JPS6036493A - 保護された核酸関連物質の分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は保護基を有するヌクレオシド、モノヌクレオチ
ド、ポリヌクレオチド等の核酸関連物質の分離法に関し
、さらに詳しくは、簡単な操作で効率よく目的物質を分
離する方法に関する。

近年、ＤＮＡやＲＮＡなとのごとき核酸関連物質の化学
合成が盛んに行われているが、その際、ヌクレオシドや
ヌクレオチドの中に含まれる官能基を部分的に保護基で
保護し、反応に必要な官能基のみを選択的に反応させる
ことが一般に行われている。

そのため、かかる化学合成プロセスにおいては、保護さ
れた核酸関連物質を目的成分とし、目的成分よりも保護
化の度合が低い核酸関連物質や、保護化剤、リン酸化剤
、縮合剤、触媒等の親水性薬剤を含む混合物が反応の過
程で随所に発生する。

また保護された核酸関連物質を単離したのちでも、該物
質は一般に不安定なため、取扱い中あるいは保存中に脱
保護反応が起きて保護基数のより少ない核酸関連物質や
保護基の誘導体が不純物として混合した状態となる場合
も多い。

而して、このような混合物から目的成分を分離する方法
として、例えば １）混合物をクロロホルム、ジクロルメタン、酢酸エチ
ル等のごとき水と相分離する疎水性溶媒に溶解したのち
水または塩の水溶液で親水性の不純物を抽出する方法（
例えばＭｅｔｈｏｄｓ　１ｎｐｎｚｙ＋ｎｏｌｏｇｙ　
ＶＯＬ、　６５．第６１０頁、１９８０年発行） ２）クロロホルム、ジクロルメタン等の疎水性溶媒に溶
解した混合物をカラムに通してシリカゲル吸着剤に吸着
させた後、クロロホルム−メタノール系、ジクロルメタ
ン−メタノール系などの溶離剤で展開、溶離させ分画す
る方法（例えば前記文献） ３）アセトン−水、アセトニトリル−水等の水系混合溶
剤に溶解した混合物をカラムに通してアルキルシラン化
シリカゲル吸着剤に吸着させた後、該混合溶剤を展開、
溶離剤として溶出させ分画する方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶＯＬ、　６８．第９０頁
１９７９年発行）などが提案されており、また前記１）
、２）、３）　を適宜組合わせた方法も多数報告されて
いる。

しかしながら、工）の方法では抽出効果が不充分なため
保護基数の異なる核酸関連物質の分離には適用できない
うえ、親水性溶剤が共存するとエマルジョン化して分離
が困難になったり、抽出後に多量の溶剤を除去しなげれ
ばならないといった欠点がある。

また２）及び３）の方法は操作が繁雑なうえ操作中に目
的物の分解が生じやすく、しかも希薄な分画溶液から目
的物を回収する工程を必要とするという欠点がある。

さらに１）と２）を組合わせて繁雑な分離、精製操作を
行った後でさえβ−シアンエタノール等の保護基が除去
されずに残るという報告もあり（例えば前記文献）、従
来の分離、精製法は未だ充分満足できるものとは言えな
かった。

そこで本発明者らは従来の分離、精製法の欠点を改良し
、目的とする核酸関連物質を簡単な操作で効率よく、か
つ高純度で得る方法を開発すべく鋭意検討を進めた結果
、特定な混合溶剤を用いて目的物を沈澱させる方法がき
わめて効果的なことを見い出し本発明を完成するに到っ
た。

かくして本発明によれば、官能基の少くとも一部が保護
基で保護された核酸関連物質ｔａ＞、該物質（ａ）より
も保護化の度合が低い核酸関連物質（ｂ）及び／または
親水性薬剤（ｃ）を含む混合物から物質（ａ）を分離す
るに際し、該混合物の親水性溶剤の溶液と水とを混合し
て物質（ａ）を選択的に沈澱分離せしめることを特徴と
する保護基で保護された核酸関連物質の分離法が提供さ
れる。

本発Ｉル」における前記物質（ａ）は、核酸関連物質を
構成する糖及び塩基の部分に存在する水酸基、アミノ基
などの官能基の少なくとも一部が保護基で保護され、か
つリン酸の部分は完全に保護されている物質である。

