JP2002536381A - オリゴヌクレオチドを脱保護するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 オリゴヌクレオチドがフォスフェート保護基を含む、基質に結合したオリゴヌクレオチドを準備し；オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドを基質から分離することなく、オリゴヌクレオチドがらフォスフェート保護基を切断する試薬、例えば、有機アミン等を接触させ；切断したフォスフェート保護基から基質に結合したオリゴヌクレオチドを単離し；基質からオリゴヌクレオチドを切断することを含むオリゴヌクレオチドを精製するための方法。この方法は、精製することが容易で、望ましい全長オリゴヌクレオチド産物を高収率で単離することができる粗オリゴヌクレオチド混合物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願の引用 本出願は、1999年2月5日に出願された米国仮出願番号60/118,575の優先権を主
張し、その記載の全部を本明細書の一部とする。

【０００２】 発明の背景 発明の分野 本明細書は、オリゴヌクレオチドを合成する方法に関する。特に、本明細書は
、非常に高純度でより高収率の粗オリゴヌクレオチド産物をもたらすオリゴヌク
レオチドを脱保護するための方法に関する。

【０００３】 背景 多くの生物学的応用においてオリゴヌクレオチドは莫大な有用性がある。例え
ば、オリゴヌクレオチド配列は、相補的オリゴヌクレオチドの標的と二本鎖を形
成し、ゲノム研究においておよび疾患を引き起こす遺伝子に関する臨床診断応用
において分子生物学的プローブとして使用できる。この応用において、検出され
るべき核酸を含む材料は、その相補的核酸配列と二本鎖を形成するオリゴヌクレ
オチドプローブとの接触によってもたらされる。そして、その二本鎖は様々な分
析法を使用して検出される。

【０００４】 オリゴヌクレオチドは、様々なポリメラーゼ応用、例えばポリメラーゼ連鎖反
応(「ＰＣＲ」)等のプライマーとして有用である。ＰＣＲにおいて、オリゴヌクレ
オチドプライマーは、酵素およびモノヌクレオチドの存在下、一本鎖テンプレー
ト核酸フラグメントを含むサンプルに添加される。プライマーで開始すると、酵
素は、テンプレート核酸に相補的である核酸鎖を築く。反応を数回連続して実施
し、各サイクルにおいて新しく築かれた鎖を増幅する。

【０００５】 オリゴヌクレオチドは、ある疾患の病因性または望しくないタンパク質の競合
的阻害剤として作用するオリゴヌクレオチド配列を設計するための、コンビナト
リアルな発見手段としても使用される。「アプタマーアプローチ(aptamer approa
ch)」としても知られているこの応用において、所望の特定のタンパク質の、何百
万ものランダムに合成されたオリゴヌクレオチドのランダムプールに存在する特
定のオリゴヌクレオチド配列との高い親和性を測定する。この方法は、トロンビ
ン等の様々なタンパク質の新規なオリゴヌクレオチド阻害剤を開発する助けとな
る。

【０００６】 オリゴヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡレベルで(「アンチセンス」)また
はＤＮＡレベルで(「アンチジーン」もしくは「三重鎖」)遺伝子発現を調節する能力
を有することが発見された。多数のオリゴヌクレオチド候補の効率が、今日、臨
床評価中である。 オリゴヌクレオチドの有意義な治療、診断および研究有用性のために、それら
を大量に容易に、速やかに低コストで調製する必要がある。フォスファイトトリ
エステルおよびＨ−フォスフォネート化学を一般に使用して、固体支持体または
基質上でオリゴヌクレオチドを調製する。大スケールの商業的ＤＮＡシンセサイ
ザーは、フォスファイトトリエステル化学を使用して、マルチキログラムのオリ
ゴヌクレオチドの生産を可能とした。

【０００７】 フォスフォルアミダイト化学の使用による固相上でのオリゴヌクレオチドの大
スケールの合成に使用されるヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成中の副産
物の形成を防止する適当な基で保護されている。モノマー形成部分における核酸
塩基上に見られる、反応性環外アミン基は、一般にベンゾイル、イソブチリル、
フェノキシアセチル、およびアセチル保護基で保護される。一方、フォスフェー
ト基を通常２−シアノエチルフォスフォルアミダイトとして保護する。オリゴヌ
クレオチド合成の完成の後、そのような保護基を、水酸化アンモニウムの濃縮溶
液による処理によって容易に除去する。

【０００８】 オリゴヌクレオチド合成を、適当に保護した５’−Ｏ−ジメトキシトリチレー
ト化したヌクレオシドを基質に結合することによって開始する。保護されたヌク
レオシドの３’−ヒドロキシル基を、コハク酸エステル結合(succinic ester li
nkage)を通して基質に結合する。最も一般的に使用される基質は、長鎖ガラス等
の無機材料またはポリスチレン等の有機支持体である;しかし、他の支持体、例
えば、ポリアミド、セルロース、シリカゲル、およびポリエチレングリコール等
も、オリゴヌクレオチドの固相合成に使用される。

