SE454299B - Sats innehallande polypeptid som finns i pankreasoamyloid och/eller antikroppar riktade mot polypeptiden - Google Patents

Description

454 299 utfällningar (islet amyloid = IA) som är exklusivt begrän- sade till de Langerhanska öarna sker i mer än 90 % av _patienter med NIDDM och i mer än 65 % av katter med vuxen- diabetes (3-5). IA finns också hos gamla personer och hos vuxna och åldrade katter, men är då mindre frekvent och av mindre omfattning. I motsats till NIDDM har man inte funnit IA-utfällningar vid IDDM.

Betydelsen av IA har diskuterats alltsedan fenomenet be- skrevs första gången 1900 (6). Fastän isolerad och renad IA potentiellt skulle kunna tjänat som en användbar markör för att påvisa en associerad med utbildandet av NIDDM nedsatt cellfunktion i de Langerhanska öarna, har man inte tidigare lyckats med kemisk analys av den. Det största hindret för kemisk karakterisering och bestämning av subenheternas aminosyrasekvens har berott på svårigheten att lösa (depoly- merisera) IA-fibrillerna (7). Denna svårlöslighet, som har bidragit till den gäckande naturen av IA, står i direkt motsats till de två huvudformerna av systemisk amyloid (dvs AA eller sekundär amyloid och AL eller primär amyloidl, vilka båda kan depolymeriseras med 6M guanidin hydroklorid efter det att de suspenderats i destillerat vatten. Dessa egenskaper hos systemiska former av amyloid har tillåtit rening och direkt kemisk analys av amyloidfibrillernas proteinsubenheter.

Amyloid är alltid en patologisk utfällning av polymeriserade subenheter vilka bildar s k beta-pleated sheet fibriller (8). Många olika typer av amyloid existerar och de kan förekomma systemiskt eller vara lokaliserade till enstaka vävnader (9). Varje typ kännetecknas av sina proteinsub- enheter, och hittills har man visat att sju olika proteiner kan bilda amyloidfibriller in vivo (10-17). Amyloid i polypeptidhormonproducerande vävnader har föreslagits bestå av motsvarande hormoner (18, 19). Detta är bäst understött för humant medullärt karcinom i tyroidea, där de bildade 454 299 amyloidfibrillernas subenheter efter bestämning av amino- syrasekvens visats vara procalcitonin (13). Eftersom amy- .loidutfällningar är vanliga i insulinproducerande tumörer (19), och eftersom det finns ett starkt samband mellan amyloidfibriller i de Langerhanska öarnas beta-celler och insulinproducerande tumörer, har man tidigare trott att amyloid på dessa platser härstammar från insulin eller dess prekursor.

Bland uppfinningens huvudaspekter kan nämnas satser inne- hållande minst en proteinpreparation (=polypeptidprepara- tion) vald bland IAPP-preparation och anti-IAPP-antikropps- preparation och satsens användning för att bilda komplex sammanhållna med biospecifik affinitet och innehållande IAPP. Bland uppfinningens underordnade aspekter kan protein- preparationerna som sådana nämnas och bestämningsmetoder för IAPP med hjälp av uppfinningens antikroppspreparationer.

Dessutom måste nämnas den potentiellt mycket viktiga tera- peutiska användningen av IAPP-preparationer för att positivt påverka sådana biologiska funktioner som reguleras av IAPP.

Uppfinningens IAPP-preparationer kännetecknas av att de innehåller IAPP samtidigt som de i huvudsak är fria från den amyloida formen. Är IAPP från ett humant insulinom, är dess aminosyrasekvens den i tabell 2 givna, speciellt med av- seende på aminosyraresterna i positionerna 3-35. Med största sannolikhet gäller samma sekvens även för IAPP isolerad från IA tagen från patienter med NIDDM. Jämfört med humant IAPP, uppvisar IAPP från andra däggdjur mindre skillnader i sin aminosyrasekvens. Med en IAPP-preparation enligt uppfin- ningen avses även olika derivat av IAPP. Sålunda kan IAPP enligt uppfinningen vara försett med någon av de analytiskt indikerbara grupper som är välkända inom immunkemisk bestäm- ningsmetodologi, t ex radioaktiva, enzymatiskt aktiva, fluoregena, kemiluminogena, biotinyl- etc grupper. IAPP kan även vara bundet till någon av de olika typer av bärarmole- kyler som är välkända inom immunkemisk metodologi och i immunsorbentsammanhang. I uppfinningens IAPP-preparationer 454 299 utgör IAPP vanligtvis huvuddelen, dvs >50 % såsom >90 % (w/W), av de proteiner som härstammar från ràvarukällan.

