DE69331825T2 - Zusammensetzungen und methoden der inhibition der beta-proteinfunktion - Google Patents

Zusammensetzungen und methoden der inhibition der beta-proteinfunktion

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Description

  • Die Alzheimer Krankheit ist eine degenerative Störung des zentralen Nervensystems, die einen fortschreitenden Verlust des Gedächtnisses und weiterer intellektueller Funktionen wie beispielsweise des Denkvermögens, der Orientierung und des Urteilsvermögens zur Folge hat (R. Katzmann, Banbury Report 15: Biological Aspects of Alzheimer's Disease, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1983)). Die Alzheimer Krankheit tritt in sporadischen und familiengebundenen Formen auf und befällt in den Vereinigten Staaten ungefähr 600 pro 100.000 Menschen. Ein charakteristischer Aspekt der Neuropathologie der Erkrankung liegt im Auftreten proteinartiger Ablagerungen, die als "Amyloid" bezeichnet werden, und zwar in den Kernen von Gehirnläsionen bzw.- verletzungen, die als neuritische oder senile Plaques bezeichnet werden, ebenso wie in zerebralen Blutgefäßen. Die "Amyloid"-Ablagerungen sind im Allgemeinen als 6 bis 10 Nanometer lange Proteinfilamente definiert, die bestimmte Färbungseigenschaften aufweisen (Abraham, C.R. et al. Cell, 52: 487-501 (1988)).
  • Amyloid-Ablagerungen sind ebenfalls in den Gehirnen von älteren Menschen zu finden, obwohl dies nicht so umfassend wie bei der Alzheimer Krankheit der Fall ist. Weiterhin entwickeln Patienten von mehr als 30 oder 40 Jahren mit dem Down-Syndrom ausnahmslos die Symptome und die Neuropathologie, die für die Alzheimer Krankheit charakteristisch ist.
  • Ein Bestandteil der Amyloid-Ablagerungen wurde als A4-Amyloid oder β-Protein (β-Protein) identifiziert und ist 42 Aminosäuren lang (Glenner, G.G. und C.G. Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120: 885-890 (1984)). Dieses Protein ist offensichtlich von einem größeren Membran-überspannenden Vorläuferprotein abgeleitet, dessen RNA alternativ gespleißt ist, so dass mehrere Proteinprodukte die Folge sind (Selkoe, D.J., Science, 248: 1058-1060). Diese Beobachtung legt nahe, dass die Amyloid- Ablagerungen bei der Alzheimer Krankheit aus einer abnormalen Expression oder posttranslationalen Modifikation oder Prozessierung bzw. Verarbeitung eines normalen Moleküls resultieren. Ebenso verblüffend war die Erkenntnis, dass das Gen, das den Amyloid-Protein-Vorläufer kodiert, sich auf dem Chromosom 21 befindet, was eine gemeinsame Ursache der Ablagerungen, die beim Down-Syndrom beobachtet werden, das durch die Trisomie von Chromosom 21 verursacht wird, und der Alzheimer Krankheit nahe legt.
  • Wie oben erwähnt, scheinen einige Fälle der Alzheimer Krankheit familiengebunden bzw. familiär bedingt zu sein und werden in einer autosomal dominanten Art und Weise vererbt. Eine Verbindungsanalyse in vier Familien wies auf eine Läsion bzw. Verletzung auf dem langen Arm von Chromosom 21 hin (St. George- Hyslop, P. H. et al., Science, 238: 664-660 (1987)), was gut mit den Mapping- bzw. Kartierungsdaten und Ähnlichkeiten zwischen dem Down-Syndrom und der Alzheimer Krankheit übereinstimmte. Kürzlich wurde berichtet, dass eine vererbliche Gehirnblutung mit Amyloidosis holländischen Ursprungs (Dutch origin) mit dem APP-Gen in Verbindung stand, und eine Punktmutation in der kodierenden Region des Gens wurde identifiziert (Van Broeckhoven, C. et al., Science, 248: 1120-1122 (1990); Levy, E. et al., Science, 248: 1124-1126 (1990)). Patienten mit dieser Erkrankung weisen eine Form des β-Proteins in Amyloid- Ablagerungen in meningealen und zerebralen Blutgefäßen auf.
  • Jedoch berichteten andere Studien von einer Verbindung der familiengebundenen Alzheimer Krankheit mit einem Ort auf Chromosom 21, der vom Amyloid-Vorläuferprotein (Amyloid Precursor Protein = APP)-Gen getrennt ist (Tanzi, R.E. et al., Nature, 329: 156-157 (1987); Van Broeckhoven, C. et al., Nature, 329: 153-155 (1987)). Darüber hinaus existierte kein Hinweis bzw. Beweis einer Verdopplung des APP-Gens in Fällen einer familiengebundenen oder sporadischen Erkrankung. Tatsächlich weisen Studien einiger Familien wie verlautet darauf hin, dass keine Verbindung zum Chromosom 21 besteht (Schellenberg, G.D., Science, 241: 1507-1510 (1988)). Diese Daten legen nahe, dass eine genetische Heterogenität in der Ursache vererbter Formen der Alzheimer Krankheit liegt, und es wurden andere Orte für das Krankheitsgen vorgeschlagen, wie beispielsweise das Chromosom 14 (Weitkamp, L.R., Amer. J. Hum. Genet., 35: 443-453 (1983)).
  • Somit können auch andere Bestandteile der proteinartigen Ablagerungen in der Alzheimer Krankheit von Interesse sein und können Schlüsse auf die Ursache oder das Fortschreiten der Krankheit bereitstellen. Tatsächlich wurde ein zweiter Bestandteil der Amyloid-Ablagerungen als α&sub1;-Antichymotrypsin (ACT) charakterisiert, das interessanterweise auf Chromosom 14 befindlich ist. Abraham et al. berichteten von der Identifizierung des Serinprotease-Inhibitors ACT in Amyloid- Ablagerungen im Gehirn von Alzheimerkranken (Abraham, C.R. et al. Cell, 52: 487-501 (1988)).
  • Potter et al. (Neurobiology of Ageing, Bd. 11 (1990), abstracts of second International conference on Alzheimer's disease abstract Nr. 245) beschreiben die Bildung spezieller Komplexe zwischen α&sub1;-Antichymotrypsin und dem β-Protein.
  • US 4 303 592 offenbart die selektive Serinprotease inaktivierende Aktivität von Amidinophenylmethylsulfonylfluorid.
  • Wo 91/13904 beschreibt die Identifizierung, Charakterisierung und Reinigung zweier Chymotrypsin-artiger Serinproteasen, die für AD (Alzheimer Disease = Alzheimer Krankheit) charakteristisch sind, und die "Chymase" und "multikatalytische Protease" genannt werden, und die aus dem Rattengehirn oder dem menschlichen Gehirn gewonnen wurden. Sowohl Chymase als auch die multikatalytische Protease weisen einen enzymatische Aktivität auf, die zur Spaltung zwischen Met und Asp in der Lage ist, und von der die Autoren feststellen, dass diese zur Erzeugung des β-Amyloids erforderlich ist.
  • GB 2 071 661 A offenbart, dass Ebelacton A eine Anti- Esteraseaktivität bzw.-Wirkung aufweist.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung findet bei Verfahren zur Störung der Bildung eines spezifischen Komplexes zwischen ACT- und β- Protein und somit zur Reduzierung von nachteiligen Wirkungen, die sich aus der Komplexbildung bei der Alzheimer'schen Krankheit ergeben, Anwendung. Sie findet ebenfalls Anwendung bei Verfahren zur Hemmung der Funktion der Bestandteile des ACT-β-Proteinkomplexes und zur Hemmung der Funktion von β- Protein, das, wie hierin gezeigt, eine enzymatische Aktivität aufweist, die von physiologischer Relevanz sein könnte.
  • Hierin beschrieben ist eine neuartige Klasse synthetischer Peptide oder Peptid-artiger Verbindungen, die einen Bestandteil des speziellen Komplexes, der zwischen dem Alzheimer β-Protein und ACT gebildet wird, nachahmen und die dazu brauchbar sind, die Bildung des Komplexes zu stören. Die Erfindung findet Anwendung bei der Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Patienten, bei dem sich derartige Komplexe bilden, was direkt oder indirekt einen abnormalen Zustand oder Krankheitszustand zur Folge hat, und insbesondere auf ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit Alzheimer Krankheit. Synthetische Peptide, die die Komplexbildung zwischen dem Alzheimer β-Protein und ACT hemmen, indem sie an das β-Protein oder an ACT binden, können einem Individuum in einer derartigen Art und Weise verabreicht werden, dass sie die ACT-β-Protein-Interaktion stören, und in einer ausreichenden Menge, so dass sie die erwünschte Wirkung aufweisen (d. h. die Reduktion der Komplexbildung und des abnormalen Krankheitszustandes).
  • Ebenfalls beschrieben sind Inhibitoren der enzymatischen oder anderen Aktivität von Bestandteilen des ACT-β-Proteinkomplexes, und Zusammensetzungen und Verbindungen, die die Aktivität von β-Protein, β-Proteinvorläufern oder β-Proteinfragmenten hemmen. Wie hierin beschrieben wurde gezeigt, dass β- Proteinvorläuferproteine und β-Proteinfragmente eine Esteraseaktivität aufweisen, einschließlich einer Cholesterinesterase-Aktivität (siehe Beispiele 3 und 4) und bezüglich einer zusätzlichen Esterase- oder Proteaseaktivität untersucht werden. Als Folge kann die Aktivität des β-Proteins durch Verabreichung von Zusammensetzungen oder Verbindungen gehemmt werden, die dessen Cholesterinesterase-Aktivität oder eine andere Esterase- (beispielsweise Lipase-) oder Proteaseaktivität stören. Derartige Zusammensetzungen oder Verbindungen, die bekannte Materialien oder Materialien sein können, die speziell zur Hemmung des β-Proteins konzipiert oder entwickelt wurden, können einem Patienten, der einer β- Proteinhemmung bedarf, durch das vorliegende Verfahren in ausreichenden Mengen verabreicht werden, die zur Hemmung der β- Proteinaktivität wirksam sind.