【０００９】 オリゴヌクレオチドは、５’−ジメトキシトリチレート化した−３’−ヌクレ
オシドフォスフォルアミダイトを、支持体上に負荷した第１のヌクレオシドの非
マスクの５’−ヒドロキシル基へ逐次的に付加することによって組みたてる。こ
の付加を、テトラゾールまたはジシアノイミダゾール等の温和に酸を出す触媒に
よって触媒する。次に、対応するフォスファイトトリエステル(「Ｐ^III」)ヌクレ
オチド間結合を、より安定なフォスフェートトリエステル(「Ｐ^V」)へ、ヨウ素ま
たはペルオキシドでの酸化によって変換する。それら(５’−ヒドロキシル基)を
対応するエステルへ変換することによる、任意の未反応の５’−ヒドロキシル基
の「キャッピング」を、酢酸無水物を含むキャッピング試薬に少しさらすことに
よって実施する。次に、温和に酸を出す条件下で、新しく付加されたヌクレオシ
ドから５’−ジメトキシトリチル基を除去することによって、５’−ヒドロキシ
ル基を生じ、カップリングサイクルを完成する。この方法を使用して、各カップ
リング段階において９９％より大きいカップリング効率を達成できる。オリゴヌ
クレオチド合成の終了に向かって、５’末端の末端ヌクレオチドのジメトキシト
リチル基を、インタクトなままとするか(「トリチル−オン」)または切断し遊離の
５’−末端ヒドロキシル基を得る(「トリチル−オフ」)。５’−トリチル基を親油
性精製ハンドルとして使用して、より短いおよび非トリチル化オリゴヌクレオチ
ド種から、トリチル基を有する全長オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣによっ
て精製しうる。

【００１０】 オリゴヌクレオチド合成の完成後、核酸塩基およびフォスフェートバックボー
ンから保護基を除去し、さらに、コハク酸エステル結合をアルカリ条件下で切断
し、基質からオリゴヌクレオチドを開放する。これを水酸化アンモニウムの濃縮
溶液で基質を処理することによって達成する。この段階は通常室温で約２４時間
または５５℃で約６時間かかる。 モノヌクレオチドフォスフォルアミダイトの順次進行のカップリングに関係す
る主要な問題の一つは、オリゴヌクレオチド合成中の短い欠失配列の形成である
。望ましくない欠如配列のこの集団(「ｎ−１」「ｎ−２」等)は、フォスフォルアミ
ダイトの１００％より小さいカップリング効率、不完全なキャッピングおよび酸
化または次のカップリングサイクルの開始前の５’−ヒドロキシル基の部分的な
非マスキングに起因する。

【００１１】 いわゆる「ｎ＋１」または「ｎ＋２」オリゴヌクレオチド不純物がしばしば観察さ
れるが解決するよう取り組まれておらず、ＨＰＬＣカラム上で主オリゴヌクレオ
チドピークの直後に溶出が見られる。これらの望ましくない不純物は、基質から
切断される総粗産物の６％まで含まれることがある。これらの不純物の性質およ
び原因についてほとんど知られていない。主生産物に接近しているこれらの不純
物の溶出によって、精製オリゴヌクレオチドの単離が困難で時間を消費する作業
となっており、結果的に全長の純粋な産物が十分に回収できない。

【００１２】 前記考察のように、オリゴヌクレオチド合成の分野において、改良がなおあり
得、かつ望ましい。特に、高収率のより純粋な粗産物を生じるオリゴヌクレオチ
ドを合成するための方法が必要である。そのような方法は、長い合成時間を必要
としないのが理想的である。好ましくは、そのような方法は、使用のためにまた
経済的である。これらおよび他の関連事項を後記でより詳細に記載する。

【００１３】 図面の簡単な説明 図１は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、粗トリチル−オン・
オリゴヌクレオチドＴ_１０Ｇ_１０混合物のクロマトグラムである。 図２は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、水酸化アンモニウム
で処理する前に、乾燥アセトニトリル中の２０％ジエチルアミンで処理した、粗
トリチル−オン・オリゴヌクレオチドＴ_１０Ｇ_１０混合物のクロマトグラムであ
る。 図３は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、粗トリチル−オン・
オリゴヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−Ｃ_７Ｔ_１４混合物のクロマト
グラムである。 図４は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、水酸化アンモニウム
で処理する前に、２０％ジエチルアミンで処理した、粗トリチル−オン・オリゴ
ヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−Ｃ_７Ｔ_１４混合物のクロマトグラム
である。