Preparationer anrikade pà IAPP kan framställas genom att man först pà i och för sig känt sätt isolerar polymeriserad IAPP, dvs IA, från vävnader som innehåller sådan IAPP, t ex från insulinom eller från Langerhanska öarna hos patienter med NIDDM, varefter det erhållna IA depolymeriseras under betingelser som ej nämnvärt hydrolyserar subenheterna. Som lämpligt depolymeriseringsagens kan nämnas koncentrerad myrsyra. Temperaturen kan ligga inom intervallet O-50 OC, men hänsyn måste alltid tas till de övriga betingelserna, t ex val av depolymeriseringsagens. IAPP kan potentiellt även framställas från cellkulturer. Med hjälp av DNA-re- kombinantteknik kan syntetiskt DNA och CDNA kodande för IAPP införas i mikroorganismer som sedan förmás att producera peptiden. I och med att IAPP's aminosyrasekvens nu blivit känd, kan IAPP även framställas syntetiskt på för peptid- syntes i och för sig känt sätt. För att föreligga i ren form måste IAPP upparbetas (extraheras) från de reaktionsbland- ningar (inkluderande odlingsmedier) som erhålles enligt någon av de ovan angivna metoderna. Ett stort antal olika biokemiska separationsförfaranden kan därvid utnyttjas, såsom elektrofores, t ex isoelektrisk fokusering, centrifu- gering och/eller vätskekromatografi. Bland de senare kan nämnas högtrycksvätskekromatografi (HPLC), gel-, affinitets- och jonbyteskromatografi. Speciellt med hjälp av HPLC kan IAPP erhållas med hög renhet.

Med uppfinningens anti-IAPP-antikroppspreparationer avses, att de är specifika mot IAPP och ej reagerar immunkemískt med andra substanser pá ett för en given användning störande sätt. Anti-IAPP-antikroppar kan framställas på för anti- kroppar gängse sätt medelst immunisering av lämpligt djur (t ex kanin, råtta, mus etc) med IAPP-immunogen följt av upparbetning av de så erhållna antikropparna till lämplig renhet och form (derivat, fragment osv). Framställningen av anti-IAPP-antikroppar kan omfatta även s k monoklonalteknik. 454 299 Antikroppspreparationens anti-IAPP-antikroppar kan således föreligga som ett antiserum eller vara affinitetsrenade, derivatiserade (t ex vara kovalent bundna till någon av de tidigare nämnda typerna av analytiskt indikerbara grupper eller vara kemiskt eller fysikaliskt bundna till en i vattenhaltigt medium olöslig fas, s k fastfas) eller frag- menterade till olika anti-IAPP-antikroppsaktiva komponenter, såsom Fab, Fab' eller F(ab')2.

För vissa varianter av uppfinningen kan man utnyttja anti- kroppar eller IAPP i s k fastfasbunden form. Att binda proteiner till fasta faser och använda dem i t ex immuno- logiska bestämningsmetoder tillhör känd teknik (20). Som exempel på fasta faser kan nämnas partikulära hydrofila och till gel svällbara men vattenolösliga matriser innehållande OH- eller NH2-grupper (exempelvis polyamider, polysacka- rider, poly(hydroxyalkylakrylater) och motsvarande metakry- later etc). Uppfinningens antikropp eller IAPP kan vara kovalent eller adsorptivt bunden till en i vatten olöslig matris.