  • Die Erfindung findet ebenfalls Anwendung in einem Verfahren zur Identifizierung von β-Proteininhibitoren und Inhibitoren, die dadurch identifiziert worden sind. In dem Verfahren werden β- Protein, ein Substrat, auf das es einwirkt (beispielsweise Acetylthiocholin) und ein potentieller β-Proteininhibitor unter Bedingungen kombiniert, die für die β-Proteinaktivität geeignet sind; in der Gegenwart eines β-Proteininhibitors tritt eine Hydrolyse des Substrats nicht auf oder tritt in einem geringeren Umfang auf, als es der Fall sein würde, wenn der Inhibitor abwesend ist.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist die Aminosäuresequenz des Alzheimer Amyloid-β- Proteins (obere Reihe) und der aktiven Orte bzw. Stellen der nachfolgenden fünf Serinproteasen: cytotoxische T-Zell- Protease; Cathepsin G; Mastzell-Protease; Trypsin; und Chymotrypsin.
  • Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Proteaseartigen regulatorischen Aktivität des Alzheimer Amyloid-β-Proteins.
  • Die Fig. 3A (Autoradiogramm) und 3B (Immunblot) zeigen die stabile Interaktion von α&sub1;-Antichymotrypsin und dem β-Protein, demonstriert wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Bahnbezeichnungen, 1-18, sind wie folgt:
  • Fig. 4 ist eine graphische Darstellung des Zeitverlaufes der Hydrolyse von Acetylthiocholiniodid durch Ratten β-Peptid 1-40 (5 ug), menschlichem β-Peptid 1-40 (5 ug) und Acetylcholinesterase (0,0025 ug).
  • Delta A Rat y = 1.9838e-2 + 1.4096e-3x RΛ2 = 0.964
  • Delta A Hum y = 2.5353e-2 + 6.5074e-4x RΛ2 = 0.959
  • Delta A AChE y = 2.94853-3 + 2.8559e-3x RΛ2 = 0.988
  • Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Hemmung durch Paraamidinophenylmethansulfonylfluorid (pAPMSF) der Hydrolyse verschiedener Konzentrationen von Paranitrophenylacetat (PNPA) durch eine APP 695-assoziierte Esterase, die aus CHO-Zellen isoliert wurde. Die Daten für die Umsetzung in Gegenwart von pAPMSF (Quadrate) und in Abwesenheit von pAPMSF (ausgefüllte Rauten) ist in Form eines doppeltreziproken (Lineweaver-Burk) Plot von 1/[PNPA] (mW&supmin;¹) versus 1/v dargestellt (wobei v = ΔA&sub4;&sub0;&sub5;/Zelt). Die Gleichungen für die oberen (ausgefüllten Rauten) und unteren Linien (Quadrate) sind jeweils:
  • y = 5.4198e-2 + 0.14479x; RΛ2 = 0.894;
  • y = 4.5422e-2 + 0.79028x; RΛ2 = 0.947;
  • Fig. 6 ist eine Darstellung der Struktur von 3,11-Dihydroxy-4, 6, 8, 10, 12-pentamethyl-9-oxo-tetradecen-1,3-lacton, eine Verbindung, die mit Ebelacton A verwandt ist und von (p- Amidinophenyl) ethansulfonylfluorid und (p-Amidinoethylbenzyl) methansulfonylfluorid, zwei Verbindungen, die mit pAPMSF verwandt sind.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Der Proteaseinhibitor α&sub1;-Antichymotrypsin (ACT) und das 42- Aminosäure-β-Protein sind integrale Bestandteile der Amyloidablagerungen der Alzheimer Krankheit, des Down-Syndroms und des normalen Alterns im Gehirn. Dies zeigt an, dass es eine spezielle Affinität zwischen ACT und dem β-Protein gibt, das vielleicht für die Amyloid-Bildung essentiell ist. Eine Basis für diese Assoziation wird durch die Ähnlichkeit des N-Terminus des β-Proteins mit der aktiven Stelle der Serinproteasen nahe gelegt.
  • Wie hierin beschrieben, zeigen in-vitro-Experimente, dass ACT und das β-Protein einen Komplex bildet, der die Spezifität und Stabilität einer Protease-Inhibitorinteraktion widerspiegelt. Diese Ergebnisse schlagen eine Modell für das Amyloid-Filament und eine physiologische Funktion für das β-Protein vor. Wie ebenfalls hierin beschrieben, wurde gezeigt, dass β-Protein- Peptide und ein β-Protein-Vorläuferprotein eine Esteraseaktivität zeigen, die eine physiologische Relevanz haben könnte. Es ist vernünftig zu erwarten, dass die Aktivität des β-Proteins eine Rolle in der toxischen Wirkung der Amyloid- Ablagerungen, von denen β-Protein ein Bestandteil ist, aufweisen könnten. Es ist ebenfalls vernünftig vorherzusagen, dass das β-Protein eine weitere Esterase- oder Proteaseaktivität aufweist, die unter Verwendung bekannter Verfahren festgestellt werden kann, und dass die enzymatische Aktivität ebenfalls eine physiologische Relevanz aufweist.
  • Es wurde demonstriert, dass das β-Protein-Vorläuferprotein, das als APP 695 bezeichnet wird, Acetylthiocholin und Paranitrophenylacetat hydrolysiert, was darauf hinweist, dass es eine Esteraseaktivität aufweist. Es wurde zusätzlich gezeigt, dass synthetische Alzheimer-Peptide 1-40, die Ratten und menschlichen Sequenzen entsprechen, Acetylthiocholin in einer zeitabhängigen Weise hydrolysieren, und dass die Esteraseaktivität eher auf eine intrinsische Eigenschaft des β- Peptids zurückzuführen ist, als auf eine unspezifische Peptid- Wirkung. Es ist ebenfalls beschrieben, dass sowohl die Aktivitätsdaten als auch die Radiomarkierungsdaten anzeigen, dass die Esteraseaktivität, die beobachtet wurde, nicht auf Acetylcholinesterase zurückzuführen ist.
  • Hierin werden Ergebnisse präsentiert, die es möglich machen, synthetische Peptide zu konzipieren oder auszuwählen, die einem Patienten (eingeführt in Zellen) verabreicht werden können, um die Bindung der beiden Bestandteile zur Bildung des Komplexes zu stören (zu reduzieren oder zu verhindern). Derartige synthetische Peptide schließen Peptide und Peptid-artige Verbindungen (beispielsweise modifizierte oder derivatisierte Peptide) ein, die die Interaktion von ACT mit dem β-Protein stören, insbesondere die Peptide, die die aktiven (oder Bindungs-) Stellen der Serinprotease "nachahmen". Derartige Peptide können Kurzpeptide sein, bei denen die Aminosäuresequenz mit der Sequenz der Bindungsstelle einer Serinprotease ausreichend homolog ist, oder mit dem N-Terminus des β-Proteins, wie in Fig. 1 dargestellt, so dass sie mit ACT binden. Alternativ können derartige Peptide zusätzlich zu der Sequenz, die mit der Serinprotease-Bindungsstelle oder der β- Protein-Region ausreichend homolog ist, andere Aminosäuren (beispielsweise ein oder mehrere Aminosäuren an jeder oder beiden Enden der Bindungsstellensequenz) einschließen. Eine wie hierin beschriebene Verbindung kann in einen Patienten in einer derartigen Weise eingebracht werden, dass sie die Bildung des ACT-β-Proteinkomplexes hemmt. Im vorliegenden Verfahren zur Störung der Komplexbildung wird eine Verbindung in einer ausreichenden Menge und auf einem geeigneten Weg verabreicht, so dass sie einen therapeutischen Effekt aufweist (um eine verminderte Komplexbildung zur Folge zu haben).
  • Die hierin beschriebenen Ergebnisse machen es ebenfalls möglich, Zusammensetzungen oder Verbindungen zu konzipieren oder auszuwählen, die zur Hemmung der Aktivität des ACT-β- Proteinkomplexes oder von dessen Bestandteilen brauchbar sind. Derartige Zusammensetzungen können beispielsweise Mittel sein, die die enzymatische Aktivität des β-Proteins, β- Vorläuferproteins oder β-Proteinfragmentes entweder direkt oder indirekt stören (die hierin kollektiv als β-Protein bezeichnet werden). Sie können beispielsweise Esterase-Inhibitoren, insbesondere Cholinesterase-Inhibitoren, oder Protease- Inhibitoren sein, die bekannte Mittel sind oder die für den Zweck der Hemmung des β-Proteins konzipiert wurden. Derartige Inhibitoren können direkt (beispielsweise durch Zerstören, Binden oder in anderer Weise Anbinden des β-Proteins) oder indirekt (beispielsweise durch Wirken wie ein "Ködersubstrat" für die β-Proteinaktivität und somit Schützen des physiologischen Substrates, auf das β-Protein einwirkt) wirken.
  • Ein Inhibitor der Aktivität eines Komplexbestandteils (beispielsweise eines Inhibitors der enzymatischen β-Protein- Aktivität) kann in ein Individuum in einer derartigen Art und Weise und in einer ausreichenden Menge eingebracht werden, so dass die Aktivität gehemmt und die nachträglichen Wirkungen (gesamt oder teilweise) reduziert werden, die ansonsten auftreten würden.
  • Das Nachfolgende ist eine Beschreibung des Beweises, dass ACT und das β-Protein mit einer Spezifität wechselwirken bzw. interagieren, so dass in vitro ein stabiler Komplex gebildet wird, und der Feststellung der Esteraseaktivität der β-Protein- Peptide und β-Vorläuferproteine von Verbindungen, die zur Störung der Interaktion verwendet werden können, und von Inhibitoren der Aktivität von ACT-β-Protein-Komplexbestandteilen, wie beispielsweise einer β-Proteinesterase-Aktivität. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff β-Protein das β- Protein (wie auf Seite 2 oben beschrieben), β-Protein- Vorläuferproteine und β-Protein-Fragmente ein, die in einem Komplex mit α&sub1;-Antichymotrypsin vorliegen, oder die in einer ungebundenen Form (nicht in einem Komplex mit α&sub1;- Antichymotrypsin) vorliegen. Die Identifizierung derartiger Verbindungen und das Verfahren, durch das sie verabreicht werden, werden ebenfalls beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung findet Anwendung bei der Behandlung von Patienten wie beispielsweise solchen mit einer Alzheimer Krankheit, bei denen eine Komplexbildung ansonsten eintreten würde, oder bei denen eine β-Proteinaktivität ansonsten eine schädliche Wirkung aufweisen würde, wie beispielsweise eine exzessive Inaktivierung oder Zerstörung von Acetylcholin oder eine Zerstörung von Schlüsselproteinen in den umgebenden Geweben.