ここで核酸関連物質とは、■糖と核酸塩基とから構成さ
れるヌクレオシド、■糖、核酸塩基及びリン酸から構成
されるヌクレオチド、■複数のヌクレオチドから構成さ
れるポリヌクレオチド、■これらの物質の誘導体及び■
これらの物質と類似構造を有する類縁体の総称であり、
その具体例として次のような化合物が例示される。

すなわち、糖の１？−位に結合した塩基の具体例として
は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル
、イノシン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチ
ルシトシンなどのごとき一般的核酸塩基の他、８−ブロ
モアデニン、５−フロロウラシル％６−チオグてニン、
６−メルカプトプリン、５−ニトロウラシル、エテノシ
チジン等の各種誘導体や、５−アザオルチン酸、６−ア
ザウリジン、６−アザシチジン、ピリドン、ペンツイミ
ダゾール等の類似構造を有する含窒素複素環塩基などが
例示される。

また糖の具体例としては、フラノーヌ型、とくに２′−
デオキシリボースまたはリボース型が最も一般的に用い
られるが、アラビノース、３１−デオキシリボース、２
’、　３’−ジデオギシリボース等のごとき他のフラノ
ースや、５Ｉ−フロロデオキシリボース、３ｒ−アミノ
リボース等の誘導体でもよく、またマンノース、グルコ
ース等のピラノース型のものであってもよい。

さらにリン酸は、通常、糖の２１−位、３・−位または
５″−位のいずれかに結合しているが、複数の位置に結
合していてもよく、それらが分子間または分子内でリン
酸エステルを形成していてもよい。

またリン酸は１−リン酸のほか２−リン酸％　３−リン
酸等のポリリン酸結合を形成するものでもよいが、リン
酸部分は完全に保護されている必要があり、イオン的に
解離するものの場合には、たとえ他の官能基を保護して
も水及び親水性溶剤の混合溶剤に対する親和性が大きく
凝集沈澱を生じにくいので１本発明からは除外されろう かかるリン酸の保護基としては通常用いられているもの
であればいずれでもよく、例えばシアンエチル基、トリ
クロルエチル基、フェニルチオエチル基、フェニルスル
フィニルエチル基、フェニルスルホニルエチル基、ｐ−
クロルフェニル基。

０−クロルフェニル基、ナフチル基などのごときエステ
ル構造を形成するものや、フェニルアミノ基、メトキシ
フェニルアミノ基などのごときアミド構造を形成するも
のなどが例示される。

またポリヌクレオチドは複数のヌクレオチドが適宜結合
したものであるが、通常は３′−位と５′−位の間また
は２′−位と５′−位の間でリン酸エステル結合を形成
したものであり、その重合度は通常２０以下、好ましく
は１０以下、さらに好ましくは５以下のものである。

このよ５な核酸関連物なの代表例を模式的に示すと、以
下のようなものが例示される。

糖−塩基　・・ＣＩ） リン酸−糖一塩基　・・（［） （但し、ｎは整数を表わす） かかる核酸関連物質とともに物質（ａ）を構成する保護
化剤は、糖及び塩基中に存在する官能基を保護するため
に一般に用いられているものであればいずれでも使用で
きる。

例えばアミノ基の保護基としては、アセチル基。

イソブチリル基、ベンゾイル基、アニソイル基、ナフト
イル基、θ−７タロイル基などのごときカルボン酸アミ
ド構造またはカルボン酸イミド構造を形成するものが一
般的であり、塩基がシチジル基またはアデニル基の場合
にはベンゾイル基が、またグアニル基の場合にはイソブ
チリル基が賞月される。

また水酸基の保護基としては、例えばアセチル基、イソ
ブチリル基、ベンゾイル基、アニソイル基、レブリニル
基、ナフトイル基などのごとき力Ａ／　ホｙ　酸ｘステ
ル構造を形成するものや、モノメトキシトリチル基、ジ
メトキシトリチル基、トルイルジフェニルメチル基、０
−メトキシフェニルナフチルフェニルメチル基、フラニ
ルクロロフェニルメチル基、テトラヒドロピラニル基、
メトキンテトラヒドロピラニル基などのごときエーテル
０１造を形成するものなどがあり、３を一位の保護には
カルボン酸エステル型が、また５Ｃ−位の保護にはエー
テル措造型が賞月される。