Uppfinníngens proteinpreparationer kan användas för att in viyg såväl som in vitro bilda s k ligand-receptor-komplex sammanhållna av biospecifik affinitet. Ligand-receptor- begreppet är i patentsammanhang välkänt och omfattar sådana substanspar som enzym-substrat, hormon-receptor för hor- monet, antigen(hapten)-antikropp osv. I beskrivning och krav avses med ligand alltid IAPP och med receptor antikropp eller den motpart som IAPP fysiskt måste samverka med in viyg för att en biologisk effekt skall uppnås i vertebrater, företrädesvis däggdjur såsom människa. 454 299 - 6 Uppfinningens ligand-receptor-komplex kan bildas 1) för att in vivo erhålla ett biologisk svar, 2) in vitro som ett delsteg i ett immunosorbentförfarande, eller 3) in vitro som ett delsteg i en immunkemisk bestämnings- 5 metod.

För bildning av de aktuella komplexen in vivo administreras en för ändamålet effektiv mängd av IAPP inkorporerad i lämplig steril beredningsform till djuret ifråga på för ändamålet lämpligt ställe. Som vehiklar kan nämnas sterila vattenhaltiga medier, såsom fysiologisk koksaltlösning. Är det fråga om terapeutisk behandling ges en terapeutiskt aktiv mängd, och är det fråga om en immuniseríng ges en imunogent aktiv mängd av IAPP, lämpligen konjugerad till en immunogen bärare.

För att bilda komplexen in vitro blandas (administreras) en preparation enligt uppfinningen med (till) ett prov, som innehåller en immunologisk motpart till det som finns i preparationen, under sådana betingelser att immunkomplexet kan bildas. Detta kan ske pá olika sätt. Används flera olika preparationer enligt uppfinningen, bestäms den exakta ordningen av vad immunkomplexet skall användas till. Be- tingelserna är de för immunreaktioner vanliga, dvs vatten- haltiga medier buffrade till ett pH som normalt ligger ¿ mellan pH 3,5 och 9,0, företrädesvis 5,0-8,6. Temperaturen ? brukar hållas i intervallet +4-+40 OC. Buffertar och deter- genter, som ej verkar störande på immunreaktionen eller dess resultat, kan vara tillsatta. 454 299 Den aspekt av uppfinningen som omfattar immunsorbentreníng av IAPP, innebär att anti-IAPP-antikroppar (t ex fastfas- bundna) får binda till IAPP och att det så erhållna immun- komplexet sedan separeras från reaktionsblandningen, var- efter IAPP på för immunsorbentrening känt sätt kan frisättas från komplexet och vid behov upparbetas vidare. Vid rening av anti-IAPP-antikroppar kan man använda IAPP analogt.

Temperatur och pH väljes som i närmast föregående stycke.

Uppfinningens immunkemiska bestämningsmetod innebär att antikroppar, som är riktade mot IAPP, får reagera med i ett prov förekommande IAPP till bildande av ett (IAPP-anti- IAPP)-immunkomplex, vars bildning och mängd utgör ett kvalitativt respektive kvantitativt mått på förekomsten av IAPP i provet. För att underlätta detektion och kvantitering tillsättes ofta ytterligare immunreaktanter eller andra reaktanter, som biospecifikt kan reagera med i komplexet ingående komponenter. Det kan vara anti-antikroppar, vilka är försedda med analytiskt indikerbara grupper.

Ett flertal olika immunkemiska bestämningsmetoder finns tillgängliga, och fackmannen kan med utgångspunkt från förekomsten av en given analyt avgöra vilken metod som är mest lämpad. Detta gäller även för IAPP. Bland olika metoder kan nämnas: kompetitiva (inhibitions) och icke-kompetitiva metoder, precipitationsmetoder, heterogena och homogena metoder, olika metoder med namn efter den analytiskt indi- kerbara grupp som användes, immunelektrofores, partikel- agglutination, immundiffusion och immunhistokemiska metoder med hjälp av märkta antikroppar.