    • Beweis der Bildung des ACT-β-Protein-Komplexes
  • Die extrazellulären Amyloidfilamente, die in den Plaques und Blutgefäßen bei der Alzheimer Krankheit, dem Down-Syndrom und bei normalem Altern zu finden sind, enthalten zwei Proteine, die beide innig mit den Filamenten verbunden sind - das 42- Aminosäure-β-Protein und den Serinprotease-Inhibitor, α&sub1;- Antichymotrypsin (Glenner, G.G. und C.W. Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm., 122: 885 (1984); C.L. Masters et al., EMBO J. 4: 2757 (1985); D.J. Selkoe et al., J. Neurochem. 46: 1820 (1986); D.J. Selkoe et al., Science, 235: 873 (1987); Abraham, C.R. und H. Potter, Bio/technology 7: 147 (1989); D.J. Selkoe, Ann. Rev. Neurosci. 12: 493 (1989); B. Muller-Hill, Ann. Rev. Biochem. 58 : 287 (1989); Neve, R.L. und H. Potter, in Molecular Genetic Approaches to Neuropsychiatric Disease, J. Brosius und R. Fremeau, Hgs. (Academic Press, San Diego, in press); C.R. Abraham et al., Cell 52: 487 (1988); C.R. Abraham et al., Neuroscience, 32: 715 (1989)). Es hat sich kürzlich herausgestellt, dass die Hauptkomponente des vaskulären Amyloids in der holländischen bzw. Dutch-Variante der vererblichen Gehirnblutung mit Amyloidosis (HCAWA-D) das β- Protein und nicht Cystatin C ist, wie bei der isländischen Version (HCHWA-I), obwohl die Angiopathie ähnlich erscheint (J. Ghiso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 2974 (1986); S.G. von Duinen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5991 (1987)). Wenn Gehirnabschnitte von Patienten mit dieser Erkrankung durch Immunmarkierung analysiert wurden, hat sich herausgestellt, dass ACT vorhanden war (M. M. Picken et al., Am. J. Pathol. 134: 749 (1989)). Im Gegensatz hierzu enthalten Amyloid- Ablagerungen, die bei anderen Erkrankungen zu finden sind, weder β-Protein noch ACT. Die biochemischen Eigenschaften von ACT und dem β-Protein legen eine Basis für diese spezielle Verbindung nahe. Zunächst ist ACT ein Serinprotease-Inhibitor, der durch Einwirken als ein Pseudosubstrat und kovalentes Binden an seine Zielprotease zur Bildung eines langlebigen Komplexes dient (J.B. Travis et al., Biochemistry 17: 5651 (1978)). Zweitens zeigt eine Inspektion der Sequenz des β- Proteins einen Bereich nahe dem N-Terminus, der eine auffällige Homologie zu einem Segment der aktiven Stelle der Serinproteasen aufweist, einschließlich der Schlüsselserin- Aminosäure (Fig. 1) (E. Roberts, Neurobiol. Aging 7: 561 (1986); Travis, J. und G.S. Salvesen, Ann. Rev. Biochem. 52: 655 (1983); G. Salvesen et al., Biochemistry 26: 2289 (1987)). Es scheint somit möglich zu sein, dass ACT und das β-Protein zur Bildung eines Komplexes mittels einer Proteaseinhibitorartigen Interaktion in der Lage sind und dass dieser Komplex zur Stabilität der Alzheimer Amyloid-Filamente beiträgt. Diese Hypothese wurde wie unten beschrieben getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass das β-Protein tatsächlich dazu in der Lage ist, an die aktive inhibitorische Stelle von ACT zu binden.
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden verschiedene synthetische Peptide bezüglich ihrer Wirkung auf die Hemmung von Chymotrypsin durch ACT in vitro getestet.
  • Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Fähigkeit von ACT, die Proteaseaktivität zu hemmen; die Bestimmung wurde mit den synthetischen Peptiden durchgeführt. Wie in Fig. 2 dargestellt, hemmte das ACT über 90% der Chymotrypsin- Aktivität, wenn das ACT/Chymotrypsin Molverhältnis ungefähr 1 : 1 war. Wenn jedoch ACT mit einem ungefähr vierfachen molaren Überschuss an synthetischen Peptiden, die den Aminosäuren 1-12 oder 1-28 des β-Peptids entsprachen, vor dem Zusatz von Chymotrypsin präinkubiert wurden, war die inhibitorische Wirkung von ACT beträchtlich reduziert, und die Chymotrypsin- Reaktions- bzw. Umsetzungsgeschwindigkeit nahm um das zwei- bis achtfache zu. Jedoch versagte die Präinkubation mit einem sogar 10 fachen molaren Überschuss eines Peptids, das den Aminosäuren 258 bis 277 des β-Protein-Vorläufers entsprach (das keine Ähnlichkeit mit der aktiven Stelle der Serinproteasen zeigt) dabei, ACT zu stören. Diese Daten legen nahe, dass Peptide, die eine Ähnlichkeit der Region um das Schlüsselserin in der aktiven Stelle der Serinproteasen (Fig. 1) herum zeigen, und insbesondere das Alzheimer Amyloid-β-Protein, dazu in der Lage ist, die inhibitorische Funktion eines Serinprotease- Inhibitors, nämlich ACT, zu hemmen. Die Spezifität der Interaktion weist darauf hin, dass sie an der inhibitorischen aktiven Stelle von ACT auftritt. Die Tatsache, dass ACT sogar in Gegenwart des Peptids noch eine beträchtliche Fähigkeit zeigt, Chymotrypsin zu hemmen, spiegelt vielleicht die Tatsache wider, dass die Bindung eines Protease-Inhibitors an sein Target bzw. Ziel viele Berührungen mit Aminosäuren in der Vollprotease-aktiven Stelle einschließt, der die kleinen Peptide natürlicherweise fehlen.
    • Bewertung der Stabilität und Spezifität der Bildung des α&sub1;-ACT- β-Protein-Komplexes
  • Anders als echte Substrate, die ein vorübergehendes kovalentes Zwischenprodukt mit der Protease durch die Hydroxylgruppe ihres Serins bilden und dann abgespalten werden, wenn die Bindung bricht und die Protease ihren aktiven Zustand wiederum einnimmt, werden Proteaseinhibitoren gespalten, geben jedoch ihre Bindung an die Protease nur sehr langsam auf (J. Travis et al., Biochemistry 17: 5651 (1978)). Somit hemmen die Inhibitoren die Protease im Wesentlichen in einer suizidalen, stöchiometrischen Wechselwirkung. Die Tatsache, dass Serinprotease-Inhibitoren stabile Komplexe mit deren Target- Proteasen bilden, und dass ein Serinprotease-Inhibitor, nämlich ACT, ein integraler Bestandteil der unlöslichen Alzheimer Amyloid-Ablagerungen ist, legt nahe, dass dieses Protein in die Filamente durch eine stabile Inhibitor-Proteaseinteraktion eingebaut sein könnte. Deswegen wurde die Stabilität der Interaktion zwischen α&sub1;-Antichymotrypsin und dem β-Protein beurteilt. Wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden radio-jodierte Peptide, die den Aminosäuren 1-12 und 1-28 des β-Proteins und dem nicht-verwandten Segment 258-277 des β-Protein-Vorläufers entsprechen, präpariert, in Gegenwart von ACT unter verschiedenen Bedingungen inkubiert und das Gemisch auf SDS- Polyacrylamid-Gelen einer Elektrophorese unterworfen. In Abwesenheit von ACT wanderten die Peptide mit niedrigem Molekulargewicht schnell an der Farbstofffront. Jedoch wurde in Gegenwart von ACT eine radioaktive Bande in einer Position erzeugt, die einigen Tausend Molekulargewicht mehr als das ACT- Protein entspricht (Fig. 3). Somit kann die Interaktion, die zunächst zwischen ACT und dem β-Protein nachgewiesen wurde, ausreichend stabil sein, um eine Denaturierung durch Sieden in SDS und β-Mercaptoethanol zu widerstehen. Der Hinweis, dass die ACT-β-Protein-Interaktion an der Proteasehemmstelle von ACT auftritt, wurde durch die Tatsache bestätigt, dass der Zusatz von Chymotrypsin zu ACT vor dem radioaktiven Peptid die Bildung des ACT-Peptid-Komplexes verhinderte. Eine Hitzedenaturierung von ACT vor dem Zusatz des Peptids vermied ebenfalls die Komplexbildung.
  • Die Spezifität der α&sub1;-ACT-β-Protein-Interaktion wurde durch Inkubieren des 1-28 Peptids mit anderen Proteinen demonstriert (beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), Creatinphosphokinase (CPK), Carboanhydrase (CA), mit denen es keine stabilen Komplexe bildete).
  • In Zusammenfassung zeigt die beschriebene Arbeit, dass die beiden Bestandteile der Alzheimer Amyloid-Ablagerungen - ACT und das β-Protein - sich in vitro zur Bildung eines SDSstabilen Komplexes assoziieren können. Die Interaktion ist sowohl für das Peptid als auch das ACT-Protein spezifisch und tritt wahrscheinlich zwischen der aktiven Proteasehemmstelle von ACT und dem N-Terminus des β-Proteins ein, der der aktiven Stelle der Serinproteasen ähnelt.