【００１４】 発明の要約 本発明は、オリゴヌクレオチドの精製方法に関連し、その方法は、 オリゴヌクレオチドがフォスフェート保護基を含む、基質に結合したオリゴヌク
レオチドを準備し； 基質からオリゴヌクレオチドを分離することなく、オリゴヌクレオチドからフォ
スフェート保護基を切断する試薬と、オリゴヌクレオチドを接触させ； 切断したフォスフェート保護基から、基質に結合したオリゴヌクレオチドを単離
し； 基質からオリゴヌクレオチドを切断すること を含む。

【００１５】 好ましくは、フォスフェート保護基は、β、例えば２−シアノエチルフォスフ
ェート等を受けることのできる基である。該試薬は、β脱離によってオリゴヌク
レオチドからフォスフェート保護基を切断する。好ましくは、該試薬は、式Ｒ−
Ｎ−Ｒ_１Ｒ_２(式中、Ｒ、Ｒ_１およびＲ_２は、独立的に、水素、ヒドロキシ、ア
ルキル、アリル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、アルコキシ、アリル
オキシ、アリールオキシであり、それらは、１ないし２０個の炭素原子を含み得
る)を有するアミンを含む。

【００１６】 特に、本発明は、オリゴヌクレオチドの精製方法に関連し、その方法は、 フォスフェート保護基が２−シアノエチルフォスフェートである、基質に結合し
たフォスフェート保護基を含むオリゴヌクレオチドを準備し； 該オリゴヌクレオチドをジエチルアミンと接触させ、基質からオリゴヌクレオチ
ドを分離することなく、オリゴヌクレオチドからフォスフェート保護基を切断し
； 切断したフォスフェート保護基から基質に結合したオリゴヌクレオチドを単離し
； 基質に結合したオリゴムクレオチドを水酸化アンモニウムと接触させ、基質から
オリゴヌクレオチドを切断すること を含む。

【００１７】 詳細な説明 手動でまたは自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して、オリゴヌクレオチドを典
型的には固体支持体または基質上に組みたて、アルカリ脱保護条件下、基質から
開放する。保護基をオリゴヌクレオチドから除去すること、およびオリゴヌクレ
オチドを基質から分離することの両方のために水酸化アンモニウム等のアルカリ
を使用する、標準的な脱保護段階中に、フォスフェートバックボーンを保護する
ために一般に使用される多くの基、例えば、２−シアノエチル等は、反応性中間
体を生産する。そのような中間体は、不可逆的に核酸塩基と反応することによっ
てオリゴヌクレオチドを修飾し、より高分子量のオリゴヌクレオチド副産物を形
成することが観察されている。理論的に側鎖の分枝は、これらのより高分子量の
種を生じることができる一方、塩基組成分析はこれらの仮説を支持しない(後記
の実施例１を参照)。

【００１８】 オリゴヌクレオチド合成のためのフォスフォルアミダイト法において、フォス
フェート保護のために使用される最も一般的な保護基は、２−シアノエチル保護
基である。この基を、濃縮した水酸化アンモニウム処理によって核酸塩基上の保
護基と共に除去する。これらの条件下、２−シアノエチル基はβ脱離を受けて、
アクリロニトリルを放出する。アクリロニトリルは、核酸塩基を不可逆的にアル
キル化することのできる強力な発癌物質であることが示された。したがって、フ
ォスフェート脱保護から放出されるアクリロニトリルは、本質的に、オリゴヌク
レオチドにおける核酸塩基と反応することができ、その望ましくない修飾をもた
らすことがあり得る。標準的なオリゴヌクレオチド脱保護プロトコルは、水酸化
アンモニウム溶液を、オリゴヌクレオチドを有する基質に比較的長時間(６−２
４時間)さらすことを含むので、アクリロニトリルは、溶液においてこの時間に
、容易に核酸塩基と反応して、観察されたｎ＋１およびｎ＋２オリゴヌクレオチ
ド修飾をもたらし得る。

【００１９】 このことは、特に基質上でのオリゴヌクレオチドの大スケールの合成に当ては
まり、その場合、経済的および実際的な理由で、小容量の溶媒を使用し、その小
容量によって、脱保護溶液において高濃度のアクリロニトリルという結果にすぐ
になり得ることから、それによって、核酸塩基の不可逆的な修飾が促進される。
高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)においてしばしばメインのオリゴヌクレ
オチドピークに接近して溶出するこれらの高分子量の種によって、多量のオリゴ
ヌクレオチドがこれらの接近して溶出する不純物のために不純粋のままである場
合、オリゴヌクレオチドの精製が非常に困難かつ非効率的な段階となる。したが
って、脱保護中に、アクリロニトリルをオリゴヌクレオチドにさらすことを減少
させることのできる方法は、核酸塩基の修飾を最小化することができる。

