DE69233195T2

DE69233195T2 - Verwendung von app-modulatoren zur herstellung eines medikamentes zur behandlung der amyloidose

Info

Publication number: DE69233195T2
Application number: DE69233195T
Authority: DE
Inventors: Samuel E. Gandy; Gregg L. Caporaso; Paul Greengard
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1991-12-17
Filing date: 1992-12-17
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2012-12-18
Also published as: US5242932A; DE69233195D1; CA2126083A1; US5348963A; CA2126083C; EP0617619B1; AU4035793A; WO1993011762A1; EP0617619A1; AU678159B2; ATE249215T1; JPH07501554A

Description

Die häufigste Ursache der Demenz und die vierthäufigste Todesursache in der entwickelten Welt ist die Alzheimer-Erkrankung, die geschätzte 10% der über 65 Jahre alten Bevölkerung in den USA betrifft. Die Krankheit äußert sich als schleichender Gedächtnisverlust, kognitiver Verfall und Persönlichkeitsveränderungen, die im Verlauf eines Jahrzehnts zum Verlust der funktionellen Fähigkeit führen. In ihrem geschwächten Zustand verbleiben den Patienten gewöhnlich nur vegetative neurologische Funktionen, und sie versterben an sekundären Infektionen.
Die Alzheimer-Erkrankung ist durch bestimmte neuropathologische Verletzungen gekennzeichnet, zu denen intrazellulär neurofibrilläre Verwicklungen („tangles") und extrazellulär parenchymales und cerebrovaskuläres Amyloid gehören. Der Hauptbestandteil der Amyloidablagerungen ist ein als β/A4-Amyloid (4, 5) bezeichnetes Protein, ein ~4 kDa-Polypeptid, das aus der Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) herrührt; vgl. Goldgaber et al., Science, 235, S. 887–880 (1987). APP kommt in drei Haupt-Transmembran-Isoformen vor (APP₆₉₅, APP₇₅₁, und APP₇₇₀), die aus einander ausschließenden Spleißungen eines einzigen primären Transkripts (1A) resultieren; vgl. Kang et al., Nature (London), 325, S. 733–736 (1987). Die proteolytische Verarbeitung von APP führt zu einer Spaltung innerhalb der β/A4-Domäne und verhindert eine Amyloidogenese. Der biochemische Defekt, der bei der Alzheimer-Erkrankung für die Amyloidproduktion verantwortlich ist, könnte deshalb entweder eine Defizienz der normalen Proteolyse oder die übermäßige Aktivität eines anderen biochemischen Weges beinhalten. Es ist bemerkenswert, daß zwei Arten der vererbten cerebralen Amyloidosen, nämlich die erbliche cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose (Dutch-Typ) und familiäre, früh einsetzende Alzheimer-Erkrankung mit Mutationen in der codierenden Sequenz von APP in der Nähe der β/A4-Amyloiddomäne einhergehen.
Die Alzheimer-Erkrankung ist durch abnormale Protein-Phosphorylierung und veränderten Proteinstoffwechsel gekennzeichnet. Durch die Arbeit mehrerer Laboratorien wurde die veränderte Proteinphosphorylierung mit der Bildung der intrazellulären neurofibrillären Verwicklungen, wie sie bei der Alzheimer-Erkrankung vorkommen, in Zusammenhang gebracht. Jedoch wurde noch nicht gezeigt, daß die Proteinphosphorylierung eine Rolle beim Abbau des β/A4-Proteinvorläufers (βAPP) spielt.
Eine zentrale Eigenschaft der Pathologie der Alzheimer-Erkrankung ist die Ablagerung von Amyloidprotein in Plaques. Das 4 kDa-Amyloidprotein (auch als A4, APC, β-Amyloid oder BAP bezeichnet) ist eine verkürzte Form des größeren Amyloid-Vorläuferproteins (APP) das von einem auf dem Chromosom 21 lokalisierten Gen codiert wird (Goldgaber et al., 1987, Science, 235: 877–880:; Kang et al., 1987, Nature, 325: 733–736; Jenkins et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun., 151: 1–8; Tanzi et al., 1987, Science, 235: 880–885). Die genetische Verbindungsanalyse mittels DNA-Sonden, die Längen-Polymorphismen von Restriktionsfragmenten feststellen, (RFLPS, Botstein et al., 1980, Am. J. Hum. Genet., 32: 314–331), hat zur Lokalisierung eines Kandidaten-Gens (FAD, Familiar Alzheimer Disease) auf dem menschlichen Chromosom 21 in Familien mit hoher Häufigkeit von Alzheimer-Erkrankung geführt (St. George-Hyslop et al., 1987, Science, 235: 885–890). Jedoch wurde der Ort des FAD noch nicht präzise lokalisiert, und über seine Funktion ist sehr wenig bekannt. Anfangsstudien an Individuen mit Down-Syndrom (DS), das durch Trisomie des Chromosoms 21 verursacht wird, zeigen, daß diese jenseits der zweiten Lebensdekade eine Alzheimer-artige Pathologie entwickeln. Jedoch zeigte die Analyse mehrerer Alzheimer-Stammbäume, daß das APP-Gen nicht mit der Familien-Alzheimer-Erkrankung segregiert (Van Broackhoven et al., 1987, Nature, 328: 153–155; Tanzi et al., 1987, Nature, 329: 156–157). Weiterhin haben zwei neuere Studien mit neuen Familien gezeigt, daß zwischen Chromosom-2l-Markern und Familien-Alzheimer-Erkrankung keine Verbindung besteht (Schellenberg et al., 1988, 241: 1507-1510; Rosea et al., 1988, Neurology, 38: 173).
Alter, genetische Elemente und möglicherweise Umweltfaktoren scheinen zur zellulären Pathologie der Alzheimer-Erkrankung beizutragen. Eine fundamentale aber nicht beantwortete Frage in der Pathogenese von Alzheimer-Erkrankung ist das Verhältnis zwischen Neuronenabnormitäten und der Ablagerung von Amyloid. Genau gesagt, ist der zelluläre Ursprung der pathologischen Ereignisse nicht bekannt, die zur Ablagerung von Amyloid-Fibrillen in der Nachbarschaft einiger Regionen der Blut-Gehirn-Barriere (cerebrovaskuläres Amyloid) und in der Nähe von Nervenenden (neuritische Plaques) in bestimmten Gehirnregionen führen; ebensowenig der Ursprung des extrazellulären Amyloids in Plaque-Kernen. Glenner und Wong haben die Reinigung und Charakterisierung von meningealem Amyloid sowohl aus den Gehirnen von Personen mit Alzheimer-Erkrankung (Glenner und Wong, 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun., 120: 885–890) als auch von solchen mit Down-Syndrom (Glenner und Wong, 1984, Biochem. Biophys. Res. Comm., 122: 1131–1135) beschrieben und die N-terminalen Peptidsequenzen bestimmt. Bei den 24 analysierten Resten wiesen die zwei Amyloid-Peptide nur einen Unterschied auf, nämlich an Aminosäureposition 11 (Glutamin im Amyloid der Alzheimer-Erkrankung gegenüber Glutamsäure im Amyloid des Down-Syndroms). Nachfolgende Studien am Amyloid aus Alzheimer-Gehirn-Plaque-Kernen ergaben Aminosäuresequenzen, die mit jenen Daten identisch waren, die beim cerebrovaskulären Amyloid des Down-Syndroms berichtet worden waren (Masters et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 4245–4249). Copy-DNA-Analysen von APP-Transkripten sowohl von normalem Gewebe als auch von Alzheimer-Gehirn Material zeigte das Vorhandensein des Codons für Glutamsäure in dieser Position (Kang et al., 1987, vorst.; Goldgaber et al., 1987, vorst.; Robakis et al., vorst.; Tanzi et al., 1987, Science, 235: 880–884; Zain et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 929–933; Vitek et al., 1988, Mol. Brain Res., 4: 121–131.