さらにジオールの保護基としては、オルト蟻酸エステル
構造を形成するものやケタール型構造を形成するものな
どが例示されるっ 物質（ａ）は分子を構成する糖及び塩基の部分にかかる
保護基を１個以上有するものであればよいが、保護基数
が多いほど、また脂溶性の高い保護基はど水を加えたと
きに沈澱が生じやすくなるので好ましく、とくに保護基
数が２以上であることが好ましい。

本発明における物質（ｂ）は、物質（ａ）よりも保護化
の度合が低いもの、すなＡ２ち物質（ａ）よりも保護基
数が少ないかまたは全く保護されていないものであれば
前記のごとき核酸関連物質と同−範らゆ５のものでよく
、またリン酸部分が保護されていないものであってもよ
い。

ここで物質（ａ）と物質（ｂ）の保護基数の差は、ヌク
レオシド及びヌクレオチドについては分子中の全保護基
数を基準とし、またポリヌクレオチドについてはヌクレ
オチド１ユニット当りの数を基準とするものであり、そ
の差が１以上のものであれば全て物質（ｂ）に包含され
るが、物質（、）及び（ｂ）がヌクレオシトである場合
やリン酸部分が完全に保護されたヌクレオチドやポリヌ
クレオチドである場合にはその差が２以上であることが
好ましい。

また本発明における親水性薬剤（ｃ）は、物質（ａ）の
化学合成を行う際に用いられる薬剤やその誘導体のうち
、多量の水と接触した場合に溶解しゃすい物質をさし、
その具体例として前記のごとき保護基を与える保護化剤
；ハロゲン化リン型、リン酸無水物型、リン酸アミデー
ト型などのごときリン酸化剤；ナヶザ中夷呻ツ≠功１梱
句しくニ）に）−’＝ｇ　芳香族スルホニルクロリド、
芳香族スルボニルイミダゾリドなどのごとき縮合剤；メ
チルイミダゾール、ニトロトリアゾール、２．６−／ｌ
／ｌクチ、ピリジンなどのごとき触媒または活性剤；こ
れらの分解生成物などが例示される。

なＪ６、物質（ａ）、物質（ｂ）及び親水性薬剤（ｃ）
については、上記の具体例に加え「核酸有機化学」（池
原ら、化学同人、１９７９年発行）に開示されている化
合物で本発明の定義に合致するものはすべて包含される
。

本発明においては、物質（ａ）と物質（ｂ）、物質（ａ
）と親水性薬剤（Ｃ）または物質（−）、物質（ｂ）及
び親水性薬剤（Ｃ）の混合物から物質（ａ）を分離精製
するにあたって、まずこれらの混合物の親水性溶剤によ
る溶液が調製される。この溶液は物質（ａ）の合成過程
で生ずるものであっても、また混合物を新たに溶剤中へ
溶解したものであってもよい。

用いられる親水性溶剤は、混合物を溶解可能で、かつ親
水性のある物質（ａ）に対して不活性”な溶剤であれば
いずれでもよ（、なかでも水に２５容量チ以上、とくに
完全に相溶するものが好ましく、さらにベンゼン、トル
エン、キシレンなどのごとき芳香族溶剤とも相溶するも
のが適切である。

かかる親水性溶剤の具体例としては、例えばメタノール
、エタノール、イソプロパツール、エチレングリコール
モノエチルエーテル、テトラヒドロフルフリルアルコー
ル、エチレングリコールモノアセテート、アセトール、
ジアセトンアルコール、シアノエタノール、２−アミノ
エタノール、などのごときアルコール類；アセトン、メ
チルエチルケトンなどのごときケトン類；テトラヒドロ
フラン、ジオキサン、ジオキシラン、モルボリンなどの
ごときエーテル類：プロビルアミン、ブチルアミン、ピ
リジン、ピコリン、ピリミジンなどのごときアミン類；
アセトニトリル、プロピオニトリルなどのごときニトリ
ル類；酢酸、プロピオン酸、酪酸などのごときカルボン
酸類；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド％
Ｎ−メチルピロリドンなどのごときアミド類；ジメチル
ホルホギシド、ジエチルスルホキシド、テトラヒドロチ
オフェン−Ｌｉ−ジオキシドなどのごときスルホキシド
類などが挙げられ、必要に応じて適宜混合して用いられ
る。

