JP2022552193A - 活性が改善された触媒活性ｄｎａ分子の製造方法及び喘息の治療方法におけるその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、触媒活性ＤＮＡ分子中の不純物の量を著しく減少させる、触媒活性ＤＮＡ分子の製造方法、該方法によって得られる触媒活性ＤＮＡ分子及び該触媒活性ＤＮＡ分子を含む医薬組成物、並びにＧＡＴＡ－３関連疾患の予防及び／又は治療のための方法におけるそれらの使用に関する。【選択図】図３

Description

本発明は、触媒活性ＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドの製造方法、当該方法によって得られるオリゴヌクレオチド、そのようなオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、及びＧＡＴＡ－３によって引き起こされる疾患を治療する方法における触媒活性ＤＮＡ又は医薬組成物の使用であって、オリゴヌクレオチドは少量の不純物を含む、製造方法、オリゴヌクレオチド、医薬組成物及び使用に関する。

触媒活性ＤＮＡ（触媒的に活性のあるＤＮＡ）分子は一本鎖の合成ＤＮＡ分子であり、自然界には存在しない。触媒活性ＤＮＡ分子の例は、１９９０年代に開発された新しいクラスのアンチセンス分子を表す、１０－２３ファミリーのＤＮＡザイムである。「１０－２３ファミリー」という用語は、一般的なＤＮＡザイムのモデルを指す（Ｓｏｎｔｏｒｏ＆Ｊｏｙｃｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４（１９９７）４２６２－４２６６）。１０－２３モデルのＤＮＡザイム（「１０－２３ＤＮＡザイム」とも呼ばれる）は、２つの基質結合ドメインが隣接する、１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを持つ（例えば、ＷＯ２００５／０３３３１４）。ＤＮＡザイムの潜在的な利点には、比較的高い安定性と細胞内酵素への依存がないことが含まれる。ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子は、最近、例えば喘息の治療における治療への応用が見出された（例えば、ＥＰ３０９３０２２Ｂ１）。ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子の製造工程は、１）合成、２）切断及び脱保護、及び３）ＤＮＡ分子の下流精製及び分離、の３つの主要な工程ステップで構成されている。

従来技術において選択された合成及び脱保護条件により、上記の製造工程は、不純物として大量の、エトキシアセタール修飾され脱プリン化された種を生成する。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析によって検出された他の工程関連の不純物は、例えば、ロングマーズ（ｌｏｎｇｍｅｒｓ）及び不完全に脱保護された種、すなわち、Ｇ塩基に依然としてイソブチリル（ｉｂｕ）保護基を含むオリゴヌクレオチドである（図２参照）。

これらの不純物のほとんどは、ＤＮＡザイム活性に必要なワトソン・クリック型塩基対に直接的な悪影響を及ぼし、それによって生成物の活性を低下させる可能性がある。加えて、これらの不純物は、最終的に精製された医薬品有効成分（ＡＰＩ）の収量を低下させる。さらに、工程の全体的な生産性が低くなり、結果としてＡＰＩが高価になる。

これらの生産特異的不純物、並びにその後のエトキシアセタール修飾リボースの形成を伴う又は伴わない脱プリンによる核酸塩基の喪失、及び／又は核酸塩基の不完全な脱保護等の触媒活性ＤＮＡ分子の修飾は、触媒活性ＤＮＡ分子の標的ｍＲＮＡへのワトソン・クリック結合を著しく減少させ、その結果、触媒活性ＤＮＡ分子の有効性を大幅に低下させる。触媒活性ＤＮＡ分子の有効性の低下は、副作用とコストのリスクを高める、増加した用量の投与によって相殺されなければならない。

さらに、触媒活性ＤＮＡ分子の修飾及び不純物は、触媒活性ＤＮＡ分子とほぼ同一の物理化学的特性を有し、したがって、触媒活性ＤＮＡ分子の高い損失を伴うクロマトグラフィーによってのみ分離することができる。

したがって、合理的な努力及び合理的なコストで生成される、活性と効率がそれぞれ向上した触媒活性ＤＮＡ分子等のオリゴヌクレオチドの必要性が高い。

本発明は、ａ）支持体上で触媒活性ＤＮＡ分子を合成する工程であって、核酸塩基保護基（例えば、塩基に不安定なアシル基）を含むヌクレオチドが、３’末端から５’末端まで、又は有機プロトン供与性活性剤の混合物を使用して３’末端から５’末端まで順番に組み立てられ、活性剤が例えば、０．２～０．４５Ｍのエチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）若しくは非活性化した（ｄａｃｉｔｉｖｉｔｙ）ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）等のテトラゾール若しくはその誘導体又はそれらの組み合わせ、及びモノマーのビルディングブロックアミダイト（ブロックホスホロアミダイト）である、工程、ｂ）合成が完了した後、３０～４５℃の温度範囲で５～２０時間、触媒活性ＤＮＡ分子を支持体から切断し、かつ、核酸塩基及び／又は骨格保護基を触媒活性ＤＮＡ分子から切断する工程、ｃ）液体クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）及び脱塩によって触媒活性ＤＮＡ分子を精製する工程、及び、ｄ）必要に応じて、凍結乾燥により触媒活性ＤＮＡ分子を単離する工程、を含むか、又は上記の工程からなる、ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子の製造方法を指す。触媒活性ＤＮＡ分子の更なる精製工程又は単離工程等、例えば、工程ｃ）又は工程ｄ）は除外される。活性剤とアミダイトは、例えば、５０：５０～７０：３０の比率に設定される。核酸塩基及び／又は骨格保護基は、例えば、塩基に不安定なアシル基である。

上記の方法における支持体は、例えば、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）又はマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）等の固体支持体である。

例えば、ヌクレオチドは、５’－ヒドロキシル基に４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基、３’－ホスファイト基にβ－シアノエチル（Ｃ－ＮＥｔ）、又はそれらの組み合わせを更に含む。

ＤＮＡザイムは、例えば、配列番号１（５’ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ）を含むｈｇｄ４０である。

