JP4246495B2 - マイトゲン活性化蛋白質キナーゼリン酸化に基づくアルツハイマー病診断 - Google Patents
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Description
(a)前記被験者の細胞の指示蛋白質のリン酸化の基礎レベルを測定することと;
(b)前記被験者の細胞をアクチベータ化合物と接触させることと(ここで、前記アクチベータおよび前記指示蛋白質は次ぎのように選択される、即ち、前記アクチベータが前記被験者の細胞中の前記指示蛋白質の異なる活性化したリン酸化応答を、前記接触が開始された後の規定時間に、非アルツハイマーコントロール被験者の細胞における活性化したリン酸化応答と比べて、惹起(elicits)するように選択される);
(c)前記被験者細胞中の前記指示蛋白質の活性化したリン酸化レベルを、接触開始後の規定時間に測定することと;および
(d)工程(a)の基礎リン酸化レベルと、工程(c)で決定した活性化したリン酸化レベルとの比率を計算することと;および
(e)前記規定時間にアルツハイマー病細胞であると判明している細胞およびアルツハイマー病細胞ではないと判明している細胞から測定した予め決定した活性リン酸化比率(activated phosphorylation ratios)と、工程 (d)で計算された比率とを比較することと;を含み、
前記計算された比率と前記アルツハイマー病細胞であると判明している細胞に関して予め決定した比率とを対比して統計学的差異がないならば、前記診断は陽性と判定され、および/または前記計算された比率と前記アルツハイマー病細胞ではないと判明している細胞に関して予め決定した比率とを対比して統計学的差異がないならば、前記診断は陰性と判定される方法である。
指示物質であるカルシウム シグナリング 経路 蛋白質(この蛋白質のリン酸化が前記細胞におけるIP-3R感受性のCa2+ 上昇に関連する)のバックグランドリン酸化レベルを測定することと;
前記被験者の細胞をIP3R アゴニスト(このアゴニストは、アルツハイマー被験者細胞の前記指示蛋白質のリン酸化レベルにおいて、非アルツハイマーコントロール細胞における前記レベルと比べて異なる応答を惹起する)と接触させることにより刺激することと;その後に、
接触させた細胞における前記指示蛋白質の応答リン酸化レベルを測定することと;並びに
前記指示蛋白質の前記応答リン酸化レベルが、前記バックグランドレベルと対比させて、アルツハイマー被験者に又は健常コントロールに由来することが判明している細胞の前記応答レベルに匹敵するかどうかを決定することと、を含む方法である。
(a)前記被験者から細胞を取得することと;
(b)前記細胞の指示蛋白質のリン酸化の基礎レベルを測定することと;
(c)前記細胞と前記指示蛋白質のリン酸化のアクチベータとを接触させることと;
(d)前記接触の開始後の規定時間に前記細胞の指示蛋白質のリン酸化レベルを測定することと;および
(e) 工程(b)で測定した前記レベルに対する工程(d)で測定した前記レベルの第1比率を計算することと、そして、前記第1比率を、予め決定された、アルツハイマー病細胞と判明した細胞から前記規定時間に取得された前記レベルの第2比率およびアルツハイマー病細胞ではないと判明した細胞から前記規定時間に取得された前記レベルの第3比率、と比較することと;を含み、
(i)工程 (e)の前記第1比率と予め決定した第2比率との間に統計学的差異がないならば、前記診断は陽性と判定され、および(ii)工程 (e)の前記第1比率と予め決定した第3比率との間に統計学的差異がないならば、前記診断は陰性と判定される方法である。工程 (d)の規定時間は、工程 (e)の第2比率および第3比率の間の差異が最大となる時間であってもよい。
(a)前記被験者の細胞を、希釈剤中の化合物とインキュベートすることと(ここで、前記化合物はカルシウム シグナリング 経路が媒介する指示蛋白質のリン酸化を刺激し、これによって刺激された細胞が産生される);
(b)工程 (a)の前に、同時に又は後に、前記被験者の同じタイプの細胞を、コントロール 化合物と又は前記希釈剤とインキュベートし、これにより非刺激コントロール細胞を産生することと;