Die cerebale β/A4-Amyloidose ist für mehrere, anscheinend miteinander verwandte Zustände des Menschen charakteristisch: Alzheimer-Erkrankung, Down-Syndrom, erbliche cerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose, Dutch-Typ und, in einem geringeren Grad, normales Altern. Wie andere organspezifische Amyloidosen beinhaltet die Pathologie dieser Zustände die Ansammlung extrazellulären Proteinniederschlags, der β-gefaltete Blätter bildet und den Farbstoff Kongorot bindet (Cotran et al., „Robbin's Pathologic Basis of Disease", 4. Aufl., W.B. Saunders, Philadelphia, 1984). Im Gegensatz zu anderen Amyloidosen jedoch, bei denen das abgelagerten Peptid eindeutig aus einer hydrophilen Domäne in einem zirkulierenden Serum-Vorläufer abgeleitet zu sein scheint, beinhaltet das abgelagerte β/A4-Amyloid einen Abschnitt der intramembranen Domäne eines integralen Transmembranproteins, nämlich das Alzheimer-β/A4-Amyloid-Vorläuferprotein (APP). Dies wirft mehrere neuartige Fragen dazu auf, wie APP innerhalb der Zelle verarbeitet wird, und wie β/A4 in den extrazellulären Raum freigesetzt wird. Synthetisches β/A4 aggregiert und präzipitiert spontan (15) und zeigt damit, daß die primäre Aminosäuresequenz dieser APP-Domäne ausreichend Strukturinformation codiert, um seine Amyloidogenität zu bestimmen.
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Mitteln, die den intrazellulären Transport und die Verarbeitung von APP steuern oder beeinflussen, und somit die Produktion von Alzheimer-Typ-Amyloidose hemmen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Produktion von Alzheimer-Typ-Amyloidose in einem Säuger, das die Verabreichung an den Säuger einer solchen Menge wenigstens eines Proteintransport-Inhibitors umfaßt, die imstande ist, den Transport und die Verarbeitung von APP in der Säugerzelle zu verringern.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Behandlung der mit der Alzheimer-Erkrankung einhergehenden Amyloidose bei einem Säuger-Patienten, die die Verabreichung an den Säuger-Patienten einer solchen Menge wenigstens eines Wirkstoffes umfaßt, die imstande ist, den Transport und die Verarbeitung von APP zu hemmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Durchmustern von Wirkstoffen, die die Amyloidbildung steuern, das das Inkontaktbringen von Säugerzellen mit einem Wirkstoff, von dem man annimmt, daß er in der Lage sein könnte, den Transport und die Verarbeitung von APP zu steuern, und die Feststellung der Veränderung beim Transport und der Verarbeitung von APP umfaßt.
Die Figuren zeigen:
1A ist ein schematisches Diagramm des APP-Moleküls.
1B, 1C und 1D sind Autoradiogramme von APP-Spezies, die aus [³⁵S]Methioninmarkierten PC12-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Chloroquin immungefällt wurden.
2A und 2B sind Graphen, die die Rückgewinnung von unreifem APP in Abwesenheit oder Anwesenheit von Chloroquin zeigen.
3A, 3B und 3C sind Graphen, die die Rückgewinnung von reifem APP in Abwesenheit oder Anwesenheit von Chloroquin zeigen.
4A, 4B und 4C sind Graphen, die die Rückgewinnung von sekretierten APP-Fragmenten in Abwesenheit oder Anwesenheit von Chloroquin zeigen.
5 ist ein Graph, der die Rückgewinnung des 16,3 kDa-Carboxy-terminalen APP-Fragments in Abwesenheit oder Anwesenheit von Chloroquin zeigt; und
6A, 6B und 6C sind Autoradiogramme von APP-Spezies, die aus [³⁵S]Methioninmarkierten PC12-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Monensin oder Brefeldin A immungefällt wurden.
Im einzelnen zeigen die Figuren:
1(A) Schematisches Diagramm des APP-Moleküls, das die extrazelluläre, die Transmembran- und die zytoplasmatische Region zeigt: β/A4-Amyloid-Domäne (schattiert); normale intra-β/A4-Amyloid-Spaltungsstelle (15) (Pfeil); Domäneninsertionen beiden Isoformen APP₇₅₁ (nur KPI) und APP₇₇₀ (sowohl KPI als auch OX-2); und mutmaßliche N-Glykosylierungsstellen (CHO). (B, C und D) Autoradiogramme von APP-Spezies, die aus [³⁵S]Methionin-markierten PC12-Zellen immungefällt wurden, die während der Chase-Periode 0, 0,25, 0,5, 1, 2 oder 4 Stunden lang in Abwesenheit (links) oder Gegenwart (rechts) von Chloroquin inkubiert wurden. (B) APP-Holoproteine von 106, 112, 116, 125, 139, und 146 kDa, die unreifem APP₆₉₅, APP₇₅₁ und APP₇₇₀ bzw. reifem APP₆₉₅, APP₇₅₁ und APP₇₇₀ entsprechen, in Zell-Lysaten. (C) 16,3 kDa-Peptide, die dem normalen carboxy-terminalen APP entsprechen, einem Fragment, das aus intra-β/A4-Amyloid-Spaltung in Zell-Lysaten herrührt. (D) aminoterminale APP-Peptide von 109, 123 und 129 kDa, die sekretierten Fragmenten von APP₆₉₅, APP₇₅₁ bzw. APP₇₇₀ entsprechen, in konditioniertem Medium. Die Autoradiogramme stammen aus einem einzelnen Versuch, der entweder auf einem SDS-Polyacrylamidgel mit kontinuierlichem Gradienten von 4 bis 15% (B, oberer Teil des Films; C unterer Teil des Films) oder auf einem 6%-SDS-Polyacrylamidgel (D) analysiert wurde. Die Autoradiogramme wurden über verschiedene Zeiträume belichtet, um die Klarheit des Signals zu optimieren.
