WO2021045141A1 - オリゴヌクレオチドの脱保護方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドの脱保護方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2021045141A1
WO2021045141A1 PCT/JP2020/033398 JP2020033398W WO2021045141A1 WO 2021045141 A1 WO2021045141 A1 WO 2021045141A1 JP 2020033398 W JP2020033398 W JP 2020033398W WO 2021045141 A1 WO2021045141 A1 WO 2021045141A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
solvent
oligonucleotide
halogen
reaction
added
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/033398
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
到 岡本
藤原　健志
正博 閨
Original Assignee
神戸天然物化学株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 神戸天然物化学株式会社 filed Critical 神戸天然物化学株式会社
Priority to JP2021544021A priority Critical patent/JPWO2021045141A1/ja
Publication of WO2021045141A1 publication Critical patent/WO2021045141A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention provides a method for deprotecting oligonucleotides.
  • acrylonitrile produced by a side reaction during the production of an oligonucleotide by liquid phase synthesis is cyanoethyl to the nucleobase of the oligonucleotide.
  • the present invention relates to a method for suppressing the occurrence of a chemical addition reaction.
  • nucleic acid drugs have been developed as nucleic acid drugs have been launched one after another.
  • oligonucleotides which are the drug substance components of nucleic acid drugs
  • the demand for mass production of oligonucleotides is increasing.
  • the solid-phase synthesis method that has been conventionally used is currently the mainstream production method, but there is a limit that the scale that can be synthesized by one production method is about several kilograms. Therefore, as a production method more suitable for mass production, a method for producing an oligonucleotide by a liquid phase synthesis method is being developed.
  • a solid-phase synthesizer In solid-phase synthesis, a solid-phase synthesizer generally produces a fully protected oligonucleotide in which all functional groups on the oligonucleotide are protected, and then the fully protected oligonucleotide is subjected to basic conditions (generally). , Using aqueous ammonia), excision from the solid-phase carrier, deprotection of the nucleic acid base site, and removal of the protecting group of the phosphoric acid site (that is, deprotection) are performed collectively, and complete deprotection is performed. Obtain the obtained oligonucleotide.
  • an impurity eg, acrylonitrile adduct
  • acrylonitrile adduct due to the cyanoethylation side reaction that acrylonitrile generated during the deprotection of the cyanoethyl group at the phosphate moiety adds to the nucleobase of the oligonucleotide (eg, thymine (T), uracil (U)) Things)
  • T thymine
  • U uracil
  • the reaction conditions for example, reaction reagent, reaction solvent
  • the treatment steps possible in the solid-phase synthesis method may be carried out in the liquid-phase synthesis method. It can be difficult, and side reactions that can be suppressed by solid-phase synthesis can be problematic in liquid-phase synthesis.
  • Non-Patent Document 1 the production of impurities due to side reactions due to the addition of acrylonitrile to nucleobases (eg, Patent Documents 1 and Non-Patent Documents 1 and 2) or phosphorothioates (eg, Non-Patent Document 1) is described by a liquid phase synthesis method. It is one of the major problems in the production of the oligonucleotides used.
  • deprotection is performed by the following procedure (for example, Patent Documents 2, 3 and 4, and non-patents).
  • Document 4 First, after the completion of synthesis, the deprotection of the cyanoethyl group at the phosphate moiety of the fully protected oligonucleotide supported on the solid phase is treated with a weakly nucleophilic base solution to deprotect only the protecting group at the phosphate moiety.
  • the oligonucleotide whose phosphate moiety is deprotected remains bound to the solid-phase carrier, the acrylonitrile produced by washing the solid-phase carrier is removed. Finally, using a base (for example, aqueous ammonia), the oligonucleotide is excised from the solid-phase carrier and the base site is deprotected to obtain a completely deprotected oligonucleotide.
  • a base for example, aqueous ammonia
  • the steps of deprotecting the cyanoethyl group from the phosphoric acid moiety and the subsequent removal of acrylonitrile by washing the solid phase as used in the solid phase synthesis described above are directly applied. Since it is difficult to do so, it is not easy to suppress the by-production of impurities by adding acrylonitrile.
  • the present invention provides a method for deprotecting oligonucleotides. Specifically, the present invention presents a side reaction during the production of an oligonucleotide by a liquid phase synthesis method, more specifically, cyanoethylation of an acrylonitrile produced by a phosphate protecting group of the oligonucleotide to a nucleobase of the oligonucleotide. A method for suppressing the occurrence of an addition reaction is provided.
  • a fully protected oligonucleotide synthesized by the liquid phase synthesis method is completely dissolved in a specific solvent different from the solvent used for solid phase synthesis, and then a specific weakly nucleophilic base is used.
  • the cyanoethyl protecting group at the phosphoric acid moiety can be selectively deprotected, then the acrylonitrile can be removed by distillation under reduced pressure after the deprotection is complete, and the phosphoric acid moiety can be further removed.
  • the deprotected oligonucleotide can also improve the solubility in aqueous ammonia
  • the nucleic acid base can be deprotected and excised from the pseudo solid phase carrier using aqueous ammonia, and the acrylonitrile adduct can be added.
  • the present invention provides, but is not limited to, the following aspects.
  • a method for producing an oligonucleotide by a liquid phase synthesis method is 1) A fully protected oligonucleotide is dissolved in an organic solvent, wherein the organic solvent is a single solvent of a halogen-based solvent or a mixed solvent of a halogen-based solvent and a non-halogen-based organic solvent; 2) Use a weakly nucleophilic base to deprotect the protecting group at the phosphate site of the fully protected oligonucleotide in the solution prepared in step 1; 3) Distill off the weakly nucleophilic base used in the step, the organic solvent, and acrylonitrile present in the reaction system; 4) The residue obtained in step 3 was treated with aqueous ammonia to deprotect the nucleobase site of the oligonucleotide obtained in step 2 from which the phosphoric acid site was deprotected, and from
  • the manufacturing method including the above.
  • Item [2] Item [1]
  • the halogen-based solvent in step 1 is at least one solvent selected from dichloromethane, chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, or 1,1,2,2-tetrachloroethane. Production method.
  • Item [3] Item [1] or [2], wherein the non-halogen solvent in step 1 is at least one solvent selected from an alcohol solvent, a nitrile solvent, an ether solvent, or a cyclic ether solvent.
  • the manufacturing method according to any one.
  • the non-halogen solvent in step 1 is at least one solvent selected from methanol, ethanol, propanol, butanol, acetonitrile, propionitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, or 1,4-dioxane.
  • Item 8 The production method according to any one of [1] and [2].
  • Item [4] The production method according to any one of Items [1] to [3], wherein the weakly nucleophilic base in step 2 is diethylamine or triethylamine.
  • Item [5] The production method according to any one of Items [1] to [4], wherein the fully protected oligonucleotide in step 1 is an oligonucleotide in which the 3'terminal hydroxyl group is protected by a pseudo solid phase protecting group. .. Item [5-1] The production method according to Item [5], wherein the pseudo-solid phase protecting group is a known pseudo-solid phase protecting group. Item [6] The production method according to any one of Items [1] to [5], wherein the dissolution in step 1 is complete dissolution. Item [6-1] The production method according to any one of Items [1] to [5], wherein the dissolution in step 1 is performed by performing ultrasonic waves.
  • Item [7] The production method according to any one of Items [1] to [6], wherein the fully protected oligonucleotide used in step 1 is a pentamer or more.
  • Item [7-1] The production method according to any one of Items [1] to [6], wherein the fully protected oligonucleotide used in step 1 is a pentamer to a 70-mer.
  • Item [8] The production method according to any one of Items [1] to [7], wherein the high-purity oligonucleotide is a completely deprotected oligonucleotide.
  • Item [9] The production according to any one of Items [1] to [8], wherein the produced oligonucleotide has a content of cyanoethylated impurities of 1% or less based on the weight of the oligonucleotide.
  • Method. Item [9-1] Any one of Items [1] to [8], wherein the produced oligonucleotide has a content of cyanoethylated impurities of 0.5% or less based on the weight of the oligonucleotide.
  • a fully protected oligonucleotide is dissolved in an organic solvent, wherein the organic solvent is a single solvent of a halogen-based solvent or a mixed solvent of a halogen-based solvent and a non-halogen-based organic solvent; 2) Use a weakly nucleophilic base to deprotect the protecting group at the phosphate site of the fully protected oligonucleotide in the solution prepared in step 1; 3) Distillate the weakly nucleophilic base used in the above step, the organic solvent, and acrylonitrile present in the reaction system; The method, including that.
  • Item [11] The method according to Item [10], wherein the acrylonitrile is acrylonitrile produced by deprotection of the phosphoric acid moiety of the oligonucleotide obtained by the liquid phase synthesis method.
  • Item [12] The method according to item [10] or [11], wherein the fully protected oligonucleotide in step 1 is an oligonucleotide in which the 3'terminal hydroxyl group is protected by a pseudo solid phase protecting group.
  • the halogen-based solvent in step 1 is at least one solvent selected from dichloromethane, chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, or 1,1,2,2-tetrachloroethane, items [10] to [12]. ] The method according to any one of the items.
  • Item [14] Item [10] to [13], wherein the non-halogen solvent in step 1 is at least one solvent selected from an alcohol solvent, a nitrile solvent, an ether solvent, and a cyclic ether solvent. The method according to any one item.
  • Item [14-1] Item [10]
  • the non-halogen solvent in step 1 is at least one solvent selected from methanol, ethanol, propanol, butanol, acetonitrile, diethyl ether, tetrahydrofuran, or 1,4-dioxane.
  • Item [15] The production method according to any one of Items [10] to [14], wherein the weakly nucleophilic base in step 2 is diethylamine or triethylamine.
  • FIG. 1 shows the abundance ratio of acrylonitrile adduct in the oligonucleotide produced by the production method of the present invention in Example 25 using ultra-high performance liquid chromatography / mass spectrometry (UPLC / MS). It is a drawing which shows the result of measurement.
  • the chromatograms extracted by mass value for each of the target deprotection product (m / z 2374) and acrylonitrile adduct (CE adduct) (m / z 2394) are shown in A), and the results of mass analysis at the top of each peak. Is shown in B).
  • FIG. 1 shows the abundance ratio of acrylonitrile adduct in the oligonucleotide produced by the production method of the present invention in Example 25 using ultra-high performance liquid chromatography / mass spectrometry (UPLC / MS). It is a drawing which shows the result of measurement.
  • Example 2 shows the abundance ratio of acrylonitrile adduct in the oligonucleotide produced by the conventional production method in Example 21 measured by using an ultra-high performance liquid chromatogram / mass spectrometry (UPLC / MS). It is a drawing which shows the result of this.
  • the chromatograms extracted by mass value for each of the target deprotection product (m / z 2374) and acrylonitrile adduct (CE adduct) (m / z 2394) are shown in A), and the results of mass analysis at the top of each peak. Is shown in B).
  • oligonucleotide by a liquid phase synthesis method.
  • the method is 1) A fully protected oligonucleotide is dissolved in an organic solvent, wherein the organic solvent is a single solvent of a halogen-based solvent or a mixed solvent of a halogen-based solvent and a non-halogen-based organic solvent; 2) Use a weakly nucleophilic base to deprotect the protecting group at the phosphate site of the fully protected oligonucleotide in the solution prepared in step 1; 3) Distill off the weakly nucleophilic base used in the step, the organic solvent, and acrylonitrile present in the reaction system; 4) The residue obtained in step 3 was treated with aqueous ammonia to deprotect the nucleobase site of the oligonucleotide obtained in step 2 from which the phosphoric acid site was
  • liquid phase synthesis method refers to an oligonucleotide in a liquid state in which all reaction solutes in the reaction system are dissolved in a method for producing an oligonucleotide generally known in the art to which the present invention belongs. It means a synthetic method for producing a nucleotide, and documents (for example, Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2017, 13, 1368-1387) are known, but the method is not limited to the methods described therein.
  • the manufacturing method of the present invention comprises the following steps 1) to 4). Hereinafter, each step will be described.
  • Step 1 the fully protected oligonucleotide as a reaction substrate is dissolved in an organic solvent.
  • the "organic solvent” means a single solvent of a halogen-based solvent or a mixed solvent of a halogen-based solvent and a non-halogen-based solvent, and reaction conditions such as solubility of a completely protected oligonucleotide used as a reaction substrate.
  • halogen solvents include, but are not limited to, at least one solvent selected from dichloromethane, chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, and 1,1,2,2-tetrachloroethane. Absent. Dichloromethane, chloroform, or dichloroethane is preferred, with dichloromethane or chloroform more preferred.
  • non-halogen organic solvent means at least one solvent selected from an alcohol solvent, a nitrile solvent, and an ether solvent.
  • non-halogen organic solvents include alcohol solvents such as methanol, ethanol, propanol and butanol; nitrile solvents such as acetonitrile and propionitrile; ethers such as diethyl ether, tetrahydrofuran and 1,4-dioxane. Examples thereof include, but are not limited to, these. Alcoholic solvents are preferred, and methanol and ethanol are more preferred.
  • the term “dissolution” refers to a state in which a fully protected oligonucleotide as a reaction substrate is completely dissolved or highly dispersed in a reaction solvent (for example, visually suspending the reaction solution).
  • a reaction solvent for example, visually suspending the reaction solution.
  • a completely dissolved state is preferable. ..
  • sonication is used with stirring the solution and, if necessary, in conventional organic synthesis techniques to completely dissolve it. Sonication may be performed using a machine.
  • oligonucleotide refers to all functional groups in all nucleotide molecules that make up an oligonucleotide (eg, hydroxyl groups at the 3'- and 5'-positions, 5'.
  • nucleotide means an ester of a nucleoside, for example, a phosphate ester of a nucleoside.
  • nucleoside refers to a sugar moiety (eg, ribose sugar, etc.), a derivative of the sugar moiety, or one having the same functional value as the sugar moiety (eg, an analog such as a carbocycle). It means a nucleic acid component containing a covalently bonded base or basic group (for example, at least one homocyclic ring, at least one heterocycle, at least one aryl group, etc.).
  • the base typically binds to the 1'position of the sugar moiety. Examples of the base include those described below.