Den tekniska effekten av uppfinningens proteinpreparationer visas i den experimentella delen. Därav framgår att IAPP- preparationer kan användas för att ta fram anti-IAPP-anti- kroppspreparationer som i sin tur kan användas för att histokemiskt bestämma IAPP- och IA-förekomst i biologisk vävnad, t ex i patienter med NIDDM. 454 299 Uppfinningens olika aspekter preciseras närmare i bifogade patentkrav som utgör en integrerad del av beskrivningen.

Uppfinningen skall nu àskádliggöras med det vetenskapliga arbete som möjliggjort den. EXPERIMENTELL DEL šsšseieïl=ssë=asesåer= _ A.

Rening av IA:s subenheter (isolering av IAPP) Amyloidfibriller isolerades från en insulinproducerande tumör tagen från en 48-årig man. 2 gram tumörvävnad, till 50 % bestående av amyloid, homogeniserades upp- repade gånger i normal fysiologisk koksaltlösning följt av tvättning med destillerat vatten tills dess att allt lösligt protein avlägsnats. Den erhållna pelleten frystorkades, avfettades med kloroform-metanol (2:1) och behandlades med en lösning av 6 M guanidin-HCI, 0,1 M Tris HCI, pH 8,0, 0,1 M EDTA och 0,1 M ditiotreitol.

Efter det att oupplöst material hade centrifugerats och tvättats i destillerat vatten, visade utstrykningar, som färgats med Kongorött och studerats i polariserat ljus, att det kvarvarande materialet huvudsakligen bestod av amyloid. Pelleten frystorkades och behand- lades med myrsyra (21) under natten i rumstemperatur varvid huvudparten av materialet löstes. Efter centri- fugering indunstades supernatanten. 1 mg av det in- dustade materialet kokades snabbt i 0,5 ml 1 % (w/v) natriumlaurylsulfat(=SDS)-lösning innehållande 0,05 M natriumfosfatbuffert, pH 7,5. 0,2 ml av reaktions- blandningen underkastades sedan HPLC pâ en TSK GZOOOSW (7,5 x 600 mm) kolonn (apparat och kolonn var från LKB, Bromma, Sverige). Elueringen genomfördes med den fosfatbuffrade SDS-lösningen och en flödeshastighet på 0,2 ml/min. Elueringskurvan togs upp vid 226 nm med en LKB 2158 SD vàglängdsdetektor utrustad med en LKB 2152 integrator (LKB, Bromma, Sverige). Kurvan visas som fig 1. 454 299 På sama sätt förfors med isolering och rening av subenheterna för amyloid från Langerhanska öarna från katt och från en patient med NIDDM.

Analys av IAPP's aminosyrasekvens Fraktionerna som svarade mot den retarderade protein- toppen (B) fälldes med 9 volymer etanol vid -20 OC.

Fällningen torkades, löstes i 50 % trifluorättikssyra och sattes till en gasfassekvensator (Applied Bio- systems, USA). Aminosyraresterna bestämdes som PTH aminosyror direkt pâ HPLC. Den procentuella aminosyra- sammansättningen bestämdes efter sur hydrolys i 24 timmar.

Immunhistokemi. IAPP-derivat och dess användning.

Framtagning av anti-IAPP antikroppreparation och dess användning.

En undekapeptid svarande mot positionerna 7-17 i IAPP från humant insulinom syntetiserades och konjugerades med hemocyanin från Keyhole limpet av Cambridge Research Biochemicals Ltd, Harston, England. Den i 0,1 M NaOH lösta konjugerade peptiden blandad med Freunds komp- letta adjuvant injicerades subkutant i marsvin. Immu~* niseringen fortsattes sedan med en injektion per vecka, men med immunogenet i Freunds inkompletta adjuvant.

Serum togs en vecka efter den fjärde injiceringen.