2: Rückgewinnung von unreifem APP in Abwesenheit (offene Kreise) oder Anwesenheit (ausgefüllte Rauten) von Chloroquin. (A) unreifes APP₆₉₅. (B) unreifes APP_KPI (APP₇₅₁ und APP₇₇₀). Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler des Durchschnitts (SEM; standard error of the mean) aus sieben Versuchen; n = 3 bis 7 für einzelne Zeitpunkte. Zwischen den unbehandelten und den behandelten Proben bestand kein statistisch signifikanter Unterschied (nicht gepaarter Student-t-Test).
3: Rückgewinnung von reifem APP in Abwesenheit (offene Kreise) oder Anwesenheit (ausgefüllte Rauten) von Chloroquin. (A) reifes APP₆₉₅. (B) reifes APP₇₅₁. (B) reifes APP₇₇₀. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler des Durchschnitts aus sieben Versuchen; n = 3 bis 7 für einzelne Zeitpunkte. Die statistische Signifikanz zwischen den unbehandelten und den behandelten Proben wurde mit dem nicht gepaarten Student-t-Test bestimmt (*, p < 0,05).
4: Rückgewinnung von sekretierten APP-Fragmenten in Abwesenheit (offene Kreise) oder Anwesenheit (ausgefüllte Rauten) von Chloroquin. (A) sekretiertes APP₆₉₅. (B) sekretiertes APP₇₅₁ (C) sekretiertes APP₇₇₀. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler des Durchschnitts aus sieben Versuchen; n = 3 bis 7 für einzelne Zeitpunkte. Die statistisches Signifikanz zwischen den unbehandelten und den behandelten Proben für die einzelnen Zeitpunkte wurde mit dem nicht gepaarten Student-t-Test bestimmt (*, p < 0,05).
5: Rückgewinnung des 16,3 kDa-carboxy-terminalen APP-Fragments in Abwesenheit (offene Kreise) oder Anwesenheit (ausgefüllte Rauten) von Chloroquin. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler des Durchschnitts aus sieben Versuchen; n = 3 bis 7 für einzelne Zeitpunkte. Die statistische Signifikanz zwischen den unbehandelten und den behandelten Proben wurde mit dem nicht gepaarten Student-t-Test bestimmt (p < 0,05).
6: Autoradiogramme von APP-Spezies, die aus [³⁵S]Methionin-markierten PC12-Zellen immungefällt wurden, die während der Präinkubations-, Puls- und Chase-Perioden von 0, 2 oder 4 Stunden in Abwesenheit (links) oder Gegenwart von Monensin (Mitte) oder Brefeldin A (rechts) inkubiert wurden. (A und B) Zell-Lysate, (C) konditioniertes Medium. (A) APP-Holoproteine von 106, 112, 116, 125, 139, und 146 kDa, die unreifem APP₆₉₅, APP₇₅₁ und APP₇₇₀ bzw. reifem APP₆₉₅, APP₇₅₁ und APP₇₇₀ entsprechen. (B) 16,3 kDa-Peptid, das dem carboxy-terminalen APP-Fragment entspricht, das aus intra-β/A4-Amyloid-Spaltung herrührt. (C) aminoterminale Peptide von 109, 123 und 129 kDa, denen sekretierte Fragmente von APP₆₉₅, APP₇₅₁ bzw. APP₇₇₀ entsprechen.
APP wird als ganzes Transmembranprotein wahrscheinlich an membrangebundenen Ribosomen oder am rauhen Endoplasmatischen Reticulum (ER) synthetisiert, um seine co-translationale Insertion ins Vesikellumen zu ermöglichen. Solche Membranvesikel enthalten typischerweise einen Signalsequenz-Rezeptor, der eine hydrophobe Signalsequenz am NH₂-Ende der naszierenden Polypeptidkette erkennt, und eine intraluminale (intravesikuläre) Signalpeptidase-Aktivität, die das hydrophobe Signalpeptid APP abspaltet. Eine solche Signalpeptidsequenz befindet sich an den Resten 1 bis 17 von naszierendem APP. Direkte Sequenzierung des NH₂-Endes von sekretiertem APP hat gezeigt, daß die ersten Reste LEVPT (Ein-Buchstaben-Aminosäurencode; Palmert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6338–6342, 1989) sind, was den vorhergesagten Resten 18–22 von APP entspricht, und mit der vorhergesagten NH₂-terminalen Sequenz nach der Spaltung des Signalpeptids übereinstimmt.
Nach der Synthese wird das APP-Polypeptid mehreren post-translationalen Modifikationen unterworfen. Im Golgi-Apparat werden zur extrazellulären oder intraluminalen Domäne Sulfatgruppen und Kohlenhydrate hinzugefügt. Das Sulfat wird zu Tyrosylresten hinzugefügt, und die Daten der Konsenssequenzen legen nahe, daß der/die modifizierte(n) Reste Tyrosin 217 und/oder Tyrosin 262 sein kann/können. N-Glykosylierung kann an den Resten 467-469 und 496–498 vorkommen. O-Glykosylierung kann ebenfalls vorkommen, doch die Glykosylierungsstelle wurde noch nicht lokalisiert (9, 21). Auch Phosphatgruppen werden zum APP hinzugefügt, und zwar wahrscheinlich in dessen zytoplasmatische Domäne, da Proteinphosphorylierungsenzyme (Proteinkinasen) typischerweise intrazellulär lokalisiert sind.
Diese post-translationalen Modifikationen könnten einige Schlüssel zur Biologie des APP liefern. Die Sulfatierung des Tyrosins geschieht typischerweise in den Domänen von Proteinen, die dazu bestimmt sind, aus der Zelle freigesetzt werden. Es hat sich erwiesen, daß dies auch bei APP der Fall ist: Nach einem kurzen zellulären Halbleben wird die sulfatierte Tyrosin-Ektodomäne in das Zellkulturmedium freigesetzt. Kovalent gebundenen Zucker-Seitengruppen sind typisch für die Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen, und tatsächlich kann eine Population von APP-Holoprotein von anscheinend voller Länge auf der Oberfläche von transfizierten Zellen festgestellt werden.
Die Phosphorylierung eines Substratproteins liefert häufig den Schlüssel zur Biologie dieses Proteins. Veränderungen im Phosphorylierungszustand eines Proteins können gewaltige Veränderungen beim Transport, der Verarbeitung oder der biologischen Aktivität des Proteins nach sich ziehen. Die Phosphorylierung bestimmter Zelloberflächenrezeptoren in ihren zytoplasmatischen Domänen ist ein Mechanismus zur Veränderung ihrer Sensitivität für liganden-induzierte Effekte. Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) und extrazelluläre Matrix-Rezeptoren werden in ihren zytoplasmatischen Domänen phosphoryliert, und der Zustand der Phosphorylierung der CAMs kann Wechselwirkungen mit dem Cytoskelett steuern. Die Endocytose des epidermalen Wachstumsfaktor-(EGF)-Rezeptors und Interleukin-2-(IL-2)-Rezeptors wird durch Proteinkinase C-vermittelte Phosphorylierung in deren jeweiligen Cytodomänen an Resten nahe der Transmembrandomäne induziert. Zu bemerken ist, daß eine APP-Phosphorylierungsstelle rasch durch Proteinkinase C oder Calcium/Calmodiulin-abhän gige Proteinkinase II phosphoryliert wird, und daß sie wie die Proteinkinase C-Phosphorylierungsstelle im IL-2R oder EGFR innerhalb von 10 Resten der Plasmamembran lokalisiert ist.