  • oligonucleotide refers to at least two nucleotides, typically three or more (eg, four) nucleotides, more typically two with complementary strands at room temperature. It means a nucleic acid containing more than 10 nucleotides capable of forming a chain, and the total number of nucleotides is indicated by n in the present invention.
  • the total number of nucleotides (n) in the oligonucleotide is 5 or more (that is, pentamer or more), usually 5 to 100 or more (that is, pentamer to 100 or more), and 5 to 70 or more (that is, 5 to 70 or more). That is, it is preferably pentamer to 70-mer or more).
  • the oligonucleotide is a single-stranded nucleotide, or a nucleotide having a 2'-O, 4'-C-methylene bridge or a 2'-O-alkyl group, or a 2'-fluoro group in the sugar portion thereof.
  • Chemical modifications for example, bridged Nucleic Acid (BNA) and the like can be mentioned.
  • BNA bridged Nucleic Acid
  • Examples of BNA include Locked Nucleic Acid (LNA), 2'-O, 4'-C-Ethylene Bridged Nucleic Acid (ENA: 2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acid). Be done.
  • BNA BNA
  • ENA ENA
  • Modifications include, but are not limited to, modified backbones of oligonucleotides, typically described in Micklefield (2001), "Current Medicinal Chemistry” 8: 1157-1170. , Peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, methylphosphonate DNA and other modifications. Oligonucleotides consist of any combination of said nucleotides and said modifications.
  • the nucleobase site at the 1'position used in the present specification is also expressed as "Base” and may be a nucleobase having a basic amino group to which a cyanoethyl group is added, and may be a natural nucleobase moiety (for example). , Timine, uracil) or non-natural (ie, artificial) nucleobases, but natural nucleobase sites are preferred. Specific nucleobase sites include, but are not limited to, thymine and uracil.
  • the protecting groups may differ depending on the functional groups to be protected, and examples thereof include groups known to be commonly used in the synthesis method of oligonucleotides.
  • the literature for example, Current Protocols in Nucleic
  • a typical example of the hydroxyl group at the 5'position used in the present specification is not particularly limited as long as it is a group that can be deprotected under acidic conditions and is used as a protecting group for the hydroxyl group, but for example, a trityl group.
  • 9- (9-phenyl) xanthenyl group, 9-phenylthioxanthenyl group, 1,1-bis (4-methoxyphenyl) -1-phenylmethyl group (abbreviated as dimethoxytrityl group (DMTr)), 1-( 4-Methoxyphenyl) -1,1-diphenylmethyl group (abbreviated as monomethoxytrityl group) and the like can be mentioned.
  • a dimethoxytrityl group and a monomethoxytrityl group are preferable.
  • the same group as the hydroxyl group at the 5'position can be taken, but the protecting group for the hydroxyl group at the 3'position is preferably pseudo. It may have a solid-phase protecting group.
  • the pseudo-solid phase protecting group means a hydrophobic group that functions as a soluble resin that imitates a resin in a solid phase synthesis method, and is, for example, a document (for example, WO2012 / 157723A1, JP-A-2010). -275254, WO2019 / 131719A1, and Chem. Eur. J. 2013, 19, 8615-8620).
  • a document for example, WO2012 / 157723A1, JP-A-2010).
  • the formula (II) described in WO2019 / 131719A1 The groups indicated by are mentioned. Specific examples of the pseudo-solid phase protecting group include However, it is not limited to this.
  • Examples of the protecting group for the hydroxyl group in the phosphoric acid ester at the 5'position or the thiophosphate ester used in the present specification include a cyanoethyl group (abbreviated as CE).
  • the protecting group of the primary amine group existing in the nucleic acid base site at the 1'position used in the present specification is a group that can be deprotected by treatment with ammonia and is used as an amino protecting group. If there is, there is no particular limitation.
  • a typical example is an isopropylcarbonyl group.
  • the fully protected oligonucleotide used in this step uses a nucleotide compound in which the 3'-hydroxyl group is protected with a pseudo solid-phase protecting group as a starting material by using the method of nucleotide oligomerization used in the usual method for producing oligonucleotides. It can be manufactured by using it.
  • the nucleotide compound in which the 3'-hydroxyl group is protected by a pseudo-solid-phase protecting group can be produced by using the method described in the literature showing the above-mentioned pseudo-solid-phase protecting group, but is limited to these production methods. It is not something that is done.
  • the amount of solvent used can be about 100-500 mL with respect to 10 g of the total oligonucleotide used as the reaction substrate, the amount of which is the type of fully protected oligonucleotide used and the amount. It may vary depending on the type of solvent used.
  • the temperature in the reaction of step 1 may vary depending on the reaction substrate or the like used, but for example, it can be usually carried out under ice-cooling to high temperature (about 40 ° C. to about 100 ° C.), preferably from room temperature to high temperature. It is below (about 40 ° C. to about 80 ° C.), typically about 25 ° C.
  • the reaction time may vary depending on the reaction substrate used, the reaction temperature and the like, but is usually from several minutes to several hours (typically about 2 hours).
  • the reaction system used in step 1 can be carried out in either the atmosphere or the atmosphere of an inert gas (for example, nitrogen or argon), but it is preferably carried out in an atmosphere of an inert gas.
  • step 2 The solution after the reaction in step 1 is applied to step 2 as it is.
  • Step 2 a weakly nucleophilic base is added to the solution prepared in step 1 and reacted with the fully protected oligonucleotide in the solution prepared in step 1, and the phosphoric acid moiety of the fully protected oligonucleotide (that is, that is). , The protecting group of phosphoric acid) is deprotected.
  • weakly nucleophilic base acts to deprotect the protecting group of a hydroxyl group in a fully protected oligonucleotide as a reaction substrate or a hydroxyl group in a thiophosphate. It means a weakly nucleophilic base that does not affect the protecting group of the primary amine group existing in the nucleic acid base site at the 1'position.
  • weakly nucleophilic bases include, but are not limited to, triethylamine and diethylamine. Diethylamine is preferred.
  • the weakly nucleophilic base is added to the solution prepared in step 1 as it is, or in the state of a solution or an aqueous solution diluted with the same solvent as the reaction solvent, while stirring the reaction system appropriately, several times. It can be added by adding or dropping separately.
  • a low temperature for example, a temperature close to the ice-cooled temperature (typically, about 4 ° C.)
  • the amount of the weakly nucleophilic base used can be about 100 molar equivalents to 600 molar equivalents with respect to the amount of the complete oligonucleotide used as the reaction substrate, but the amount is used. It may vary depending on the number and type of nucleotides of the fully protected oligonucleotide.
  • the amount of solvent used can be about 100-600 mL with respect to 10 g of complete oligonucleotide used as the reaction substrate, the amount of which is the type of fully protected oligonucleotide used and the amount. It may vary depending on the type of solvent used.
  • the temperature in the reaction of step 2 may vary depending on the reaction substrate or the like used, but can be carried out, for example, usually from ice-cooled to high temperature (for example, about 40 ° C. to about 100 ° C.), preferably from room temperature. It is under high temperature (eg, about 40 ° C to about 80 ° C), typically about 25 ° C.
  • the reaction time may also vary depending on the reaction substrate used, the reaction temperature, etc., but is usually several minutes to several hours, typically tens of minutes to several hours (eg, about 30 minutes to about 6). Time), typically about 2 hours.
  • the reaction system used in step 2 can be carried out in either the atmosphere or the atmosphere of an inert gas (for example, nitrogen or argon), but it is preferably carried out in an atmosphere of an inert gas.
  • an inert gas for example, nitrogen or argon
  • Completion of the deprotection reaction can be tracked and confirmed by chromatographic and spectroscopic techniques (eg, thin layer liquid chromatography (TLC), or high performance liquid chromatography (HPLC), or mass spectrometry). .. Further, the deprotection of the phosphate group site in the reaction product can be determined by confirming that the phosphoric acid triester site has been changed to the phosphoric acid diester by , for example, 31 P-NMR.
  • TLC thin layer liquid chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Step 3 the weakly nucleophilic base used in step 2, the organic solvent, and acrylonitrile present in the reaction system are distilled off.
  • acrylonitrile (boiling point at about 77 ° C. at normal pressure) is distilled off by distilling the reaction solution after the reaction in step 2 under reduced pressure (for example, using an evaporator). be able to.
  • the degree and completion of acrylonitrile distillation can be tracked and confirmed by chromatographic method of the treated residue (eg, HPLC method or gas chromatogram method).
  • Step 4 the residue obtained in step 3 was treated with aqueous ammonia or a mixture of aqueous ammonia-40% methylamine solution to obtain the phosphoric acid moiety obtained in step 2 by reaction with ammonia.
  • aqueous ammonia Deprotection of the nucleic acid base site of the deprotected oligonucleotide and excision from the pseudo-solid phase carrier are performed.
  • Treatment with aqueous ammonia can deprotect the amino group at the 1'-position nucleobase site and cleave the oligonucleotide product from the pseudo-solid phase carrier to obtain the desired fully deprotected oligonucleotide. Can be manufactured.
  • Ammonia water can be added to the residue prepared in step 3 by adding it all at once, adding it in several times, or dropping it while appropriately stirring.
  • a low temperature for example, a temperature close to the ice cooling temperature (typically, about 4 ° C.)).
  • a 40% aqueous solution of methylamine is subsequently used. May be processed. For example, after adding aqueous ammonia for a certain period of time (for example, several minutes to several hours (typically, about 15 minutes)), a 40% aqueous solution of methylamine is further added for a certain period of time (for example, several minutes to several hours). It may be processed for hours (typically about 15 minutes).
  • the amount of aqueous ammonia used may be from about 5000 molar equivalents to about 50,000 molar equivalents relative to the amount of fully protected oligonucleotide used as the reaction substrate used in step 1.
  • the amount may vary depending on the number and type of nucleotides of the fully protected oligonucleotide used.
  • the temperature in the reaction of step 4 may vary depending on the reaction substrate or the like used, but can be usually carried out from ice-cooled to high temperature (for example, about 40 ° C. to about 100 ° C.), preferably from room temperature. It is under high temperature (eg, about 40 ° C to about 80 ° C), typically about 65 ° C.
  • the reaction time may also vary depending on whether the treatment is carried out with aqueous ammonia or aqueous ammonia-40% methylamine solution, the reaction substrate used, the reaction temperature, etc., but is usually from a few minutes to about 12 Time, typically when treated with aqueous ammonia, from several hours to about 12 hours (eg, about 5-8 hours), and with aqueous ammonia-40% methylamine aqueous solution. In this case, it takes several minutes to several tens of minutes (for example, about 5 minutes to about 30 minutes), and typically about 15 minutes.
  • the reaction system used in step 4 can be carried out in either the atmosphere or the atmosphere of an inert gas (for example, nitrogen or argon), but it is preferably carried out in an atmosphere of an inert gas.
  • an inert gas for example, nitrogen or argon
  • the content of cyanoethylated impurities in the oligonucleotide product obtained as a result of the operation in step 4 can be determined by mass spectrometry (MS) or the like.
  • the content of the cyanoethylated impurities is about 1% by weight or less, preferably about 0.5% by weight or less, more preferably about 0.3% by weight or less, based on the weight of the oligonucleotide product.
  • the oligonucleotide produced by the production method of the present invention is a high-purity oligonucleotide in which all protecting groups in the structural formula are deprotected and substantially free of cyanoethylated impurities. Its structure and the like can be confirmed by various spectroscopic methods (for example, mass spectrometry (MS), proton nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR)).
  • a fully protected oligonucleotide is dissolved in an organic solvent, wherein the organic solvent is a single solvent of a halogen-based solvent or a mixed solvent of a halogen-based solvent and a non-halogen-based organic solvent; 2) A weak nucleophilic base is added to the solution prepared in step 1 to deprotect the protecting group at the phosphate site of the fully protected oligonucleotide; 3) Distillate the weakly nucleophilic base used in the above step, the organic solvent, and acrylonitrile present in the reaction system; A method (hereinafter, may be referred to as “the method of the present invention” in the present specification), including the above, is provided.
  • the cyanoethyl group existing as a protecting group for the hydroxyl group in the phosphate group in the fully protected oligonucleotide as a reaction starting material is eliminated, and then the acrylonitrile is placed at the 1'position in the oligonucleotide. It is possible to suppress the addition to the amino group in the nucleic acid base site. Therefore, according to the method of the present invention, in the method for producing an oligonucleotide using the liquid phase synthesis method, a side reaction which is one of the factors for reducing the purity of the produced oligonucleotide can be suppressed, and a high-purity oligonucleotide can be suppressed. Nucleotides can be given.
  • the reagent was appropriately obtained from the market or produced according to a known method.
  • NMR measurement was performed using Bruker 400MHz, and mass spectrometry was performed using Waters UPLC H-Class / MS Xevo-G2XS QTof.
  • mass spectrometry was performed using Waters UPLC H-Class / MS Xevo-G2XS QTof.
  • normally used instruments were used as various other measuring instruments.
  • oligonucleotides Using oligonucleotides, the inhibitory effect of acrylonitrile produced by deprotection of its phosphate protecting group on the cyanoethyl addition reaction to its nucleobase was investigated.
  • I. Regarding the inhibitory effect of the cyanoethyl addition reaction to the nucleobase using the oligonucleotide tenameric first, an oligonucleotide tenameric consisting of a phosphorothioate bond whose 3'end is protected by a pseudo-solid phase protecting group was produced, and then Using the produced oligonucleotide decameric, a deprotection reaction was carried out under various conditions, and the effect of suppressing subsequent side reactions was investigated.
  • oligothymidylate decamer this oligonucleotide 1 consisting of a phosphorothioate bond whose 3'end is protected with a pseudo-solid phase protecting group (Example 1).
  • Example 1 Production of DMTr-dT-Suc (Compound 2) DMT-dT (Compound 1) (Carbosynth) (8.17 g, 15 mmol) was dissolved in dehydrated dichloromethane (75 mL), wherein triethylamine (6.3 mL, 45 mmol) and succinic anhydride (2.25 g, 22.5 mmol) were dissolved. After the addition, the mixture was stirred at room temperature overnight.
