施例2和3以及比较实施例1和2获得的溶液进行高效液相色谱质谱法LC-MS分析)(测量条件，柱；Clarity 3微米 Oligo-RP50×4.6mm(Phenomenex制造)，UV检测；254nm，缓冲液A：100mMTEAA(pH 7.0)，缓冲液B；乙腈)。
结果，在实施例2中制备的DNA寡核苷酸的主峰被证实是T-5-mers，其在3’末端具有磷酸基团(分子量(测量值)：1539)。而且，在实施例3中制备的核酸的主峰被证实是20-mer寡核苷酸，其在3’末端具有磷酸基团(分子量(测量值)；6219)。另一方面，在比较实施例1和2中制备的DNA寡核苷酸的主峰被证实是分别是T-5-mers，其具有3’末端-OH基团(分子量(测量值)；1459)，和20-mer DNA寡核苷酸，其具有3’末端-OH基团(分子量(测量值)；6139)。
实施例4
用于核酸固相合成的载体(B)的制备
将4-羟基苯基醇(TOKYO CHEMICAL INDSUTRY Co.，Ltd.制造)溶解在吡啶中，添加4，4’-二甲氧基三苯甲基氯，并将混合物在室温下反应14小时以通过二甲氧基三苯甲基基团(DMTr)保护羟基。其中羟甲基基团被DMTr保护的化合物的收率是93％。将得到的产物溶解在二氯甲烷中，添加琥珀酸酐和三乙胺，并且混合物在室温下反应31小时，以得到琥珀酰基团的连接部分被结合的化合物(收率80％)。然后，将具有羟基的交联聚乙烯固相载体的NittoPhase(注册商标)(NITTO DENKOCo.，Ltd.制造)，分散在乙腈中，添加上述化合物、HBTU和N，N-二异丙基乙基胺，并且混合物在28摄氏度下反应23小时，以在固相载体上携带上述化合物。然后，添加乙酸酐、N-甲基咪唑、吡啶、4-二甲基氨基吡啶和乙腈，并且反应物在28摄氏度下反应23小时，以为未反应的羟基加帽，从而得到本发明用于核酸合成的固相载体(B)，其是由下式表示的：
本发明的接头与如上述获得固相载体的结合量是29微摩尔/g。
实施例5
利用用于固相合成核酸的载体(B)合成5-mer胸腺密啶核苷
将在实施例1中制备的本发明用于核酸合成的固相载体(B)(34mg)包装在反应柱中，通过DMT-on(不除去5’末端保护基团的方法)利用自动化DNA/RNA合成仪ABI 3400(Applied Biosystems制造)合成5-mer胸腺密啶核苷(5’-TTTTT-3’)(合成规模1微摩尔)。合成后，将结合DNA寡核苷酸的固相载体浸于30％氨水/乙醇(1∶1)中，在55摄氏度混合溶液15小时，以从固相载体切割DNA寡核苷酸。
实施例6
利用用于核酸固相合成的载体(B)合成20-mer DNA寡核苷酸
以与实施例5中相同的方法，通过DMT-on(合成规模1微摩尔)利用本发明的用于核酸合成的固相载体(B)合成20-mer DNA寡核苷酸(5’-ATA CCG ATT AAG CGA AGT TT-3’：SEQ ID NO：1)。合成后，从固相载体切割DNA寡核苷酸。
比较实施例3
利用结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的用于固相合成的载体合成5-mer 胸腺密啶核苷
将在比较实施例1中制备的结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的固相载体(25mg)包装在反应柱中，并且以与实施例5中相同的方法通过DMT-on(合成规模1微摩尔)合成DNA寡核苷酸5-mer胸腺密啶核苷(5’-TTTTT-3’)。合成后，从固相载体切割DNA寡核苷酸。
比较实施例4
利用结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的用于固相合成的载体合成20-mer DNA寡核苷酸
将在比较实施例1中制备的结合DMT-dT-3’-琥珀酸酯的固相载体(25mg)包装在反应柱中，并且以与实施例6中相同的方法，通过DMT-on(合成规模1微摩尔)合成20-mer DNA寡核苷酸(5’-ATA CCG ATTAAG CGA AGT TT-3’：SEQ ID NO：1)。合成后，从固相载体切割DNA寡核苷酸。
试验实施例2
将在实施例5和6以及比较实施例3和4中获得的DNA寡核苷酸溶液通过HPLC进行测量。测量条件为柱；XBridge OST C18 2.5微米50×4.6mm(Waters制造)，UV检测；260，缓冲液A；100mMHFIP/7mMTEA/水(pH 8.0)，缓冲液B；甲醇。图2A-D显示每个HPLC图表。
另外，将在实施例5和6以及比较实施例3和4中获得的溶液进行LC-MS分析(测量条件为XBridge OST C18 2.5微米50×4.6mm(Waters制造)，UV检测；254nm，缓冲液A；100mM HFIP/7mMTEA/水(pH 8.0)，缓冲液B；甲醇)。
结果，在实施例5中制备核酸的主峰被证实是T-5-mers，其在3’末端具有磷酸基团(分子量(测量值)：1840)。在实施例6中制备的DNA寡核苷酸的主峰被证实是20-mer寡核苷酸，其在3’末端具有磷酸基团(分子量(测量值)；6521)。
另一方面，在比较实施例3和4中制备的DNA寡核苷酸的主峰被证实是分别是T-5-mers，其具有3’末端-OH基团(分子量(测量值)；1760)，和20-mer DNA寡核苷酸，其具有3’末端-OH基团(分子量(测量值)；6441)。
表1 总结现实在试验实施例1和2中获得的数据
工业实用性
随着近年来核酸药物产品的开发，已经期望开发更有效和更实用的方法用于合成核酸。利用本发明的用于核酸合成的固相载体自动地合成在3’末端具有磷酸基团的核酸可以被广泛地用于核酸的化学连接反应，利用3’磷酸基团修饰核酸，核酸的结构研究等等。
该申请基于在日本提交的专利申请No.2009-242445(提交日期：2009年10月21日)，通过参照将其内容完全并入本文中。
[序列表自由本文]
SEQ ID NO：1 人工合成的寡聚20-mers

Claims (7)

1.一种用于固相合成核酸的接头，其包含由下式的至少一种表示的化合物
其中
X是由酸解离的羟基保护基团，
L是琥珀酰基团，和
R1、R2、R3和R4各自独立地是氢原子，碳数目为1～6的烷基基团，碳数目为1～6的烷氧基基团，碳数目为1～6的烷基氨基基团，或者卤素原子。
2.根据权利要求1所述的用于固相合成核酸的接头，其中X是二甲氧基三苯甲基基团。
3.一种用于固相合成核酸的载体，其包含由下式的至少一种显示的结构
其中
X是由酸解离的羟基保护基团，
L是琥珀酰基团，
Sp是包括-OH基团的固相载体，其中Sp通过该-OH基团键合到L，和
R1、R2、R3和R4各自独立地是氢原子、碳数目为1～6的烷基基团，碳数目为1～6的烷氧基基团，碳数目为1～6的烷基氨基基团，或者卤素原子。
4.根据权利要求3所述的用于固相合成核酸的载体，其中X是二甲氧基三苯甲基基团。
5.根据权利要求3或4所述的用于固相合成核酸的载体，其中Sp是包括多孔合成聚合物颗粒或者多孔玻璃颗粒的固相载体。
6.一种制备核酸的方法，其包括在根据权利要求3～5任一项所述的用于固相合成核酸的载体上进行核酸合成反应的步骤。
7.权利要求6的制备方法，其中所述核酸合成反应是通过固相亚磷酰胺方法进行的。
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