  • Diese Ergebnisse legen ein Modell für die Struktur der Alzheimer Amyloid-Filamente nahe. Der hydrophobe C-terminale Anteil der β-Proteinmoleküle, die das Filament bilden, würde im Inneren verstaut werden, wohingegen das hydrophile Zentralsegment (Aminosäuren 12-28) die Oberfläche des Filaments bilden würde. Die mit der aktiven Stelle der Protease verwandten Aminosäuren am N-Terminus würden einen Arm bilden, der, aus der Oberfläche des Filaments vorspringt und für eine Bindung durch ACT verfügbar ist. Jedoch scheint das Letztere zumindest insofern möglich, als das β-Protein alleine Filamente in vitro mit einer β-Faltblattkonformation bilden kann (D.A. Kirschner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 503 (1986); E.M. Castano et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 141: 782 (1986); D.A. Kirschner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 6953 (1987)). Jedoch können diese Filamente einfacherweise solubilisiert werden, und es muss ihnen deswegen ein Schlüsselbestandteil oder eine strukturelle Konformation fehlen, die für echte Alzheimer Amyloid-Filamente charakteristisch ist. Es ist möglich, dass die Bindung eines β-Protein-Kernfilamentes an das relativ Protease-resistente ACT die erforderliche Extrastabilität bereitstellt.
  • Diese Ergebnisse legen ebenfalls eine potentielle biologische Funktion für das β-Protein nahe. Weil das β-Protein mit der aktiven Stelle eines Serinprotease-Inhibitors in vitro kompetitiv wechselwirken kann, könnte erwartet werden, dass es dazu in der Lage ist, in vivo eine ähnliche Rolle zu spielen. Durch Anlockung von Proteaseinhibitoren (einschließlich des Inhibitors im β-Protein-Vorläufer vom Kunitz-Typ) würde das β- Protein als ein Proteaseverstärker bzw. -enhancer dienen - der die proteolytische Aktivität in dessen Nachbarschaft effektiv erhöht. Eine Überproduktion des β-Proteins wie es beispielsweise aus einem erhöhten proteolytischen Abbau des β- Protein-Voräufers resultieren würde, könnte somit zu einer weiteren Erhöhung der Proteaseaktivität mit fortschreitend nachteiligen Konsequenzen führen.
  • Somit wurde wie hierin beschrieben gezeigt, dass ein Serinprotease-Inhibitor (ACT) in vitro spezifisch mit einem Serinprotease-artigen Zielprotein (Alzheimer β-Protein) in einer Region des Letzteren interagiert, die eine auffällige Sequenzhomologie zur aktiven Stelle von Serinproteasen zeigt, was die Bildung von stabilen ACT-β-Protein-Komplexen zur Folge hat. Die hierin beschriebene Arbeit stellt einen vernünftigen molekularen Mechanismus zur Bildung der unlöslichen Proteinfilamente bereit, die Amyloid-Ablagerungen der Alzheimer Krankheit umfassen.
    • Bewertung der Esteraseaktivität des β-Proteins, von β-Protein- Fragmenten und des β-Protein-Vorläuferproteins
  • Es wurde gezeigt, dass das β-Protein und ein β-Protein- Vorläuferprotein eine Esteraseaktivität aufweisen, einschließlich einer Cholinesterase-Aktivität, wie hierin beschrieben. Dies ergibt sich vermutlich aus der Proteaseartigen Struktur der β-Proteinsequenz, die in Fig. 1 dargestellt ist, insofern als Proteasen und Esterasen ähnliche Wirkmechanismen und eine ähnliche Struktur in ihren katalytischen aktiven Stellen aufweisen.
  • Die Implikationen dieser Erkenntnisse sind, dass der β- Proteinbestandteil des Amyloidproteins, das bei der Alzheimer Krankheit vorliegt, eine Esteraseaktivität aufweist, offensichtlicher sind, wenn zwei Tatsachen über die Alzheimer Krankheit in Erwägung gezogen werden. Es wurde zunächst gezeigt, dass die Mehrzahl der Neuronen, die von der Alzheimer Krankheit befallen sind, cholinerge Neuronen sind. Diese Tatsache hat zur Formulierung der cholinergen Hypothese der Pathogenese geführt. Diese Hypothese war der Hintergrund für Ansätze bzw. Versuche, die Symptome der Alzheimer Krankheit mit cholinergen Arzneistoffen wie beispielsweise Acetylcholinesterase-Inhibitoren abzumildern bzw. zu lindern. Als sich diese Arzneistoffe als unwirksam herausstellten, wurde die Validität der cholinergen Hypothese fraglich. Die andere Tatsache ist, dass mehrere Forscher demonstriert haben, dass neuritische Plaques eine Acetylcholinesterase-Aktivität aufweisen, wenn sie histochemisch überprüft wurden. Es ist nunmehr reizvoll zu folgern, dass die histochemisch beobachtete Acetylcholinesterase-Aktivität auf die Aktivität der in vitro untersuchten Peptide zurückzuführen ist. Die Basis dieser Hypothese ist die Tatsache, dass das β-Protein ein Hauptbestandteil der neuritischen Plaque ist, und dass eine echte Acetylcholinesterase aus den Plaques nicht isoliert wurde oder durch immunologische Assays als in den Plaques vorliegend gezeigt werden konnte. Es ist vernünftig zu erwarten, dass die Cholinesterase-Aktivität, die von diesen Peptiden gezeigt wurde, Acetylcholin in einer größeren Geschwindigkeit als normal abbauen könnte. Eine derartige exzessive Acetylcholin- Inaktivierung könnte den cholinergen Input der Empfangsneuronen verschlechtern und eine Degeneration zur Folge haben. Es ist wohl bekannt, dass Neurone, einschließlich cholinerger Neurone, wenn sie ihrer afferenten Innervation entzogen werden, degenerieren. Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass diese Peptide ebenfalls eine Proteaseaktivität aufweisen könnten, die direkt Schlüsselproteine im umgebenden Gewebe zerstören könnte.
  • Was immer die normalen oder pathologischen Funktionen dieser Peptide sein könnten, ist das Design von Verbindungen, die deren beobachtete Aktivität selektiv modifizieren, eine Strategie, die sich bei der Behandlung der Alzheimer Krankheit als fruchtbar erweisen könnte. Ein Erklärung für die Tatsache, dass Forscher von widersprüchlichen Ergebnissen über die Effektivität bei cholinergen Behandlung berichten, besteht darin, dass die Inhibitoren, die verwendet wurden, zu unspezifisch waren, um in einer genug hohen Konzentration verwendet zu werden. Nach alldem waren sie Inhibitoren der echten Acetylcholinesterase, die im Gehirn viele essentielle Funktionen aufweist. Es ist ziemlich möglich, dass das, was erforderlich ist, Inhibitoren sind, die die Peptidcholinesterase-Aktivität hemmen, jedoch die echte Acetylcholinesterase schonen. Es ist nunmehr möglich, die β- Proteinaktivität zu charakterisieren und identifizieren und/oder Inhibitoren zu konzipieren, die selektiv zur Hemmung des β-Proteins dienen, während sie die Acetylcholinesterase- Aktivität nicht beeinträchtigen. Wie in Beispiel 4 dargestellt, wurden Inhibitoren, die vorzugsweise zur Hemmung der β- Proteinaktivität im Vergleich zur Acetylcholinesterase- Aktivität in der Lage sind, identifiziert.
    • Verbindungen und Verfahren zum Behindern bzw. Stören der ACT-β- Protein-Interaktionen und zum Stören der β-Protein- Esteraseaktivität
  • Als Folge der Entdeckung der spezifischen Interaktion zwischen ACT und dem Alzheimer β-Protein ist es möglich, Zusammensetzungen oder Verbindungen zu konzipieren oder auszuwählen, die bei der Störung (Reduzierung oder Verhinderung) dieser ACT-β-Protein-Interaktion von Nutzen sind. Diese Entdeckung hat weiterhin ein Verfahren zur Vermeidung der Interaktion in einem Patienten möglich gemacht und somit ein Verfahren, das zur Behandlung oder Vermeidung einer Komplexbildung und nachteiligen Wirkungen, die sich hieraus ergeben, potentiell brauchbar ist. Es stellt ein Verfahren zur Behandlung und Vorbeugung von Zuständen bzw. Leiden wie beispielsweise der Alzheimer Krankheit, dem Down-Syndrom und dem normalen Altern bereit, bei denen ein ACT-β-Protein-Komplex gebildet wird. Es ist ebenfalls möglich, Verbindungen zu konzipieren oder auszuwählen, die die Esteraseaktivität des β- Proteins hemmen (reduzieren oder eliminieren) oder dieses in anderer Weise inaktivieren oder unwirksam machen. Bei einer Ausführungsform wird die Cholesterinesterase-Aktivität des β- Proteins, β-Protein-Vorläufers oder β-Protein-Fragmentes gehemmt oder inaktiviert. Es kann bei dieser Ausführungsform wünschenswert sein, die β-Proteincholinesterase-Aktivität bei einem Patienten speziell zu stören oder zu inaktivieren und andere Enzyme, die ähnliche vorteilhafte Aktivitäten aufweisen, nicht zu stören, wie beispielsweise die "echte" Acetylcholinesterase. Derartige Zusammensetzungen oder Verbindungen, die zur Störung der ACT-β-Protein-Interaktion oder bei der Hemmung der β-Proteinesterase-Aktivität oder dabei, diese in anderer Weise unwirksam oder inaktiv zu machen, von Nutzen sind; Verfahren zum Stören der ACT-β-Protein- Interaktion; Verfahren zur Hemmung der β-Proteinesterase- Aktivität oder Verfahren, diese in anderer Weise inaktiv oder unwirksam zu machten; und Verfahren der Verabreichung derartiger Verbindungen oder Zusammensetzungen zur Störung der ACT-β---Protein-Interaktion oder zur Hemmung der β- Proteinesterase-Aktivität oder diese unwirksam zu machen, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Verbindungen und Verfahren sind insbesondere bei der Reduktion der Bildung von ACT-β-Protein-Komplexen in Individuen brauchbar, in denen sich derartige Komplexe bilden und ergeben, direkt oder indirekt, in einem abnormalen oder unerwünschten Zustand bei einem Krankheitszustand. Beispielsweise können derartige Verbindungen dazu verwendet werden, die Bildung von ACT-β-Protein-Komplexen in Patienten zu reduzieren (total oder teilweise) oder diese zu verhindern, wobei die Patienten eine Alzheimer Krankheit aufweisen oder ohne geeignete Behandlung eine Alzheimer Krankheit entwickeln würden.