なかでも物質（ａ）及び物質（ｂ）の溶解度が高く、は
ぼ中性で、安定性、低毒性、低価格のものが好ましく、
とくに取扱いの容易さの点で沸点範囲が４０〜１２０℃
程度のものが賞月される。このような好マしい溶剤の具
体例として、エタノール、アセトン、メチルエチルケト
ン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ピリジン、ピコ
リンなトカ例示される。

溶液中の混合物の濃度は均一な溶液を形成可能な範囲内
で適宜選択すればよいが、通常は５〜５０重量％であり
、高濃度であるほど水の使用量を減少させ、かつ回収率
を向上させることができるっ次いで、この溶液と水とを
混合することによって物質（ａ）の選択的な沈澱形成が
行われる。用いられる水の量は物質（ａ）の沈澱が生ず
るに足る量であり、物質（ａ）や物質（ｂ）の種類によ
って必ずし′も一定ではないが、通常は親水性溶剤に対
して２容量倍以上、好ましくは３〜２００容景倍、さら
に好ましくは５〜１００容量倍であり、混合物の種類に
応じて簡単な予備実験を行うことにより、容易にその最
適値を定めることができる。

また水を混合するにあたつ℃、物質（−）に不活性な塩
を共存させ系中のイオン強度を高めることもできる。こ
の処理によって物質（ａ）の沈澱が促進され回収率も向
上するが、過度にイオン強度を高めると物質（ａ）の純
度が低下する傾向を示すので、その強度は５Ｍ／ｌ以下
、とくに０．１〜２Ｍ／ｌ程度が好ましいっ かかる塩類の具体例としては、例えば塩化ナトリウム、
塩化アンモニウム、硫酸ナトリウムなどのごとき中性塩
、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２カリウム、炭
酸水素ナトリウム、炭酸水素トリエチルアミンなどのご
とき多塩基性酸の酸性壇、ｐＨ緩衝作用を有するように
適宜組合わされた酸と塩基の混合物（例えば酢酸と水酸
化カリウムとの組合せや炭酸素ナトリウムと水酸化ナト
リウムの組合せなど）等をあげることができ、なかでも
物質（ａ）が安定なｐＨ領域でｐＨ緩衝作用を有するも
のが賞月されるっ 混合物の溶液と水との混合手法は格別制限されるもので
はなく、溶液中に水を添加する方法でも。

逆に水中に溶液を添加する方法であってもよいっ混合の
条件は混合物の種類に応じて適宜選択すればよいが、通
常は一２０〜４０℃、好ましくはＯ〜３０℃程度で０．
５〜１８０分間、好ましくは２〜３０分間にわたり攪拌
することによって行われる。系のｐＨも適宜選択しうる
が、通常はｐＨ２〜１１の範囲内で、物質（ａ）の安定
性を保ち、かつ物質（ｂ）や親水性薬剤（Ｃ）の混合溶
剤への溶解性を高めるようなｐＨ領域を選定することが
適切であろうまた混合装置はとくに制限がなくバッチ方
式、連続方式のいずれを使用することもできる。

本発明においては、かかる簡単な操作を行うことによっ
て物質（ａ）を粘稠なアメ状物または粉末状の形態で回
収することができる。また必要に応じて、回収した物質
（ａ）を再度親水性溶剤に溶解して水と混合する操作を
２度もルくはそれ以上くり返すこともでき、それによっ
て物質（ａ）の純度をさらに高めることができる。とく
に混合溶剤中に塩類を共存させた場合には、回収される
物質（ａ）中に塩が随伴しやすいので、塩を含まない混
合溶剤でくり返し処理することによって塩の除去率を高
めることが好ましい。