Neuerdings zeigen Hinweise (Buxbaum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: S. 6003-6006, 1990) direkt, daß die Proteinphosphorylierung ein wichtiges Ereignis in der Biologie von APP steuert, und zwar seine proteolytische Verarbeitung. In Pulse-Chase-Studien mit PC-12-Zellen verringerten Phorbolester (Wirkstoffe, die Proteinkinase C stimulieren) die Rückgewinnung des reifen APP dramatisch, während sie die Rückgewinnung eines COOH-terminalen Fragments von etwa 15 kDa erhöhten. Okadainsäure (ein Wirkstoff, der die Proteinphosphatasen 1 und 2A inhibiert) hatte ähnliche Wirkungen. Wenn die Zellen gleichzeitig sowohl mit Phorbolester als auch mit Okadainsäure behandelt wurden, wurde zusätzlich zu den Wirkungen des reifen APP und dem 15-kDa-COOH-terminalen Fragment ein größeres (~19 kDa) COOH-terminales Fragment in großen Mengen erzeugt. In anderen Versuchen führte H-7 (ein Inhibitor von Proteinkinasen, darunter auch der Proteinkinase C) zu einer scheinbaren Abnahme der Grundrate der APP-Verarbeitung, was für die physiologische Bedeutung der Steuerung der APP-Verarbeitung durch Proteinkinase C spricht. Diese Ergebnisse liefern den ersten direkten Beweis für die Steuerung der APP-Verarbeitungsrate durch Proteinphosphorylierung. Sie lassen es auch möglich erscheinen, daß die Proteinphosphorylierung zu einem anderen, das heißt qualitativ verschiedenen Weg der APP-Verarbeitung führen könnte.
Die intrazellulären Transportwege, die an der APP-Verarbeitung beteiligt sind, haben begonnen, die Aufmerksamkeit der Forschung zu wecken, doch bleibt noch vieles zu klären. Nachdem es die Trans-Golgi-Region verlassen hat, wurde APP an zwei Stellen lokalisiert: Anscheinend intaktes APP-Holoprotein ist auf der Zelloberfläche feststellbar (Weidemann et al., Cell, 57, S. 115–126, 1989); und ein verkürztes lösliches Protein, das die NH₂-terminale Region des Moleküls enthält, wird von der Zelle freigesetzt (ebenda). Der Zellort, an dem APP gespaltet und das verkürzte Protein hergestellt wird, ist unbekannt; wahrscheinliche Kandidaten dafür sind u.a. der Golgi-Apparat, die lysosomale Abteilung und/oder die Zelloberfläche.
Mehrere Hinweisketten lassen vermuten, daß das Lysosom wahrscheinlich eine Station auf dem intrazellulären Weg von APP ist. Das neuronale Lipofuscin, das durch die altersabhängige Anhäufung von unvollständig degradierten lysosomalen Nebenprodukten gebildet wird, ist durch das Vorhandensein APP-artiger Immunreaktivität in Verbindung mit intrazellulären vesikulären Lipofuscinkörnchen gekennzeichnet. Bei Anwendung der Immuncytochemie des Gehirns erscheint die APP-artige Immunreaktivität als intrazelluläres vesikuläres Färbungsmuster, das so interpretiert werden könnte, daß es möglicherweise die Assoziierung von APP-Immunreaktivität mit Lysosomen darstellt. Es wurde vorgeschlagen, daß verschiedene Proteaseinhibitoren, darunter die Lysosomen-Säuerungsinhibitoren Ammoniumchlorid und Chloroquin die APP-Verarbeitung verlangsamen könnten (Cole et al., Neurochem. Res., 14: 933-939, 1989). Neuerdings wurde eine Signalsequenz, nämlich Asparagin-Prolin-X-Tyrosin festgestellt. Man nimmt an, daß sie Transmembranproteine (darunter auch der LD-(low density)-Lipoproteinrezeptor, der EGF-Rezeptor und der Insulinrezeptor) zu ausgekleideten Vertiefungen steuert, um deren Endocytose beginnen zu lassen. Diese zusammenlaufenden Hinweisketten lassen stark vermuten, daß wenigstens einige der Schritte der APP-Verarbeitung in Lysosomen stattfinden könnten. Diese Hinweise würden eine Spaltung an der Zelloberfläche nicht notwendigerweise ausschließen, und auch nicht die Möglichkeit, daß der lysosomale Aufenthalt nicht im Zug der anfänglichen Verarbeitung des APP-Holoproteins stattfindet, sondern später, beim Transport der COOH-terminalen APP-Fragmente. Auch kann man aufgrund der bisher verfügbaren Daten nicht unterscheiden, ob der vorgeschlagene frühe lysosomale Aufenthalt nach der Freisetzung an der Zelloberfläche stattfindet, oder im Zug eines Verarbeitungsweges, der APP direkt an das Lysosom liefert, nachdem es von der Trans-Golgi-Region erscheint.
Gezüchtete Säugerzellen bilden leicht verfügbare und gut charakterisierte Systeme für Proteintransportstudien. In der vorliegenden Erfindung wurde der intrazelluläre Transport und die Verarbeitung von APP durch Pulsmarkierung von neuroendokrinen PC 12-Zellen in Gegenwart von verschiedenen pharmakologischen Wirkstoffen untersucht.
Unter Verwendung eines Durchmusterungsverfahrens wurden Wirkstoffe bestimmt, die den Transport und die Verarbeitung von APP steuern und damit die Produktion von Amyloidose vom Alzheimer-Typ hemmen.
Die folgende Aufzählung ist nicht als vollständige oder erschöpfende Liste gedacht; sie stellt nur repräsentative Beispiele für die vorliegenden Erfindung dar.
7-Chlor-4-(4-diethylamin-1-methylbutylamino)-chinolin (Chloroquin),
8-(4-Amino-1-methylbutylamino)-6-methoxychinolin (Primaquin),
4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin,
4-Diethylaminobutylamino-7-chlorchinolin,
4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-methylchinolin,
4-[5'-Diethylaminopentyl-(2')-amino]-7-iodchinolin,
3-Methyl-4-(5'-diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin,
3-Ethoxy-4-(5-diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin,
4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-5,7-dichlorchinolin,
2-[5-Ethyltetrahydro-5-[tetrahydro-3-methyl-5-[tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,5-dimethyl-2H-pyran-2-yl]-2-furyl]-2-furyl]-9-hydroxy-β-methoxy-α,τ,2,8-tetramethyl-1,6-dioxaspiro[4,5]decan-7-buttersäure (Monensin);
Ammoniumchlorid;
Methylamin; und
Brefeldin A.