  • Verbindungen der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, die Bindung von ACT und dem Alzheimer β-Protein zu stören, entweder durch Bindung an ACT, wodurch die Bildung des ACT-β-Protein-Komplexes verhindert wird, oder durch Bindung an β-Protein, wodurch ebenfalls die Bildung des ACT-β-Protein- Komplexes verhindert wird. Beispielsweise kann ein Peptid, das einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz einer Serinprotease entspricht, wie beispielsweise die gesamte oder Teilsequenz des Alzheimer β-Proteins, verwendet werden. Alternativ kann ein synthetische Peptid, das die Aminosäuresequenz der inhibitorischen aktiven Stelle von ACT nachahmt bzw. ähnelt, dazu verwendet werden, die ACT-β-Protein- Komplexbildung zu stören. Diese Peptidart bindet an das β- Protein und hat die Produktion eines synthetischen β-Peptid-β- Protein-Komplexes zur Folge und wird im Wesentlichen das β- Protein "anbinden", was die Interaktion des β-Proteins mit ACT ausschließt. Es ist ebenfalls möglich, Verbindungen zu identifizieren, die die ACT-β-Protein-Komplexbildung stören (reduzieren oder eliminieren) und somit Verbindungen zu identifizieren, die zur Reduktion oder Vermeidung einer Komplexbildung brauchbar sind. Bei dem Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die die Komplexbildung stört, werden ACT, das β-Protein und eine auf ihre Fähigkeit zu prüfende Verbindung, ob sie die Komplexbildung reduziert oder verhindert, vereinigt, und zwar unter Bedingungen, die zur Komplexbildung geeignet sind. Wenn die untersuchte Verbindung die ACT-β-Protein-Interaktion stört, tritt eine Komplexbildung nicht ein oder wird in einem geringeren Umfang eintreten als dies der Fall sein würde, wenn die Verbindung nicht vorliegen würde. Das Ausmaß, in dem eine Komplexbildung eintritt, wird unter Verwendung bekannter Verfahren bestimmt, wie beispielsweise denjenigen, die in Beispiel 2 beschrieben sind. Ein Vergleich der Komplexbildung in Gegenwart und Abwesenheit (Kontrollbedingungen) der Verbindung, die untersucht wird, ist ein Indikator für das Vermögen der Verbindung zu stören (d. h. kein Unterschied in der Komplexbildung ist ein Hinweis darauf, dass die Verbindung nicht zu einer Störung in der Lage ist).
  • Die Peptidverbindungen der vorliegenden Erfindung können zusätzliche Wirkungen aufweisen, die sich aus ihrem Einfluss, direkt oder indirekt, auf die Protease-Inhibitorfunktion von ACT ergibt. ACT ist ein Serinprotease-Inhibitor, und es wurde gezeigt, dass das Alzheimer β-Protein die Fähigkeit von ACT zur Hemmung einer Serinprotease hemmt (d. h. Chymotrypsin). Somit kann das β-Protein die Proteaseaktivität erhöhen, indem die proteolytische Aktivität anderer Moleküle wirksam angehoben wird (d. h. durch Reduzierung der Fähigkeit von ACT, Serinprotease zu hemmen), weil es Proteaseinhibitoren anlockt.
  • Diese Sicht der Interaktion zwischen ACT und dem β-Protein legt alternative Folgen der Verabreichung der zwei Arten von Peptiden nahe. In dem Fall, in dem das Peptid an ACT zur Hemmung der Komplexbildung bindet, kann das Peptid eine inhibitorische Wirkung auf ACT aufweisen, was eine Steigerung der Proteaseaktivität zur Folge hat, und zwar in einer Art und Weise, die der für das β-Protein selbst vorgeschlagenen Weise ähnlich ist. In dem Fall, in dem das synthetische Peptid die inhibitorische aktive Stelle von ACT nachahmt und an das β- Protein bindet, könnte man die gegenteilige Folge erwarten. Das heißt, das Peptid würde mit dem β-Protein einen Komplex bilden, dessen Interaktion mit ACT verhindern und somit die postulierte Protease-steigernde Wirkung des β-Proteins blockieren. ACT würde dann freigelassen werden, um dessen Funktion als Proteaseinhibitor zu überprüfen.
  • Ein synthetisches Peptid der vorliegenden Erfindung kann in einem physiologisch verträglichen Träger (beispielsweise einem geeigneten Puffer oder einer physiologischen Salzlösung) an ein Individuum verabreicht werden, indem eine ACT-β-Protein- Komplexbildung gestört werden soll. Es kann auf jedem Weg verabreicht werden, über den es möglich ist, eine therapeutisch wirksame Menge oder Dosis einem Individuum in einer Form zu verabreichen, die die erwünschte Wirkung aufweisen kann (Reduktion der Komplexbildung). Beispielsweise kann ein synthetisches Protein der vorliegenden Erfindung parenteral (beispielsweise intravenös oder intramuskulär) in einer Zusammensetzung verabreicht werden, die das Peptid vor seinem Abbau schützt. Es kann mit einem anderen Arzneistoff bzw. Mittel oder Arzneimittel verabreicht werden, wie beispielsweise als ein Arzneistoff, der in herkömmlicher Weise zur Behandlung des zu behandelnden Zustands verwendet wird oder Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die die enzymatische β- Proteinaktivität hemmen.
  • Ein synthetisches Peptid der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung bekannter Techniken hergestellt werden, wie beispielsweise Rekombinationstechniken/Gentechnik oder chemische Synthese.
  • Eine Charakterisierung der β-Proteinaktivität wurde wie hierin beschrieben bezüglich ihrer Esteraseaktivität durchgeführt, einschließlich der Cholinesterase-Aktivität. Zusätzlich kann eine andere Esteraseaktivität (beispielsweise Lipaseaktivität) und Proteaseaktivität des β-Proteins unter Verwendung bekannter Verfahren festgestellt werden. Beispielsweise können Paranitroanilid-konjugierte Substrate, die so konzipiert werden, dass sie verschiedene Peptidsequenzen enthalten, synthetisiert und mit dem Enzym getestet werden (Sarath, G. et al., "Protease assay methods", in: Proteolytic Enzymes, A Practical Approach, Hsg. R.J. Beynon und J.S. Bond, IRL Press, Eynsham (1989)). Zusätzliche Information über die β- Proteinaktivität wird bezüglich des erforderlichen Typs an Inhibitoren eine zusätzliche Anleitung bzw. Führung bereitstellen (beispielsweise Esterase-Inhibitoren, Protease- Inhibitoren).
  • Inhibitoren können unter Verwendung des β-Proteins, β-Protein- Vorläuferproteins und/oder β-Protein-Fragmentes, wie beispielsweise denjenigen, die hierin beschrieben sind, identifiziert werden. Bei einem Verfahren zur Identifizierung eines geeigneten Inhibitors werden β-Protein, ein Substrat, von dem gezeigt wurde, dass es auf β-Protein einwirkt (beispielsweise Acetylthiocholin, Paranitrophenylacetat (PNPA)) und ein potentieller Inhibitor kombiniert, unter Bedingungen, die für das β-Protein geeignet sind, um auf das Substrat einzuwirken (beispielsweise enzymatisch, um das Acetylthiocholin oder PNPA zu hydrolysieren). Wenn das Mittel, das untersucht wird, ein Inhibitor ist, wird die β- Proteinaktivität geringer sein als die β-Proteinaktivität in Abwesenheit des zu untersuchenden Mittels. Die Aktivität kann unter Verwendung bekannter Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise kann im Fall eines Esterase-Inhibitors, der die Aktivität des β-Proteins reduziert, die Reduktion in der Aktivität durch Messung der Hydrolyse durch ein geeignetes Substrat wie beispielsweise PNPA bestimmt werden. In ähnlicher Weise kann im Fall eines Esterase-Inhibitors, wie beispielsweise eines Cholinesterase-Inhibitors, der die Aktivität des β-Proteins reduziert, die Reduktion der Aktivität durch Messen der Hydrolyse des Substrats, wie beispielsweise Acetylthiocholin, bestimmt werden. Eine geringere Hydrolyse des Substrats in Gegenwart des Mittels, das untersucht wird, als in dessen Abwesenheit, ist ein Hinweis darauf, dass das Mittel ein Inhibitor ist. Inhibitoren können Voll- bzw. Ganz- oder Teilinhibitoren sein. Wenn die Bestimmung zeigt, dass β-Protein eine andere enzymatische Aktivität aufweist (beispielsweise eine andere Esteraseaktivität oder Proteaseaktivität) können geeignete Inhibitoren identifiziert oder unter Verwendung bekannter Verfahren konzipiert werden. Es ist ebenfalls möglich, die β-Proteinaktivität auf der Ebene des β-Protein- Vorläuferproteins zu stören, um zu vermeiden, dass es zu β- Protein verarbeitet wird (wodurch somit verhindert wird, dass es einen ACT-β-Protein-Komplex bildet), zusätzlich oder anstatt der Hemmung von dessen enzymatischer Aktivität.
  • Potentielle Inhibitoren können bekannte Verbindungen einschließen wie beispielsweise Protease-, Esterase-, Lipase- und Cholinesterase-Inhibitoren, oder Verbindungen, die so konzipiert sind, dass sie eine inhibitorische Aktivität aufweisen. Wenn einmal ein Inhibitor identifiziert oder konzipiert wurde, kann er wie identifiziert oder konzipiert verwendet werden oder kann modifiziert werden. Beispielsweise können Modifikationen, die den Verteilungskoeffizient, die Ionisierung und/oder die Proteinbindungseigenschaften eines Inhibitors verändern, durchgeführt werden. Modifikationen eines Inhibitors können dazu dienen, dessen Fähigkeit zu steigern, (a) in Zellen des Gehirns einzudringen (durch die Bluthirnschranke hinweg), (b) einem Abbau durch zelluläre Enzyme zu widerstehen und/oder (c) beispielsweise β-Protein zu hemmen. Durch derartige Modifikationen gewonnene Verbindungen können eine gesteigerte inhibitorische Wirkung im zentralen Nervensystem aufweisen und können eine gesteigerte therapeutische Leistungsfähigkeit aufweisen.