本発明はさらに、液体クロマトグラフィーの主な生成物のピークの前後に溶出するすべてのクラスＩＶ不純物等の、すべての不純物の合計に対して０．５重量％～１２重量％の範囲の不純物を含む、本発明の方法によって得られる触媒活性ＤＮＡ分子に関する。触媒活性ＤＮＡ分子は、例えばＧＡＴＡ－３を対象とした、例えばＤＮＡザイムである。

本発明の触媒活性ＤＮＡ分子又は医薬組成物は、例えば、ＧＡＴＡ－３関連疾患に罹患しているヒト患者を予防及び／又は治療する方法において使用される。

本発明の方法によって得られる触媒活性ＤＮＡは一例として、２型喘息、例えば２型重症（ｔｙｐｅ２－ｈｉｇｈ）喘息に苦しむヒト患者を予防及び／又は治療する方法で使用するためのものであり、ヒト患者は、（ｉ）血中好酸球数が３％以上、特に４％以上、より具体的には５％以上であり、及び／又は（ｉｉ）血中好酸球数が３５０×１０^６／Ｌ以上、特に４５０×１０^６／Ｌ以上であり、及び／又は（ｉｉｉ）呼気中一酸化窒素濃度が３５ｐｐｂ又は４０ｐｐｂ以上であることを特徴とする。

さらに、本発明は、本発明の方法によって得られる触媒活性ＤＮＡ分子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

医薬組成物は一例として、２型喘息、例えば２型重症（ｔｙｐｅ２－ｈｉｇｈ）喘息に苦しむヒト患者を予防及び／又は治療する方法で使用するためのものであり、ヒト患者は、（ｉ）血中好酸球数が３％以上、特に４％以上、より具体的には５％以上であり、及び／又は（ｉｉ）血中好酸球数が３５０×１０^６／Ｌ以上、特に４５０×１０^６／Ｌ以上であり、及び／又は（ｉｉｉ）呼気中一酸化窒素濃度が３５ｐｐｂ又は４０ｐｐｂ以上であることを特徴とする。

触媒活性ＤＮＡ分子又は医薬組成物は、例えば、経口、経鼻、静脈内、皮下、局所、直腸、非経口、筋肉内、大槽内、膣内、腹腔内、髄腔内、血管内、局所（粉末、軟膏若しくは点滴薬）、又はスプレー若しくは吸入剤の形で、投与される。

本明細書中で引用又は参照されているすべての文献（「本明細書中で引用されている文献」）、及び本明細書中で引用されている文献中で引用又は参照されているすべての文献は、本明細書又は本明細書に参照により組み込まれる任意の文書に記載される任意の製品の製造業者の指示、説明、製品仕様、及び製品シートとともに、参照により本明細書に組み込まれ、かつ本発明の実施に使用することができる。より具体的には、すべての参照された文献は、個々の文献が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照によって組み込まれる。

ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドの合成スキームを示す。 一般的な固相ホスホロアミダイト合成サイクルを示す。 本発明の方法（Ｘ４８１７９Ｋ１Ｋ２）に従って調製されたＤＮＡザイムと、従来技術の方法に従って調製されたＤＮＡザイムのバッチとのバッチ比較を示す。 従来技術の方法によって調製されたｈｇｄ４０のバッチの不純物の変化を示す。

本発明は、触媒活性ＤＮＡ分子、例えば、ＤＮＡザイム等のオリゴヌクレオチドの生成、例えば、拡張可能な生成のための方法に関する。この方法は、合成工程中に、例えば、アセトニトリル等の乾燥単極性有機溶媒に溶解された、有機プロトン供与性活性剤及びアミダイト等の活性剤の使用を含む。さらに、この方法は、３０℃～４５℃の温度での５～２０時間の脱保護工程を含む。

本発明の大きな利点は、触媒活性ＤＮＡ分子、例えば、著しく減少した不純物を含むＤＮＡザイム等のオリゴヌクレオチドの生成である。本発明の不純物は、例えば、クラスＩＶの不純物である。液体クロマトグラフィーの主生成物のピークの前後に溶出するすべてのクラスＩＶ不純物の合計に対する、クラスＩＶ不純物の合計は１２重量％より小さく、例えば、０．１重量％、０．２重量％、０．３重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％若しくは０．９重量％～４．５重量％、１重量％～４重量％、１．２重量％～３．８重量％、１．４重量％～３．６重量％、１．５重量％～３．５重量％、１．６重量％～３．４重量％、１．７重量％～３．２重量％、１．８重量％～３重量％、２重量％～２．５重量％の範囲、又は最大０．１重量％、０．２重量％、０．３重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、１重量％、１．２重量％、１．５重量％、１．７重量％、１．９重量％、２重量％、２．５重量％、３重量％、３．５重量％、４重量％、若しくは４．５重量％である。

重大なクラスＩＶ不純物は、水素結合によって誘発される、標的分子へのワトソン・クリック結合に重要な官能基を修飾及びブロックする。したがって、そのようなクラスＩＶ不純物の提示された減少は、触媒活性ＤＮＡ分子の増加した標的特異性を直接もたらす。それは、オリゴヌクレオチドの触媒活性の増加を永続させ、その治療用途におけるオリゴヌクレオチドの（潜在的な）投与量の減少をもたらす。さらに、本発明の方法によって得られる触媒活性ＤＮＡ分子は、改善された標的相互作用、例えば、改善された動力学によって特徴付けられるその基質への結合を示す。

オリゴヌクレオチド安全性ワーキンググループ（ＯＳＷＧ）によると、オリゴヌクレオチド治療薬の不純物は４つのクラスに分類される：クラスＩ～ＩＩＩは重大とは見なされず、毒物学的研究で追加の評価を必要としない。クラスＩＶ不純物は、それらの非天然起源のために重要であると定義されており、したがってそれらの毒物学的特性の評価は必要となる。正式な分類を表１に示す。