【００２０】 我々は、基質に結合したオリゴヌクレオチドを、迅速かつ選択的にフォスフェ
ート保護基を除去するが、オリゴヌクレオチドが基質に繋留したままであること
のできる試薬と接触させることによって、このことが達成できることを見出した
。容易に、試薬溶液中のアクリロニトリルを速やかに吸い上げることができ、一
方、オリゴヌクレオチドは基質に結合したままであり、それによって、核酸塩基
をアクリロニトリルにさらすことを最小化することができることを、このことに
よって確保する。アクリロニトリル含有試薬溶液を除去した後、次に、該基質を
濃縮した水酸化アンモニウムで処理し、基質からオリゴヌクレオチドを開放し、
同時に他の保護基を除去することができる。

【００２１】 「オリゴヌクレオチド」は、標準的および修飾した両方のオリゴリボヌクレオチ
ド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴプリン、オリゴピリミジン、およ
びそれらの類似物または組み合わせを含む。例は、通常のおよび修飾したＤＮＡ
、ＲＮＡ、およびそれらの組み合わせである。オリゴヌクレオチドは、塩基、例
えば、水素結合または／およびスタッキングのできる共通のヌクレオシドプリン
またはピリミジン塩基等を含み得、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウ
ラシルまたは置換したプリンまたはピリミジン塩基として選択されることができ
る。そのような塩基は、通常、プリンの９位で糖に結合しているが、７位でも結
合し得る。

【００２２】 ピリミジンにおいて、糖は、塩基の１位で結合する。置換塩基は、５−メチル
シトシン、６−チオグアニン、ニトロインドール、８−アジドアデニン、８−ア
ミノアデニン、８−メルカプトアデニン、８−アザグアニン、８−デアザグアニ
ン、５−フルオロウラシル、ジアミノプリンを含むが必ずしもこれらに限定され
ない。糖は、ペントース、ヘキソース、テトロース、トリオースを含む。天然の
糖は、β−Ｄ−リボフラノース、３’または２’−デオキシリボフラノースまた
はＬ−糖等のような非天然の糖を含む。グリコシド結合は、通常、天然に存在す
るβ−アノマー形態であるが、グリコシド結合についてα−アノマー配置を含み
得る。修飾した糖は、誘導体化したβ−Ｄ−リボフラノシル、３’／２’−デオ
キシβ−リボフラノシル、コンフォメーション的に制限された糖および炭素環式
糖を含むが必ずしもこれらに限定されない。これらの誘導体を調製するために使
用される方法は、当業者に周知である。

【００２３】 ホスホラミダイト化学によるオリゴヌクレオチドの大スケール合成において使
用されるヌクレオシドは、通常、適当な基で保護され、オリゴヌクレオチド合成
中の副産物の形成を防止する。モノマー形成部分における核酸塩基に見出される
反応性環外アミン基は、一般的に、ベンゾイル、イソブチリル、フェノキシアセ
チル、およびアセチル保護基で保護されているが、一方、フォスフェート保護基
は、通常、２−シアノエチルホスホラミダイトとして保護されている。さらに、
β脱離を受けて、オリゴヌクレオチドにおける核酸塩基を有力に修飾することが
できる可能な反応性中間体を生じる多くの他の利用可能なフォスフェート保護基
がある(Ravikumar, V. T.; Cheruvallath, Z. S. & Cole, D. L.(1997), Nucleo
sides & Nucleotides vol. 16(7-9)1709-1712; Beaucage, S. L.& Iyer, R. P.(
1993) Tetrahedron, 49(28),6123-6194)。そのような保護基は、当該中間体とオ
リゴヌクレオチドの相互作用を最小化する試薬で選択的に除去されれば、本発明
の範囲に入る。

【００２４】 オリゴヌクレオチドが結合している基質系は、広範囲の有機および無機材料の
両方、例えば、制御された孔ガラスおよび様々なガラス、シリカゲル、ポリアミ
ド、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、多糖類、架橋多糖類およびそれらの組み
合わせ等から選択し得る。一般に、基質は、オリゴヌクレオチドおよび修飾した
オリゴヌクレオチド合成のすべての条件に安定であるべきである。