  • Beispielsweise kann (p-Amidinophenyl)methansulfonylfluorid (pAPMSF), das im Handel erhältlich ist und von dem hierin gezeigt wurde, dass es die β-Proteinesterase-Aktivität hemmt, wie oben beschrieben modifiziert werden. Kandidatenanaloga schließen (p-Amidinophenyl)ethansulfonylfluorid und (p- Amidinoethylbenzyl)methansulfonylfluorid ein. Diese Analoga können unter Verwendung von Vorschriften synthetisiert werden, die denjenigen ähnlich sind, die von Laura et al. zur Herstellung von pAPMSF beschrieben wurden und zu den Verfahren von Wong und Shaw (Laura, R. et al., Biochemistry 19: 4859-4864 (1980); Wong, S.C. und Shaw, E., Arch. Biochem. Biophys. 161: 536-543 (1974); Wong, S.C. und Shaw, E., Arch. Biochem Biophys., 176: 113-118 (1976)).
  • Es wurde hierin ebenfalls gezeigt, dass Ebelacton A die β- Proteinesterase-Aktivität hemmt. Ebelacton A und Ebelacton B sind im Handel erhältlich. Analoga dieser Verbindungen, wie beispielsweise diejenigen, die eine veränderte Methylierung aufweisen, können konzipiert werden. Beispielsweise kann 3, 11- Dihydroxy-4, 6, 8, 10, 12-pentamethyl-9-oxo-tetradecen-1, 3- lacton aus Actinomycetes unter Verwendung des Verfahrens von Umezawa et al. isoliert werden (Umezawa et al., J. Antibiotics 33: 1594-1596 (1980)). Alternativ kann es durch chemische Synthese gewonnen oder aus Ebelacton A durch Demethylierung an Kohlenstoff 2 gewonnen werden.
  • Wie bei Verbindungen, die bei der Störung der ACT-β-Protein- Komplexbildung von Nutzen sind, können Verbindungen, die zur Hemmung der enzymatischen β-Proteinaktivität von Nutzen sind, einem Patienten verabreicht werden, bei dem die β- Proteinaktivität gehemmt werden soll (beispielsweise einem Patienten mit Alzheimer Krankheit). Derartige Verbindungen können in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden, wie beispielsweise einem geeigneten Puffer oder einer physiologischen Salzlösung. Sie werden durch irgendeinen geeigneten Weg verabreicht werden, auf dem es möglich ist, eine therapeutisch wirksame Menge oder Dosis dem Individuum in einer Form zu verabreichen, die so verfügbar ist, dass sie die erwünschte Wirkung aufweist (Hemmung, ganz oder teilweise, der enzymatischen β-Proteinaktivität, wie beispielsweise der Esterase- oder Proteaseaktivität). Sie kann parenteral (beispielsweise intravenös oder intramuskulär) verabreicht werden. Sie kann mit irgendeinem anderen Mittel oder Arzneistoff, wie beispielsweise einem synthetischen Peptid der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, das die ACT-β- Protein-Komplexbildung stört.
  • Die hierin beschriebene Entdeckung macht es weiterhin möglich, ACT-β-Protein-Komplexe in Gewebe zu identifizieren, das von einem Individuum gewonnen wurde, wie beispielsweise in Biopsiegewebe, das von einem Individuum gewonnen wurde, das unter dem Verdacht steht, abnormal hohe Konzentrationen des Komplexes aufzuweisen. Dies kann beispielsweise zur Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens und falls gewünscht, der Menge an ACT-β-Protein-Komplexen im Hirngewebe, das bei der Autopsie gewonnen wurde, verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht werden, die jedoch auf keinen Fall als einschränkend aufgefasst werden sollen.
    • Beispiel 1: Bestimmung der regulatorischen Proteaseaktivität des Alzheimer β-Proteins
  • Verschiedene synthetische Peptide wurden bezüglich ihrer Wirkung auf die Hemmung von Chymotrypsin durch ACT in vitro getestet. Die synthetischen Peptide, die getestet wurden, waren:
  • 1. ein Peptid, das den Aminosäuren 1-28 des N-terminalen Anteils des Alzheimer β-Proteins entspricht (s. Fig. 1)
  • 2. ein Peptid, das den Aminosäuren 1-12 des N-terminalen Anteils des Alzheimer β-Proteins entspricht (s. Fig. 1, erste 12 Aminosäuren) und
  • 3. ein Kontrollpeptid, das den Aminosäuren 258-277 des Alzheimer β-Protein-Vorläufers entspricht, das keine Ähnlichkeit zur Sequenz der aktiven Region der Serinprotease zeigt.
  • Die Aktivität von Chymotrypsin wurde durch Spaltung des chromogenen Substrates Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-nitroanilid gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Chymotrypsin- Aktivität um ungefähr 90% in Gegenwart einer ungefähr gleichen molaren Konzentration an ACT reduziert wird. Wenn ein vierfacher molarer Überschuss von jedem der beiden synthetischen Peptide von N-terminalen Anteil des β-Proteins (entsprechend den Aminosäuren 1-28 bzw. 1-12) ACT vor dem Proteaseassay zugesetzt wird, stört das Peptid die inhibitorische Aktivität von ACT. Im Gegensatz hierzu moduliert das Kontrollpeptid, das den Aminosäuren 258-277 des β-Protein- Vorläufers entspricht, die Fähigkeit von ACT nicht, Chymotrypsin zu hemmen.
  • Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Die für jede graphische Darstellung gezeigten Daten repräsentieren das Mittel bzw. den Durchschnitt von vier unabhängigen Assays, bei denen 0,5 (links) oder 0,6 (rechts) ug ACT für 2 Minuten ± Peptid in 10 ul 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, bei 20ºC vor dem Zusatz von 0,3 ug Chymotrypsin inkubiert wurden. Nach einer weiteren Inkubation von 2 Minuten wurde das Reaktionsvolumen auf 0,8 ml erhöht, 15 ul von 2 mg/ml Substrat wurden zugesetzt und die Umsetzung bei OD 405 für 5 Minuten verfolgt. Die graphischen Darstellungen vergleichen die relativen Steigungen der Reaktionskurven (alle geraden Linien), normalisiert mit der Reaktionsgeschwindigkeit von Chymotrypsin alleine. Die Peptide hatten keine unabhängige Wirkung auf Chymotrypsin.
    • Beispiel 2: Bestimmung der Stabilität der Interaktion zwischen α&sub1;-Antichymotrypsin und β-Protein
  • Die Fähigkeit synthetischer Fragmente des β-Proteins, ACT zu hemmen (Fig. 2) zeigt, dass zumindest ein vorübergehender Komplex sich zwischen den beiden Proteinen bilden kann. Die Stabilität derartiger Komplexe wurde durch Inkubieren von ACT mit radioaktiv markiertem bzw. radiomarkierten β-Protein- Fragmenten unter verschiedenen Bedingungen und darauf Analysieren der Komplexbildung durch Polyacrylamidgel- Elektrophorese demonstriert. In einigen Experimenten wurde ein Proteinvernetzungsmittel (DSS) dazu verwendet, den Komplex vor der Gelelektrophorese zu stabilisieren (Fig. 3, Bahnen 1-6, 8-11). Jedoch wird selbst in Abwesenheit einer Vernetzung ein Komplex gebildet, der gegenüber Sieden bzw. Kochen in SDS und β-Mercaptoethanol stabil ist (Fig. 3, Bahnen 7, 12 und 13). Der Zusatz einer gleichen molaren Menge an Chymotrypsin zu ACC blockiert die aktive Stelle und vermeidet die Komplexbildung (Fig. 3, Bahnen 5, 10, 11, 14 und 15). Die Denaturierung des ACT-Proteins durch Hitze (Fig. 3, Bahn 3) verhindert ebenfalls die Komplexbildung. Ein Immunfärben des geblotteten Proteins mit Antikörpern gegen α&sub1;-Antichymotrypsin (Fig. 3, untere Tafel) zeigte, dass weder die Hitze noch die Chymotrypsin- Behandlung ACT zerstörte. Eine Dünnschichtchromatographie bestätigte, dass die Chymotrypsin-Menge, die dem ACT zugesetzt wurde, nicht zur Digerierung bzw. Verdauung des Peptids ausreichend war.
    • Beispiel 3: Charakterisierung der Esteraseaktivität des β- Proteins, von β-Protein-Vorläufern und β-Protein-Fragmenten
  • Wegen der strukturellen Ähnlichkeiten zwischen β-Protein und der aktiven Stelle von Serinproteasen/Esterasen und der Erkenntnis, dass ACT an β-Protein bindet, wurden Experimente durchgeführt, um zu überprüfen, ob β-Protein, dessen Vorläufer oder Fragmente irgendeine Esterase- oder Proteaseaktivität zeigen. Die Peptide wurden so synthetisiert, dass sie unterschiedlichen Längen von Aminosäuren entsprachen und drei gut charakterisierte Formen von Amyloid-Vorläuferproteinen, die als APP 751, APP 770 und APP 695 bezeichnet werden, wurden verwendet. Sie wurden von Dr. Barry Greenberg (Upjohn, Kalamazoo, MI) bezogen und wurden aus einem Bacculovirus- Expressionssystem gereinigt. Die relativen Konzentrationen dieser drei Proteine werden in der Alzheimer Krankheit verändert (Neve, R.L. und H. Potter, in Molecular Genetic Approaches to Neuropsychiatric Disease, J. Brosius und R. Fremeau, Hsg. (Academic Press, San Diego)). Es wird angenommen, dass das Hauptprotein im Gehirn das APP 695-Protein ist, das sich von APP 751 und APP 770 dahingehend unterscheidet, dass ihm eine Domäne mit Protease/Esterase-inhibitorischer Funktion fehlt.