クラス１の不純物は、親分子の主要代謝物でもある工程関連不純物、すなわち、３’若しくは５’末端での１つのヌクレオチドのエンドヌクレアーゼによる損失、又はコンジュゲート若しくはリンカーの喪失を分類する。これらは主要代謝物と構造的に同一であるため、そのような不純物は、毒性学的研究を通じてデフォルトで認定される。
クラス２の不純物は、核酸中に天然に存在するが、修飾された親化合物を表す構造要素を含む工程関連不純物、すなわち、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのホスホジエステル不純物又は５－メチルシトシンのシトシンへの分解を分類する。そのような構造要素の内因性の存在は、不純物に関連する固有の安全性の懸念を除外する。
クラス３の不純物は、分子配列に基づいて親分子とは異なる工程関連不純物、すなわち、（ｎ－１）、（ｎ－ｘ）、（ｎ＋１）、（ｎ＋ｘ）又はチミンからシトシンへの脱アミノ化を分類する。この特定のクラスの不純物に対する安全性の懸念は、配列の変化又は免疫刺激モチーフの生成による、思いもよらない的外れな効果に限定される。治療的アンチセンス手法では、特定の修飾配列のレベルが低すぎて薬理学的効果を生み出すことができない。
クラス４の不純物は、親分子や天然の核酸には見られない構造要素を持つ工程関連不純物、すなわち、ＣＮＥＴ（アクリロニトリル－Ｔ－塩基の付加物）、脱プリン種、出発物質関連の修飾又はアミノ基転移種（Ｃ－塩基のメチル付加物）を分類する。クラス４の不純物の安全性は、仕様限界が認定しきい値を超えている場合、非臨床毒性試験で評価する必要がある。

様々な不純物のレベルと性質は、ＵＶ検出によるクロマトグラフィー分離と連続した高分解能質量分析によって識別される。識別された各不純物は、製造工程のそれぞれの単位操作に直接関連する。

高純度の治療用オリゴヌクレオチドが不可欠であるため、治療用オリゴヌクレオチドは、重大なクラスＩＶ不純物等の大量の不純物の形成を回避する工程によって製造する必要がある。

以下、本発明の要素についてより詳細に説明する。これらの要素は、特定の実施形態とともに列挙されているが、それらは、追加の実施形態を作成するために、任意の方法及び任意の数で組み合わせることができることを理解されたい。様々に説明された実施例及び実施形態は、本発明を明示的に説明された実施形態のみに限定するように解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に説明された実施形態を任意の数の開示された要素と組み合わせる実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本明細書中で説明されているすべての要素の順列及び組み合わせは、文脈で別段の指示がない限り、本明細書中の説明によって開示されていると見なされるべきである。

本明細書及び特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の定めがない限り、「含む」という言葉、及び「含み」及び「含まれる」等の変形は、記載された要素、整数又は工程又は要素の群、整数又は工程であるが他の要素が除外されないもの、整数又は工程又は要素の群、整数又は工程を含むことを意味すると理解される。本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の参照は、本明細書で別段の指示がない、又は文脈によって明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書での数値範囲の列挙は、範囲内にある個々の値を個別に参照するための、簡略化された方法として機能することを目的とする。本明細書に別段の記載がない限り、個々の数値は、本明細書に個別に記載されているかのように明細書中に組み込まれる。本明細書に記載されているすべての方法は、本明細書に別段の指示がない、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「一例として」、「等」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、他の方法で特許請求される本発明の範囲を制限するものではない。本明細書のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠なクレームされていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

一般に、ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドの合成は、Ｈ－ホスホネート及びホスホロアミダイトビルディングブロック等のモノマービルディングブロックをそれぞれ使用する、確立されたホスホジエステル又はホスファイトトリエステルのプロトコルを使用する連続固相化学によって実行される。完全に自動化された合成工程は、市販のコンピューター制御のＤＮＡ合成機器とフロースルー、固定床又はバッチタイプの攪拌床技術を使用して実行される。進行中の工程の工程内管理とオンライン監視のために、合成装置にはオンラインのＵＶ、圧力及び導電率の検出器が含まれている。

簡単に言えば、これらの手法は、アミノ及び／又はヒドロキシル部分及びリンカー分子で官能化され、続いてオリゴヌクレオチドの最も３’側のヌクレオシドを固定する、固体支持樹脂等の固体支持体を含む。制御された化学反応により、所望のオリゴヌクレオチド配列は、それぞれのヌクレオチド残基の段階的付加によって、固体支持体上で連続的に、例えば、合成的に組み立てられる。触媒活性ＤＮＡ分子は、例えば、ホスホロアミダイト又はＨ－ホスホネート化学に従って連続的に、合成的に組み立てられる。

ヌクレオシド間結合は、流入するヌクレオシドの３’官能基と、固体支持体結合オリゴヌクレオチドのそれぞれの５’末端ヌクレオシドの高反応性５’－ヒドロキシル基との間に形成される。ホスホロアミダイト手法では、ヌクレオシド間結合は保護されたホスファイトトリエステル部分であるのに対し、Ｈ－ホスホネート手法では、Ｈ－ホスホネートホスホジエステル部分である。

最先端の固相支持樹脂は、本発明のＤＮＡザイム（例えば、ｈｇｄ４０）等の触媒活性ＤＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドの合成のための出発点として使用されている。固相ベース材料は、有機（ポリマー）又は無機の性質、すなわち、ＣＰＧ（制御された細孔ガラス）のいずれかであり得る。

固相合成中にモノマーシントンとして使用される２’－デオキシ－ホスホロアミダイトは、例えば、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）基等のリボースの５’－ヒドロキシル官能基の酸に不安定な保護基、及びβ－シアノエチル（Ｃ－ＮＥｔ）などの３’－Ｏ－（Ｎ，Ｎ）－ジアルキル－ホスファイトトリエステル基の塩基に不安定な保護基を持っている。

３つの核酸塩基であるアデニン、シチジン、及びグアニンの潜在的に反応性の環外アミノ官能基は、例えば、合成工程中の望ましくない副反応及び不純物形成をそれぞれ防ぐために、塩基に不安定なアシル基によって保護されるが、チミジンは環外アミノ機能を持たないため、核酸塩基保護を必要としない。