(c)前記刺激された細胞のリン酸化指示蛋白質のレベルを、前記非刺激コントロール細胞のリン酸化指示蛋白質のレベルと比較することと、を含み、
前記非刺激細胞と比べて前記刺激された細胞のリン酸化指示蛋白質の前記レベルの増加が、アルツハイマー病の存在を示す方法である。
(i)前記刺激および/または前記非刺激細胞からの蛋白質サンプルを、前記リン酸化指示蛋白質を認識する抗体と、接触させることと;並びに
(ii)前記抗体の前記指示蛋白質に対する結合を検出することと、を含んでいてもよい。
a)前記被験者の細胞を、指示蛋白質のリン酸化を増加させるアクチベータ化合物で刺激することと、および
b)刺激された細胞における非リン酸化指示蛋白質およびリン酸化指示蛋白質のレベルを、前記被験者の同じタイプの非刺激細胞における非リン酸化指示蛋白質およびリン酸化指示蛋白質のレベルと比較することと、を含んでいてもよく、
ここで、刺激された細胞におけるリン酸化指示蛋白質の非刺激細胞と比べた際の相対的レベルの増加が、アルツハイマー病の存在を示す方法である。
前記被験者の細胞を、イノシトール 1,4,5-三リン酸 (IP3) レセプターを介した細胞内のカルシウム放出を惹起する薬剤と接触させることと、
前記の接触させる工程後の1以上のタイムポイントで前記被験者細胞のMAPK蛋白質のリン酸化量を測定することと、並びに
1以上のタイムポイントでの前記被験者の細胞におけるMAPK 蛋白質のリン酸化量を、非アルツハイマーコントロール被験者の細胞に前記薬剤を接触させた後に同じタイムポイントで測定した前記リン酸化量と比較することと、
を含み、
前記被験者細胞におけるMAPK 蛋白質のリン酸化の前記コントロール細胞と比較した増加が、アルツハイマー病の診断となる方法である。
AD 被験者の試験細胞を、前記接触させる工程の前、途中、または後に、スクリーニングする化合物と接触させることと、前記試験細胞を、イノシトール 1,4,5-三リン酸 (IP3) レセプターを介した細胞内のカルシウム 放出を惹起する薬剤で刺激することと、
前記試験細胞におけるMAPK 蛋白質のリン酸化量を、前記試験細胞を刺激した後の1以上の タイムポイントで測定することと、
前記1以上のタイムポイントでの前記試験細胞におけるMAPK 蛋白質のリン酸化量を、前記化合物と接触させなかったAD 被験者のコントロール細胞における同じ1以上の タイムポイントでのリン酸化量と比較することと、を含む。
AD細胞およびコントロール細胞の指示蛋白質のリン酸化における前記化合物の効果を測定することと、コントロール細胞と比べて、AD細胞において前記指示蛋白質のリン酸化の量および/または持続時間を増加させる化合物を選択することと、を含む。
可能性のある治療化合物(therapeutic compound)を選択することと、
前記可能性のある治療化合物を前記患者に投与することと、そして後に、
前記細胞を前記指示蛋白質のリン酸化を刺激する化合物で活性化した後に、前記患者の細胞のリン酸化指示蛋白質の異常に上昇したレベルの存在または非存在を検出することと、を含み、
かかる上昇したレベルの存在が前記可能性のある治療化合物が前記患者に対して効果がないことを示し、且つかかる上昇したレベルの非存在が前記可能性のある治療化合物が前記患者に対して治療上有用であることを示す、方法である。前記方法は、更に前記被験者のアルツハイマー病を、前記患者に治療上有用であることが示された化合物を投与することにより治療すること又は予防することを含んでいてもよい。
(a)コントロール細胞と比べて前記被験者の細胞のMAPK 蛋白質の異常に上昇したリン酸化を阻害する若しくは阻止する;および/または
(b)前記MAPK 蛋白質の異常に上昇したリン酸化により生じたイベントを阻害する;医薬である。
(a)前記被験者の及び非アルツハイマーコントロール被験者の皮膚繊維芽細胞を、効果的なリン酸化刺激濃度のブラジキニンと接触させることと、
(b)前記被験者細胞のリン酸化されたErk1/2量を、2分、5分、10分、20分、および30分からなる群から選択される1以上の タイムポイントで、リン酸化Erk1/2に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定することと;