  • Verschiedene Ester und Peptidsubstrate wurden unter verschiedenen Bedingungen getestet. Wenn die Peptide mit Acetylthiocholiniodid oder Butyrylthicholiniodid unter Verwendung eines modifizierten Acetyltholinesteraseassays inkubiert wurden (Ellman, G.L. et al., Biochem. Pharmacol. 7: 88-95 (1961), Gorun, V. et al., Anal. Biochem. 86: 324-326 (1978)) wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet. AAP 751- und AAP 770-Proteine (β-Protein-Vorläuferproteine) hydrolysierten keines der Substrate signifikant. Andererseits hydrolysierte das AAP 695-Peptid beide Substrate. Es wies eine spezifische Aktivität von 4-6 nmol/min/mg unter Verwendung von Acetylthiocholin als Substrat auf und 1,8 nmol/min/mg unter Verwendung von Butyrylthiocholin als Substrat. Ein Peptid, das 1-28 Aminosäuren des β-Proteins umfasste, wies eine spezifische Aktivität von 0,5-1,4 nmol/min/mg mit Acetylthiocholin gegen 1,1 nmol/min/mg mit Butyrylthiocholin als Substraten auf. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die β-Proteinesterase von jeweils Acetylcholinesterase oder Butyrylcholinesterase verschieden ist, wobei jede von diesen starr ihre eigenen spezifischen Substrate bevorzugen. Diese Werte waren in wiederholten Experimenten unter Verwendung unterschiedlicher Ansätze der Peptide konsistent.
  • Um zu bestimmen, ob die beobachtete Aktivität in APP 695 eher auf eine echte esteratische Wirkung als auf eine unspezifische Proteinwirkung zurückzuführen war, wurde dessen Aktivität mit derjenigen verglichen, die mit Cathepsin G, einer Serinprotease, beobachtet wurde, die entweder Acetylthiocholin oder Butyrylthiocholin nur minimal hydrolysierte, jedoch das Butyrylthiocholin noch gegenüber dem Acetylthiocholin bevorzugte.
  • Wenn das APP 695-Protein mit entweder Physostigmin oder DFP gehemmt wurde, zeigte es eine 58%ige bzw. 70%ige Hemmung von dessen Fähigkeit, Acetylthiocholin zu hydrolysieren. Die Inhibitoren wurden dem AAP 695-Protein 15 Minuten vor dem Zusatz des Substrates zugesetzt. Der Standardassay für die Esteraseaktivität wurde dann wie oben beschrieben durchgeführt. Die Menge an Inhibitoren, die verwendet wurde, war ausreichend, um eine viel höhere Aktivität an Erythrozyten-Acetylcholinesterase vollständig zu hemmen. Die letztere Erkenntnis zeigt an, dass die beobachtete Aktivität nicht auf eine Verunreinigung bzw. Unreinheit der echten Acetylcholinesterase zurückzuführen ist, die ansonsten durch die Konzentration von Inhibitoren, die verwendet wurden, gehemmt worden wäre. Zuletzt wurde nur eine Hauptbande beobachtet, was damit konsistent ist, dass dort nur ein Hauptvorläuferprotein vorliegt, wenn die Vorläufer auf SDS-PAGE elektrophoretisiert und mit Silber gefärbt wurden.
  • Ein Grund dieser Aktivität, von dem früher nicht berichtet wurde, ist die Möglichkeit, dass eine unterschiedliche Quelle an APP verwendet worden sein könnte. In einem bakteriellen System exprimiertes APP würde sich von diesem eukaryotischen System-exprimierten APP dahingehend unterscheiden, dass das bakteriell exprimierte APP unglycosyliert ist. Noch wichtiger wird das hierin beschriebene und verwendete Assay für die Acetylcholinesterase-Messung bei höheren Enzymkonzentrationen durchgeführt und ist empfindlicher als Standardtechniken.
  • Experimente unter Verwendung von synthetischem Alzheimer β- Protein 1-40, entsprechend Ratten- und humanen Sequenzen, wurden durchgeführt, um den Zeitverlauf der Hydrolyse von Acetylthiocholiniodid zu messen. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse, die erzielt wurden. Die Ergebnisse zeigen an, dass beide Peptide Acetylthiocholin in einer zeitabhängigen Art und Weise hydrolysieren.
  • HPLC-reines synthetisches 1-40 Peptid und 40-1 reverses Peptid, bezogen von Dr. Bruce Yankner, wurden dazu verwendet, zu testen, ob die Esteraseaktivität, die beobachtet wurde, auf eine intrinsische Eigenschaft des β-Peptids zurückzuführen war und nicht auf eine unspezifische Peptidwirkung. Die Peptide können ebenfalls unter Verwendung bekannter Verfahren gewonnen werden (beispielsweise können sie chemisch synthetisiert werden). Das reverse Peptid enthält exakt dieselben Aminosäuren wie die 1-40, außer dass sie in reverser Reihenfolge bzw. umgekehrter Reihenfolge vom Carboxy-terminalen zum Aminoterminalen Ende angeordnet sind. Wenn die Esterasewirkung des Peptids auf eine unspezifische Wirkung zurückzuführen war, dann würde die Anordnung der Aminosäuren erwartungsgemäß nicht diese signifikant beeinflussen. Wenn es jedoch ein echtes Enzym wäre, dann ist die Anordnung der Aminosäuren für dessen Wirkung von Schlüsselbedeutung. Vorläufige Experimente mit diesen Peptiden haben angezeigt, dass das 1-40 β-Peptid eine Aktivität von 0,26 mU (nmol/min/mg) aufweist. Das reverse Peptid wies ein Viertel dieser Aktivität auf, jedoch mit einer hohen Standardabweichung, so dass dies wahrscheinlich nicht real ist. Der letztere Punkt wird durch ein Hemmungsexperiment bestätigt, bei dem DFP (ein klassischer Serinesterase/Protease-Inhibitor) die Aktivität des 1-40 Peptids um 75% hemmte, jedoch keine Wirkung auf die Aktivität des reversen 40-1 Peptids aufwies.
  • Radiomarkierungsexperimente zeigen an, dass das APP 695 vorzugsweise mit [³H]-DFP im Vergleich zu APP 751 oder APP 770 markiert wird. Die Markierung befindet sich an der Position der Hauptproteinbande und migriert nicht zusammen mit Acetylcholinesterase auf SDS-PAGE. Die Signifikanz dieser Erkenntnis besteht darin, dass sie die beobachteten Ergebnisse mit Esteraseaktivität bestätigt: Sowohl die Aktivitätsdaten als auch die Radiomarkierungsdaten zeigen an, dass das Esteraseenzym, das beobachtet wurde, nicht Acetylcholinesterase ist. Zuletzt spricht die Markierung der Haupt-APP 695-Bande und nicht der Hauptbanden der anderen APP-Arten 751 und 770 dagegen, dass das DFP-bindende Protein eine Verunreinigung ist, insbesondere deswegen, weil alle Vorläuferproteine in einer ähnlichen Weise gereinigt wurden.
    • Beispiel 4: Identifizierung von Inhibitoren der β-Protein- Funktion
  • Zwei Inhibitoren der Esteraseaktivität des β-Proteins wurden gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert. Diese Inhibitoren zeigen vorzugsweise eine Hemmung der β- Proteinaktivität im Vergleich mit der Acetylcholinesterase- Aktivität.
    • A) Hemmung der β-Proteinaktivität durch Paraamidinophenylmethansulfonylfluorid (pAPMSF).
  • P-Nitrophenylacetat (PNPA) ist ein Substrat für eine Vielzahl von Esterasen, einschließlich von Acetylcholinesterasen und anderen Esterasen. Dieses Substrat wurde als ein Substrat für das β-Protein ausgewählt. Insbesondere wurde ein Amyloid- Vorläuferprotein (APP 695) gereinigt aus Chinesischen Hamsterovarzellen (Chinese hamster ovary = CHO) auf seine Fähigkeit getestet, PNPA zu hydrolysieren. APP 695 wurde aus Chinesischen Hamsterovarzellen (CHO-Zellen) im Wesentlichen wie beschrieben (Lowery, D. E. et al., J. Biol. Chem. 266: 19842-19850 (1991)) aufgereinigt. Diese Studien zeigten an, dass die APP 695-assoziierte Esterase dieses Substrat hydrolysieren kann.
  • Als nächstes wurden Assays unter Verwendung von APP 695 und PNPA durchgeführt, um Inhibitoren der Reaktion zu identifizieren.
  • Paraamidinophenylmethansulfonylfluorid (4- Amidinophenylmethansulfonylfluorid; pAPMSF; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), ein bekannter Inhibitor bestimmter Serinproteasen, wurde als potentieller Inhibitor ausgewählt. Teilmengen der CHO-Zell-abgeleiteten APP 695 (5 ul, die 0,9 ug enthielten) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Paraamidinophenylmethansulfonylfluorid (5 mM) in einem Endvolumen von 20 ul Na/Phosphat (20 mM, pH 7,0) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurden 20 ul p- Nitrophenylacetat (PNPA) in Phosphatpuffer in Konzentrationen von 1, 2, 4 oder 8 mM zugesetzt und mit den Proben mit oder ohne pAPMSF vermischt. Das Fortschreiten der Reaktionen wurde spektrophotometrisch überwacht. Die Extinktion bei 405 nm wurde abgelesen und unter Verwendung eines ELISA-Plattenablesegerätes über eine Zeitspanne hinweg aufgezeichnet. Eine Reihe von Rohlingen bzw. Blanks, die aus jedem Bestandteil ohne das Protein zusammengesetzt waren, wurden parallel hergestellt. Für kinetische Untersuchungen wurde der Unterschied zwischen Probe und dem entsprechenden Rohling verwendet.
  • Die Ergebnisse dieser Studie zeigten an, dass p- Amidinophenylmethansulfonylfluorid (pAPMSF) die APP 695- assoziierte Esteraseaktivität um bis zu 70% hemmt. Die Daten wurden einer Lineweaver-Burk-Analyse unterworfen (s. Fig. 5), und die Ergebnisse dieser Analyse legen nahe, dass die Hemmung kompetitiv ist.