縮合反応中の合成の最初のステップとして、（Ｎ，Ｎ）－ジイソアルキル基は、有機プロトン供与活性剤、例えば、ブレンステッド酸等の弱有機酸、通常はテトラゾール、又はベンジルチオテトラゾール／５－（ベンジルメルカプト）－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ、ＢＭＴ）、ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）及び／又は５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）等のテトラゾール誘導体を使用してプロトン化される。この求核攻撃は、例えば、流入するモノマーと活性剤の間に、支持体に結合したオリゴヌクレオチド鎖の遊離５’－ヒドロキシル基での縮合反応を完了する高反応性中間体としてのテトラゾリド塩を形成する。

固相合成中にモノマーシントンとして使用される２’－デオキシ－Ｈ－ホスホネートモノエステルは、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ、ジメトキシトリチル）基などのリボースの５’－ヒドロキシル官能基の酸に不安定な保護基を持っている。リン酸塩保護基は要求されない。

オリゴヌクレオチドは、例えば、線形の多段階固相合成で組み立てられ、この工程中に中間体は単離されない。

触媒活性ＤＮＡ分子等のオリゴヌクレオチドの合成サイクルは、例えば３’－ヒドロキシ官能基で保護され、例えば５’－ヒドロキシ官能基によって、かつ塩基に不安定なスクシニルリンカーを介して固相ビーズに共有結合しているＤＭＴである、逆位のデオキシ－チミジンの３’－ヌクレオシドで始まる。このヌクレオシド上に、配列内の次のヌクレオチドが結合し、続いてヌクレオチド残基を段階的に付加することにより、触媒活性ＤＮＡ分子等のオリゴヌクレオチドの配列が３’→５’伸長する。

１つのヌクレオシドの付加に必要なすべての試薬は、例えば定義され、コンピューター制御された合成レシピに従って、カラムを介して供給される。各カップリングサイクルは、図１に示す次の４つの主要な化学的ステップで構成される。

各一次ステップの間に、例えばアセトニトリル洗浄ステップを実行して、過剰な反応物と反応副生成物を除去する。オリゴヌクレオチドは、伸長する鎖の反応性の高い５’－ＯＨ末端に３’－ホスホロアミダイトを付加することによって伸長する。合成サイクルは、触媒活性ＤＮＡ分子のプログラムされたヌクレオチド配列に従って、完全長のオリゴマーの合成が完了するまで繰り返される。

オリゴヌクレオチドの合成に続いて、このオリゴヌクレオチドの切断及び脱保護が行われる。触媒活性ＤＮＡ分子の合成の最終的な脱トリチル化ステップに続いて、架橋リン酸トリエステル結合のβ－シアノエチル保護基は、例えば、支持体に付着したオリゴヌクレオチドをアセトニトリル中のジエチルアミンの溶液と反応させることによって除去される。このβ-シアノエチル脱保護ステップは、制御された方法によって合成装置上で等しく実行される。

ＤＥＡ処理の完了後、カラムは、例えば、合成装置から取り出され、含まれる固体支持体は、例えば、窒素又はアルゴン等の不活性ガスによって乾燥される。続いて、エタノール中の濃アンモニアで塩基に不安定なスクシニルリンカーを切断することにより、オリゴヌクレオチドが固体支持体から放出される。次に、固相がカラムから除去され、オリゴヌクレオチドは、水又はエタノール等の適切な溶媒中で、任意の高温、例えば２０℃～７０℃、２５℃～６５℃、３０℃～６０℃、３５℃～５５℃又は４０℃～５０℃の範囲で、例えば濃アンモニア若しくはエチルアミン又はそれらの混合物（アンモニアメチルアミン、ＡＭＡ）等の塩基で、塩基に不安定なスクシニルリンカーを切断することによって、固体支持体から連続的に放出される。より高い温度は反応を加速させるが、触媒活性ＤＮＡ、例えばｈｇｄ４０を含むオリゴヌクレオチドの化学修飾又は分解の速度も増加させ、望ましくない不純物をもたらす。

この処理はまた、塩基に不安定な核酸塩基保護基を切断する。例えば濾過によって残りの固体支持ビーズを除去した後、粗生成物は、それぞれの脱保護溶液中、例えば、アンモニア溶液中で得られるであろう。あるいは脱保護溶液を、例えばフロースルー方式で、例えば１０～１２０分、１５～９０分、又は３０～６０分にわたって、例えば室温で、カラムを通して洗浄して、オリゴヌクレオチドと固相ビーズとの間のリンカーを放出する。次に、オリゴヌクレオチドは溶液中に放出され、該オリゴヌクレオチド含有溶液は、任意で例えば脱保護容器内で、脱保護工程に移され、例えば溶液の加熱によって脱保護される。合成の完了後、例えば、ＤＮＡザイム等の本発明の方法によって得られる触媒活性ＤＮＡ分子は、固相支持樹脂から切断され、核酸塩基及び骨格保護基は、塩基性水溶液を使用して連続的に除去される。温度は、例えば、例えば５～２０時間の間、３０℃～４５℃に上昇される。

本発明のオリゴヌクレオチドの製造工程は、例えば、精製及び単離手順で終了する。切断及び脱保護後に得られた粗製の完全長オリゴヌクレオチド含有溶液には、失敗シーケンス（ｎ－１種、ショートマーズ（ｓｈｏｒｔｍｅｒｓ））、追加の塩基を持つシーケンス（ｎ＋ｘ種、ロングマーズ）、保護基の不完全な切断に由来する化学修飾された生成物、及び塩基修飾された化合物等の、製品及び工程関連の不純物が含まれている。さらに、酸性脱トリチル化ステップ中に、ヌクレオチドの脱プリンが起こり、１つ又は複数のプリン塩基を失った脱塩基生成物の生成につながる可能性がある。塩基性水溶液で処理すると、例えばアンモニアによる切断中に、これらの脱塩基生成物は部分的に分解されてより短い（ｎ－ｘ）フラグメントになる。

これらの潜在的な不純物はいずれも精製中に、例えばイオン交換（ＩＥＸ）液体クロマトグラフィー等の液体クロマトグラフィーによって分離できる。例えば、液体クロマトグラフィー及び脱塩のほかに、触媒活性ＤＮＡ分子のさらなる精製工程及び／又は単離工程、並びに任意の凍結乾燥は、本発明による触媒活性ＤＮＡ分子の製造方法において除外される。