【００２５】 膨張しまたは膨張しない能力のある広範囲の多孔性のまたは非多孔性の基質を
本発明に使用し得る。好ましい実施態様において、基質は固体基質からなるが、
液体または固体として(反応環境に依存する)存在する基質もまた本発明含まれう
る(Bonora, G. M.;Scremin, C. L.; Colonna, F. P. & Garbesi, A.(1990)Nucle
ic Acids Research, vol. 18(11),3155-3159)。オリゴヌクレオチドが溶液中に
あるよりも基質に結合しているときに、アクリロニトリルによる核酸塩基の不可
逆的な修飾の動態学がより遅いので、好ましくは、基質は固体の物質である。好
ましくは、基質は反応カラム内に含まれる。

【００２６】 任意の利用可能な方法、例えば、フォスファイトトリエステルおよびＨ−フォ
スフォネート化学等を使用するオリゴヌクレオチド合成の完成の後、基質に結合
したオリゴヌクレオチドを試薬で処理し、オリゴヌクレオチドバックボーンから
フォスフェート保護基を選択的に除去する。一般に、試薬およびその条件の選択
は、試薬が選択的にフォスフェート保護基を、オリゴヌクレオチドがなお基質に
結合したままであるような方法で、選択的に切断することが可能か否かによる。
この効果を達成できる任意の化合物または酵素が、本発明の範囲に入る。例えば
、多くのフォスフェート保護基、例えば、２−シアノエチルフォスフェート等が
β脱離を受けることができる。

【００２７】 したがって、フォスフェート保護基をβ脱離によってオリゴヌクレオチドから
切断することのできる任意の試薬を使用しうる。基質からオリゴヌクレオチドを
切断することなく、フォスフェート保護基を除去することのできる有機アミン、
例えば、第１級、第２級または第３級アミン等が好ましい。式Ｒ−Ｎ−Ｒ_１Ｒ_２ (式中、Ｒ、Ｒ_１およびＲ_２が、独立的に、水素、ヒドロキシ、アルキル、アリ
ル、アリール、シクロアルキル、アルケニル、アルコキシ、アリルオキシ、アリ
ールオキシであり、１ないし２０個の炭素原子が含まれ得る)を有するアミンが
より好ましい。ｔ−ブチルアミン−メチルアミンおよびジエチルアミン、特に無
水アセトニトリル中の約２０％Ｖ／Ｖのジエチルアミンの溶液が最も好ましい。

【００２８】 試薬を、反応物へ液体またはより好ましくは気体として導入しうる。この段階
は、反応容器中で手動により行い得る。好ましくは、該段階は、商業的なＤＮＡ
シンセサイザーを使用して自動化され、これは、最後のカップリングサイクルの
完成の後、該シンセサイザーの送達ラインの１つを通じて、液または気相中のア
ミン含有試薬を送達するようにプログラムされている。好ましくは、該試薬を反
応カラムを通して、約１ｍｌ／分の流速で約１０分で６５℃で(または室温で９
０分)通過させ、選択的にフォスフェート保護基を除去する。または、該試薬を
反応カラムを通して、約１ｍｌ／分の流速で約９０分で室温で通過させ、フォス
フェート保護基を選択に除去し得る。

【００２９】 該試薬溶液中のすべてのアクリロニトリルを速やかにサイホンで吸い出し、一
方、オリゴヌクレオチドは基質に結合したままであり、それによって、核酸塩基
をアクリロニトリルへさらすことを最小化する。好ましくは、この段階に続いて
、該基質を溶媒、例えば、アセトニトリル等で洗浄し、アクリロニトリルの最後
の痕跡のすべてを除去する。該オリゴヌクレオチドおよび基質を、次に、濃縮水
酸化アンモニウムで処理し、基質からオリゴヌクレオチドを開放し、同時に他の
保護基を除去する。

【００３０】 この方法によれば、多量の高純度および高収率の粗オリゴヌクレオチドを、速
やかに、容易に、高価ではなく製造できる。後記の実施例は単に説明のみのため
のものであり、いかなる意味においても特許請求の範囲を限定するために使用す
べきではない。

【００３１】 実施例 方法 アクリロニトリル−チミジン付加体の合成： チミジン(０．４８ｇ、２ｍｍｏｌ)、トリエチルアミン(２０ｍｌ)及び乾燥ピ
リジン(２０ｍｌ)の撹拌した溶液に、蒸留したアクリロニトリル（１ｍｌ、１５
ｍｍｏｌ)を新しく添加した。５０℃で２４時間加熱した後、反応混合物を冷却
し、濃縮し、流動相としてジクロロメタン:酢酸エチル:メタノール(８５:１５:
５)を使用してフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。適当な分画を
収集し、濃縮し、114-116℃のa m.ptを有する４７％収率で望ましい付加体を無
色固体として得た。該産物は、^１Ｈ ＮＭＲおよび^１３Ｃ ＮＭＲの望ましい分光
学的プロファイルを示した。