  • the reaction mixture was stirred at 45 ° C. overnight, ethanol (32 mL) was added, and the insoluble material was washed with dichloromethane and filtered through a Kiriyama funnel. The obtained filtrate was concentrated under reduced pressure, methanol (150 mL) was added to the residue, and the precipitated solid was filtered through a Kiriyama funnel. The resulting solid was dissolved in dichloromethane (65 mL), N-methylimidazole (10 mL), colisine (15 mL) and acetic anhydride (10 mL) were added and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Methanol (65 mL) was added to the reaction mixture and the mixture was stirred for 15 minutes.
  • Example 4 (1-4) Production of Phosphorothioate 9-mer (Compound 6) in which the 3'terminal hydroxyl group is protected by a pseudo-solid-state protecting group Using the dimer (Compound 5) synthesized in Step 1-3 as a starting material. , The same procedure as in Step 1-3 was repeated 7 more times to synthesize a phosphorothioate dimer (1.99 g, 0.462 mmol, total yield 92%) (Compound 6).
  • Example 5 Production of phosphorothioate decameric (oligonucleotide 1) in which the 5'-terminal hydroxyl group is protected by a DMTr group and the 3'-terminal hydroxyl group is protected by a pseudo solid-phase protecting group.
  • the synthesized nine-mer (Compound 6) (1.99 g, 0462 mmol) was dissolved in dehydrated dichloromethane (10 mL), in which dT phosphoramidite (559 mg, 0.75 mmol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole were dissolved. (146 mg, 1.13 mmol) was added.
  • oligonucleotide 1 was obtained.
  • Example 6 (1-6): Deprotection reaction of the 5'terminal DMTr group of a phosphorothioate decamer (oligonucleotide 1) in which the 5'terminal hydroxyl group is protected by a DMTr group and the 3'terminal hydroxyl group is protected by a pseudo solid phase protecting group.
  • the protected deca-mer (oligonucleotide 1) (994 mg, 0.2 mmol) prepared in -5) was dissolved in dichloromethane (15 mL), in which 5-methoxyindole (441 mg, 3 mmol), and tri.
  • a solution of fluoroacetic acid (459 ⁇ L, 15 mmol) diluted with dichloromethane (4 mL) was added.
  • Example 7 When deprotection is performed using aqueous ammonia in a state where oligonucleotide 1 is insufficiently dissolved Oligothymidylate decamericate in which the 3'terminal hydroxyl group produced in Example 5 is protected by a pseudo solid-phase protecting group (the above). Oligonucleotide 1) (4.7 mg, 1 ⁇ mol) was weighed into a 1.5 mL screw cap tube and concentrated aqueous ammonia (1 mL) was added. At this time, the solution was in a suspended state, and the oligothymidylate decamer in which the 3'terminal hydroxyl group was protected by a pseudo solid phase protecting group was not completely dissolved.
  • the mixture was heat-treated at 65 ° C. for 10 minutes in a suspended state for deprotection. After the mixture was quickly cooled to 4 ° C, the supernatant was collected, analyzed by UPLC / MS, and the abundance of cyanoethylated by-products was calculated. As a result, about 9.1% of by-products were present. all right. When the same experiment was carried out multiple times, it was confirmed that about 5-10% of by-products were produced with good reproducibility.
  • Example 8 When oligonucleotide 1 is completely dissolved by ultrasonic treatment and then deprotected with aqueous ammonia. Oligothymidylate 10 in which the 3'-terminal hydroxyl group produced in Example 5 above is protected by a pseudo solid-phase protecting group.
  • the weight (oligonucleotide 1) (4.7 mg, 1 ⁇ mol) was weighed into a 1.5 mL screw cap tube, and concentrated aqueous ammonia (1 mL) was added. At this time, the solution was in a suspended state, and the oligothymidylate decamer in which the 3'terminal hydroxyl group was protected by a pseudo solid phase protecting group was not completely dissolved.
  • Example 9 When deprotection is performed using aqueous ammonia-nitromethane in a state where oligonucleotide 1 is insufficiently dissolved 10 amounts of oligothymidylate in which the 3'-terminal hydroxyl group produced in Example 5 above is protected by a pseudo solid-phase protecting group.
  • the body (oligonucleotide 1) (4.7 mg, 1 ⁇ mol) was weighed into a 1.5 mL screw cap tube, and concentrated aqueous ammonia (1 mL) containing 0.5% nitromethane was added.
  • the solution was in a suspended state, and the oligothymidylate decamer (oligonucleotide 1) in which the 3'terminal hydroxyl group was protected by a pseudo solid phase protecting group was not completely dissolved.
  • the mixture was deprotected by heat treatment at 55 ° C. for 10 minutes in a suspended state. After the mixture was quickly cooled to 4 ° C, the supernatant was collected, analyzed by UPLC / MS, and the abundance of cyanoethylated by-products was calculated. As a result, about 7.2% of by-products were present. I understood.
  • Example 10 When oligonucleotide 1 is completely dissolved by ultrasonic treatment and then deprotected with aqueous ammonia-nitromethane. Oligothymidyl in which the 3'-terminal hydroxyl group produced in Example 5 above is protected by a pseudo solid-phase protecting group.
  • the acid deca-mer (oligonucleotide 1) (4.7 mg, 1 ⁇ mol) was weighed into a 1.5 mL screw cap tube, and concentrated aqueous ammonia (1 mL) containing 0.5% nitromethane was added.
  • the solution was in a suspended state, and the oligothymidylate decamer (oligonucleotide 1) in which the 3'terminal hydroxyl group was protected by a pseudo solid phase protecting group was not completely dissolved.
  • the mixture was completely dissolved by ultrasonic waves, it was heat-treated at 55 ° C. for 10 minutes for deprotection. After the mixture was quickly cooled to 4 ° C, the supernatant was collected, analyzed by UPLC / MS, and the abundance of cyanoethylated by-products was calculated. As a result, about 0.3% of by-products were present. I understood.
  • the solution was in a suspended state, and the oligothymidylate decamer (oligonucleotide 1) in which the 3'terminal hydroxyl group was protected by a pseudo solid phase protecting group was not completely dissolved.
  • the mixture was deprotected by heat treatment at 65 ° C. for 10 minutes in a suspended state. After the mixture was quickly cooled to 4 ° C, the supernatant was collected, analyzed by UPLC / MS, and the abundance of cyanoethylated by-products was calculated. As a result, about 0.4% of by-products were found. all right. It was found that the use of methylamine-ammonia water suppressed cyanoethylation without eliminating the suspension. As will be described later, this treatment reaction is known to cause another side reaction to the uracil-thymine base (ring-opening reaction of the pyrimidine ring), which is not preferable as the production method of the present invention.
  • Example 15 (2-2): Production of DMTr-Gmoe-Suc-SR (Compound 9) Pseudo-solid phase protecting group (820 mg, 0.83 mmol) produced according to Patent Document (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-253896) under an argon atmosphere, and DMT-dT-Suc (Compound 8) (894 mg) synthesized in the above step 2-1. , 0.98 mmol) was added dehydrated chloroform (5 mL). Further, diisopropylethylamine (226 ⁇ L, 1.27 mmol), HBTU (483 mg, 1.27 mmol) and dimethylaminopyridine (156 mg, 1.27 mmol) were added thereto.
  • the reaction mixture was stirred at 45 ° C. overnight, and then methanol (20 mL) was added thereto.
  • the obtained mixed solution was concentrated under reduced pressure, methanol (40 mL) was added to the residue, and the precipitated solid was filtered through a Kiriyama funnel.
  • the resulting solid was dissolved in dichloromethane (6.5 mL), N-methylimidazole (1 mL), colisine (1.5 mL) and acetic anhydride (1 mL) were added and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Methanol (6.5 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was stirred for 15 minutes.
  • Example 16 (2-3): Production of HO-Gmoe-Suc-SR (Compound 10) Dichloromethane (8.2 mL) was added to DMTr-Gmoe-Suc-SR (Compound 9) (1.47 g, 0.826 mmol) synthesized in Step 2-2 to dissolve it. Further, pyrrole (298 ⁇ L, 4.3 mmol) and trifluoroacetic acid (411 ⁇ L, 5.37 mmol) were added, and the mixture was stirred for 15 minutes. Methanol (10 mL) was added to the reaction mixture, collagen (1.07 mL) was further added, and the mixture was stirred for 5 minutes.
  • Example 19 (2-6): Production of phosphorothioate 18-mer (oligonucleotide 2) in which the 5'-terminal hydroxyl group is protected by a DMTr group and the 3'-terminal hydroxyl group is protected by a pseudo solid-phase protecting group.
  • the 17-mer (Compound 12) (3.086 g, 0318 mmol) produced was dissolved in dehydrated dichloromethane (10 mL), in which Tmoe phosphoramidite (614 mg, 0.75 mmol) and 5-ethylthio-1H-tetrazole (5-ethylthio-1H-tetrazole) were dissolved. 146 mg, 1.13 mmol) was added.
  • Example 20 (2-7): Production of phosphorothioate 18-mer (oligonucleotide 2) in which the 3'terminal hydroxyl group is protected by a pseudo solid-phase protecting group.
  • the protected 18-mer (oligonucleotide) produced in (2-6) above. 2) (417 mg, 0.2 mmol) was dissolved in dichloromethane (2 mL), to which 5-methoxyindole (88 mg, 0.6 mmol) and trifluoroacetic acid (92 ⁇ L, 1.2 mmol) were added. The mixture was stirred for 15 minutes, methanol (2 mL) and pyridine (100 ⁇ L) were added thereto, and the mixture was stirred for 5 minutes.
  • the oligonucleotide 2 produced above was examined for its inhibitory effect on the deprotection reaction of the nucleobase under various reaction conditions.
  • Example 21 When oligonucleotide 2 is deprotected in a suspended state Weigh the oligonucleotide 2 (2.6 mg, 0.25 ⁇ mol) produced in Example 19 into a 1.5 mL screw cap tube, and concentrate aqueous ammonia (250 ⁇ L). Was added. At this time, the solution was in a suspended state, and the oligonucleotide 2 was not completely dissolved. The mixture was heat-treated at 65 ° C. for 15 minutes in a suspended state. After rapidly cooling the mixture to 4 ° C., a 40% aqueous methylamine solution (250 ⁇ L) was further added thereto, and the mixture was heat-treated at 65 ° C. for 15 minutes.
  • Example 21 is a conventional production method in which both the base portion and the phosphoric acid triester portion are deprotected with aqueous ammonia without deprotecting the phosphoric acid triester in advance.
  • a chromatogram by UPLC / MS analysis of the product of deprotection by the conventional method of Example 21 is shown in FIG.
  • the chromatograms extracted by mass value for each of the target deprotection product (m / z 2374) and acrylonitrile adduct (CE adduct) (m / z 2394) are shown in A), and the results of mass analysis at the top of each peak. Is shown in B).
  • the peak of the chromatogram extracted with the mass value corresponding to the target deprotected product (m / z 2374) had a retention time of 7.24 minutes.
  • the chromatogram extracted with the mass value corresponding to the acrylonitrile adduct m / z 2394 gave a chromatogram with a peak at 7.44 minutes, which was clearly different from the deprotection product in retention time.
  • Example 22 When oligonucleotide 2 is completely dissolved by sonication for deprotection The polynucleotide 2 (2.6 mg, 0.25 ⁇ mol) produced in Example 19 is weighed into a 1.5 mL screw cap tube and concentrated in aqueous ammonia. (250 ⁇ L) was added. At this time, the solution was in a suspended state. After removing the suspension by sonication, the mixture was heat treated at 65 ° C. for 15 minutes. The mixture was rapidly cooled to 4 ° C., an additional 40% aqueous methylamine solution (250 ⁇ L) was added, and the mixture was heat-treated at 65 ° C. for 15 minutes.
  • Example 23 (3) Observation of decyanoethylation reaction using diethylamine by 31 P NMR measurement
  • the 18-mer (oligonucleotide 2) (48 mg, 5 ⁇ mol) synthesized in Example 19 above was dissolved in deuterated chloroform (400 ⁇ L). Diethylamine (100 ⁇ L) was added thereto. 31 It was confirmed by P NMR measurement that the cyanoethyl group at the phosphate triester site was deprotected to form a phosphate diester, and that the deprotection was completed at room temperature for 2 hours.
  • Example 24 (4) Observation of decyanoethylation reaction using triethylamine by 31 P NMR measurement
  • the 18-mer (oligonucleotide 2) (48 mg, 5 ⁇ mol) synthesized in Example 19 above was dissolved in deuterated chloroform (250 ⁇ L). Triethylamine (250 ⁇ L) was added thereto. It was confirmed by 31 P NMR measurement that the cyanoethyl group at the phosphate triester site was deprotected to form a phosphate diester, and that deprotection required about 20 hours.
  • Example 25 When the phosphoric acid triester is deprotected with diethylamine and the oligonucleotide 2 is deprotected with aqueous ammonia, a 50 mL eggplant flask while washing the sample for which the decyanoethylation reaction was completed in Example 23 with chloroform from an NMR tube. And concentrated under reduced pressure. Concentrated aqueous ammonia (5 mL) was added to the residue to dissolve it, and a 250 ⁇ L solution of a portion of the resulting solution was transferred to a 1.5 mL screw cap tube. The mixture was heated at 65 ° C.
  • FIG. 1 shows a chromatogram diagram of the deprotected product according to the production method of the present invention of Example 25 by UPLC / MS analysis.
  • the chromatograms extracted by mass value for each of the target deprotection product (m / z 2374) and acrylonitrile adduct (CE adduct) (m / z 2394) are shown in A), and the results of mass analysis at the top of each peak. Is shown in B).
  • the peak of the chromatogram extracted with the mass value corresponding to the target deprotected product (m / z 2374) had a retention time of 7.22 minutes, and the chromatograph had a retention time consistent with that of the deprotection product shown in FIG. Grams were obtained.
  • Example 11 Although the formation of the cyanoethyl adduct is suppressed without prior treatment, the corresponding reaction condition may cause another side reaction (ring-opening reaction of the pyrimidine ring) to the uracil-thymine base. It is known (see, for example, Non-Patent Document 1), it is difficult to use, and it should be noted that there may be a problem related to another side reaction in terms of suppressing the side reaction, and the conditions used for manufacturing. Is not appropriate.
  • the deprotection conditions for suppressing the formation of the most desirable cyanoethyl adduct are Examples 25 and 26.
  • Table 2 shows a table summarizing the results of comparative studies under each of the deprotection conditions.