切断手順から得られた粗ＤＭＴオフ生成物は、例えば、希釈され、定義された濃度で、強陰イオン交換樹脂が充填されたクロマトグラフィーカラムにロードされる。副生成物からの全長生成物の分離は、アルカリ性水溶液中の塩化ナトリウムの勾配によって達成される。勾配分離中に、オリゴヌクレオチドを含む溶出液の画分が収集され、ＵＰＬＣ－ＭＳによって連続的に分析される。

次に、指定された仕様基準を満たす画分をプールし、ＩＥＸ－ＨＰＬＣで再度分析して、プールの結果を確認する。

これらの組み合わされた画分は、勾配溶出からの過剰な塩を含み、例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）に送られる。必要に応じて、バッファー交換ステップ中に溶液のｐＨを調整し、濾過して濃縮した生成物を凍結乾燥して、最終的な医薬品有効成分（ＡＰＩ）をアモルファス粉末又はケーキとして生成する。ＡＰＩは収穫され、最終的に－２０℃でスクリューキャップ（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標））付きの滅菌ＨＤＰＥボトルに保管される。

従来技術において選択された合成及び脱保護条件のために、この製造工程は、不純物として大量のエトキシアセタール修飾された脱プリン種を生成する。ＵＰＬＣ－ＭＳ分析によって検出された他の工程関連不純物は、ロングマーズ及び不完全に脱保護された種、すなわち、Ｇ塩基にイソブチリル（ｉｂｕ）保護基を依然として含むオリゴヌクレオチドである（図２を参照）。

これらの不純物のほとんどは、ＤＮＡザイムの活性に必要なワトソン・クリックの塩基対に直接的な悪影響を及ぼし、それにより製品の活性を低下させる可能性がある。加えて、これらの不純物は、最終的に精製された医薬品有効成分（ＡＰＩ）の収率を低下させる。さらに、プロセスの全体的な生産性が低く、ＡＰＩが高価になる。

表３から推測し得るように、各バッチでかなりの量（２．１２％～８．５３％）のエトキシアセタール不純物が生成されている。この不純物は、高温（５５℃）でエタノール性アンモニア溶液を使用した切断及び脱保護ステップ中に発生し、明らかに工程関連である。不純物はＨＰＬＣ精製中に除去するのが難しく、ワトソン・クリックの塩基対を形成できないため、ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子の活性を低下させる。

Ｇ－核酸塩基上の残留イソブチリル保護基（ｉｂｕ）は、各バッチで０．００％～４．９４％のレベルで検出できる。この不純物は、アンモニア処理中のＧ－核酸塩基の不完全な脱保護に関連している。ＨＰＬＣ精製中に除去することは困難であり、ワトソン・クリックの塩基対形成をブロックするため、ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子の活性が低下する。

（ｎ＋１）不純物は、分子内のランダムな位置に１つの追加の塩基を持つ不均一な不純物のグループを表す。分子内の位置によっては、追加の塩基がＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子の標的ｍＲＮＡへの適切な結合を妨げ、活性を低下させる可能性がある。ダブルカップリングは、制御されていないカップリング反応が原因で発生する。すべてのバッチで０．７８％～２．１４％のレベルで見つけることができる。精製中、不純物はメインピークの近くで溶出し、除去するのは非常に困難である。

（ｎ－１）不純物は、分子内のランダムな位置で１つの塩基が欠落している不均一な不純物のグループを表す。分子内の位置によっては、塩基が欠落していると、ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子の標的ｍＲＮＡへの適切な結合が妨げられ、活性が低下する可能性がある。欠落している塩基は、流入する塩基の不完全なカップリング（最適化されていないカップリング条件）、又は脱トリチル化ステップ中の不完全な酸化及び関連する鎖切断のいずれかに関連している可能性がある。すべてのバッチで０．５７％～４．９６％のレベルで見つけることができる。精製中、不純物はメインピークの近くで溶出し、除去するのは非常に困難である。

この工程で得られた粗収率（精製前）は、２．５７～３．４１ｇｍ／ｍｍｏｌ合成スケールで測定された。ＤＮＡザイム（ｈｇｄ４０）等の触媒活性ＤＮＡ分子の分子量は１０６０３Ｄａであり、理論収率は１０．６ｇｍ／ｍｍｏｌ合成スケールであるため、精製前に観察される収率は２４．２５％～３２．１７％である。精製中及び下流では、さらに５０％の収率低下が予想される。したがって、総収率は１２．１３％～１６．８５％の間で計算される。

高分解能ＵＰＬＣ－ＭＳによる利用可能なすべてのＤＮＡザイム（ｈｇｄ４０）バッチの詳細な分析に続いて、関連する個々の工程ステップが最適化され、工程関連の不純物負荷が最小限に抑えられた。

上記の表４は、本発明の確立された製造工程を使用して２０１３年に製造されたｈｇｄ４０バッチ＃２００２９３の精製後の例示的な不純物プロファイルを説明する。表２に示されているように、このバッチは、８３．７５％の純度で、例えば４．７７ｇｍ／ｍｍｏｌ合成スケールの粗収率で放出された。ｈｇｄ４０の分子量は１０６０３Ｄａであり、理論収率は例えば１０．６ｇｍ／ｍｍｏｌ合成スケールであるため、精製前に観察される収率は例えば４５．００％と計算される。半生成の不純物のピークは５．３１％と計算され、生成後の不純物のピークは合計で８．９４％になる。分子の放出時の最終収量は、例えば、理論的収量に対して計算された２．４７ｇｍ／ｍｍｏｌ又は２３．３０％と計算される。
本発明の方法は、前述の方法のいずれかに基づくが、（ｎ＋１）不純物、（ｎ－１）不純物又はそれらの組み合わせなどの不純物を大幅に低減又は排除さえする。本発明の方法によって得られる、ＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子は、著しく減少した総不純物、例えば、分析用ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを介して主生成物のピークの前後に溶出するすべての不純物に対して＜２０％、＜１５％、＜１２％、＜１０％又は＜５％の範囲の総不純物を含む。