【００３２】 オリゴヌクレオチドの酵素的消化： 全長のオリゴヌクレオチドおよびｎ＋不純物の両方を、ヘビ毒フォスフォジエ
ステラーゼおよびシュリンプアルカリフォスファターゼによる酵素的分解に服さ
せた。Ａ_２６０ＯＤ単位のオリゴヌクレオチドを、２ｍＭのＭｇＣｌ_２およびそ
れぞれ４単位のフォスフォジエステラーゼおよびアルカリフォスファターゼ酵素
を含む１０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファーｐＨ８．２に溶解し、３７℃で１８
時間インキュベートした。次に、該反応混合物を９０℃で２分間過熱し、室温に
冷却し、真正のヌクレオチドスタンダードに対して逆相ＨＰＬＣによって分析し
た。

【００３３】 オリゴヌクレオチドの脱保護： オリゴヌクレオチド合成の完成後、オロゴヌクレオチドはなおカラム中の基質
に結合している一方、無水アセトニトリル中の２０％のジエチルアミン溶液を、
１ｍｌ／分の流速で１０分間カラムを通して通過させ、フォスフェート保護基を
選択的に除去した。該カラムをアセトニトリルで洗浄し、基質を真空で乾燥させ
た。これに続いて、濃縮水酸化アンモニウムでオリゴヌクレオチドを処理し、基
質からオリゴヌクレオチドを除去し、ヌクレオシド保護基を除去した。

【００３４】 実施例１ ＤＮＡ核酸塩基におけるアクリロニトリルの付加物： オリゴヌクレオチドＧ_１０Ｔ_１０を、Amersham Pharmaciaポリマー支持体30-H
L(商標)を使用して、Oligo Pilot(商標)II DNAシンセサイザーにおいて合成した
。このポリスチレンに基づく基質を24mlのカラムに負荷し、標準的フォスフォル
アミダイト化学を使用してオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴマーを基質か
ら切断し、基質を３０％のＮＨ_４ＯＨで６５℃で１６時間処理することによって
脱保護した。溶媒を真空で除去し、粗オリゴヌクレオチド混合物を得た。粗材料
（ＤＭＴｒ−オン）のイオン交換ＨＰＬＣによって、８％のｎ＋不純物の存在と
共に全長の産物が７１％収率で形成されたことがわかった（図１）。粗材料をAm
ersham-Pharmacia AKTA（商標）ＨＰＬＣ精製システムにおいて精製した。

【００３５】 ２個のオリゴヌクレオチドサンプルを、Matrix-Assisted Laser Desorption I
onization-Time Of-Fight/Mass Spectrometry（「ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ／ＭＳ」）
によってさらに分析し、分子量を測定した。全長材料(「ＤＭＴｒ‐オフ」)の分子
量を観察し、６２７１質量単位に対応し、Ｇ_１０Ｔ_１０配列を有するオリゴヌク
レオチドの計算値と一致した。６３２７質量単位に対応する(５６質量単位の相
違)単離したｎ＋不純物の分子量は、アクリロニトリルからのシアノエチル基(５
３質量単位)の付加と一致する。ｎ＋不純物のＬＣＭＳ分析によって、この不純
物の分子量は６３２４質量単位(５３質量単位の相違)であり、アクリロニトリル
のチミジンへの付加に対応するとわかった。

【００３６】 全長のオリゴヌクレオチドおよびｎ＋不純物の両方をフォスフォジエステラー
ゼおよびアルカリフォスファターゼによる酵素的分解に服させた。この方法にお
いて、オリゴヌクレオチドを酵素の組み合わせで処理し、オリゴヌクレオチドを
それぞれのヌクレオシド化合物に分解し、次にＨＰＬＣによって分析する。次に
、酵素的消化におけるヌクレオシドのリテンションタイムを、真正のヌクレオシ
ド参照と比較し、その相対的率およびすべての修飾されたヌクレオシド産物の存
在を決定する。ｎ＋オリゴヌクレオチド不純物の加水分解から得られた消化サン
プルを逆相ＨＰＬＣにおいて分析したとき、チミジンおよび２’デオキシグアノ
シンに対応するピークに加えてさらなるピーク溶出の存在を観察した。異なるル
ーとによって合成的に調製した真正サンプルの溶出プロファイルと比較したとき
、このピークは、チミジンのＮ^３シアノエチル付加物であるとわかった。