Pankreas från katt och människa, som med Kongorött- infärgning visats innehålla stora mängder IA, och kirurgiskt tagna prov fixerades i 4 % formalin, paraf- fininbäddades och snittades. Avparaffinerade snitt studerades med peroxidas-antiperoxídasmetoden (22) varvid primärt anti-IAPP-antiserum användes i späd- ningar på 1:50-l:800. Marsvinsserum och primärt anti- serum adsorberat med den syntetiska peptiden (10 mg/ml) användes som kontroller. 454 299 Resultat 'Upprepade homogeniseringar med insulinom- och pankreas- vävnader i normal fysiologisk koksaltlösning med efter- följande extraktion med guanidin-HCl resulterade i båda fallen i mikroskopiskt nästan ren amyloid. Den erhållna amyloiden, som var olöslig i guanidin-HCI, löstes av kon- centrerad myrsyra. Frystorkad depolymeriserad amyloid var löslig i SDS.

Gelkromatografi (HPLC) av depolymeriserad pankreas-IA från både människa (insulinom) och katt gav elutionskruvor med huvudsakligen en enda retarderad proteintopp. Fraktíonerna som svarade mot denna topp underkastades automatisk gasfas- sekvensering med avseende på aminosyror. I varje steg frisattes en aminosyra. Aminosyrasekvensen hos de tvâ polypeptiderna isolerade från insulinom respektive från Langerhanska öarna hos katt visas i tabell l. Polypeptiden från insulinom underkastades 40 cykler aminosyrasekven- sering, men inga aminosyrarester kunde påvisas efter 37 cykler. Den procentuella aminosyrasammansättningen beräknad från aminosyrasekvensen är i fullständig överens- stämmelse med den sammansättning som kan beräknas efter sur hydrolys (tabell 1). Inga aminosyrarester kunde påvisas för positionerna 2 och 36 i insulinompolypeptiden. Eftersom polypeptiden enligt aminosyraanalys (tabell 2, kolumn A) innehåller cystin (cystein) och eftersom humant CGRP (med vilken en viss grad av partiell identitet föreligger) har cystin i position 2, är det mycket sannolikt att position 2 i den studerade polypeptiden från pankreastumör represen- teras av cystein. Baserat på aminosyrasammansättningen (tabell l, kolumn A), innehåller polypeptiden två glutamin- syra-/glutaminrester, under det att enbart en identifierades genom sekvensanalysen. Det är därför mycket troligt att position 36 representeras av antingen glutaminsyra eller glutamin. Aminosyrasekvensering av humant IAPP har startats, men den bröts efter 18 cykler eftersom ingen skillnad då erhållits relativt insulinom IAPP. Resultatet tillsammans 454 299 med likheten i peptidernas aminosyrasammansättning visar att de är identiska.

Mängden glycin i position 34 var låg men ingen annan amino- syrarest kunde identifieras i detta steg. Under prioritets- året har detta visats vara fel. I positionen 34 finns serin.

Baserat på aminosyrasekvens är molekylvikten på peptiden från human pankreastumör 3 840 dalton.

Datorbaserad jämförelse med aminosyrasekvensen hos kända proteiner med hjälp av programmet "Search" (Protein Identi- fication Resource, release 7, Biomedical Research Foundation, Georgetown University Medical Center, Washington DC, USA) visar på partiell identitet med den kalcitoningenrelaterade peptiden (CGRP) (23, 24), se tabell 3. Fastän aminosyra- sekvenserna för de två peptiderna liknar varandra, finns det också flera distinkta skillnader som klart indikerar att de inte är identiska. Det finns ingen likhet med preproinsulin eller calcitonin. Jämförelsen har klart visat att den aminosyrasekvens som vi bestämt ej finns beskriven för något tidigare känt protein.

Resultatet av N-terminal aminosyrasekvenserinq av amyloid- peptiden från katt visas i tabell 2. Analysen var entydig för aminosyraresterna i positionerna 3-27. Den funna sekven- sen är identisk med den som bestämdes för den humana pan- kreaspolypeptiden, med undantag för tre aminosyrasubstitu- tioner i positionerna 17, 18 och 23. Den ofullständiga sekvensen hos kattpeptiden representerar 44 % identitet med motsvarande region i humant CGRP.