触媒活性ＤＮＡ分子の還元された不純物は、例えば、触媒活性を改善するだけでなく、触媒活性ＤＮＡ分子の基質結合、すなわち、触媒活性ＤＮＡ分子とその基質との相互作用も改善する。これらの改善は、例えば、従来技術の触媒活性ＤＮＡ分子と比較して、触媒活性ＤＮＡ分子の効力の改善をもたらす。

本発明の方法は、例えば、オリゴヌクレオチドの合成におけるポリマー樹脂として、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）又はマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）を含む。樹脂の充填量は、例えば１０～５００μｍｏｌ／ｇｍ、５０～４５０μｍｏｌ／ｇｍ、１００～４００μｍｏｌ／ｇｍ、１５０～３５０μｍｏｌ／ｇｍ、２００～３００μｍｏｌ／ｇｍ、又は６０～１２０μｍｏｌ／ｇｍの範囲である。

場合により、本発明の方法は、活性剤及び／又はアミダイトの使用を含む。活性剤は、例えば有機酸等の酸、例えばテトラゾール、又はエチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ／ＢＭＴ）若しくはジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）等のその誘導体等の有機ブレンステッド酸であって、例えばアセトニトリル等の乾燥した単極性有機溶媒に溶解したものである。ブレンステッド酸等の活性剤は、塩基性化合物、例えば、Ｎ－メチルイミダゾール等の添加剤を、例えば、０．０５～０．２Ｍの濃度で含み得る。テトラゾール又はその誘導体、例えば、ＥＴＴ、ＢＴＴ／ＢＭＴ若しくはＤＣＩ等の活性化剤の濃度は、例えば０．１Ｍ～１Ｍ、０．２Ｍ～０．８Ｍ、０．３Ｍ～０．６Ｍ又は０．５Ｍである。アミダイト濃度は、例えば０．１～０．２５Ｍである。アミダイトは、例えばアセトニトリル等の乾燥した単極性有機溶媒に溶解される。
アミダイト当量は、例えば、０．５～５．０当量、１．０～４．０当量、１．５～３．５当量、又は１．２～３．０当量である。本発明の方法における活性剤：アミダイトの比率は、例えば、１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０若しくは９０：１０、又は１０：９０～９０：１０、２０：８０～８０：２０、３０：７０～７０：３０、４０：６０～６０：４０若しくは５０：５０～７０：３０である。
場合により、本発明の方法は、例えば、アセトニトリル等の乾燥した単極性有機溶媒に溶解された、例えば、無水酢酸等の酸無水物であるキャッピング試薬を更に使用する。無水酢酸等の酸無水物の量は、例えば３～１００％、５～５０％、１０～４０％、２０～３０％、又は１０～３０％である。

切断及び脱保護ステップでは、例えば濃アンモニア水溶液等の塩基性水溶液が使用される。切断及び脱保護ステップの持続時間は、例えば１～２４時間、５～２０時間、１０～１５時間、又は８～１６時間である。切断及び脱保護ステップの温度は、例えば１０～６０℃、１５～５５℃、２０～５０℃、３０～４５℃、又は３５～４０℃である。

本発明の精製ステップで使用される精製樹脂は、例えば、強い陰イオン交換基で修飾された多孔質親水性ポリマービーズである。このようなポリマーの例は、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ ５ＰW ２０である。

精製ステップでは、例えば２つの異なる緩衝液が使用され、これらは、例えば水酸化ナトリウム単独、又はアルカリ水酸化物とアルカリハロゲン化物の組み合わせ等のアルカリ水酸化物である。第１の緩衝液は、例えば、１～３０ｍＭ、５～２５ｍＭ、１０～２０ｍＭ又は５～２５ｍＭの水中の水酸化ナトリウムを含むか、又はそれらからなり、第２の緩衝液は、例えば１～３０ｍＭ、５～２５ｍＭ、１０～２０ｍＭ又は５～２５ｍＭの水中の水酸化ナトリウム及び０．５～２．０の臭化ナトリウム、１．０～１．８の臭化ナトリウム又は１．５の臭化ナトリウムを含むか、またはそれらからなる。

上記のすべてのパラメータは、それぞれ異なる量と濃度で互いに組み合わせることができる。

一般的な従来技術の方法で使用される材料及び方法ステップと比較した、本発明の方法で使用される材料及び方法ステップの例を、以下の表５に示す。

上記で説明及び列挙されているすべての工程変更は、ＤＮＡ合成の重要工程パラメーター（ＣＰＰ）であり、表４及び５に示すように、観察された不純物プロファイルに直接関連付けられ得る。

本発明の方法によって得られる本発明の触媒活性ＤＮＡ分子は、例えば、ＧＡＴＡ－３を対象とするＤＮＡザイムである。このＤＮＡザイムの配列は、例えば、ＷＯ２００５／０３３３１４の配列ｈｇｄ１～ｈｇｄ７０から選択され（ＷＯ２００５／０３３３１４の図３を参照）、特に配列ｈｇｄ１１、ｈｇｄ１３、ｈｇｄ１７及びｈｇｄ４０から選択され、より具体的にはｈｇｄ４０（５’－ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ；配列番号1）であり、すなわち、ＤＮＡザイムはこれらの配列を含むか、又はこれらの配列からなる。

ＤＮＡザイム「ｈｇｄ４０」は、例えば、配列５’－ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧを有する３４塩基を含むか、又はそれらからなる。３’及び５’領域の両方にある９つの塩基は、ＧＡＴＡ－３の標的ｍＲＮＡに高度に特異的に結合する２つの結合ドメインを形成する。分子の中心核は、ｈｇｄがＧＡＴＡ－３のｍＲＮＡに結合した後の、標的の切断の主要因となる触媒ドメインを示す。製薬原料であるｈｇｄ４０は、吸入による薬物送達部位における高い生物活性及び生体利用効率を特徴とする。

ＤＮＡザイム（ｈｇｄ４０）等の本発明の触媒活性ＤＮＡ分子は、例えば、経口、経鼻、静脈内、皮下、局所、直腸、非経口、筋肉内、大槽内、膣内、腹腔内、髄腔内、血管内、局所（粉末、軟膏若しくは点滴薬）、又はスプレー若しくは吸入剤の形で患者に投与され得る製剤に含まれる。有効成分は、例えば無菌条件下で、必要に応じて、生理学的に許容される賦形剤及び有効な防腐剤、緩衝剤又は噴射剤と混合される。