  • the acrylonitrile addition in the production of the oligonucleotide by the liquid phase synthesis method By suppressing the acrylonitrile generated by the phosphate protecting group of the oligonucleotide of the present invention from causing the cyanoethylation addition reaction to the nucleic acid base of the oligonucleotide, the acrylonitrile addition in the production of the oligonucleotide by the liquid phase synthesis method. Completely deprotected, high-purity oligonucleotides with few by-products can be produced on a high scale.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造において、オリゴヌクレオチドのリン酸保護基により生じたアクリロニトリルが、オリゴヌクレオチドの核酸塩基へのシアノエチル化付加の副反応を生じるのを抑制する、オリゴヌクレオチドの製造方法を提供する。具体的には、本発明は、液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造方法であって、該方法は、１）完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させ、ここで、該有機溶媒は、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系有機溶媒との混合溶媒である；２）弱求核性塩基を用いて、工程１で調製した溶液中の完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位の保護基を脱保護する；３）前記工程で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する；および、４）工程３において得られた残渣をアンモニア水を用いて処理して、工程２で得られたリン酸部位が脱保護されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基部位の脱保護、および擬似固相担体からの切り出しを行う、ことを含む、当該製造方法、を提供する。

Description

オリゴヌクレオチドの脱保護方法
　本発明は、オリゴヌクレオチドの脱保護方法を提供する。具体的には、本発明は、液相合成によるオリゴヌクレオチドの製造時における副反応、より詳細には、オリゴヌクレオチドのリン酸保護基の脱保護により生じたアクリロニトリルが、オリゴヌクレオチドの核酸塩基へシアノエチル化付加反応を生じるのを抑制する方法に関する。
　近年、核酸医薬の上市が相次ぐとともに多くの核酸医薬の開発が行われるようになってきている。それに伴い、核酸医薬の原薬成分となるオリゴヌクレオチドの大量製造への需要も増大している。オリゴヌクレオチドの大量製造には、従来から利用されてきた固相合成法が現在主流の製造方法であるが、１回の製法で合成できるスケールが数キログラム程度であるという限界がある。そのため、より大量製造に適した製法として、液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造法の開発が行われている。
　液相合成法による大量製造を実現するためには、固相合成と同等の品質のオリゴヌクレオチドの生成を液相合成においても達成する必要がある。一般に、創薬研究の初期段階では小スケールの固相合成により得られたオリゴヌクレオチドが原薬候補として使用される。従って、品質の同等性を保証するためにも、液相合成法による大量製造により得られるオリゴヌクレオチドの品質が、創薬研究の初期段階に使用された固相合成品と同等であることは極めて重要である。
　固相合成法では、一般的に、固相合成機によってオリゴヌクレオチド上の官能基が全て保護された完全保護オリゴヌクレオチドを製造した後、かかる完全保護オリゴヌクレオチドを、塩基性条件下（一般的に、アンモニア水を使用）の処理により、固相担体からの切り出し、核酸塩基部位の脱保護、およびリン酸部位の保護基の除去（すなわち、脱保護）が一括して行われ、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを得る。しかしながら、リン酸部位のシアノエチル基の脱保護時に生じるアクリロニトリルが、オリゴヌクレオチドの核酸塩基（例えば、チミン（Ｔ)、ウラシル（Ｕ)）へ付加するシアノエチル化副反応に起因する不純物（例えば、アクリロニトリル付加物）も同時に生じることが知られている（例えば、特許文献１、および非特許文献１、２および３）。また、ホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチドを製造する際に、アクリロニトリルによるホスホロチオエート結合部位の硫黄原子へ付加する副反応、それに続く脱硫反応によってホスホジエステル体が不純物として生じることも報告されている（例えば、前記非特許文献１）。そして、これら副反応により脱保護されたオリゴヌクレオチドの純度は低下するとともに、この不純物は精製段階で除去することがしばしば困難であり、最終精製品の純度低下の一因となる。
　また、固相合成法と液相合成法とでは、同一の出発化合物から同一の目的物を製造する方法においても、同一の反応経路をとることが困難であり得て、あるいは、同じ反応経路をとり得る場合であっても、それぞれが使用する反応条件（例えば、反応試薬、反応溶媒）が異なることもあり、そのため、固相合成法では可能な処理工程が液相合成法では実施することが困難な場合もあり得て、また、固相合成法では抑制可能である副反応が液相合成法では問題となる場合もある。とりわけ、核酸塩基（例えば、前記特許文献１および非特許文献１および２）またはホスホロチオエート（例えば、非特許文献１）へのアクリロニトリルの付加による副反応に起因する不純物の生成は、液相合成法を用いるオリゴヌクレオチドの製造における主要な問題の１つである。
　例えば、固相合成法におけるオリゴヌクレオチドのシアノエチル化副反応の一般的な回避法としては、以下のような手順で脱保護が行われている（例えば、特許文献２、３および４、および非特許文献４）。まず、合成終了後に固相に担持された完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位のシアノエチル基の脱保護を弱求核性の塩基溶液で処理し、リン酸部位の保護基のみを脱保護する。次に、リン酸部位が脱保護されたオリゴヌクレオチドは固相担体に結合したままであるため、固相担体を洗浄することによって生じたアクリロニトリルを除去する。最後に、塩基（例えば、アンモニア水）を用いて、固相担体からのオリゴヌクレオチドの切り出し及び塩基部位の脱保護を行い、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを得る。
　一方で、液相合成法を用いる製造法においては、上述した固相合成で採用するようなリン酸部位からのシアノエチル基の脱保護及びそれに続く固相の洗浄によるアクリロニトリルの除去の工程をそのまま適応するのは難しいため、アクリロニトリル付加による不純物の副生の抑制は容易ではない。
　また、固相合成方法において、上記の塩基等の処理液中にアクリロニトリルを捕捉する試薬を共存させて脱保護反応を実施することにより、不純物の副生を抑制する方法も報告されている（例えば、前記特許文献１および特許文献５）。
　そこで、液相合成法において、脱保護により生じるアクリロニトリルの付加による不純物の副生を抑制する効果的な脱保護の方法が求められている。
特開２００４－５０３５６１ ＷＯ　２００９／１３０３２８Ａ１ 特開２０００－２２６３９９ ＷＯ　２０００－０４６２３１Ａ１ 特開２００８－２０８１３５
Comprehensive Medicinal Chemistry III 2017, 233-279 Molecules 2010, 15, 7509-7531 Tetrahedron Letters, 2005, 46, 4251-4253 Organic Process Research & Development 2003, 7, 832-838
　本発明は、オリゴヌクレオチドの脱保護方法を提供する。具体的には、本発明は、液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造時における副反応、より詳細には、オリゴヌクレオチドのリン酸保護基により生じたアクリロニトリルが、オリゴヌクレオチドの核酸塩基へのシアノエチル化付加反応を生じるのを抑制する方法を提供する。
　本発明は、液相合成法により合成された完全保護オリゴヌクレオチドが固相合成に用いられる溶媒とは異なる特定の溶媒に完全に溶解させた後、特定の弱求核性の塩基を用いることによりリン酸部位のシアノエチル保護基を選択的に脱保護することができ、次に、脱保護が完了した後、減圧下で留去することにより、アクリロニトリルを除去することができ、さらに、リン酸部位が脱保護されたオリゴヌクレオチドはアンモニア水への溶解性をも改善され得ることから、アンモニア水を用いて核酸塩基部の脱保護および擬似固相担体からの切り出しを行うことができ、アクリロニトリル付加物がほとんど副生していない、完全脱保護された高純度のオリゴヌクレオチドを大スケールで製造することができる製造方法を見出した。
　すなわち、本発明は、以下の態様を提供するが、これに限定されるものではない。
（液相合成法による、高純度のオリゴヌクレオチドの製造方法）
項［１］　液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造方法であって、
　該方法は、
１）完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させ、ここで、該有機溶媒は、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系有機溶媒との混合溶媒である；
２）弱求核性塩基を用いて、工程１で調製した溶液中の完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位の保護基を脱保護する；
３）前記工程で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する；および、
４）工程３において得られた残渣をアンモニア水を用いて処理して、工程２で得られたリン酸部位が脱保護されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基部位の脱保護、および擬似固相担体からの切り出しを行う、
ことを含む、当該製造方法。
項［２］　工程１におけるハロゲン系溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素、または１，１，２，２－テトラクロロエタンから選ばれる少なくとも１つの溶媒である、項［１］に記載の製造方法。
項［３］　工程１における非ハロゲン系溶媒が、アルコール系溶媒、ニトリル系溶媒、エーテル系溶媒、または環状エーテル系溶媒から選ばれる少なくとも１種の溶媒である、項［１］または［２］のいずれかに記載の製造方法。
項［３－１］　工程１における非ハロゲン系溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、または１，４－ジオキサンから選ばれる少なくとも１つの溶媒である、項［１］または［２］のいずれかに記載の製造方法。
項［４］　工程２における弱求核性塩基が、ジエチルアミンまたはトリエチルアミンである、項［１］～［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［５］　工程１における完全保護オリゴヌクレオチドが、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴヌクレオチドである、項［１］～［４］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［５－１］　擬似固相保護基が、公知の擬似固相保護基である、項［５］に記載の製造方法。
項［６］　工程１において溶解が、完全な溶解であることを含む、項［１］～［５］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［６－１］　工程１における溶解が超音波を行って溶解を行う、項［１］～［５］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［７］　工程１において使用する完全保護オリゴヌクレオチドが、５量体以上である、項［１］～［６］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［７－１］　工程１において使用する完全保護オリゴヌクレオチドが、５量体～７０量体である、項［１］～［６］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［８］　高純度オリゴヌクレオチドが、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドである、項［１］～［７］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［９］　製造されたオリゴヌクレオチドが、当該オリゴヌクレオチドの重量に対する、シアノエチル化された不純物の含有量が１％以下である、項［１］～［８］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［９－１］　製造されたオリゴヌクレオチドが、当該オリゴヌクレオチドの重量に対する、シアノエチル化された不純物の含有量が０．５％以下である、項［１］～［８］のいずれか１項に記載の製造方法。
項［９－２］　製造されたオリゴヌクレオチドが、当該オリゴヌクレオチドの重量に対する、シアノエチル化された不純物の含有量が０．３％以下である、項［１］～［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
（液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造における副反応の抑制方法）
項［１０］　液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造における、アクリロニトリルの付加による副反応を抑制するための方法であって、
１）完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させ、ここで、該有機溶媒は、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系有機溶媒との混合溶媒である；
２）弱求核性塩基を用いて、工程１で調製した溶液中の完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位の保護基を脱保護する；
３）前記工程で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する； 
ことを含む、方法。
項［１１］　アクリロニトリルが、液相合成法によって得られたオリゴヌクレオチドのリン酸部位の脱保護により生成したアクリロニトリルである、項［１０］に記載の方法。
項［１２］　工程１における完全保護オリゴヌクレオチドが、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴヌクレオチドである、項［１０］または［１１］のいずれかに記載の方法。
項［１３］　工程１におけるハロゲン系溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素、または１，１，２，２－テトラクロロエタンから選ばれる少なくとも１つの溶媒である、項［１０］～［１２］のいずれか１項に記載の方法。
項［１４］　工程１における非ハロゲン系溶媒が、アルコール系溶媒、ニトリル系溶媒、エーテル系溶媒、または環状エーテル系溶媒から選ばれる少なくとも１種の溶媒である、項［１０］～［１３］のいずれか１項に記載の方法。
項［１４－１］　工程１における非ハロゲン系溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、または１，４-ジオキサンから選ばれる少なくとも１つの溶媒である、項［１０］～［１３］のいずれか１項に記載の方法。
項［１５］　工程２における弱求核性塩基が、ジエチルアミンまたはトリエチルアミンである、項［１０］～［１４］のいずれか１項に記載の製造方法。
　本発明の液相合成方法による高純度のオリゴヌクレオチドの製造方法により、アクリロニトリル付加反応に由来する不純物を実質的に含有しない高純度のオリゴヌクレオチドを簡便に製造することができる。
図１は、実施例２５における、本発明の製造方法によって製造したオリゴヌクレオチド中の、アクリロニトリル付加不純物（CE adduct）の存在比を、超高速液体クロマトグラム／質量分析法（ＵＰＬＣ／ＭＳ）を用いて測定した結果を示す図面である。目的物である脱保護生成物（m/z 2374）およびアクリロニトリル付加不純物（CE adduct）（m/z 2394）の各々についてマス値で抽出したクロマトグラムをＡ）に、各ピークトップのマス分析結果をＢ）に示す。 図２は、実施例２１における、従来の製法によって製造したオリゴヌクレオチド中の、アクリロニトリル付加不純物（CE adduct）の存在比を、超高速液体クロマトグラム／質量分析法（ＵＰＬＣ／ＭＳ）を用いて測定した結果を示す図面である。目的物である脱保護生成物（m/z 2374）およびアクリロニトリル付加不純物（CE adduct）（m/z 2394）の各々についてマス値で抽出したクロマトグラムをＡ）に、各ピークトップのマス分析結果をＢ）に示す。
　以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
　本明細書および特許請求の範囲中で使用する用語の定義を示す。特に記述がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。なお、本明細書において引用された全ての刊行物に記載されている構築物および方法論を、記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み込まれる。
（液相合成法による、高純度のオリゴヌクレオチドの製造方法）
　本発明の１態様によれば、液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造方法であって、
　該方法は、
１）完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させ、ここで、該有機溶媒は、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系有機溶媒との混合溶媒である；
２）弱求核性塩基を用いて、工程１で調製した溶液中の完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位の保護基を脱保護する；
３）前記工程で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する；および、
４）工程３において得られた残渣をアンモニア水を用いて処理して、工程２で得られたリン酸部位が脱保護されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基部位の脱保護、および擬似固相担体からの切り出しを行う、
ことを含む、製造方法（以下、本明細書中に「本発明の製造方法」と呼称することがある）、を提供する。
　本明細書中で使用する用語「液相合成法」とは、本発明が属する当該分野で通常知られるオリゴヌクレオチドの製造方法における、反応系内の全ての反応溶質が溶解した液体の状態でオリゴヌクレオチドの製造を行う合成法を意味し、文献（例えば、Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2017, 13, 1368-1387）が知られるが、これらに記載される方法に限定されるものではない。