Demgemäß betrifft die vorliegenden Erfindung die Verwendung von 2-[5-Ethyltetrahydro-5-[tetrahydro-3-methyl-5-[tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,5-dimethyl-2H-pyran-2-yl]-2-furyl]-2-furyl]-9-hydroxy-β-methoxy-α,τ,2,8-tetramethyl-1,6-dioxaspiro[4,5]decan-7-Buttersäure (Monensin);
Brefeldin A;
8-(4-Amino-1-methylbutylamino)-6-methoxychinolin (Primaquin);
4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin;
4-Diethylaminobutylamino-7-chlorchinolin;
4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-methylchinolin;
4-[5'-Diethylaminopentyl-(2')-amino]-7-iodchinolin;
3-Methyl-4-(5'-diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin;
4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-5,7-dichlorchinolin; oder Methylamin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Es versteht sich, daß Derivate und Analoga der vorstehenden Wirkstoffe von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfaßt werden.
Andere Wirkstoffe, von denen bekannt ist, daß sie den Proteintransport in Zellen steuern und beeinflussen, sind in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendbar.
Die Wirkstoffe zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können als ein Medikament, das heißt eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die in den Verfahren dieser Erfindung zur Verabreichung an Tiere und Menschen angewandt werden, umfassen einen aktiven Wirkstoff in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Excipiens. Das Medikament kann die Form von Tabletten (darunter auch Lutschtabletten und Granulate), Dragees, Kapseln, Pillen, Ampullen oder Suppositorien haben, die eine Verbindung der Erfindung umfassen.
„Medikament" bedeutet in diesem Zusammenhang physikalisch diskrete, zusammenhängende Portionen, die für ärztliche Verabreichung geeignet sind. „Medikament in Form von Dosierungseinheiten" bedeutet in diesem Zusammenhang physikalisch diskrete, zusammenhängende Einheiten, die für ärztliche Verabreichung geeignet sind, und von denen jede eine Tagesdosis oder ein Mehrfaches (bis zum Vierfachen) oder einen Bruchteil (bis zu einem Vierzigstel) einer Tagesdosis des Wirkstoffes der Erfindung zusammen mit einem Träger und/oder einer Umhüllung enthält. Ob das Medikament eine Tagesdosis oder zum Beispiel eine halbe, drittel oder viertel Tagesdosis enthält, hängt davon ab, ob das Medikament einmal oder zum Beispiel zweimal, dreimal oder viermal täglich verabreicht werden soll.
Vorteilhafterweise werden die Verbindungen als Dosierungseinheiten zubereitet, wobei jede Einheit so ausgelegt ist, daß sie eine feste Dosis des Wirkstoffes liefert. Tabletten, glasierte Tabletten, Kapseln, Ampullen und Suppositorien sind Beispiele für bevorzugte Dosierungsformen gemäß der Erfindung. Es ist nur nötig, daß der Wirkstoff die effektive Menge darstellt, das heißt, daß eine geeignete effektive Dosierung mit den Dosierungsformen bei Einzel- oder Mehrfachdosierungseinheiten übereinstimmt. Die genaue individuelle Dosierung und die tägliche Dosierung werden natürlich nach Standardverfahren unter der Aufsicht eines Arztes oder Veterinärs bestimmt.
Der Wirkstoff kann auch als Suspension, Lösung und Emulsion der Verbindung in wässrigen oder nichtwässrigen Verdünnungsmitteln, Sirupen, Granulaten oder Pulvern verabreicht werden.
Verdünnungsmittel, die in Arzneimitteln (z. B. Granulaten) angewandt werden können, die den Wirkstoff in einer Form enthalten, der sich zu Tabletten, Dragees Kapseln und Pillen formen läßt, sind unter anderem folgende: (a) Füll- und Verlängerungsstoffe, z. B. Stärke, Zucker, Mannitol und Kieselsäure; (b) Bindemittel, z. B. Carboxymethylcellulose und andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon; (c) Feuchtigkeitsspender, z. B. Glycerin; (d) Stoffe zur Auflösung, z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat; (e) Mittel zur Lösungsverzögerung, z. B. Paraffin; (f) Resorptionsbeschleuniger, z. B. quartäre Ammoniumverbindungen; (g) oberflächenaktive Mittel, z. B. Cetylalkohol, Glycerinmonostearat; (h) adsorptive Träger, z. B. Kaolin und Bentonit; (i) Schmiermittel, z. B. Talkum, Calcium- und Magnesiumstearat und feste Polyethylenglykole.
Die Tabletten, Dragees, Kapseln und Pillen, die den Wirkstoff umfassen, können die üblichen Beschichtungen, Hüllen und Schutzmatrizes haben, die auch Opazifizierer enthalten können.
Sie können so beschaffen sein, daß sie den Wirkstoff nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Teil des Verdauungstrakts, möglicherweise über einen Zeitraum hinweg freisetzen. Die Beschichtungen, Hüllen und Schutzmatrices können zum Beispiel aus polymeren Substanzen oder Wachs sein.
Der Wirkstoff kann auch in mikroverkapselter Form und mit einem oder mehreren der vorstehend erwähnten Verdünnungsmittel aufgebaut sein.
Die Verdünnungsmittel zur Verwendung in Arzneimittelzusammensetzungen, die zur Herstellung von Suppositorien ausgelegt sind, können zum Beispiel die üblichen wasserlöslichen Verdünnungsmittel sein, wie etwa Polyethylenglykole und Fette [z. B. Kokosöl und hohe Ester (z. B. C₁₄-Alkohole mit C₁₆-Fettsäure)] oder Gemische dieser Verdünnungsmittel.
Die Arzneimittel, die Lösungen und Emulsionen sind, können zum Beispiel die üblichen Verdünnungsmittel enthalten (natürlich mit der vorstehend erwähnten Ausnahme von Lösungsmitteln mit einem Molekulargewicht unter 200 in Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels), wie Verdünnungen, Lösungsmittel und Emulgatoren. Konkrete Beispiele solcher Verdünnungsmittel sind unter anderen Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylglykol, 1,3-Butylglykol, Dimethylformamid, Öle (z. B. Erdnußöl, Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykol und Fettsäureester von Sorbitol oder Gemische davon.
Zur parenteralen Verabreichung sollten die Lösungen und Suspensionen steril sein, das heißt Wasser oder Erdnußöl sollten in Ampullen enthalten und wenn geeignet isotonisch in bezug auf Blut sein.
Die Arzneimittel, die Suspensionen sind, können die üblichen Verdünnungsmittel enthalten, wie flüssige Verdünnungsmittel, z. B. Wasser, Ethylalkohol, Propylglykol, oberflächenaktive Mittel, (z. B. ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylsorbitole und Sorbitester), polykristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Agar-Agar und Tragacanth oder Gemische von diesen.