Under prioritetsàret har vi visat att aminosyrorna vid positionerna 7 och 34 i humant IAPP och positionen 7 i katt IAPP var felbestämda (jfr ref 26 och 27 samt tabellerna 1-3). 454 299 12 Med hjälp av peroxidas-antiperoxidasteknik och primärt antiserum riktad mot det syntetiska peptidsegmentet (posi- tionerna 8-17 av den humana tumörpeptiden, egentligen 7-17 eftersom aminosyran i positionen 7 hos humant IAPP visats vara cystein och inte serin som sades i den ursprungliga texten), visades en stark immunreaktivitet i beta-celler hos de Langerhanska öarna från normal human pankreas och i IA från både katt och människa. Pankreaskörtelvävnaden i övrigt förblev helt ofärgad. Immunreaktiviteten hos cellerna i de Langerhanska öarna och hos IA kunde ej erhållas, om det primära antiserumet först adsorberats med den syntetiska peptiden eller om det primära antiserumet ersattes med normalt marsvinsserum.

Diskussion Studierna som lett fram till denna uppfinning har skett med förhoppningen, att information om det molekylära ursprunget och om den kemiska naturen av amyloid associerad med de Langerhanska öarna i såväl människa som katt skall ge viktiga insikter i patogenesen av den diabetes mellitus (DM) som är associerad med åldrande. IA som liknar den humana formen förekommer ofta i gamla kattor som har en form av DM som liknar NIDDM (25). Preliminära kemiska och immunologiska studier har visat, att IA hos katt har egenskaper som mycket liknar de som finns hos humant IA.

De immunhistokemiska försöken visar på en kraftig immun- reaktivitet hos normala celler i de Langerhanska öarna i human pankreas och hos IA-utfällningar hos både katt och människa. Dessa resultat tyder pá att IAPP frisätts lokalt från cellerna i de Langerhanska öarna.

IAPP från människa och katt är av samma kemiska natur. Med största sannolikhet finns även likhet med andra djur. Den potentiella biologiska och patobiologiska betydelsen av V denna tidigare oidentifierade neuropeptidliknande substans med avseende på pankreas endokrina funktion och med avseende 454 299 på patogenesen av NIDDM är också intressant, speciellt med tanke pá att vi även visat på förekomst av amyloidutfäll- ningar i pankreasnerver och i ganglier hos katter med diabetes. Dessa amyloidutfällningar har visats ha samma histokemiska och immunhistokemiska egenskaper son IA och har påvisats i nära association med ganglioniska beta-celler.

IAPP:s roll i de Langerhanska öarna är okänd, men dess partiella identitet med CGRP pekar mycket starkt på en viktig regulatorisk funktion.

Under prioritetsáret har vi publicerat uppfinningen (26, 27). I augusti 1987 har det dessutom publicerats data från en annan grupp som verifierar den av oss funna sekvensen för IAPP (28).

Ett tillstånd där brist på IAPP kan tänkas vara av vikt är insulinberoende (juvenil) diabetes mellitus (IDDH). Denna sjukdom karakteriseras av mer eller mindre total förlust av de insulinproducerande beta-cellerna (1). Dä hittills erhållna resultat talar för att IAPP syntetiseras i beta- cellerna föreligger troligen också IAPP-brist vid IDDM. Det kan tänkas att denna brist ger upphov till en del av de förändringar som ses vid IDDM, t ex njurskador eller retinopati. I så fall skulle IAPP eventuellt kunna användas terapeutiskt vid IAPP-brist. 454 299 - 14 Tabell 1 Aminosyrasammansättning av IAPP renad från amyloíd produ- cerad av humant insulinom (A), Langerhanska öarna hos människa (B) och Langerhanska öarna hos katt (C). De angivna värdena är aminosyrarester i procent per molekyl. Mut- svarande värden beräkande från aminosyrasekvensen hos IAPP isolerad från humant insulinom ges inom parentes. Cystin bestämdes efter oxidation med permyrsyra. ND = ej bestämd. è ä E Asx 5,5 (6) 4,8 4,0 Thr 4,2 (4) 3,6 2,7 Ser 5,3 (5) 4,2 3,0 Glx 1,9 (l*) 1,8 2,7 Pro 0,0 (0) Spår 1,6 Gly 3,4 (3) 4,2 3,2 Ala 3,9 (4) 4,2 3,2 Cys 1,5 ND ND Val 2,1 (2) 2,4 2,2 Met 0,0 (0) 0,0 0,0 Ile 1,0 (1) 1,2 2,0 Leu 2,9 (3) 3,1 4,1 Tyr 0,9 (1)) 0,9 1,3 Phe 1,7 (2) 1,8 1,6 His 0,8 (1) 1,2 0,6 Lys 1,1 (1) 0,9 2,0 Arg 1,3 (l) 1,3 1,8 Glx = Glutamin eller glutaminsyra.