ＤＮＡザイム（ｈｇｄ４０）は、例えば吸入用の製剤に含まれるか、又はＰＢＳに溶解される。

本発明の方法によって得られるＤＮＡザイム等の触媒活性ＤＮＡ分子は、例えば、ＧＡＴＡ－３由来の疾患、障害又は状態の予防及び／又は治療の方法において使用される。そのような疾患、障害又は状態は、細胞内の正常レベルと比較して、細胞内でＧＡＴＡ－３が上方制御される任意の疾患、障害又は状態である。細胞は、ＧＡＴＡ－３を発現する任意の細胞、例えば免疫細胞である。ＧＡＴＡ－３の上方制御は、例えば疾患、障害若しくは状態の発生、症状の発生、及び／又は疾患、障害若しくは状態の進行につながる、病理学的工程の開始、影響及び／又は深刻化に例えば関連する。そのような疾患は、例えば２型炎症又は疾患、一例としてＴＨ－２によって引き起こされる疾患、障害又は状態である。特に、２型炎症又は疾患は、例えば２型重症喘息等の２型喘息である。

以下の実施例は、本発明の異なる実施形態を示しているが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

実施例１：小規模な単一バッチの、高分解能不純物プロファイルの作成
本発明の方法で得られたｈｇｄ４０（ＤＮＡザイム）の粗収量（精製前）を５．９１ｇｍ／ｍｍｏｌ合成スケールで測定した。ｈｇｄ４０の分子量は１０６０３Ｄａであり、理論収率は１０．６ｇｍ／ｍｍｏｌ合成スケールであるため、精製前に観察された収率は５５．７５％（前の工程と比較して＋９．７５％）と計算される。精製中及び下流で、６７．８％の収率が観察された。半生成の不純物のピークは５．７０％（＋０．３９％）と計算され、生成後の不純物のピークは合計で４．０２％（－４．９２％）になる。工程の変更により、２つの不純物（エトキシアセタール及びイソブチリル修飾）が完全に消失し、１つの新しい不純物（ＣＮＥＴ）が低パーセンテージで検出された。したがって、総収量は３７．５％（前の工程と比較して＋１４．２０％）と計算される。

表６は、本発明の方法を使用して、２０１９年に製造された小規模の単一バッチの例示的な高分解能不純物プロファイルを示す。

実施例２：切断アッセイ
ＤＮＡザイム（ｈｇｄ４０）の活性は、溶液中での構造形成に基づくため、機能アッセイを実行することにより、オンターゲットの有効性を判断できる。したがって、機能的なインビトロ切断アッセイは、さまざまなｈｇｄ４０バッチの時間依存性切断活性を監視するために開発された。

ｈｇｄ４０は、両側にＧＡＴＡ－３のｍＲＮＡ特異的な５ヌクレオチド（ｎｔ）の長さの結合アームが隣接する、中央の２３塩基の触媒ドメインを持っている。アッセイターゲットとして、ｈｇｄ４０の内因性ｍＲＮＡ ＧＡＴＡ－３ターゲット領域に対応する４０ｎｔのＲＮＡ配列を設計し、合成的に製造した。４０ｎｔのＲＮＡは、ｈｇｄ４０によって１７ｎｔと２３ｎｔのフラグメントに特異的に切断される。これらのフラグメントは、ＨＰＬＣを変性させることで十分に分離できる。ｈｇｄ４０の切断速度は、変性イオンペア逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣ）によってさまざまな時点で分析された。

図３は、合計５つのバッチの切断アッセイを示しす。バッチＸ４８１７９Ｋ１Ｋ２は、本発明の方法に従って製造され、バッチ１３８９７６、１５８６０２、２００２９３、２５７８４８は、従来技術の方法に従って製造された。結果は、溶液中のｈｇｄ４０含有量に対して正規化されており、以下の表７に示される。

表７は、本発明の方法に従って製造されたｈｇｄ４０が、他のバッチと比較して、最初はより高い活性を有することを示している。活性の増加は、４０ｍｅｒの切断テンプレートの減少に直接関係する。本発明の方法は、９．０２～１７．６８％の間の初期のより高い活性を示す。テンプレートは、本発明の方法では２５～３０分、従来技術の方法では３５分で、プラトーでゆっくりと消化されるので、数は時間とともに減少する。本発明の方法に従って製造されたｈｇｄ４０は、古いバッチよりも速い切断速度論を示す。

実施例３：重大な工程関連不純物のテスト
従来技術の方法に従って、２００９年から２０１７年の間に８つのバッチのｈｇｄ４０を調製し、工程に関連する重大な不純物のレベルをテストした（表８を参照）。本発明の方法に従って、２０１９年にｈｇｄ４０の１つのバッチを調製した。

さまざまな不純物のレベルと性質は、ＵＶ検出によるクロマトグラフィー分離と、連続した高分解能質量分析によって特定された。識別されたそれぞれは、製造工程のそれぞれの単位操作に直接関連していた。

従来技術の方法に従って調製された９つの異なるｈｇｄ４０バッチの分析結果を比較することにより、重大な不純物の量が監視され、本発明の方法に従って調製されたｈｇｄ４０バッチの不純物と直接比較された。本発明の方法は、著しく少ない量の重大なクラスＩＶ不純物及びより高いオリゴヌクレオチドの収率をもたらす。従来技術の方法は、表８に示されるように、検出可能な範囲で重大な不純物を生成した。サプライヤー１のバッチｈｇｄ４０（バッチ番号Ｘ４８１７９Ｋ１Ｋ２）は、本発明の方法に従って製造され、０．９６重量％という低い不純物を示すが、従来技術による方法によって生成されたサプライヤー２の他のすべてのバッチｈｇｄ４０の不純物は、約５～１５重量％の間で変化する。サプライヤー２のバッチｈｇｄ４０が集中的に精製された場合（バッチ番号２５５６０３及び１６４１５４）にのみ、不純物は約２．５～３．７５重量％に減少する。ｈｇｄ４０バッチの製造後の精製ステップでは、時間と材料において多大な労力が必要となる。同時に、オリゴヌクレオチドの収量は減少する。