かくして得られる物質（ａ）は通常１０〜４０重量％の
水を含んでいるが、水を除く必要がある場合には適当な
手法で脱水することができる。かかる乾燥法の具体例と
しては、例えばｎ−へブタン、トルエン、ピリジ／％ジ
オキサンなどのごとき溶剤を用いて共沸混合物として脱
水する方法、減圧下に乾燥する方法、溶剤に溶かし脱水
剤を用いて脱水した後乾固する方法等があり、なかでも
共沸脱水する方法が確実で便利な方法であるっ以下に実
施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお実
施例及び比較例中の部及びチはと（に断わりのない限り
重量基準であるっ実施例Ｉ Ｎ、　２５３ｔ５’−テトラベンン゛イルンチジン（ａ
）１部、シチジン（ｂ）’　（Ｌ　２　部、Ｎ−ベンゾ
イルシチジン（ｂ）０．０５部、安息香酸（Ｃ）０．５
部、ピリジン３部及びＮ−メチルピロリドン１部から成
る溶液に２Ｎ水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ９とした
後、０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液３００部を加え
、室温下に３分間攪拌翼で激しくかきまぜた後静置する
と、白色粉末状固体が沈澱した。この固体を吸　′引ろ
過によりろ別した後、ｎ−へブタン１部と共にナスフラ
スコに入れ、エバポレータで共沸して脱水乾固したとこ
ろ、０．９９部の粉末が得られた。

シリカゲル薄層クロマト板にこの粉末１０μｇを吸着さ
せ、クロロホルム／メタノール（１０／１容量比）混合
溶媒で展開し、２６０　ｎｍと２４０ｎｍの２波長クロ
マトスキヤナによる定量分析を行った結果、この粉末は
Ｎ、　２’　３．’　５’−テトラベンゾイルシチジン
であり、純度約９９ｑ６であることが確認された。

超施例２ ０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液３００部による沈澱
処理を行ったのち、引き続いて生成した沈澱をアセトン
２部に溶解し、このアセトン溶液に水３００部を加えて
再度攪拌すること以外は実施例１と同様にして実験を行
った。

その結果、Ｎ、２．’３．’５−テトラベンゾイルシチ
ジン０．９８部が回収され、その純度はほぼ１００チで
あった。

超施例３〜６ 第１回目の処理における０、５Ｍ炭酸水素ナトリウム水
溶液の添加量及び第２回目の処理における水の添加量を
第１表に示すごとく変量すること以外は実施例２に準じ
て実験を行った。結果を第１表に示す。

第　１　表 比較例１ 実施例１と同じ組成の混合物の溶液にクロロホルム６０
部を加え分液ロートに移し、０．５Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム水溶液４０部とともに室温下で３分間機しく振とうし
た。クロロホルム相を分液し、残った水相をクロロホル
ム１ｏ部で抽出する操作を２度くり返したのち、クロロ
ホルム相を合ワせて水４０部とともに分液ロート内で室
温下に３分激しく振とうした。次いでクロロホルム相を
分液し、再度水洗を（つかえしたのち、クロロホルム相
をナスフラスコに移し、減圧下にクロロホルムを留去し
たところ、発泡状態の白色固体が得られた。さらにｎ−
へブタン１部を加えエバポレータで減圧下に乾固し、白
色固体１．０５部を得た。実施例１と同様に分析した結
果、純度は約９２ｑ６であった。

実施例７ Ｎ−ベンゾイル−３ｒ−ジメトキシトリチル−３′＝（
０′−クロルフェニルシアノエチルリン酸）−デオキシ
アデノシン（’）　１　ｆＡ、　Ｎ−ベンゾイル−５１
−ジメトキシトリチル−３＋−（ｏＴ−クロルフェニル
リン酸）デオキシアデノシン（ｂ）０．０５部、β−シ
アノエチルアルコール（Ｃ）０．５部、Ｏ′−クロロフ
ェニルシンアノエチルリン酸（ｃ）０．２部、）　！Ｊ
アゾリ／ｌ／−〇−クロロフェニルリン酸（ｃ）０．０
５部、オキグベンゾトリアゾリルー〇−クロロフェニル
リン酸（ｃ）ｏ、ｏｓ部、ヒドロキシベンシトリアゾー
ル（ｃ）　Ｏ−３部、トリアゾール（ｃ）　０．３部、
Ｎ−メチルイミダゾール（ｃ）　０．５部、ピリジン１
部及びジオキサン１部から成る溶液に中性リン酸緩衝液
（リン酸水素２カリウム０．５Ｍ、リン酸２水素ナトリ
ウム０．５Ｍ）６０部、塩化ナトリウム３部を加え、２
５℃で１０分間激しく攪拌した後、１時間静置すると水
あめ状の淡黄白色沈澱が生成した。この沈澱物をピリコ
ン０．５部に溶解した後、激しく攪拌しながら水５０部
を加え、１０℃に保つと白色小塊沈澱を得た。沈澱を吸
引ろ過してろ別した後、テトラヒドロ７２７１部に溶解
し、０℃％５０部の水により沈澱させた。白色粗粉末状
沈澱を得た。