Die Arzneimittel können auch Verdickungsmittel und Konservierungsmittel enthalten, ebenso wie Duftstoffe und Geschmackszusätze (z. B. Pfefferminzöl und Eukalyptusöl) und Süßstoffe (z. B. Saccharin und Aspartam).
Die Arzneimittel werden im allgemeinen 0,5 bis 90 Gewichts-% Wirkstoff, bezogen auf die ganze Verbindung enthalten.
Zusätzlich zum Wirkstoff können die Arzneimittel und Medikamente auch andere pharmazeutisch aktive Bestandteile enthalten.
Die Verdünnungsmittel in den Medikamenten der vorliegenden Erfindung können beliebige der vorstehend in Bezug auf die Arzneimittel erwähnten sein. Solche Medikamente können Lösungsmittel von einem Molekulargewicht unter 200 als einziges Verdünnungsmittel enthalten.
Es ist beabsichtigt, diesen Wirkstoff peroral, parenteral (z. B. intramuskulär, intraperitoneal subcutan, transdermal oder intravenös), rektal oder lokal, vorzugsweise oral oder parenteral, besonders perilingual oder intravenös zu verabreichen.
Die Dosierungsrate, zum Beispiel 0,05 bis 20 mg/kg Körpergewicht, richtet sich nach der Art und dem Körpergewicht des menschlichen oder tierischen Patienten, dessen individueller Reaktion auf die Behandlung, der Art der Zubereitung, in der der Wirkstoff verabreicht wird, der Art und Weise der Verabreichung, dem Zeitpunkt im Krankheitsverlauf oder dem Intervall, in dem es zu verabreichen ist. So kann es in manchen Fällen genügen, weniger als die Minimaldosierungsrate zu verwenden, während man in anderen Fällen eine Obergrenze überschreiten muß, um die gewünschten Resultate zu erzielen. Wenn größere Mengen verabreicht werden, kann es ratsam sein, diese in mehrere einzelne Verabreichungen im Tagesverlauf aufzuteilen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die darin verwendeten Durchmusterungsverfahren als Mittel zur Feststellung weiterer Wirkstoffe, die die Produktion von Alzheimer-Typ Amyloidose steuern oder hemmen, verwendet werden.
Bei diesem Durchmusterungsverfahren werden Säugerzellen mit einem Mittel in Kontakt gebracht, von dem man annimmt, daß es in der Lage sein könnte, den Transport und die Verarbeitung von APP zu steuern, und dann werden die Veränderungen beim Transport und der Verarbeitung von APP untersucht.
Beispiele
Chloroquin wurde von Sigma Chemical Company bezogen, Monensin wurde von Calbiochem bezogen, und Brefeldin A wurde von Epicentre Technologies (Madison, WI) bezogen. Ascites-Flüssigkeit von Mäusen, denen intraperitoneal Hybridomzellen injiziert worden waren, die den anti-aminoterminalen monoclonalen APP-Antikörper 22C11 produzierten, war das freundliche Geschenk von R. P. Fracasso (Molecular Therapeutics, Inc., West Haven, CT) und T. V. Ramabhadran (The Rockefeller University Laboratory of Molecular and Cellular Neuroscience) und von S. S. Sisodia (The John Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Affinitätsgereinigter anti-carboxy-terminaler APP-Antikörper 369A von Kaninchen ist schon früher beschrieben worden (Buxbaum et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6003–6006, 1990). Agarose-gekoppelte anti-Maus- und anti-Kaninchen-Antikörper wurden von HyClone Laboratories, Inc. (Logan, UT) bezogen. Protein A-Sepharose CL-4B (PAS) wurde von Pharmacia LKB erworben.
Beispiel 1
Undifferenzierte PC12-Zellen wurden auf drei Kulturschalen von 10 cm Durchmesser in Dulbeccos Modified Eagle's Medium mit 10% (Vol./Vol.) durch Hitze inaktiviertem fötalem Rinderserum, 5% (Vol./Vol.) durch Hitze inaktiviertem Pferdeserum und antibiotischantimykotischer Lösung (Gibco) bei 37°C (alle folgenden Inkubationen bis hin zur Zell-Lyse wurden bei dieser Temperatur ausgeführt) und 5% CO₂ bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal mit Hepes-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (HBS) (10 mM Hepes, pH 7.4; 110 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl₂; 1 mM MgSO₄) gewaschen, in HBS suspendiert und durch kurze Zentrifugierung gefällt. Die Zellen wurden in 1 ml methioninfreiem Eagle's Modified Minimum Essential Medium (MEM) mit 25 mM Hepes, pH 7.4, resuspendiert. Nach 45-minütiger Präinkubation wurden die Zellen 20 Minuten lang durch Hinzufügen von 1 mCi [³⁵S]Methionin (1000 mCi/mmol; NEN Research Products) pulsmarkiert. Die Chase-Periode wurde durch Hinzufügen von 5 ml MEM eingeleitet, das einen Überschuß von nichtmarkiertem Methionin (200 μM) und 25 mM Hepes, pH 7.4 enthielt, anschließend erfolgte die Aufteilung in 200 μl-Proben in Mikrozentrifugenröhrchen.
Bei Verwendung von Chloroquin (50 μM) wurde der Wirkstoff am Beginn der Chase-Periode hinzugefügt. Bei der Untersuchung der Wirkung von Monensin oder Brefeldin A (10 μg/ml) wurde der Wirkstoff am Beginn der Präinkubationsphase hinzugefügt und war während der Puls-Chase-Periode vorhanden. Die Lebensfähigkeit der Zellen blieb während der Chase-Periode unverändert, wie dies mit Trypanblau-Auschluß festgestellt wurde.
Am Ende der Chase-Periode (0–8 Std.) wurden die Zellen rasch gefällt und das Medium entfernt. Zellen und Medium wurden mit 1% (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt, 5 Min gekocht, ultraschallzertrümmert (nur die Zell-Lysate) und 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert. Nach Verdünnung mit dem gleichen Volumen Neutralisierungspuffer [6% (Vol./Vol.) Nonidet-P40; 200 mM Tris, pH 7.4; 300 mM NaCl; 10 mM EDTA; 4 mM NaN₃], wurden die Überstände bei 40°C mit Antikörper 22C11 über Nacht inkubiert (Medium) oder 2 Stunden lang mit Antikörper 369A inkubiert (Zell-Lysate). Die Immunkomplexe wurden mit 200 μl (Vol./Vol.) Agarose-gekoppeltem anti-Maus- oder anti-Kaninchen-Antikörper oder mit PAS gefällt, und die Präzipitate wurden dreimal mit 1 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung [100 mM Tris, pH 7.4; 150 mM NaC; 2 mM NaN₃] gewaschen.