表の左側に列挙されているクラスＩＶ不純物の合計のすべてのパーセンテージは、高解像度の粗（未精製）オリゴヌクレオチド生成物において測定されている。比較すると、表８の右側の２つのバッチは、高度に精製された標準物質を示す。バッチ番号２５５６０３の標準物質は、２０１７年付けのバッチ２５４９３６から精製されており、バッチ番号１６４１５４の標準物質は、２０１１年付けのバッチ１６１７１３から精製されている。

従前の工程で生成された重大なクラスＩＶ不純物は、４．８６％（２０１１年のバッチ１６１７１３）～１５．０８％（２０１８年のバッチ２５７８４８）の範囲である。これらの不純物は、精製された標準物質バッチの分析によって証明されるように、精製することは可能であるが、全体的な合成収率は低下する。初期実験では、新しく開発された工程により、クラスＩＶの不純物がわずか０．９６％しか上昇しなかった。表９は、従来技術による方法を使用した粗ＡＰＩの典型的な不純物プロファイルを示しており、表１０は、本発明の方法によって生成されたオリゴヌクレオチドの不純物プロファイルを示す。クラスＩＶ不純物は、化合物固有の高分解能分析ＬＣ－ＭＳ法の開発後にのみ検出可能である。

図４は、表８に列挙された従来技術の方法によって調製されたｈｇｄ４０のバッチの不純物の変化を示す。

次のステップでは、従来技術の方法によって調製されたｈｇｄ４０バッチの不純物をさらに調査して、表９に示されるように不純物のタイプを特定した。

本発明による方法によって生成されたオリゴヌクレオチド中の不純物のタイプも分析され、表１０に示される。これらの不純物はいずれも、それらの非天然起源のために重要であると定義されているクラスＩＶ不純物に属していないため、それらの毒物学的特性の評価が必要である。

Claims (15)

1. ａ）支持体上で触媒活性ＤＮＡ分子を合成する工程であって、核酸塩基保護基を含むヌクレオチドが、３’末端から５’末端まで、又は有機プロトン供与性活性剤の混合物を使用して３’末端から５’末端まで順番に組み立てられ、活性剤が例えば、０．２～０．４５Ｍのエチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）又はジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）等のテトラゾール若しくはその誘導体、及びモノマーのビルディングブロックアミダイトである、工程、
   ｂ）合成が完了した後、３０～４５℃の温度範囲で５～２０時間、触媒活性ＤＮＡ分子を支持体から切断し、かつ、核酸塩基及び／又は骨格保護基を触媒活性ＤＮＡ分子から切断する工程、
   ｃ）液体クロマトグラフィー及び脱塩によって触媒活性ＤＮＡ分子を精製する工程、及び
   ｄ）必要に応じて、凍結乾燥により触媒活性ＤＮＡ分子を単離する工程
   を含む、触媒活性ＤＮＡ分子の製造方法であって、触媒活性ＤＮＡ分子のさらなる精製工程又は単離工程は除外される、触媒活性ＤＮＡ分子の製造方法。
2. 支持体が、制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）又はマクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）等の固体支持体である、請求項１に記載の方法。
3. 核酸塩基及び／又は骨格保護基が塩基に不安定なアシル基である、請求項１又は２に記載の方法。
4. ヌクレオチドが、５’－ヒドロキシル基に４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基、３’－ホスファイト基にβ－シアノエチル（Ｃ－Ｎｅｔ）基又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 活性剤が０．２～０．４５Ｍのエチルチオテトラゾール（ＥＴＴ）、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ／ＢＭＴ）、ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）等のテトラゾール若しくはその誘導体、又はそれらの組み合わせである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 活性剤：アミダイトの比が５０：５０～７０：３０である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 触媒活性ＤＮＡ分子がＤＮＡザイムである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
8. ＤＮＡザイムが配列番号１（５’－ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ）を含むｈｇｄ４０である、請求項７に記載の方法。
9. 液体クロマトグラフィーにおける主生成物のピークの前後に溶出するすべての不純物の合計に対して０．１重量％～４．５重量％の範囲の総不純物を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法によって得られる触媒活性ＤＮＡ分子。
10. 触媒活性ＤＮＡ分子は、例えば、ＧＡＴＡ－３を対象とするＤＮＡザイムである、請求項９に記載の触媒活性ＤＮＡ分子。
11. ＤＮＡザイムが配列番号１（５’－ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ）を含むｈｇｄ４０である、請求項９又は１０に記載の触媒活性ＤＮＡ分子。
12. 請求項９から１１のいずれか１項に記載の触媒活性ＤＮＡ分子、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
13. ＧＡＴＡ－３関連疾患に罹患しているヒト患者を予防及び／又は治療する方法で使用するための、請求項９から１１のいずれか１項に記載の触媒活性ＤＮＡ分子又は請求項１２に記載の医薬組成物。
14. ２型喘息に罹患しているヒト患者を予防及び／又は治療する方法で使用するためであって、ヒト患者が（ｉ）血中好酸球数が３％以上、特に４％以上、より具体的には５％以上であり、及び／又は（ｉｉ）血中好酸球数が３５０×１０^６／Ｌ以上、特に４５０×１０^６／Ｌ以上であり、及び／又は（ｉｉｉ）呼気中一酸化窒素濃度が３５ｐｐｂ又は４０ｐｐｂ以上であることを特徴とする、請求項１２若しくは１３に記載の医薬組成物、又は請求項９から１１若しくは１３のいずれか１項に記載の触媒活性ＤＮＡ分子。
15. 触媒活性ＤＮＡ分子又は医薬組成物が、経口、経鼻、静脈内、皮下、局所、直腸、非経口、筋肉内、大槽内、膣内、腹腔内、髄腔内、血管内、局所（粉末、軟膏若しくは点滴薬）、又はスプレー若しくは吸入剤の形で、投与される、請求項１３又は１４に記載の使用のための触媒活性ＤＮＡ分子又は医薬組成物。

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