　上記の通り、本発明の製造方法は、下記の工程１）～工程４）で構成される。以下、各工程を説明する。
（工程１）
　工程１においては、反応基質としての完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させる。
　ここで、「有機溶媒」とは、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系溶媒との混合溶媒を意味し、反応基質として使用する完全保護オリゴヌクレオチドの溶解度等の反応条件に応じて、いずれの場合であってもよい。「ハロゲン系溶媒」の例としては、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素、および１,１,２,２－テトラクロロエタンから選ばれる少なくとも１つの溶媒を挙げられるが、これらに限定されるものではない。ジクロロメタン、クロロホルム、またはジクロロエタンが好ましく、ジクロロメタンまたはクロロホルムがより好ましい。
　ここで、「非ハロゲン系有機溶媒」とは、アルコール系溶媒、ニトリル系溶媒、およびエーテル系溶媒から選ばれる少なくとも１種の溶媒を意味する。具体的な非ハロゲン系有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノール等のアルコール系溶媒；アセトニトリルおよびプロピオニトリル等のニトリル系溶媒；ジエチルエーテル、テトラヒドロフランおよび１,４－ジオキサン等のエーテル系溶媒が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アルコール系溶媒が好ましく、メタノールおよびエタノールがより好ましい。
　ここで、本明細書中で使用する用語「溶解」とは、反応基質としての完全保護オリゴヌクレオチドが反応溶媒中に完全に溶解または高度に分散した状態（例えば、目視にて反応液の懸濁が確認できない状態を意味する）を含み、本発明の製造方法において生じ得る副反応（特に、核酸塩基へのシアノエチル化付加反応）を最大限抑制するためには、完全に溶解された状態が好ましい。また、完全保護オリゴヌクレオチドは反応溶媒に対する溶解度が低い傾向があるために、完全に溶解させるために、溶液を撹拌しながら、且つ必要に応じて通常の有機合成の手法で使用される超音波処理機を用いて超音波処理を行ってもよい。
　本願明細書中で使用する用語「完全保護オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドを構成する全てのヌクレオチド分子中の全ての官能基（例えば、３’位－および５’位－の各水酸基、５’位－リン酸エステル基もしくはチオリン酸エステル基の水酸基、２’位水酸基、および１’位－の核酸塩基部位内の環上に存在する第１級アミノ基）がそれぞれ適当な保護基で置換されたオリゴヌクレオチドを意味する。
　本明細書中で使用する用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのエステル、例えば、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。
　本明細書中で使用する用語「ヌクレオシド」とは、糖部分（例えば、リボース糖など）、糖部分の誘導体、又は糖部分と官能価が同等なもの（例えば、炭素環等の類似体）と共有結合した塩基または塩基性基（例えば、少なくとも１つの同素環、少なくとも１つの複素環、少なくとも１つのアリール基など）を含む核酸成分を意味する。例えば、ヌクレオシドが糖部分を含む場合には、典型的には塩基が糖部分の１’位に結合する。塩基は、後記のものを挙げられる。
　本明細書中で使用する用語「オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも２個のヌクレオチド、典型的には３個以上（例えば、４個）のヌクレオチド、より典型的には室温にて相補鎖による２本鎖形成が可能な１０個を超えるヌクレオチドを含む核酸を意味し、ヌクレオチドの総数は、本発明においてｎで示す。オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの総数（ｎ）は、５以上（すなわち、５量体以上）であり、通常５～１００以上（すなわち、５量体～１００量体以上）であり、５～７０以上（すなわち、５量体～７０量体以上）であることが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、一本鎖のヌクレオチド、又はそれらの糖部分に２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン架橋または２’－Ｏ－アルキル基、２’－フルオロ基を有するヌクレオチド等の、その化学修飾物（例えば、架橋構造型人工核酸（ＢＮＡ：Bridged Nucleic Acid））などが挙げられる。ＢＮＡとしては、例えば、ロックト人工核酸（ＬＮＡ：Locked Nucleic Acid）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ：２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ethylenebridged Nucleic Acid）などが挙げられる。以下に、本発明に用いることができるＬＮＡ及びＥＮＡを含むＢＮＡの具体的な構造（ヌクレオシド部分）を、国際公開第2016/006697号公報に記載の図を引用して示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　修飾物としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチドの修飾された骨格が挙げられ、典型的には、Micklefield（２００１年）の「Current Medicinal Chemistry」８：１１５７－１１７０に記載されている、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、メチルホスホネートＤＮＡ等の修飾物が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、前記のヌクレオチドおよび前記の修飾物の任意の組み合わせからなる。
　本明細書中で使用する、１’位の核酸塩基部位は、「Ｂａｓｅ」とも表わされ、シアノエチル基が付加する塩基性アミノ基を有する核酸塩基であればよく、天然の核酸塩基部分（例えば、チミン、ウラシル）または非天然（すなわち、人工）の核酸塩基が挙げられるが、天然の核酸塩基部位が好ましい。具体的な核酸塩基部位としては、チミン及びウラシルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　上記保護基は、それぞれの保護される官能基に応じて異なり得て、通常オリゴヌクレオチドの合成法において使用し得ることが知られる基を挙げることができ、例えば、文献（例えば、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2000, 00, 2.1.1-2.1.17.およびCurrent Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2000, 00, 2.2.1-2.2.24.）中に記載される基を挙げることができる。
　本明細書中で使用する、５’位の水酸基の典型例としては、酸性条件下で脱保護可能であり、水酸基の保護基として用いられる基であれば、特に限定はされないが、例えばトリチル基、９－（９－フェニル）キサンテニル基、９－フェニルチオキサンテニル基、１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－１－フェニルメチル基（ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）と略す）、１－（４－メトキシフェニル）－１，１－ジフェニルメチル基（モノメトキシトリチル基と略す）等を挙げることができる。ジメトキシトリチル基、およびモノメトキシトリチル基が好ましい。
　本明細書中で使用する、３’位の水酸基の保護基の典型例としては、上記５’位の水酸基と同じ基をとり得るが、３’位末端の水酸基の保護基は、好ましくは擬似固相保護基を有し得る。
　本明細書中で使用する、擬似固相保護基とは、固相合成法における樹脂を模した可溶性樹脂として機能する疎水性基を意味し、例えば、文献（例えば、ＷＯ２０１２／１５７７２３Ａ１、特開２０１０－２７５２５４、ＷＯ２０１９／１３１７１９Ａ１、およびChem. Eur. J. 2013, 19, 8615-8620）中で記載されている公知の擬似固相保護基を挙げられる。典型的な例としては、ＷＯ２０１９／１３１７１９Ａ１中に記載の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で示される基を挙げられる。擬似固相保護基の具体例としては、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　本明細書中で使用する、５’位のリン酸エステルまたはチオリン酸エステル内の水酸基の保護基としては、シアノエチル基（ＣＥと略す）を挙げられる。
　本明細書中で使用する、１’位の核酸塩基部位内に存在する第１級アミン基の保護基としては、アンモニアを用いた処理により脱保護可能であり、アミノ保護基として用いられる基であれば、特に限定されない。典型的な例としては、イソプロピルカルボニル基を挙げることができる。
　本工程で使用する完全保護オリゴヌクレオチドは、通常のオリゴヌクレオチドの製法において用いられるヌクレオチドのオリゴマー化の手法を用いて、３’位水酸基が擬似固相保護基で保護されたヌクレオチド化合物を出発物質として用いることによって、製造することができる。ここで、３’ 位水酸基が擬似固相保護基で保護されたヌクレオチド化合物は、上記の擬似固相保護基について示した文献に記載の手法を用いることによって製造し得るが、これらの製法に限定されるものではない。
　工程１において、溶媒の使用量は、反応基質としての完全オリゴヌクレオチドの使用量１０ｇに対して、約１００～５００ｍＬの量であり得るが、その量は、使用する完全保護オリゴヌクレオチドの種類、および使用する溶媒の種類に応じて変わり得る。
　工程１の反応における温度は、使用する反応基質等に応じて変わり得るが、例えば、通常氷冷下から高温（約４０℃～約１００℃）下で行うことができ、好ましくは室温から高温下（約４０℃～約８０℃）下であり、典型的には約２５℃である。反応時間は、使用する反応基質および反応温度等に応じて変わり得るが、通常、数分間から数時間（典型的には、約２時間）である。また、工程１で使用される反応系は、大気下または不活性ガス（例えば、窒素、またはアルゴン）雰囲気下のいずれでも行うことができるが、不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましい。
　工程１の反応後の溶液は、そのまま工程２に適用する。
（工程２）
　工程２においては、上記工程１で調製した溶液に、弱求核性塩基を加えて、工程１で調製した溶液中の完全保護オリゴヌクレオチドと反応させて、完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位（すなわち、リン酸の水酸基）の保護基を脱保護する。
　本明細書中で使用する用語「弱求核性塩基」とは、反応基質としての完全保護オリゴヌクレオチド内のリン酸エステルまたはチオリン酸エステル内の水酸基の保護基を脱保護するのに作用する一方で、１’位の核酸塩基部位内に存在する第１級アミン基の保護基には影響を及ぼさない弱求核性の塩基を意味する。弱求核性塩基の典型例としては、トリエチルアミン、およびジエチルアミンを挙げられるが、これらに限定されない。ジエチルアミンが好ましい。
　弱求核性塩基は、工程１で調製した溶液中に、そのままで、または反応溶媒と同じ溶媒で希釈した溶液もしくは水溶液の状態で、反応系を適宜撹拌しながら、一度に添加する、数回に分けて添加する、または滴下する、ことにより、加えることができる。弱求核性塩基を、溶液中に加える際には、低温（例えば、氷冷温度近くの温度（典型的には、約４℃））で行うことが好ましい。
　工程２の反応において、弱求核性塩基の使用量は、反応基質としての完全オリゴヌクレオチドの使用量に対して、約１００モル当量～６００モル当量の量であり得るが、その量は、使用する完全保護オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのオリゴ数および種類などに応じて変わり得る。
　工程２において、溶媒の使用量は、反応基質としての完全オリゴヌクレオチドの使用量１０ｇに対して、約１００～６００ｍＬの量であり得るが、その量は、使用する完全保護オリゴヌクレオチドの種類、および使用する溶媒の種類に応じて変わり得る。
　工程２の反応における温度は、使用する反応基質等に応じて変わり得るが、例えば、通常氷冷下から高温（例えば、約４０℃～約１００℃）下で行うことができ、好ましくは室温から高温（例えば、約４０℃～約８０℃）下であり、典型的には約２５℃である。反応時間はまた、使用する反応基質および反応温度等に応じて変わり得るが、通常、数分間から数時間であり、典型的には数十分間から数時間（例えば、約３０分間～約６時間）であり、典型的には約２時間である。
　また、工程２で使用される反応系は、大気下または不活性ガス（例えば、窒素、またはアルゴン）雰囲気下のいずれでも行うことができるが、不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましい。
　脱保護反応の完結は、クロマトグラム法および分光学的手法（例えば、薄層液体クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、もしくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または質量分析法）によって、追跡及び確認することができる。
　また、反応生成物におけるリン酸基部位の脱保護は、例えば３１Ｐ－ＮＭＲによってリン酸トリエステル部位がリン酸ジエステルへと変化したことを確認することで判断できる。
　工程２の反応後の溶液は、そのまま工程３に使用する。
（工程３）
　工程３において、前記工程２で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する。
　工程３における留去の手法としては、工程２の反応後の反応溶液を、減圧下で蒸留（例えば、エバポレーターを使用）することによって、アクリロニトリル（常圧で約７７℃の沸点）を留去することができる。アクリロニトリルの留去の程度及び完了は、処理後の残渣のクロマトグラム法（例えば、ＨＰＬＣ法またはガスクロマトグラム法）によって追跡及び確認することができる。
（工程４）
　工程４においては、前記工程３において得られた残渣を、アンモニア水またはアンモニア水－４０％メチルアミン水溶液の混合物を用いて処理して、アンモニアとの反応によって工程２で得られたリン酸部位が脱保護されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基部位の脱保護、および擬似固相担体からの切り出しを行う。アンモニア水を用いて処理することによって、１’位の核酸塩基部位のアミノ基上の脱保護、および擬似固相担体からのオリゴヌクレオチド生成物を切り出すことができ、所望する完全脱保護オリゴヌクレオチドを製造することができる。
　アンモニア水は、工程３で調製した残渣に、適宜撹拌しながら、一度に添加する、数回に分けて添加する、または滴下する、ことにより、加えることができる。アンモニア水を、残渣に加える際には、低温（例えば、氷冷温度近くの温度（典型的には、約４℃））で行うことが好ましい。
　アンモニア水－４０％メチルアミン水溶液の混合物を用いて処理する場合には、これら混合物を一度に添加してもよく、あるいは、アンモニア水を用いて処理した後に、続いて４０％メチルアミン水溶液を用いて処理してもよい。例えば、アンモニア水を加えて一定時間（例えば、数分間～数時間（典型的には、約１５分間））処理した後に、更に４０％メチルアミン水溶液を加えて一定時間（例えば、数分間～数時間（典型的には、約１５分間））処理してもよい。
　工程４の反応において、アンモニア水の使用量は、工程１で使用する反応基質としての完全保護オリゴヌクレオチドの使用量に対して、約５０００モル当量～約５００００モル当量の量であり得るが、その量は、使用する完全保護オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのオリゴ数および種類などに応じて変わり得る。
　工程４の反応における温度は、使用する反応基質等に応じて変わり得るが、例えば、通常氷冷下から高温（例えば、約４０℃～約１００℃）下で行うことができ、好ましくは室温から高温下（例えば、約４０℃～約８０℃）下であり、典型的には約６５℃である。反応時間はまた、アンモニア水、またはアンモニア水－４０％メチルアミン水溶液のいずれを用いて処理するか、および、使用する反応基質および反応温度等に応じて変わり得るが、通常、数分間から約１２時間であり、典型的にはアンモニア水を用いて処理する場合には、数時間から約１２時間（例えば、約５～８時間）であり、またアンモニア水－４０％メチルアミン水溶液を用いて処理する場合には、数分間から数十分間（例えば、約５分間～約３０分間）であり、典型的には約１５分間である。
　また、工程４で使用される反応系は、大気下または不活性ガス（例えば、窒素、またはアルゴン）雰囲気下のいずれでも行うことができるが、不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましい。
　工程４の操作の結果得られたオリゴヌクレオチド生成物中の、シアノエチル化された不純物の含有量は、質量分析（ＭＳ）等を行うことによって、その存在比率を決定することができる。シアノエチル化された不純物の含有量は、オリゴヌクレオチド生成物の重量に対して、約１％重量以下、好ましくは約０．５％重量以下、より好ましくは約０．３％重量以下、である。
　本発明の製造方法によって製造される、オリゴヌクレオチドは、構造式中の保護基が全て脱保護され、シアノエチル化された不純物を実質的に含有しない高純度のオリゴヌクレオチドである。その構造等は、種々の分光学的手法（例えば、質量分析（ＭＳ）、プロトン核磁気共鳴法（１Ｈ－ＮＭＲ））によって確認することができる。
（液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造における副反応の抑制方法）
　本発明の１態様によれば、
　液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造における、アクリロニトリルの付加による副反応を抑制するための方法であって、
１）完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させ、ここで、該有機溶媒は、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系有機溶媒との混合溶媒である；
２）工程１で調製した溶液に、弱求核性塩基を加えて、完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位の保護基を脱保護する；
３）前記工程で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する； 
ことを含む、方法（以下、本明細書中、「本発明の方法」と呼称することがある）、を提供する。
　本発明の方法により、反応出発物質としての完全保護オリゴヌクレオチド内のリン酸基内の水酸基の保護基として存在するシアノエチル基が脱離して、その後に、当該アクリロニトリルがオリゴヌクレオチド内の１’位の核酸塩基部位内のアミノ基に付加することを抑制することができる。従って、本発明の方法により、液相合成法を用いたオリゴヌクレオチドの製造方法において、生成するオリゴヌクレオチドの純度を低下させる要因の１つである副反応を抑制することができ、高純度のオリゴヌクレオチドを与えることができる。
　本発明の製造方法の１実施態様の例を、下記反応式に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明の実施例を、下記に実施例として記載するが、これらに限定されるものではない。