Asx = Asparagin eller asparaginsyra. 454 299 Tabell 2 Fullständig aminosyrasekvens hos humant insulinom IAPP jämfört med en del av IAPP från katt. * ännu ej med säkerhet bestämd aminosyra. Under prioritetsàret har vi visat att aminosyrorna i positionerna 7 och 34 i humant IAPP och 7 i katt IAPP var felbestämda (jfr 26, 27). Sekvenserna har nu korrigerats och de tidigare angivna men felaktigt bestämda aminosyrorna har satts inom parentes. Aminosyran i position 7 hos katt IAPP har ännu ej bestämts med säkerhet. * för system i position 2 humant IAPP har tagits bort, eftersom aminosyran nu bestämts med säkerhet.

Humant IAPP: 10 Lys-Cys-AsnfThr-Ala4Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala~Asn-Phe-Leu-Val-His (*) (Ser) Katt IAPP: Lys-*- Asn-Thr-Ala-Thr-*- Ala-Thr-Gln-Axg~Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Ile-Arg (Ser) 30 35 Ser-Ser-AsnfAsn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-ThrfAsn-Val-Gly-Ser-Asn-Glx*-Tyr (Gly) Ser-Ser-Asn-Asn-Ieu-Gly-Ala-Ile-Leu,Ser,Gly Tabell 3 Aminosyrasekvens hos humant ínsulinom IAPP jämfört med de två humana CGRP och med den sekvensbestämda delen av IAPP från katt IA. De sekvensbestämda delarna av katt och human IAPP är identiska med undantag av positionerna 17, 18 och 23. I likhet med ovan har korrigeringar gjorts för tidigare felaktigt bestämda aminosyror. * ännu ej med säkerhet bestämd. 454 299 16 flumanncczxn() AcnIAIcvmHRLAcLLsnscGHvxsNFvPIuvcsLAF Hunmn:ccx1>2( ) AcNIAIcvIHRLAGLLsRscGvvKNNFvPINvGsLAï HumantinsuHnomIAPPKCNIAICAIQRLANI-'LVHSSNNFGAILSSTNVGSN*Y (S) (G) xcancm? K*N1°AIIQRLANFLIRSSNNLGAIL i: (S) .få 454 299 REFERENSER 1. Maclean, N. & Ogilvie, R. F. (1955) Diabetes 4, 367-376. 2. Gepts, W. (1958) Endokrinologie 36, 185-211. 3. Ludwig, G. & Heitner, H. (1967) Z. Inn. Med. 22, 814-818. 4. Westermark, P. & Wilander, E. (1978) Diabetologia 15, 417-421.

. Yano, B. L., Hayden, D. W. & Johnson, K. H. (1981) Vet. Pathol. 18, 621-627. 6. Opie, E. L. (1900) J. Exp. Med. 5, 397-428. 7. Westermark, P. (1975) Acta Path. Microbiol. Scand. C 83, 349-446. 8. Eanes, E. D. & Glenner, G. G. (1968) J. Histochem.

Cytochem. 16, 673-677. 9. Cornwell, G. G. & Westermark, P. (1980) J. Clin. Path. 33, 1146-1152.