    • B) Hemmung der β-Proteinaktivität durch Ebelacton A und Ebelacton B
  • Ebelacton A und Ebelacton B (CalBiochem, La Jolla, CA), von denen bekannt ist, dass sie Inhibitoren bestimmter Esterase-, Lipase- und N-Formylmethioninaminopeptidase-Aktivitäten sind, wurden als potentielle Inhibitoren ausgewählt. Ebelacton A und B wurden bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Amyloid- Vorläuferprotein-assoziierte Esteraseaktivität zu hemmen. Membranfraktionen, die APP 695 enthielten, wurden von CHO 695- Zellen gewonnen, im Wesentlichen wie beschrieben (Yoshikawa et al., Nature 359: 64-67 (1992)). CHO695-Zellen sind CHO-Zellen, die mit einem Klon transfiziert wurden, der APP 695 kodiert, und der die Überexpression von APP 695 regelt. Teilmengen (5 ul) der Membranfraktionen von APP 695-exprimierenden CHO-Zellen (CHO 695) oder scheintransfizierte Kontrollzellen (TH-8) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von jedem des nachfolgenden inkubiert: Ebelacton A (2,6 mM), Ebelacton B (2,5 mM) oder DFP (10 mM Diisopropylfluorphosphat; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in einem Endvolumen von 10 ul Na/Phosphat (20 mM, pH 7,4) für 20 Minuten bei 37ºC. Als nächstes wurden 10 ul Acetylthiocholiniodid (4 mM) in Phosphatpuffer mit den Proben vermischt und für 85 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden 250 ul Dithionitrobenzoesäure (DTNB) jeder Probe zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, und die Extinktion wurde bei 405 nm abgelesen und unter Verwendung eines ELISA- Plattenlesegerätes aufgezeichnet. Die Rohlinge wurden anfangs aus jedem Bestandteil ohne der entsprechenden Membranprobe zusammengesetzt. Die entsprechenden Membranproben wurden den geeigneten Rohlingen nach Abschluss der Reaktion mit DTNB zugesetzt. Zur Aktivitätsbestimmung wurde der Unterschied zwischen jeder Probe und dem entsprechenden Rohling verwendet. Dasselbe Experiment wurde auf gereinigten APPs aus einem Bacculovirus-Expressionssystem durchgeführt (Lowery et al., J. Biol. Chem. 266: 19842-19850 (1991)), außer dass die Präinkubation mit den Inhibitoren 1 Stunde lang durchgeführt wurde und die Inkubation mit dem Substrat 55 Minuten lang.
  • Die Membranfraktionen von CHO-Zellen, die APP 695 überexprimierten, wiesen eine Aktivität von 6,9 nmol/min/mg versus 2,2 für die TH-8-Kontrollen auf. Ebelacton A hemmte die Aktivität der Membranfraktionen von TH-8-Zellen nicht, wohingegen es vollständig die Aktivität von Membranfraktionen von CHO 695-Zellen hemmte. Ebelacton A hemmte ebenfalls Rindererythrozyten-Acetylcholinesterase (AChE) um 12%. Im Gegensatz hierzu hemmte Ebelacton B die Aktivität jeder der Membranfraktionen nicht, wohingegen sie die AChE-Aktivität um 62% hemmte. DFP hemmte die Aktivität der Membranfraktionen von Kontroll-TH-8-Zellen um 5% und von CHO 695-Zellen um 87%. DFP hemmte die AChE-Aktivität vollständig.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn APP 695 aus einem Bacculovirus-Expressionssystem aufgereinigt wurde. Insbesondere hemmte Ebelacton A die APP 695-assoziierte Esteraseaktivität um > 90%. Zusätzlich wurde unter den Bedingungen des Experiments keine Hemmung einer APP 751-assoziierten Esteraseaktivität durch Ebelacton A beobachtet und Ebelacton B ergab ein abnormal hohes Leerzeichen bzw. Blank mit APP 751 derartig, dass die Hemmung nicht bestimmt werden konnte. Wiederum war die AChE- Aktivität gegenüber einer Hemmung durch Ebelacton B (86%) eher zugänglich als Ebelacton A (56%). Das letztere Ergebnis stimmt mit den Ergebnissen des ersten Experimentes überein unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Zeiten der Präinkubation mit dem Inhibitor (20 Minuten versus 60 Minuten).
  • Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ebelacton A eine spezifische inhibitorische Aktivität gegen eine APP-assoziierte Esteraseaktivität aufweist, die in der Diagnose, Studie und Behandlung der Alzheimer Krankheit von Bedeutung ist.
    • Sequenzprotokoll
  • (1) Allgemeine Information:
  • (i) Anmelder: Potter, Huntington Kayyali, Usamah
  • (ii) Titel der Erfindung: Zusammensetzungen und Methoden zur Inhibition der β-Protein-Funktion
  • (iii)Anzahl der Sequenzen: 6
  • (iv) Korrenspondenzadresse:
  • (A) Adressat: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
  • (B) Straße: Two Militia Drive
  • (C) Stadt: Lexington
  • (D) Staat: Massachusetts
  • (E) Land: USA
  • (F) ZIP: 02173
  • (v) Computerlesbare Form:
  • (A) Mediumtyp: Floppy Disk
  • (B) Computer: IBM PC-kompatibel
  • (C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) Software: Patent Release Nr. 1,0, Version Nr. 1,25
  • (vii) Daten zu früheren Anmeldungen:
  • (A) Anmeldenummer: US 07/819 361
  • (B) Anmeldedatum: 13. Januar 1992
  • (viii) Anwalt/Vertreterinformation:
  • (A) Name: Granahan, Patricia
  • (B) Registriernummer: 32 227
  • (C) Aktenzeichen: HU90-03AA PCT
  • (ix) Telekommunikationsinformation:
  • (A) Telefon: 617-861-6240
  • (B) Telefax: 617-861-9540
  • (2) Information für Sequenz ID No. 1:
  • (i) Sequenzeigenschaften:
  • (A) Länge: 42 Aminosäuren
  • (B) Typ: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear (ix) Seauenzbeschreibung: Sequenz ID No. 1:
  • (2) Information für Sequenz ID No. 2:
  • (i) Sequenzeigenschaften:
  • (A) Länge: 9 Aminosäuren
  • (B) Typ: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear (ix) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID No. 2:
  • (2) Information für Sequenz ID No. 3:
  • (i) Sequenzeigenschaften:
  • (A) Länge: 9 Aminosäuren
  • (B) Typ: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear (ix) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID No. 3:
  • (2) Information für Sequenz ID No. 4:
  • (i) Sequenzeigenschaften:
  • (A) Länge: 9 Aminosäuren
  • (B) Typ: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear (ix) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID No. 4:
  • (2) Information für Sequenz ID No. 5:
  • (i) Sequenzeigenschaften:
  • (A) Länge: 9 Aminosäuren
  • (B) Typ: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear (ix) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID No. 5:
  • (2) Information für Sequenz ID No. 6:
  • (i) Sequenzeigenschaften:
  • (A) Länge: 9 Aminosäuren
  • (B) Typ: Aminosäure
  • (D) Topologie: linear (ix) Sequenzbeschreibung: Sequenz ID No. 6:

Claims (8)

1. Verwendung einer Verbindung, die die β-Protein-Vorläufer-Protein-(APP)-Cholinesterase-Aktivität hemmt, jedoch die notwendige Gehirn-Acetylcholinesterase-Aktivität schont, zur Herstellung eines Medikaments für die Therapie der Alzheimer'schen Krankheit über die in vivo Hemmung der APP- Aktivität.
2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Verbindung Ebelacton A ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Verbindung Paraamidinophenylmethansulfonylfluorid ist.
4. Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die ein β-Protein-Inhibitor ist, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Vereinigen von β-Protein, eines Substrats, auf das β-Protein einwirkt (beispielsweise ausgewählt aus Acetylthiocholin, Butyrylthiocholin und Paranitrophenylacetat) und einer Verbindung, die ein potentieller β- Protein-Inhibitor ist, unter Bedingungen, die zur Einwirkung von β-Protein auf das Substrat geeignet sind, und
(b) Bestimmen, ob β-Protein auf das Substrat einwirkt, wobei das Ausbleiben der β-Proteineinwirkung auf das Substrat auf einen β-Protein-Inhibitor hinweist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem in (b) das Ausmaß, in dem β-Protein auf das Substrat einwirkt, bestimmt wird und mit dem Ausmaß verglichen wird, in dem β-Protein auf das Substrat in Abwesenheit der Verbindung einwirkt und wobei, wenn β-Protein auf das Substrat in einem geringeren Ausmaß in Gegenwart der Verbindung als in deren Abwesenheit einwirkt, die Verbindung ein β-Protein- Inhibitor ist.
6. Verfahren zur Selektion eines Inhibitors zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Inhibitor durch die folgenden Schritte bereitgestellt wird:
(a) Kombinieren von β-Protein, einem Substrat auf das β-Protein einwirkt und einer Verbindung, die ein potentieller β-Protein-Inhibitor ist, unter Bedingungen, die zur Einwirkung von β-Protein auf das Substrat geeignet sind, und
(b) Bestimmen des Ausmaßes, zu dem das β-Protein auf das Substrat einwirkt,
wobei das Ausmaß, in dem das β-Protein auf das Substrat einwirkt, bestimmt wird und mit dem Ausmaß verglichen wird, in dem β-Protein auf das Substrat in Abwesenheit der Verbindung einwirkt, und wobei, wenn β-Protein auf das Substrat in einem geringeren Ausmaß in Gegenwart der Verbindung als in deren Abwesenheit einwirkt, die Verbindung ein β-Protein-Inhibitor ist.
7. Verfahren zum Screenen von Test-Arzneistoffen, umfassend den Schritt der Prüfung der Fähigkeit einer Verbindung, die Bildung eines Komplexes zwischen α&sub1;-Antichymotrypsin und β-Protein zu stören, umfassend die folgenden Schritte:
(a) Kombinieren von α&sub1;-Antichymotrypsin, β-Protein und einer Verbindung, die auf ihre Fähigkeit überprüft werden soll, die Bildung eines Komplexes zwischen α&sub1;-Antichymotrypsin und β-Protein zu stören, unter Bedingungen, die zur Bildung eines α&sub1;-Antichymotrypsin und β- Protein-Komplexes geeignet sind; und
(b) Bestimmen, ob Komplexbildung eintritt, wobei das Ausbleiben einer Komplexbildung auf das Vermögen der Verbindung hinweist, die Komplexbildung zu stören.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem in (b), das Ausmaß, in dem die Komplexbildung eintritt, bestimmt und mit dem Ausmaß verglichen wird, in dem eine Komplexbildung in Abwesenheit der Verbindung eintritt, und wobei eine Komplexbildung in einem geringeren Ausmaß in Gegenwart der Verbindung als in Abwesenheit der Verbindung ein Indikator ist, daß die Verbindung die Komplexbildung stört.
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