　試薬は、適宜、市販のものを入手するか、あるいは公知の方法に従って製造した。また、実施例中、NMR測定はBrucker 400MHzを、質量分析はWaters UPLC　H-Class/MS Xevo-G2XS QTofを用いて測定を行った。また、それ以外の各種測定機器は、通常使用される機器を使用した。
　後述の実施例、図表等で使用する略号の表記は以下の表１に記載のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　オリゴヌクレオチドを用いて、そのリン酸保護基の脱保護により生じたアクリロニトリルが、その核酸塩基へシアノエチル付加反応することの抑制効果を調べた。
Ｉ．オリゴヌクレオチド１０量体を用いた、核酸塩基へのシアノエチル付加反応の抑制効果について
　まず、３’末端が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート結合からなるオリゴヌクレオチド１０量体を製造し、次いで、製造したオリゴヌクレオチド１０量体を用いて、各種条件下で脱保護反応を行い、続く副反応の抑制効果を調べた。
３’末端が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート結合からなるオリゴチミジル酸１０量体（本オリゴヌクレオチド１）の製造
（実施例１）
（１－１）DMTr-dT-Suc（化合物２）の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　DMT-dT（化合物１）（Carbosynth製）（8.17 g, 15 mmol）を脱水ジクロロメタン（75 mL）に溶解し、そこにトリエチルアミン（6.3 mL, 45 mmol）および無水コハク酸（2.25 g, 22.5 mmol）を加えた後、混合物を室温にて終夜攪拌した。反応混合物にメタノール（2.0 mL）を加え、混合物を２時間攪拌した。得られた混合溶液をリン酸トリエチルアミン緩衝液（pH 約6.8）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させた。得られた有機層を減圧濃縮し、DMTr-dT-Suc（11.35 g）（化合物２）をトリエチルアンモニウム塩として定量的に得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 1.15 (t, 9 H), 1.33 (s, 3H), 2.41-2.62 (m, 6H), 2.81(q, 6H), 3.46 (d, 2H), 3.79 (s, 6H), 4.17 (d, 1H), 5.47 (d, 1H), 6.43 (dd, 1H), 6.81-6.85 (m, 4H), 7.21-7.37 (m, 5H), 7.39-7.40 (m. 2H), 7.62 (d, 1H).
（実施例２）
（１－２）HO-dT-Suc-SR（化合物４）の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 　アルゴン雰囲気下、特許文献（特開２００１－２５３８９６）により合成した擬似固相保護基（11.8 g, 12 mmol）、および前述の工程１－１で合成したDMT-dT-Suc（11.3 g）の混合物に脱水クロロホルム（75 mL）を加えた。そこに、さらにジイソプロピルエチルアミン（3.3 mL, 18.7 mmol）、HBTU（7.1 g, 18.7 mmol）およびジメチルアミノピリジン（2.3 g, 18.7 mmol）を加えた。反応液を45℃で一晩攪拌した後、エタノール（32 mL）を加え、不溶物をジクロロメタンで洗いつつ桐山ロートでろ過した。得られたろ液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（150 mL）を加え、析出した固形物を桐山ロートでろ過した。得られた固形物をジクロロメタン（65 mL）に溶解させ、N-メチルイミダゾール（10 mL）、コリジン（15 mL）および無水酢酸（10 mL）を加え、混合物を室温で2時間攪拌した。反応液にメタノール（65 mL）を加え、混合物を15分間攪拌した。その後、反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣にメタノール（100 mL）を加え、析出した固形物を桐山ロートによりろ取してDMTr-dT-Suc-SR（化合物３）を得た。つづいてDMTr-dT-Suc-SR（化合物３）にジクロロメタン（120 mL）を加えて溶解させた。そこに、さらにピロール（4.35 mL, 62.7 mmol）、トリフルオロ酢酸（6 mL, 78.4 mmol）を加え、混合物を15分間攪拌した。反応液にメタノール（120 mL）を加え、そこに、さらにコリジン（15. 5 mL, 117.5 mmol）を加え5分間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（200 mL）を加えて、析出した固形物を桐山ロートによりろ過し、HO-dT-Suc-SR（15.9 g, 12 mmol, 100%）（化合物４）を無色固体として得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.88 (t, 9 H), 1.26-1.35 (m, 84H), 1.45-1.46 (m, 6H), 1.76-1.78 (m, 6H), 1.92 (s, 3H), 2.37-2.41 (m, 2H), 2.66 (brs, 4H), 3.06 (brs, 3H), 3.61-3.69 (br, 2H), 3.77-3.91 (m, 2H) 3.95-3.98 (m, 6H), 4.07-4.08 (m, 1H), 4.23-4.39 (m, 2H), 5.32 (quin, 1H), 6.22 (t, 1H), 6.60 (s, 2H), 7.52 (brs, 1H), 8.18 (s. 1H).
（実施例３）
（１－３）３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート２量体（HO-dT-ps-dT-Suc-SR）（化合物５）の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　アルゴン雰囲気下、工程１－２で合成したHO-dT-Suc-SR（654 mg, 0.5 mmol）（化合物４）を脱水ジクロロメタン（10 mL）に溶解させ、そこにdTホスホロアミダイト（559 mg, 0.75 mmol）、および5-エチルチオ-1H-テトラゾール（146 mg, 1.13 mmol）を加えた。混合物を室温で1時間攪拌し、出発物質の消失をTLCで確認後、前記特許文献（特開２００１－２５３８９６）により合成した2-シアノエチルオクタデシルジイソプロピルホスホロアミダイト（71 μL, 0.15 mmol）を加え、反応混合物を30分間撹拌した。反応液にエタノール（146 μL, 2.5 mmol）を加え、混合物を室温にて10分間攪拌した。2,6-ジメチルアニリン（174 μL, 1.4 mmol）、POS（228 mg, 1.17 mmol）を加え、混合物を室温にて45分間攪拌した。得られた反応混合物をジクロロメタン（18 mL）で希釈後、5-メトキシインドール（1.10 g, 7.5 mmol）、およびトリフルオロ酢酸（1.15 mL, 15 mmol）をジクロロメタン（9 mL）で希釈した溶液を加えた。混合物を室温にて15分間攪拌し、その後そこにメタノール（25 mL）およびピリジン（2.4 mL）を加えた。反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（50 mL）加え、析出した固形物をろ過し減圧乾燥することで目的化合物（824 mg, 0.49 mmol, 98%）（化合物５）を得た。
（実施例４）
（１－４）３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート９量体（化合物６）の製造
　出発原料として工程１－３で合成した２量体（化合物５）を使用して、工程１－３と同様の手順をさらに7回繰り返すことでホスホロチオエート9量体（1.99 g, 0.462 mmol, 総収率92%）（化合物６）を合成した。
（実施例５）
（１－５）：５’末端水酸基がDMTr基、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート１０量体（オリゴヌクレオチド１）の製造
　アルゴン雰囲気下、上記（１－４）で合成した９量体（化合物６）（1.99 g, 0462 mmol）を脱水ジクロロメタン（10 mL）に溶解させ、そこに、dTホスホロアミダイト（559 mg, 0.75 mmol）、および5-エチルチオ-1H-テトラゾール（146 mg, 1.13 mmol）を加えた。混合物を室温で2時間攪拌し、出発物質の消失をUPLC/MSで確認後、2-シアノエチルオクタデシルジイソプロピルホスホロアミダイト（70 μL, 0.15 mmol）を加え、反応混合物を30分間撹拌した。反応液にエタノール（146 μL, 2.5 mmol）を加え、混合物を室温にて10分間攪拌した。2,6-ジメチルアニリン（147 μL, 1.19 mmol）、およびPOS（193 mg, 1 mmol）を加え、混合物を室温にて45分間攪拌した。その後そこにメタノール（25 mL）を加え、反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（50 mL）加え、析出した固形物をろ過し、減圧乾燥することで無色固体の目的化合物（2.29 g, 0.461 mmol, 99%）（オリゴヌクレオチド１）を得た。
（実施例６）
（１－６）：５’末端水酸基がDMTr基、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート１０量体（オリゴヌクレオチド１）の５’末端DMTr基の脱保護反応
　上記（１－５）で製造した保護された１０量体（オリゴヌクレオチド１）（994 mg, 0.2 mmol）をジクロロメタン（15 mL）に溶解させ、そこに5-メトキシインドール（441 mg, 3 mmol）、およびトリフルオロ酢酸（459 μL, 15 mmol）をジクロロメタン（4 mL）で希釈した溶液を加えた。混合物を15分間攪拌し、そこにメタノール（10 mL）を加え、混合物を5分間攪拌した。さらにそこにピリジン（967 μL）を加え、混合物を5分間攪拌した。その後、反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（20 mL）を加え、析出した固形物を桐山ロートでろ過し、無色固体の目的化合物（本オリゴヌクレオチド１）（882 mg, 0.189 mmol, 95%）を得た。
　次に、上記で製造したオリゴヌクレオチド１について、各種反応条件下でそのリン酸保護基の脱保護により生じたアクリロニトリルが、その核酸塩基へシアノエチル付加反応することの抑制効果を調べた。
（実施例７）
オリゴヌクレオチド１を溶解不十分な状態でアンモニア水を用いて脱保護を行った場合
　上記実施例５により製造した３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）（4.7 mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、濃アンモニア水（1 mL）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体は完全には溶解していない状態であった。懸濁状態のまま混合物を65℃で10分間加熱処理して脱保護を行った。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ9.1%ほど副生成物が存在することがわかった。なお同様の実験を複数回実施したところ、再現よく5-10％ほどの副生成物が生じていることが確かめられた。
（実施例８）
オリゴヌクレオチド１を超音波処理により完全溶解させた後、アンモニア水を用いて脱保護を行った場合
　上記実施例５により製造した３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）（4.7 mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、濃アンモニア水（1 mL）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体は完全には溶解していない状態であった。混合物を超音波により完全溶解させた後、65℃で10分間加熱処理して脱保護を行った。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ1.7%ほど副生成物が存在することがわかった。なお同様の実験を複数回実施したところ、再現よく1-2％ほどの副生成物が生じていることが確かめられた。
（実施例９）
オリゴヌクレオチド１を溶解不十分な状態でのアンモニア水－ニトロメタンを用いて脱保護を行った場合
　上記実施例５により製造した3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）（4.7 mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、0.5%ニトロメタンを含む濃アンモニア水（1 mL）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）は完全には溶解していない状態であった。混合物を懸濁状態のまま55℃で10分間加熱処理して脱保護を行った。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、7.2%ほど副生成物が存在することがわかった。
（実施例１０）
オリゴヌクレオチド１を超音波処理により完全溶解させた後、アンモニア水－ニトロメタンを用いて脱保護を行った場合
　上記実施例５により製造した3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）（4.7 mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、0.5%ニトロメタンを含む濃アンモニア水（1 mL）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）は完全には溶解していない状態であった。混合物を超音波により完全溶解させた後、55℃で10分間加熱処理して脱保護を行った。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、0.3%ほど副生成物が存在することがわかった。
（実施例１１）
オリゴヌクレオチド１を溶解不十分な状態でアンモニア水－メチルアミンを用いて脱保護を行った場合
　上記実施例５により製造した3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）（4.7 mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、濃アンモニア水-40%メチルアミン（1 mL, 1:1 = v/v）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴチミジル酸１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）は完全には溶解していない状態であった。混合物を懸濁状態のまま65℃で10分間加熱処理して脱保護を行った。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ0.4%ほど副生成物が存在することがわかった。メチルアミン－アンモニア水を使用すると、懸濁状態を解消せずともシアノエチル化が抑えられることがわかった。
　なお、後述する通り、本処理反応は、ウラシル・チミン塩基への別の副反応（ピリミジン環の開環反応）を引き起こすことが知られているため、本発明の製法としては好ましくない。
（実施例１２）
オリゴヌクレオチド１を超音波処理により完全溶解させた後、メチルアミン－アンモニア水を用いて脱保護を行った場合
　上記実施例５により製造した前記オリゴヌクレオチド１（4.7 mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、40%メチルアミン水溶液－濃アンモニア水（1 mL, 1:1 = v/v）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、前記オリゴヌクレオチド１は完全には溶解していない状態であった。超音波処理により完全溶解させた後、65℃で10分間加熱処理して脱保護を行った。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、0.4%ほど副生成物が存在することがわかった。
（実施例１３）
オリゴヌクレオチド１を超音波処理により完全溶解させた後、メルカプトエタノール－アンモニア水を用いて脱保護を行った場合
　上記実施例５により製造した前記オリゴヌクレオチド１（4.7 mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、メルカプトエタノール－濃アンモニア水（1 mL, 1:9 = v/v）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、前記オリゴヌクレオチド１は、完全には溶解していない状態であった。混合物を懸濁状態のまま65℃で10分間加熱処理して脱保護を行った。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、0.2%ほどシアノエチル化された副生成物が存在することがわかった。また、アクリルアミド付加体に相当する副生成物が3.9％存在することがわかった。
ＩＩ．オリゴヌクレオチド１８量体を用いた、核酸塩基へのシアノエチル付加反応の抑制効果について
　まず、２’－MOE ホスホロチオエート１８量体（5’-TmoeCmoeAmoeCmoeTmoeTmoeTmoeCmoeAmoeTmoeAmoeAmoeTmoeGmoeCmoeTmoeGmoeGmoe-3’）（本オリゴヌクレオチド２）を製造し、次いで、製造したオリゴヌクレオチド１８量体を用いて、各種条件下で脱保護反応を行い、副反応の抑制効果を調べた。
３’末端が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート結合からなる２’-MOE 18量体（本オリゴヌクレオチド２）の製造
（実施例１４）
（２－１）DMTr-Gmoe-Suc（化合物８）の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　DMT-Gmoe（化合物７）（Carbosynth製）（714 mg, 1 mmol）を脱水ジクロロメタン（5 mL）に溶解し、そこにトリエチルアミン（418 μL, 3 mmol）および無水コハク酸 （150 mg, 1.5 mmol）を加えた後、混合物を室温にて終夜攪拌した。反応混合物にメタノール（200 μL）を加え、混合物を3時間20分攪拌した。得られた混合溶液をリン酸トリエチルアミン緩衝液（pH 約6.8）で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥させた。得られた有機層を減圧濃縮し、無色泡状固体のDMTr-Gmoe-Suc（化合物８）（894 mg, 0.98 mmol, 98%）をトリエチルアンモニウム塩として得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.83 (d, 3 H), 0.98 (d, 3H), 1.18 (t, 9H), 1.85 (quin, 1H), 2.57-2.60 (m, 2H), 2.69-2.72 (m, 2H), 2.88 (q, 6H), 3.17-3.19 (m, 4H), 3.34-3.48 (m, 3H), 3.59-3.72 (m, 2H), 3.77 (d, 6H), 4.26-4.27 (m, 1H), 5.07 (dd, 1H), 5.60 (dd, 1H), 5.82 (d, 1H), 6.77-6.82 (m, 4H), 7.19-7.23 (m. 3H), 7.34-7.36 (m, 4H), 7.48-7.50 (m, 2H), 7.82 (s, 1H), 8.43 (brs, 1H), 12.0 (brs, 1H).