. Glenner, G. G. (1980) New Engl. J. Med. 302, 1283-1292 & 1333-1343. 11. Glenner, G. G., Terry, W., Harada, M., Isersky, C. & Page, D. (1971) Science 172, 1150-1151. 12. Benditt, E. P., Eriksen, N., Hermodson, M. A. & Ericsson, L. H. (1971) FEBS Lett. 19, 169-173. 13. Sletten, K., Westermark, P. & Natvig, J. B. (1976) J. Exp. Med. 143, 993-998. 14. . 16. 17. 18. 19. . 21. 22. 23. 24. 454 299 Costa, P. P., Figueira, A. S. & Bravo, F. R. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 4499-4503.

Cohen, D. H., Feiner, H., Jensson, 0. & Frangione, B. (1983) J. Exp. Med. 158, 623-628.

Glenner, G. G. & Wong, C. W. (1984) Biochem. Biophys.

Res. Commun. 120, 885-890.

Gejyo, F., Yamada, T., Odani, S., Nakagawa, Y., Arakawa, M., Kunitomo, T., Kataoka, H., Suzuki, M., Hirasawa, Y., Shirahama, T., Cohen, A. S. & Schmíd, K. (1985) Biochem, Biophys. Res. Commun. 129, 701-705.

Pearse, A. G. E., Ewen, S. W. B. & Polak, J. M. (1972) Virchows Arch. Cell. Pathol. 10, 93-107.

Westermark, P., Grimelius, L., Polak, J. M., Larsson, L-I., van Noorden, S., Wilander, E. & Pearse, A. G. E. (1977) Lab. Invest. 37, 212-215.

Wide, L. et al. Radioimmunoassays and related Procedures in Medicine, Vol I (1978), 143-54.

Masters, C. L., Multhaup, G., Simms G., Pottgíesser, J., Martins, R. N. & Beyreuther, K. (1985) EMBO J. 4, 2757-2763.

Sternberger, L. A. (1979) Immunocytochemistry. 2nd Edit., John Wiley & Sons, New York.

Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S. & (1982) Nature 298, 240-244.

(J- Evans, R. M.

Rosenfeld, M. G., Mermod, J.-J., Amara, S. G., Swanson, L. W., Sawchenko, P. E., River, J., Vale, W.

R. M. (1983) Nature 304, 129-135. ff W. & Evans, . 26. 27. 28. 29. 454 299 Johnson, K. H., Hayden, D. W., O'Bríen, T. D. & Westermark, P. (1986) Am. J. Pathol. In press 125, 416-9.

Westermark, P., Wernstedt, C., Wilander, E. och Sletten, K. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 140, 827-31.

Westermark, P., Wernstedt, C., Wilander, E., Hayden D.W., 0'Brien, T.D. och Johnson, K.H. (1987) Proc. Natl. Sci.

USA 84, 3881-5.

Clark, A., Lewis, C.E., Wellis, A.C., Cooper, G.J.S., Morris, J.F. och Reid, K.B.M. (1987) Lancet August 231-2. 414-7.

Westermark, P et al, (1987) Am. J. Pathol 127,

Claims (1)

1. 454 299 20 Patentkrav.

1. Sats innehållande protein relaterat till pankreas- öamyloid (IA) och användbar för att bilda komplex mellan proteinet och en till detta bindande receptor, såsom vid immunsorbentrening och immunkemisk bestämning av proteinet, k ä n n e t e c k n a d av att satsen innehåller (i) en IAPP-preparation där IAPP står för depolymeri- serad IA som i huvudsak är fri fràn IA och utgör huvuddelen, såsom mer än 50 % (w/w) av preparationens protein härstammande från råvarukälla, varvid IAPP när det isolerats från human IA i aminosyrapositionerna 8-33 har sekvensen 8 10 20 -Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn~Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser 30 33 -Asn~Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly- och/eller (ii) en antikroppspreparatíon som är specifikt riktad m0t IAPP. Ja* 41 I!