【００３７】 実施例２ いくつかの定型的および修飾したオリゴヌクレオチド配列（２’−Ｏ−メチル
ＲＮＡおよびフォスフォロチオエートオリゴヌクレオチドを含む）を、Oligo Pi
lot(商標)IIにおいて、基質としてAmersham Pharmaciaポリマー支持体30-HL(商
標)または制御された孔ガラス(「ＣＰＧ」)のいずれかを使用して合成した。未だ
合成カラム中の基質に結合しているすべてのオリゴヌクレオチドを、無水アセト
ニトリル中の２０％のジエチルアミンの溶液で１０分間処理した。これに続いて
、濃縮水酸化アンモニウムによって標準的脱保護した。揮発成分を除去した後、
すべてのオリゴヌクレオチドをイオン交換ＨＰＬＣによって分析した。結果によ
れば、ジエチルアミンで予備処理したすべてのサンプルは、濃縮水酸化アンモニ
ウムで直接的に処理したものと比較して、ｎ＋不純物プロファイルが有意により
少ないことを示唆している。

【００３８】 予備処理したオリゴマーにおけるｎ＋不純物は、０．０５％よりも少なくなり
、全長オリゴマーの収率は、配列によっては３−７％増加した。例えば、ジエチ
ルアミンによる処理のない標準的条件で脱保護したとき、試験配列Ｔ_１０Ｃ_１０ は、７１％の全長産物、さらに〜８％のｎ＋産物の存在を示すＨＰＬＣクロマト
グラムを示した(図１)。これに対して、標準的な水酸化アンモニウム脱保護の前
に、ジエチルアミンで予備処理した同じ基質は、ほとんど無視できるｎ＋不純物
と共に、７８％の全長産物の存在を示すＨＰＣＬクロマトグラムを示した(図２)
。

【００３９】 ジエチルアミン処理中に基質からオリゴヌクレオチドの喪失は観察されなかっ
た。脱保護および基質からの切断の後の消化実験は、オリゴヌクレオチドを２回
２０％ジエチルアミンに曝露した後でさえも、いずれの塩基の修飾も示さなかっ
た。同じ結果を、２’−Ｏ−メチル、フォスフォロチオエートおよびキメラオリ
ゴヌクレオチドの場合においても観察した。該結果は、様々なスケールのオリゴ
ヌクレオチド合成についておよび様々な長さのオリゴヌクレオチドについて再現
可能である。

【００４０】 実施例３ アミノ基を有するリンカーにつないだオリゴヌクレオチドは、透明産物を与え
、アミノ基修飾の証拠がなかった(図４)。これらのオリゴヌクレオチドを、一般
に、保護したアミノリンカーアミダイトを加えることによってシンセサイザーに
おいて合成する。水酸化アンモニウムによる標準的脱保護の間に、恐らくアクリ
ロニトリルの付加のために、有意な量のオリゴヌクレオチドが、不可逆的にアミ
ノ基において修飾される。したがって、アミノ基に対するレポーター部分の結合
に関連する任意のポスト合成修飾産物の収率は有意に減少する。

【００４１】 実施例４ ５０ｍｍｏｌのジチオスレイトール(ＨＳ−ＣＨ_２−ＣＨＯＨ−ＣＨＯＨ−Ｃ
Ｈ_２−ＳＨ)を含む水酸化アンモニウム溶液で処理して脱保護中に形成されたア
クリロニトリルを除去するとき、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基修飾を完全に
は抑制することができなかった。これは第１級および第３級のアミン溶液を選択
的脱保護のために使用するときにもあてはまった。ジチオスレイトールとともに
水酸化アンモニウム溶液を含むすべての試薬は、ｎ＋不純物を小さい程度減少さ
せることができるのみであった。さらに、気体状のアンモニアを使用するオリゴ
ヌクレオチドの脱保護によれば、粗オリゴヌクレオチド混合物中により高濃度の
ｎ＋不純物を得た。

【００４２】 実施例５ 多くの異なったオリゴヌクレオチド(定型的なＤＮＡまたは２’−ＯＭｅ)を、
種々の塩基化合物を用いて、基質としてPS HL 30またはCPGのいずれかを使用し
、Oligo Pilot IIによって合成した。すべてのオリゴヌクレオチドを、無水アセ
トニトリル中の２０％ジエチルアミンで１０分間処理し、このとき、カラム中の
基質になお結合している。脱保護および支持体からの切断の後、オリゴヌクレオ
チドをイオン交換高速クロマトグラフィーによって分析した。結果は、ｎ＋不純
物が０．０５％まで減少し、全長材料の収率が増加したことを示している。処理
中にオリゴヌクレオチドの喪失はなく、これは、洗浄物を別々に収集し、それを
分析することによって達成した。脱保護および基質からの切断の後の消化実験に
よれば、２回の２０％ジエチルアミンにさらした後でさえも、いずれの塩基修飾
も示さなかった。この方法は、２’−ＯＭｅオリゴヌクレオチドおよびアミノリ
ンクしたオリゴヌクレオチドに適用可能であり、合成の様々なスケールおよびオ
リゴヌクレオチド配列の様々な長さにおいて再現可能であった。