吸引ろ過してろ別した後、ナスフラスコに移しジオキサ
ン１部に溶解後、減圧下に揮発分を留去して白色粉末０
．９５部を得た。実施例１と同様に分析したところ、こ
の粉末は純度約９９チの物質（ａ）であった。また水素
炎イオン化検出器（ＦＩＤ）によるスキャナでも不純物
は１％以下であり、β−シアンエチルアルコールはほぼ
完全に除去されていることを示した。

実施例８〜１０ 実施例７で用いた溶液中の（ａ）成分及び（ｂ）成分に
代えて第２表に示す物質を用いること以外は実施例７と
同様にして実験を行った。結果を第２表に示す。

第　２　表 比較例２ 実施例７と同じ組成の混合物の溶液をナスフラスコに移
し、３０℃でエバポレーターにより留去しうる溶剤を留
去した後、クロロポルム１００部を加え、飽和炭酸水素
ナトリウム水溶液５０部と共に分液ロート内室温で１ｏ
分間激しく振とうし静置してクロロホルム相を分液した
。これを再度くり返した後５水５ｏ部を用いて抽出操作
を再度行った。クロロホルム相を分液してナスフラスコ
に移し減圧下留去した。残留物は発泡状に固化せず粘稠
な液であった。ｎ−へブタン１部を加えて留去した後も
同様であった。この液を実施例１と同様にして分析した
ところ、紫外吸光度法による純度は約９０係で、５％程
Ｗメトキシトリチルー３１　（ｏＴ−クロルフェニルリ
ン酸）チオキシ咄込嵯子ｐアデノシンと同じＲＦ値を有
する不純物及び５係程度のその他の不純物を含有してい
た。水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）による純度はさら
に悪く、ｕｖ検出器で検出された不純物β の他に９−ンアノエチルアルコールト同じＲＦ値を有す
る不純物を１６チ程度含有していた。

比較例３ 比較例２で回収した液体１部をクロロホルム１部、ピリ
ジ１０．００２部の混合溶剤に溶解し、シリカゲル２０
部を充填層とする順相カラムクロマトグラフィーにより
クロロホルム／メタノール系溶離剤でｕｖ検出器による
分析を行いつつ分取した。

ｕｖ検出器によりほぼ１００チの純度が確認される溶出
分画のみを集めると溶液は１４０部であった。これをナ
スフラスコに移しエバポレータで減圧下留去すると発泡
固化しない無色の液状物０．８８部を得たつ実施例７と
同様にｕｖ検出器、水素炎イオン化検出器により分析し
たところ、各々９９チ、８９チであった。この不純物は
別途ガスクロマトグラフィーにより分析した結果、β−
シアノエチルアルコールであった。

実施例１１ Ｎ−ベンシイ／ｌ／−５’−ジメトキシトリチル−３′
（６フークロルフエニルシアノエチルリン］−デオキシ
アゾノンｙ（ａ）１部、Ｎ−ペンシイ／Ｉ／−５’−ジ
メトキシトリチル−３’　−（ｏ’〜クロルフェニ／ｌ
／　ＩＪン酸）　−チオキシアデノシン（ｂ）０．２部
及ヒヒロリジン３部から成る溶液に水２０部を加えて２
５℃で１０分間攪拌後、生成した沈澱物を分取し、ピコ
リン０．５部に溶解した。次いでこの溶液に水１２０部
を加えて同様に処理したところ、前記物質（ａ）が純度
９９俤の白色沈澱として生成した。