Die Proben wurden in 100 μl Probenpuffer [62,5 mM Tris, pH 6.8; 2% SDS; 5% 2-Mercaptoethanol; 10% Sucrose] gekocht und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf Gelen mit 4–15%-Gradienten (Zell-Lysate) oder 6%-Gelen (Medium) separiert. Die Gele wurden zur Fluorographie mit Verstärkerlösung (Entensity; N-EN Research Products) behandelt und bei –70°C auf mit Blitz vorbelichteten Röntgenfilm belichtet. Die Proteine wurden durch scannende Densitometrie quantifiziert (da unreifes APP₇₅₁ und APP₇₇₀ durch Densitometrie nicht aufgelöst werden konnten, werden sie hier zusammen als unreifes APP_KPI dargestellt). Die Werte wurden nach Länge der Belichtungszeit, Signalabnahme und der Zahl der Methioninreste in einzelnen APP-Spezies korrigiert und auf das gesamte APP-Holoprotein normalisiert, das am Beginn der Chase-Periode in unbehandelten Zellen vorhanden war (100 relative Einheiten). Die statistische Signifikanz wurde mit dem nicht gepaarten Student-t-Test bestimmt.
Bestimmung der APP-Spezies
Wenn APP mit einem gegen sein Carboxylende gerichteten Antikörper aus stoffwechselmarkierten PC12-Zellen immungefällt wurde, erschienen sechs Proteinbanden der Molekularmassen 106, 112 116, 125, 139 und 146 kDa (1B). Die drei unteren Banden wurden schon vorher als unreifes APP₆₉₅-, APP₇₅₁- bzw. APP₇₇₀-Holoprotein bezeichnet, und die drei oberen Banden als die entsprechenden reifen APP-Isoformen, in denen die Proteine vollständig N- und O-glykosyliert und sulfatiert sind (13, 20). Durch Verwendung von Mitteln, die die Umwandlung von unreifem in reifes APP hemmen (vgl. nachstehend), und eines gegen eine Kunitz-Serin-Proteaseinhibitor-(KPI)-Domäne der Isoformen APP₇₅₁, und APP₇₇₀ gerichteten monoclonalen Antikörpers, sowie aufgrund der Längen der einzelnen Isoformen wurde die Zuordnung der Proteinbanden bestätigt.
In den immungefällten Zell-Lysaten kommt auch ein Protein der Molekularmasse 16,3 kDa vor (1C). (Diese APP-Spezies wanderte gemeinsam mit dem Alpha-Lactalbumin-Standardmarker, dessen Molekularmasse mit 14,2 kDa angegeben wird; wenn jedoch die Molekularmasse der APP-Spezies durch lineare Regressionsanalyse bestimmt wurde, wie dies bei den APP-Holoproteinen geschah, ergab sich eine Molekularmasse von 16,3 kDa; zwecks Konsistenz wird hier eine Molekularmasse von 13,6 kDa angegeben.) Wie durch seine Proteinsequenzierung bestimmt, repräsentiert dieses verkürzte APP-Fragment das carboxy-terminale Produkt, das aus der normalen intraamyloiden Spaltung des APP entsteht. Die Immunfällung der sieben APP-Spezies mit dem carboxy-terminalen Antikörper könnte durch Präinkubation von Antikörper mit Peptid, das APP_645–694 (APP₆₉₅-Numerierungssystem) entspricht, verhindert werden.
Wenn Kulturmedium mit dem gegen das Aminoende von APP gerichteten Antikörper immungefällt wurde, wurden drei Proteinbanden der Molekularmassen 109, 123 und 129 festgestellt (1D). Die beiden höheren Banden konnten auch mit dem gegen das KPI-Domänen-Insert gerichteten Antikörper gefällt werden. Diese Proteine konnten nicht mit dem anti-carboxy-terminalen Antikörper gefällt werden. Da die Massendifferenz zwischen den reifen APP-Holoproteinen (von denen die sekretierten Formen vermutlich herrühren; vgl. nachstehend) und dem carboxy-terminalen APP-Fragment ziemlich genau mit den Massen der sekretierten Formen übereinstimmen, wurde gefolgert, daß sie die sekretierten Fragmente von APP₆₉₅-, APP₇₅₁ und APP₇₇₀ sind. Es konnten keine sekretierten Formen aus den Zell-Lysaten gewonnen werden, wenn Überstände aus Immunfällungen mit anti-carboxy-terminalem Antikörper mit anti-aminoterminalem Antikörper reinkubiert wurden.
Wirkung von Chloroquin auf saure Organellen
Da über Hinweise auf eine lysosomale APP-Verarbeitung schon vorher berichtet worden ist, wurde die Wirkung von Chloroquin auf den APP-Stoffwechsel untersucht. Chloroquin ist eine schwache Base, die von Zellen aufgenommen wird, wo sie konzentriert wird, und sie neutralisiert saure Organellen, wie Lysosomen. Der hohe pH-Wert dieser Organellen kommt von der Hemmung ihrer säureabhängigen Hydrolasen. Die Neutralisierung des Chloroquins der sauren Organellen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie von Acridinorange-behandelten Zellen in Abwesenheit und in Gegenwart von Chloroquin bestätigt.
Wirkung von Chloroquin auf die Reifung von APP
Am Beginn der Chase-Periode lag fast das ganze markierte APP in der Form von unreifem Holoprotein vor (1B). Innerhalb von etwa 15 Minunten war die Hälfte des unreifen APP in reifes APP umgewandelt (2). Es wurde kein Unterschied in der Reifungsrate zwischen APP₆₉₅ und APP_KPI festgestellt – somit hat Chloroquin praktisch keine Auswirkung auf die APP-Reifung (2).
Wirkung von Chloroquin auf reifes APP-Holoprotein
In unbehandelten Zellen stieg der Spiegel des reifen APP-Holoproteins innerhalb 30 Minuten auf ein Maximum, entsprechend der Umwandlung von unreifem APP in seine vollständig glykosylierte und sulfatierte Form (3). Die Menge der reifen APP-Isoform nahm dann mit einer Halblebensdauer von etwa 90 Minuten ab. Nach 8 Stunden Chase hatten die Spiegel der reifen APP-Isoformen ihre Ausgangswerte erreicht. Die Abnahme der APP-Spiegel im Lauf der Zeit wurde der Umwandlung von reifem APP in sekretierte Formen, sowie auch der proteolytischen Degradation, die nicht mit der Sekretion einhergeht, zugeschrieben.
Wurden die Zellen mit Chloroquin behandelt, ließ sich eine signifikante Auswirkung auf den Umschlag von reifem APP beobachten (3). Die Spiegel von reifem APP-Holoprotein erreichten ihr Maximum 30 Minuten später als bei den Kontrollproben. Die APP-Isoformen waren während 1 bis 8 Stunden Chase etwa in den doppelten Mengen wie in unbehandelten Zellen vorhanden. Die Stärke der Chloroquinwirkung war bei den verschiedenen APP-Isoformen gleich.
Wirkung von Chloroquin auf die APP-Sekretion
In unbehandelten Zellen stiegen die Spiegel der sekretierten APP-Isoformen nach einer kurzen Verzögerung während 1 bis 4 Stunden Chase linear an (4). Bei bis zu 8 Stunden Chase wurde eine geringe oder gar keine weitere Zunahme der APP-Sekretion beobachtet. Die Maximalspiegel des sekretierten APP stellten etwa 14% des Gesamt-APP am Beginn des Chase dar.