（実施例１５）
（２－２）：DMTr-Gmoe-Suc-SR（化合物９）の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　アルゴン雰囲気下、特許文献（特開２００１－２５３８９６）により製造した擬似固相保護基（820 mg, 0.83 mmol）、前述の工程２－１で合成したDMT-dT-Suc（化合物８）（894 mg, 0.98 mmol）に脱水クロロホルム（5 mL）を加えた。さらにそこにジイソプロピルエチルアミン（226 μL, 1.27 mmol）、HBTU（483 mg, 1.27 mmol）およびジメチルアミノピリジン（156 mg, 1.27 mmol）を加えた。反応液を45℃で一晩攪拌した後、そこにメタノール（20 mL）を加えた。得られた混合液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（40 mL）を加え、析出した固形物を桐山ロートでろ過した。得られた固形物をジクロロメタン（6.5 mL）に溶解させ、N-メチルイミダゾール（1 mL）、コリジン（1.5 mL）および無水酢酸（1 mL）を加え、混合物を室温で2時間攪拌した。反応液にメタノール（6.5 mL）を加え、混合物を15分間攪拌した。その後、減圧下濃縮して得られた残渣にメタノール（40 mL）を加え、析出した固形物を桐山ロートによりろ取した。固形物を減圧下終夜乾燥させ、DMTr-Gmoe-Suc-SR（化合物９）（1.37 g）を無色固体として定量的に得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.80-0.82 (d, 3H), 0.86-0.93 (t, 12 H), 1.25-1.34 (m, 84H), 1.43-1.45 (m, 6H), 1.75-1.89 (m, 12H), 3.05 (brs, 3H), 3.18-3.21 (m, 4H), 3.34-3.49 (m, 5H), 3.62-3.67 (m, 3H) 3.77 (d, 6H), 3.92-3.95 (m, 6H), 4.23-4.42 (m, 3H), 5.08 (dd, 1H), 5.61 (dd, 1H), 5.84 (d, 1H), 6.58 (s, 2H), 6.78 (t, 4H), 7.16-7.31 (m, 5H), 7.34-7.41 (m. 2H), 7.48-7.5 (m. 2H), 7.83 (s. 1H), 8.2-8.60 (m. 1H), 12.07 (brs. 1H).
（実施例１６）
（２－３）：HO-Gmoe-Suc-SR（化合物１０）の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　工程２－２で合成したDMTr-Gmoe-Suc-SR（化合物９）（1.47 g, 0.826 mmol）にジクロロメタン（8.2 mL）を加えて溶解させた。さらにピロール（298 μL, 4.3 mmol）、トリフルオロ酢酸（411 μL, 5.37 mmol）を加え、混合物を15分間攪拌した。反応液にメタノール（10 mL）を加え、さらにコリジン（1.07 mL）を加えて、混合物を5分間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（50 mL）を加え、析出した固形物を桐山ロートによりろ過し、HO-Gmoe-Suc-SR（化合物１０）（1.89 g, 1.45 mmol, 96%）を無色固体として得た。
1H-NMR (400 MHz CDCl3); δ 0.87 (t, 9 H), 1.22-1.32 (m, 84H), 1.45-1.47 (m, 6H), 1.70-1.82 (m, 8H), 2.23 (brs, 1H), 2.70-2.77 (m, 5H), 3.07 (brs, 3H), 3.13 (s, 3H), 3.29-3.32 (m, 2H) 3.45-3.52 (m, 4H), 3.57-3.63 (m, 2H), 3.78-3.81 (m, 2H), 3.93-3.96 (m, 6H), 4.29-4.30 (m, 1H), 4.41 (brs, 1H), 4.71-4.76 (m, 1H), 5.58 (d, 1H), 5.80 (d, 1H), 6.60 (s, 2H), 7.83 (m. 1H), 8.85-9.48 (m. 1H), 12.17-12.18 (m. 1H).
（実施例１７）
（２－４）：3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート2量体（HO-GmoeGmoe-Suc-SR）（化合物１１）の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　アルゴン雰囲気下、工程２－３で合成したHO-Gmoe-Suc-SR（化合物１０）（739 mg, 0.5 mmol）を脱水ジクロロメタン（10 mL）に溶解させ、そこにGmoeホスホロアミダイト（686 mg, 0.75 mmol）、および5-エチルチオ-1H-テトラゾール（146 mg, 1.13 mmol）を加えた。混合物を室温で2時間攪拌し、出発物質の消失をHPLCで確認後、前記特許文献（特開２００１－２５３８９６）により合成した2-シアノエチルオクタデシルジイソプロピルホスホロアミダイト（71 μL, 0.15 mmol）を加え、反応混合物を30分間撹拌した。反応液にエタノール（146 μL, 2.5 mmol）を加え、混合物を室温にて10分間攪拌した。コリジン（376 μL, 2.7 mmol）、5-メトキシインドール（1.1 g, 7.5 mmol）、およびDDTT（277 mg, 1.35 mmol）を加え、混合物を室温にて45分間攪拌した。さらにそこに亜リン酸トリメチル（110 μL, 0.9 mmol）を加え、混合物を室温で15分間攪拌した。得られた反応混合物をジクロロメタン（28 mL）で希釈後、そこにトリフルオロ酢酸（1.15  mL, 15mmol）を加えた。混合物を室温にて15分間攪拌し、その後メタノール（25 mL）およびピリジン（2.4 mL）を加えた。反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（50 mL）加え、析出した固形物をろ過し、減圧乾燥することで目的化合物（化合物１１）（824 mg, 0.49 mmol, 98%）を得た。
（実施例１８）
（２－５）：3’末端が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート結合からなる2’-MOE 17量体（5’-CmoeAmoeCmoeTmoeTmoeTmoeCmoeAmoeTmoeAmoeAmoeTmoeGmoeCmoeTmoeGmoeGmoe-3’）（化合物１２）の製造
　出発原料として工程２－４で合成した2量体（化合物１１）を使用して、上記2量体の合成と同様の手順を、配列に対応するGmoe、Amoe、Tmoe、Cmoeのホスホロアミダイトを使用し、15回繰り返すことで17量体（化合物１２）を合成した。（3.086 g, 0.318 mmol, 総収率64%）
（実施例１９）
（２－６）：5’末端水酸基がDMTr基、3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート18量体（オリゴヌクレオチド２）の製造
　アルゴン雰囲気下、上記（２－５）で製造した17量体（化合物１２）（3.086 g, 0318 mmol）を脱水ジクロロメタン（10 mL）に溶解させ、そこにTmoeホスホロアミダイト（614 mg, 0.75 mmol）、および5-エチルチオ-1H-テトラゾール（146 mg, 1.13 mmol）を加えた。混合物を室温で2時間攪拌し、出発物質の消失をUPLC/MSで確認後、2-シアノエチルオクタデシルジイソプロピルホスホロアミダイト（70 μL, 0.15 mmol）を加え、反応混合物を30分間撹拌した。反応液にエタノール（146 μL, 2.5 mmol）を加え、室温にて10分間攪拌した。そこにコリジン（376 μL, 2.7 mmol）、5-メトキシインドール（1.1 g, 7.5 mmol）、およびDDTT（277 mg, 1.35 mmol）を加え、混合物を室温にて45分間攪拌した。さらに亜リン酸トリメチル（110 μL, 0.9 mmol）を加え、混合物を室温で15分間攪拌した。その後そこにメタノール（25 mL）を加え、反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（50 mL）加え、析出した固形物をろ過し減圧乾燥することで無色固体の目的化合物（オリゴヌクレオチド２）（3.211 g, 0.308 mmol, 97%）を得た。
（実施例２０）
（２－７）：3’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたホスホロチオエート18量体（本オリゴヌクレオチド２）の製造
　上記（２－６）で製造した保護された18量体（オリゴヌクレオチド２）（417 mg, 0.2 mmol）をジクロロメタン（2 mL）に溶解させ、そこに5-メトキシインドール（88 mg, 0.6 mmol）、およびトリフルオロ酢酸（92 μL, 1.2 mmol）を加えた。混合物を15分間攪拌し、そこにメタノール（2 mL）、さらにピリジン（100 μL）を加え、混合物を5分間攪拌した。その後、反応液を減圧下濃縮し、残渣にメタノール（10 mL）を加え、析出した固形物を桐山ロートでろ過し、無色固体の目的化合物（本オリゴヌクレオチド２）（882 mg, 0.189 mmol, 95%）を得た。
　次に、前記オリゴヌクレオチド１の場合と同様に、上記で製造したオリゴヌクレオチド２について、各種反応条件下で核酸塩基の脱保護反応の抑制効果を調べた。
（実施例２１）
オリゴヌクレオチド２を懸濁状態で脱保護を行った場合
　上記実施例１９により製造した前記オリゴヌクレオチド２（2.6 mg, 0.25 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、濃アンモニア水（250 μL）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であり、前記オリゴヌクレオチド２は、完全には溶解していない状態であった。混合物を懸濁状態のまま65℃で15分間加熱処理した。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、さらにそこに40%メチルアミン水溶液（250 μL）を加え、混合物を65℃で15分間加熱処理した。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、12.1%ほど副生成物が存在することがわかった。
　実施例２１の製法は、リン酸トリエステルの脱保護を事前に行うことなく、アンモニア水により塩基部、リン酸トリエステル部を共に脱保護する従来の製法である。実施例２１の従来の製法による脱保護の生成物についてのUPLC/MS分析によるクロマトグラム図を図２に示す。目的物である脱保護生成物（m/z 2374）およびアクリロニトリル付加不純物（CE adduct）（m/z 2394）の各々についてマス値で抽出したクロマトグラムをＡ）に、各ピークトップのマス分析結果をＢ）に示す。図２中、目的物である脱保護生成物（m/z 2374）に対応するマス値で抽出したクロマトグラムのピークは保持時間７．２４分であった。一方、アクリロニトリル付加不純物（CE adduct）m/z 2394に対応するマス値で抽出したクロマトグラムは、脱保護生成物と明確に保持時間の異なる７．４４分にピークをもつクロマトグラムを与え、約７～１５％の（典型的には、約１２％）の面積強度比でアクリロニトリル付加不純物が観察された。各ピークの主成分が、それぞれ脱保護生成物、アクリロニトリル付加不純物（CE adduct）であることがわかる。
（実施例２２）
オリゴヌクレオチド２を超音波処理により完全溶解させて脱保護を行った場合
　上記実施例１９により製造した前記ポリヌクレオチド２（2.6 mg, 0.25 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、濃アンモニア水（250 μL）を加えた。この際、溶液は懸濁状態であった。超音波処理により懸濁状態を解消させた後、混合物を65℃で15分間加熱処理した。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、さらに40%メチルアミン水溶液（250 μL）を加え、65℃で15分間加熱処理した。混合物を速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、副生成物は0.7%ほどであった。
ＩＩＩ．オリゴヌクレオチドにおいて、アミン試薬を用いたリン酸保護基の脱シアノエチル化に伴う、核酸塩基へのシアノエチル化の抑制効果を調べた。
（実施例２３）
（３）ジエチルアミンを用いた脱シアノエチル化反応の３１Ｐ ＮＭＲ測定による観察
　上記実施例１９で合成した18量体（オリゴヌクレオチド２）（48mg, 5 μmol）を重クロロホルム（400 μL）に溶解させ、そこにジエチルアミンを（100 μL）加えた。31P NMR測定によりリン酸トリエステル部位のシアノエチル基が脱保護されてリン酸ジエステルが生成することを確認し、また室温2時間で脱保護が終了することをも確認した。
（実施例２４）
（４）トリエチルアミンを用いた脱シアノエチル化反応の３１Ｐ ＮＭＲ測定による観察
　上記実施例１９で合成した18量体（オリゴヌクレオチド２）（48mg, 5 μmol）を重クロロホルム（250 μL）に溶解させ、そこにトリエチルアミンを（250 μL）加えた。31P NMR測定によりリン酸トリエステル部位のシアノエチル基が脱保護されてリン酸ジエステルが生成することを確認し、また脱保護には20時間ほどの時間が必要であることをも確認した。
（実施例２５）
　リン酸トリエステルがジエチルアミンにより脱保護され、オリゴヌクレオチド２のアンモニア水を用いた脱保護の場合
　上記実施例２３で脱シアノエチル化反応が終了したサンプルをNMR管からクロロホルムで洗い込みつつ50 mLナスフラスコに移し、減圧下濃縮した。残渣に濃アンモニア水（5 mL）を加えて溶解させ、得られた溶液の一部の250 μLの溶液を1.5 mLのスクリューキャップチューブに移した。混合物を65℃で15分間加熱し、混合物を速やかに4℃まで冷却した後、そこに40％メチルアミン水溶液（250 μL）を加えた。混合物を65℃で15分間加熱し、速やかに4℃まで冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、副生成物は観察されなかった。
　実施例２５の本発明の製法による、脱保護の生成物についてのUPLC/MS分析によるクロマトグラム図を図１に示す。目的物である脱保護生成物（m/z 2374）およびアクリロニトリル付加不純物（CE adduct）（m/z 2394）の各々についてマス値で抽出したクロマトグラムをＡ）に、各ピークトップのマス分析結果をＢ）に示す。目的物である脱保護生成物（m/z 2374）に対応するマス値で抽出したクロマトグラムのピークは保持時間７．２２分であり、図２の脱保護生成物と保持時間が一致したクロマトグラムが得られた。一方、シアノエチル付加不純物（CE adduct）に対応するマス値（m/z 2394）で抽出したクロマトグラムからは保持時間７．１７分のピークが得られているように見えるが、図２のシアノエチル付加不純物（CE adduct）に対応するピークの保持時間（７．４４分）と明確に保持時間は異なっており、シアノエチル付加不純物は観察されなかったことがわかる。また主成分のマスからもシアノエチル付加不純物（CE adduct）は観察されなかった。
（実施例２６）
　リン酸トリエステルがジエチルアミンにより脱保護され、オリゴヌクレオチド１のアンモニア水を用いた脱保護の場合
　上記実施例５で合成した１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）（4.7mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、ジクロロメタン－メタノール（80 μL, 9:1 = v/v）に溶解させた。そこに、ジエチルアミン（20 μL）を加え、室温2時間でシアノエチル基の脱保護を行った。スピードバックにより反応溶液を減圧下濃縮した。濃縮乾固した固体に濃アンモニア水（1 mL）を加え、混合物を65℃で10分間加熱処理した。混合物を4℃まで速やかに冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行い、シアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、0.3％ほど副生成物が存在することがわかった。
（実施例２７）
　リン酸トリエステルがトリエチルアミンにより脱保護され、オリゴヌクレオチド１のアンモニア水を用いた脱保護の場合
　上記実施例５で合成した１０量体（前記オリゴヌクレオチド１）（4.7mg, 1 μmol）を1.5 mLのスクリューキャップチューブに量り取り、ジクロロメタン－メタノール（50 μL, 9:1 = v/v）に溶解させた。そこに、トリエチルアミン（50 μL）を加え、室温19時間でシアノエチル基の脱保護を行った。スピードバックにより反応溶液を減圧下濃縮した。濃縮乾固した固個体に濃アンモニア水（1 mL）を加え、混合物を65℃で10分間加熱処理した。混合物を4℃まで速やかに冷却した後、上澄み液を採取し、UPLC/MSによる分析を行いシアノエチル化された副生成物の存在量を算出したところ、0.6％ほど副生成物が存在することがわかった。
（結果）