実施例１２ 下記構造式（Ｉ）で示されるヌクレオチドダイマー（ａ
１１部、下記構造式σ力で示されるヌクレオチド塩（ｂ
）　０．２　部、メシチレンスルボニルニトロトリアゾ
リト０．２部、トリイソプロピルベンゼンスルボニルテ
トラゾリド０．２部、メンチレンスルポ／酸０．０６部
、ト’Ｊイソフロビルベンゼンスルホン酸０．０６部、
ニトロトリアゾール０．０４部、テトラゾール０．０４
部、メチルイミダゾール０．５部、及びピリジン２．５
部から成る溶液を０℃で攪拌しつつ、中性リン酸緩衝液
（リン酸２水素す）　ＩＪウムＩＭ、水酸化ナトリウム
０．６Ｍ）５０部の中に滴下した後、硫酸す）ＩＪウム
６部を加えて室温で２０分間激しく攪拌し、２時間静置
すると粘稠なあめ状沈澱が生成した。ろ紙を通して上澄
を捨て、該ろ紙の上からろ紙を通して沈澱の入っている
容器にジオキサ７０．４部、アセトニトリル０．４部。

メチルエチルケトン０．４部の混合溶剤を加え沈澱物を
溶解した。この溶液に塩化す）　ＩＪウム０．５Ｍ水溶
液２５部を加え１０℃で５分間激しく攪拌後。

１時間静置し、上澄を前記のごとくして捨てた。

この操作を２回繰り返した後、アセトン０．８部に溶解
して１００部の水に激しく攪拌しながら滴下して沈澱さ
せると白色粉末状沈澱が生成した。これを吸引ろ過によ
りろ別しジオキザ／１部に溶解した後、エバポレータで
減圧留去して乾固すると泡状白色固体０．９５部を得た
。実施例１と同様にし℃分析したところ、吸光変法純度
は約９９チでヌクレオチド塩が若干混入していた。

式中、ＸはＮ−バラメトキシベンゾイルアデニル基、Ｙ
はＮ−インブチリルグアニル基、Ｒ２はトリクロロエチ
ル基、Ｒ，はナフチル基、Ｒ８はｐ−クロルフェニル基
、　Ｒ４ｔハラトリルフェニルジフェニルメチル基、Ｅ
ｔ　はエチル基を表わす。

比較例４ 実施例１２と同じ組成の混合物にクロロホルムｉｏｏ部
を加え、５％炭酸水素ナトリウム５０部と分液ロートで
振と５してクロロホルム相を分液した。この操作を３回
繰り返した後、水５０部に変えて１回抽出操作を行った
。クロロホルム相に硫酸ナトリウム２０部を加え、１夜
静置した後、ろ過しナスフラスコに移してエバポレータ
で乾固すると、淡黄色の泡状固体１．１５部が得られた
。

実施例１２と同様の分析を行ったところ、吸光変法純度
は約８２チで、クロロホルム／メタノール（１ｏ／ｌ、
２／１　）の両組酸でＲＦ値がヌクレオチド塩に近い化
合物約１６係を含有していた。

特許出願人　日本ゼオン株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　官能基の少くとも一部が保護基で保護された核酸関
   連物質（ａ）、該物質（ａ）よりも保護化の度合が低い
   核酸関連物質（ｂ）及び／または親水性薬剤（Ｃ）を含
   む混合物から物質（ａ５を分離するに際し、該混合物の
   親水性溶剤の溶液と水とを混合して物質（ａ）を選択的
   に沈澱分離せしめ、必要に応じて同様の操作を反復する
   ことを特徴とする保護基で保護された核酸関連物質の分
   離法。 ２　沈澱分離操作が塩の存在下に実施される特許請求の
   範囲第１項記載の分離法。 ３　沈澱分離操作が２回以上反復される特許請求の範囲
   第１項記載の分離法。 ４　沈澱分離操作が塩の存在下における操作と、それに
   引き続いて行われる塩の不存在下におけるる操作とから
   成る特許請求の範囲第３項記載の分離法。