Wurden die Zellen mit Chloroquin behandelt, ließ sich praktisch keine Veränderung der APP-Sekretionsrate bei keiner der APP-Isoformen beobachten (4). Der Maximalspiegel der APP-Sekretion war bei Kontrollen und bei Chloroquin-behandelten Proben nach 4 Stunden ungefähr gleich. Nach 6 bis 8 Stunden Chase nahm die rückgewonnene Menge des sekretierten APP in Gegenwart von Chloroquin etwas ab. Diese Abnahme ließ sich auf die proteolytische Degradation im Medium zurückführen, da die Wiedergewinung von sekretiertem APP aus Medium, das in Abwesenheit von Zellen inkubiert wurde, nach 4 Stunden Chase im Lauf der Zeit abnahm. Es zeigte sich, daß Chloroquin die Proteolyse im Medium in einem Ausmaß katalysierte, das mit dem in 4 gezeigten vergleichbar war.
Wirkung von Chloroquin auf das C-terminale APP-Fragment
In unbehandelten Zellen erreichte der Spiegel des carboxy-terminalen APP-Fragments nach 1 Stunde Chase ein Maximum und nahm danach langsam ab (5). Da immer noch reifes APP-Holoprotein degradiert und immer noch sekretiertes APP produziert wurde, wird geschlossen, daß das carboxy-terminale APP-Fragment weiterer proteolytischer Degradation unterworfen wird.
Chloroquin hat eine signifikante Wirkung auf die Rückgewinnung des carboxy-terminalen Fragments. Die maximale Menge von 16,3 kDa APP wurde nach 4 Stunden Chase gefunden. Danach fiel der Spiegel des APP-Fragments mit einer Rate ab, die der bei unbehandelten Zellen beobachteten entspricht. Diese Daten stimmen mit der Annahme überein, daß das carboxy-terminale APP-Fragment nach seiner Spaltung in einem sauren Zellorganell weiter degradiert wird.
Der maximale Spiegel von APP-Fragment entsprach etwa 9% APP-Holoprotein beim Beginn des Chase und 6% sekretiertem APP insgesamt (in relativen Einheiten, die nach der Zahl der Methioninreste korrigiert wurden; vgl. vorstehend). In Gegenwart von Chloroquin betrugen diese Werte 13% bzw. 92%.
Beispiel 2
Wirkung von Ammoniumchlorid, Monensin und Brefeldin A auf die APP-Verarbeitung
Zusätzlich zu der von Chloroquin wurde die Wirkung des lysomotropen Mittels Ammoniumchlorid (50 mM) auf die APP-Verarbeitung geprüft. Ammoniumchlorid hatte auf den APP-Umsatz eine ähnliche Wirkung wie Chloroquin. Jedoch hatte es eine starke Hemmungswirkung auf die APP-Reifung. Wegen seiner komplizierten Wirkungen wurde Ammoniumchlorid nicht weiter untersucht.
Der einwertige Kationen-Ionophor Monensin unterbricht Protonengradienten und alkalisiert damit saure Organellen, darunter auch Lysosomen und die Trans-Golgi-Region. Wenn am Beginn der Chase-Periode Monensin hinzugefügt wurde, inhibierte es den APP-Umsatz in einem Maß, das dem bei Chloroquin und Ammoniumchlorid beobachteten ähnelt. War Monensin vom Anfang der Präinkubationsphase an und während der ganzen Pulse-Chase-Periode vorhanden, hemmte es die APP-Reifung völlig (6A). Ferner wurde kein 16,3 kDa-APP-Fragment oder sekretiertes APP-Fragment zurückgewonnen (6B und 6C).
Das Pilzprodukt Brefeldin A rief eine scheinbare Auflösung des Golgi-Komplexes hervor, indem es die Resorption des cis/medialen Golgi-Apparates in das Endoplasmatische Reticulum verursachte. Wurden die Zellen vom Beginn der Präinkubationsperiode an mit Brefeldin A behandelt, so wurde die normale APP-Reifung gehemmt (6A). Stattdessen wurde eine breite Bande einer Molekularmasse beobachtet, die größer als die des unreifes APP aber kleiner als die des reifen APP war. Da cis/mediale Golgi-Enzyme in Gegenwart von Brefeldin A noch wirken können, auch wenn sie ins Endoplasmatische Reticulum verbracht wurden, ist es wahrscheinlich, daß APP die normale Glykosylierung mitgemacht hat. Brefeldin A verhinderte auch die Sekretion von APP-Fragmenten und die Produktion des carboxy-terminalen Fragments (6B und 6C).

Claims

Verwendung von 2-[5-Ethyltetrahydro-5-[tetrahydro-3-methyl-5-[tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,5-dimethyl-2H-pyran-2-yl]-2-furyl]-2-furyl]-9-hydroxy-β-methoxy-α,τ,2,8-tetramethyl-1,6-dioxaspiro[4.5]decan-7-buttersäure (Monesin) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von Brefeldin A für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 8-(4-Amino-1-methylbutylamino)-6-methoxychinolin (Primaquin) für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 4-Diethylaminobutylamino-7-chlorchinolin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-methylchinolin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 4-[5'-Diethylaminopentyl-(2')-amino]-7-iodchinolin für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 3-Methyl-4-(5'-diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-5,7-dichlorchinolin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von 3-Ethoxy-4-(5-diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verwendung von Methylamin für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Amyloidose im Zusammenhang mit der Alzheimer-Erkrankung.
Verfahren zur Durchmusterung von Mitteln, welche die Bildung von Amyloid modulieren, umfassend das Inkontaktbringen von Säugerzellen mit einem Wirkstoff, von dem vermutet wird, dass dieser zur Modulation oder Beeinflussung der intrazellulären Verteilung und Prozessierung von APP in der Säugerzelle fähig ist, und das Untersuchen dieser Zellen auf Änderung der Verteilung und der Prozessierung von APP, wobei das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 8-(4-Amino-1-methylbutylamino)-6-methoxychinolin (Primaquin), 4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin, 4-Diethylaminobutylamino-7-chlorchinolin, 4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-7-methylchinolin, 4-[5'-Diethylaminopentyl-(2')-amino]-7-iodchinolin, 3-Methyl-4-(5'-diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin, 4-(5'-Diethylaminopentyl-2'-amino)-5,7-dichlorchinolin, 3-Ethoxy-4-(5-diethylaminopentyl-2'-amino)-7-chlorchinolin, 2-[5-Ethyltetrahydro-5-[tetrahydro-3-methyl-5-[tetrahydro-6-hydroxy-6-(hydroxymethyl)-3,5-dimethyl-2H-pyran-2-yl]-2-furyl]-2-furyl]-9-hydroxy-βmethoxy-α,τ,2,8-tetramethyl-1,6-dioxaspiro[4.5]decan-7-buttersäure (Monesin); und Brefeldin A.