　上記の実施例から、脱保護反応に付す、反応基質である保護オリゴヌクレオチドを脱保護溶液に完全に溶解させることが、シアノエチル付加体の生成を抑制するのに重要であることが示唆された（前記実施例８、１０、１２、２２）。完全に溶解させるには製造スケールが小スケールの場合では超音波処理が有効であるが、数百グラム以上の製造スケールを想定する場合には実施が困難な場合もありうる。加えて、超音波処理を使用せずにスケールアップが容易となる方法として、オリゴヌクレオチドのリン酸部位のシアノエチル基のみを脱保護する前処理を行うと、効果的にオリゴヌクレオチドの核酸塩基へのシアノエチル付加体の生成を抑制できることがわかった（前記実施例２５、２６、２７）。しかし、実施例２７の場合は実施例１５、２６の場合と比較して長時間の処理が前処理に必要であった。
　更に、実施例１１では事前の処理がなくともシアノエチル付加体の生成は抑えられているが、該当反応条件はウラシル・チミン塩基への別の副反応（ピリミジン環の開環反応）を引き起こすことが知られており（例えば、非特許文献１を参照）、使用に難点があり、副反応の抑制という点では別の副反応に関する問題が生じうることに留意する必要があり、製造に使用する条件としては適切ではない。
　以上のことから、最も望ましいシアノエチル付加体の生成を抑制する脱保護条件は前記実施例２５、２６であることが示唆される。
　前記各脱保護条件による比較検討結果をまとめた表を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　本発明の、オリゴヌクレオチドのリン酸保護基により生じたアクリロニトリルが、オリゴヌクレオチドの核酸塩基へのシアノエチル化付加反応を生じるのを抑制することにより、液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造において、アクリロニトリル付加物がほとんど副生していない、完全脱保護された高純度のオリゴヌクレオチドを高スケールで製造することができる。

Claims (15)

  1. 　液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造方法であって、
    　該方法は、
    １）完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させ、ここで、該有機溶媒は、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系有機溶媒との混合溶媒である；
    ２）弱求核性塩基を用いて、工程１で調製した溶液中の完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位の保護基を脱保護する；
    ３）前記工程で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する；および、
    ４）工程３において得られた残渣をアンモニア水を用いて処理して、工程２で得られたリン酸部位が脱保護されたオリゴヌクレオチドの核酸塩基部位の脱保護、および擬似固相担体からの切り出しを行う、
    ことを含む、当該製造方法。
  2. 　工程１におけるハロゲン系溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素、または１，１，２，２－テトラクロロエタンから選ばれる少なくとも１つの溶媒である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　工程１における非ハロゲン系溶媒が、アルコール系溶媒、ニトリル溶媒、エーテル系溶媒、または環状エーテル系溶媒から選ばれる少なくとも１種の溶媒である、請求項１または２のいずれかに記載の製造方法。
  4. 　工程２における弱求核性塩基が、ジエチルアミンまたはトリエチルアミンである、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　工程１における完全保護オリゴヌクレオチドが、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　工程１において溶解が、完全な溶解であることを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　工程１において使用する完全保護オリゴヌクレオチドが、５量体以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　高純度オリゴヌクレオチドが、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドである、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　製造されたオリゴヌクレオチドが、当該オリゴヌクレオチドの重量に対する、シアノエチル化された不純物の含有量が１％以下である、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　液相合成法によるオリゴヌクレオチドの製造における、アクリロニトリルの付加による副反応を抑制するための方法であって、
    １）完全保護オリゴヌクレオチドを、有機溶媒に溶解させ、ここで、該有機溶媒は、ハロゲン系溶媒の単一溶媒、またはハロゲン系溶媒と非ハロゲン系有機溶媒との混合溶媒である；
    ２）弱求核性塩基を用いて、工程１で調製した溶液中の完全保護オリゴヌクレオチドのリン酸部位の保護基を脱保護する；
    ３）前記工程で使用した弱求核性塩基、有機溶媒、および反応系中に存在するアクリロニトリルを留去する； 
    ことを含む、方法。
  11. 　アクリロニトリルが、液相合成法によって得られたオリゴヌクレオチドのリン酸部位の脱保護により生成したアクリロニトリルである、請求項１０に記載の方法。
  12. 　工程１における完全保護オリゴヌクレオチドが、３’末端水酸基が擬似固相保護基で保護されたオリゴヌクレオチドである、請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　工程１におけるハロゲン系溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素、または１，１，２，２－テトラクロロエタンから選ばれる少なくとも１つの溶媒である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　工程１における非ハロゲン系溶媒が、アルコール系溶媒、ニトリル溶媒、エーテル系溶媒、または環状エーテル系溶媒から選ばれる少なくとも１種の溶媒である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　工程２における弱求核性塩基が、ジエチルアミンまたはトリエチルアミンである、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
PCT/JP2020/033398 2019-09-04 2020-09-03 オリゴヌクレオチドの脱保護方法 WO2021045141A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021544021A JPWO2021045141A1 (ja) 2019-09-04 2020-09-03

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019161104 2019-09-04
JP2019-161104 2019-09-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021045141A1 true WO2021045141A1 (ja) 2021-03-11

Family

ID=74853209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/033398 WO2021045141A1 (ja) 2019-09-04 2020-09-03 オリゴヌクレオチドの脱保護方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2021045141A1 (ja)
WO (1) WO2021045141A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591387A (zh) * 2022-03-21 2022-06-07 通用生物(滁州)有限公司 一种药用核酸合成后的胺洗工艺
WO2024053578A1 (ja) * 2022-09-07 2024-03-14 株式会社日本触媒 核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000226399A (ja) * 1999-02-04 2000-08-15 Isis Pharmaceut Inc オリゴマ―化合物を合成するための改善された方法
JP2002536381A (ja) * 1999-02-05 2002-10-29 アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法
JP2011521901A (ja) * 2008-04-24 2011-07-28 ギリンダス・アメリカ・インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドの製造方法
WO2013122236A1 (ja) * 2012-02-17 2013-08-22 味の素株式会社 塩基部保護オリゴヌクレオチド
WO2018203574A1 (ja) * 2017-05-02 2018-11-08 日産化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000226399A (ja) * 1999-02-04 2000-08-15 Isis Pharmaceut Inc オリゴマ―化合物を合成するための改善された方法
JP2002536381A (ja) * 1999-02-05 2002-10-29 アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法
JP2011521901A (ja) * 2008-04-24 2011-07-28 ギリンダス・アメリカ・インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドの製造方法
WO2013122236A1 (ja) * 2012-02-17 2013-08-22 味の素株式会社 塩基部保護オリゴヌクレオチド
WO2018203574A1 (ja) * 2017-05-02 2018-11-08 日産化学株式会社 オリゴヌクレオチドの製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Transactions 1", JOURNAL OF THE CHEMICAL SOCIETY, vol. 23, 2002, pages 2619 - 2633 *
ALEJANDRO GIMENEZ MOLINA, AMIT M. JABGUNDE, PASI VIRTA AND HARRI LÖNNBERG*: "Solution phase synthesis of short oligoribonucleotides on a precipitative tetrapodal support", BEILSTEIN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 10, 29 September 2014 (2014-09-29), pages 2279 - 2285, XP055798686 *
HARRI LÖNNBERG: "Synthesis of oligonucleotides on a soluble support", BEILSTEIN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 13, 2017, pages 1368 - 1387, XP055798685 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114591387A (zh) * 2022-03-21 2022-06-07 通用生物(滁州)有限公司 一种药用核酸合成后的胺洗工艺
WO2024053578A1 (ja) * 2022-09-07 2024-03-14 株式会社日本触媒 核酸の製造方法、不純物の除去方法及び不純物が少ない核酸

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021045141A1 (ja) 2021-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2797188C (en) 5-position modified pyrimidines and their use
KR101869570B1 (ko) 변형된 뉴클레오사이드 및 그로부터 제조된 올리고머 화합물
JP5173546B2 (ja) オリゴヌクレオチドの合成および精製に使用する方法および反応試薬
EP2462153B1 (en) Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
CN105658658B (zh) 胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸组合物及其相关方法
JP5689054B2 (ja) Ｒｎａ化学合成方法
US20090203132A1 (en) Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
WO2021045141A1 (ja) オリゴヌクレオチドの脱保護方法
JP2013520438A (ja) 逆方向合成ｒｎａのためのホスホルアミダイト
Zhou et al. Development of kilogram-scale convergent liquid-phase synthesis of oligonucleotides
EP3825300A1 (en) Alkoxyphenyl derivative, nucleoside protector, nucleotide protector, method for producing oligonucleotide, and method for removing substituent
US6069243A (en) Process for oligonucleotide synthesis
JP5076504B2 (ja) 核酸合成用アミダイド及び核酸合成方法
Fang et al. Dim and dmoc protecting groups for oligodeoxynucleotide synthesis
Tsurusaki et al. Development of a new synthetic method for oligodeoxynucleotides using 3′-H-phosphonamidate derivatives
Kotikam et al. Synthesis and properties of 2′-O-[R-and S-(2-amino-3-methoxy) propyl](R-AMP and S-AMP) nucleic acids
JPH11506107A (ja) 求核試薬および一酸化炭素を用いるパラジウム触媒ヌクレオシド修飾方法
US6486313B1 (en) Oligonucleotides having alkylphosphonate linkages and methods for their preparation
Dioubankova et al. Phosphoramidites and solid supports based on N-substituted 2, 4-dihydroxybutyramides: universal reagents for synthesis of modified oligonucleotides
Kawanaka et al. Synthesis of dinucleoside phosphates and their analogs by the boranophosphotriester method using azido-based protecting groups
TWI541249B (zh) ５－位置經修飾之嘧啶類及彼等之用途
WO2023054350A1 (ja) 精製ジクロロ酢酸の製造方法
Zatsepin et al. Efficient conjugation and preferential DNA binding of oligonucleotides containing 2′-O-(2-oxoethyl) arabinouridine
WO2024059258A1 (en) Click-labeled nucleosides and phosphoramidites
KR20240082343A (ko) 정제 디클로로아세트산의 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20860314

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021544021

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20860314

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1