【００４３】 いくつかの実施態様を前記の実施例で詳細に記載したが、本発明はその特定の
例に限られない。様々な修飾が当業者にとって容易に明白であり、添付クレーム
の精神および範囲内に入る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、粗トリ
チル−オン・オリゴヌクレオチドＴ_１０Ｇ_１０混合物のクロマトグラムである。

【図２】 図２は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、水酸化
アンモニウムで処理する前に、乾燥アセトニトリル中の２０％ジエチルアミンで
処理した、粗トリチル−オン・オリゴヌクレオチドＴ_１０Ｇ_１０混合物のクロマ
トグラムである。

【図３】 図３は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、粗トリ
チル−オン・オリゴヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−Ｃ_７Ｔ_１４混合
物のクロマトグラムである。

【図４】 図４は、ＨＰＬＣによって分離し２６０ｎｍで検出した、水酸化
アンモニウムで処理する前に、２０％ジエチルアミンで処理した、粗トリチル−
オン・オリゴヌクレオチド５’−ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−Ｃ_７Ｔ_１４混合物のク
ロマトグラムである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 800 Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕ ｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 1327，Ｐｉｓｃａ ｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ 08855−1327，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 アニラ・バン アメリカ合衆国08502ニュージャージー州 ベル・ミード、ヒルズ・ドライブ26番 (72)発明者 ラーズ・ホームバーグ アメリカ合衆国07921ニュージャージー州 ベッドミンスター、オーク・ノール・レイ ン６番 Ｆターム(参考） 4B064 AF27 CA21 CB02 CB05 CB30 DA20 4C057 AA04 AA21 MM01

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オリゴヌクレオチドを精製するための方法であって： a)オリゴヌクレオチドがフォスフェート保護基を含む、基質に結合したオリゴヌ
   クレオチドを準備し； b)オリゴヌクレオチドを、基質からオリゴヌクレオチドを分離することなく、フ
   ォスフェート保護基をオリゴヌクレオチドから切断する試薬と接触させ； c)基質に結合したオリゴヌクレオチドを、切断したフォスフェート保護基から単
   離し；そして d)基質からオリゴヌクレオチドを切断する ことを含む方法。
2. 【請求項２】 基質が固体である請求項１の方法。
3. 【請求項３】 基質が液体である請求項１の方法。
4. 【請求項４】 基質が無機材料、有機材料、またはそれらの組み合わせであ
   る、請求項１の方法。
5. 【請求項５】 フォスフェート保護基がβ脱離を受けることのできる基であ
   る、請求項１の方法。
6. 【請求項６】 フォスフェート保護基が２−シアノエチルフォスフェートで
   ある、請求項５の方法。
7. 【請求項７】 試薬がフォスフェート保護基をオリゴヌクレオチドからβ脱
   離によって切断する、請求項１の方法。
8. 【請求項８】 請求項１の方法であって、フォスフェート保護基を選択的に
   除去するために使用される試薬が、式Ｒ−Ｎ−Ｒ_１Ｒ_２[式中、Ｒ、Ｒ_１および
   Ｒ_２が、独立的に、水素、ヒドロキシ、アルキル、アリル、アリール、シクロア
   ルキル、アルケニル、アルコキシ、アリルオキシ、アリールオキシであり、それ
   らは１ないし２０個の炭素原子を含みうる]を有するアミンである、方法。
9. 【請求項９】 試薬が有機アミンである、請求項１の方法。
10. 【請求項１０】 試薬がジエチルアミンである、請求項１の方法。
11. 【請求項１１】 試薬が約２０％ｖ／ｖジエチルアミンを含む、請求項１の
    方法。
12. 【請求項１２】 試薬が気体として送達される、請求項１の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１の方法であって、オリゴヌクレオチドバックボー
    ンが少なくとも１個のフォスフォジエステル結合を含む、方法。
14. 【請求項１４】 請求項１の方法であって、オリゴヌクレオチドバックボー
    ンが少なくとも１個のフォスフォルアミデート結合を含む、方法。
15. 【請求項１５】 オリゴヌクレオチドを精製するための方法であって： a)フォスフェート保護基が２−シアノエチルフォスフェートである、基質に結合
    したフォスフェート保護基を含むオリゴヌクレオチドを準備し； b) オリゴヌクレオチドをジエチルアミンと接触させ、オリゴヌクレオチドを基
    質から分離することなく、フォスフェート保護基をオリゴヌクレオチドから切断
    し； c)基質に結合したオリゴヌクレオチドを、切断したフォスフェート保護基から単
    離し；そして d)基質に結合したオリゴヌクレオチドと水酸化アンモニウムを接触させ、オリゴ
    ヌクレオチドを基質から切断する ことを含む方法。