(c)非アルツハイマーコントロール被験者の細胞のリン酸化Erk1/2量を、(b)と同じタイムポイント(若しくは複数のタイムポイント)で、リン酸化Erk1/2に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定することと(ここで、工程(b)および(c)の前記リン酸化Erk1/3量は、前記細胞に存在する蛋白質量に対してノルマライズされる);
(d) 前記タイムポイントで前記被験者細胞のリン酸化Erk1/2量と前記コントロール細胞のリン酸化Erk1/2量とを比較することと;を含み、
1以上の前記タイムポイントで前記被験者細胞のリン酸化Erk1/2量の前記コントロール細胞と比較した増加が、アルツハイマー病の診断となる方法である。
(a)AD 被験者の試験皮膚繊維芽細胞を、スクリーニングする化合物と接触させることと;
(b)前記被験者のコントロール 皮膚繊維芽細胞を前記化合物に対するコントロール 薬剤と接触させることと或いは前記コントロール 繊維芽細胞を非存在下で又は前記化合物もしくは前記コントロール 薬剤の何れかの存在下でインキュベーションすることと;
(c)工程 (a)および(b)の前、途中、または後に、前記試験および前記コントロール 繊維芽細胞を、効果的なリン酸化刺激濃度のブラジキニンで刺激することと、
(d)前記試験および前記コントロール 繊維芽細胞におけるリン酸化Erk1/2量を、2分間、5分間、10分間、20分間、および30分間からなる群から選択される1以上の タイムポイントで、リン酸化Erk1/2に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定することと(ここで、前記リン酸化Erk1/3量は、前記試験およびコントロール 繊維芽細胞に存在する蛋白質量に対してノルマライズされる);
(e)前記試験繊維芽細胞におけるリン酸化Erk1/2量と前記コントロール 繊維芽細胞におけるリン酸化Erk1/2量とを比較して、前記化合物が前記コントロール細胞と比較して前記試験細胞におけるErk1/2リン酸化のブラジキニン誘導性の増加を阻害するか又は阻止するかどうかを決定することと;を含み、
前記増加したリン酸化を阻害する又は阻止する化合物は、アルツハイマー病の治療または予防に有用な化合物であると同定される方法である。
家族性 (FAD)および非家族性 (nFAD) AD患者の皮膚繊維芽細胞並びに年齢が適合した コントロール(AC)の保存された皮膚繊維芽細胞は、Coriell Institute for Medical Researchから購入した。培養液は、ウシ胎児血清(FBS ; Bio Fluids)を添加したダルベッコ・モディファイド・イーグルス培地(DMEM; Gibco BRL)を使用した。ブラジキニン、ジフェニルボリックアシッド2−アミノエチルエステル (2ABP;diphenylboric acid 2-aminoethyl ester)、プロテアーゼ及びホスファターゼ インヒビター カクテルはシグマ社から;ビスインドリルマレイミド(BiSM-1;ビスインドリルマレイミド-1)及びLY29400はAlexis社から;PP1はビショップ博士(Dr Anthony Bishop, Princeton University)から入手した。抗リン酸化Erk1/2、抗リン酸化CREB、および抗CREB 抗体はCell シグナルing Technology社から入手した。抗Erk1/2 抗体は、Upstate Biotechnology社から入手した。4-20% SDS-ミニゲルは、Invertrogene Novexから入手した。ニトロセルロース膜は、Schleicher & Schuellより入手した。全てのSDS電気泳動試薬は、バイオラッド社から入手した。スーパーシグナルケミルミネッセント基質キットは、ピアス社から入手した。
家族性 (FAD)および非家族性 (nFAD) 両方のタイプを含むアルツハイマー病患者の、並びに年齢が適合した コントロール(AC)の保存された繊維芽細胞を、DMEM + 10% FBSと共にT-25/T75フラスコ中で維持および継代した。前記細胞を52〜67歳の範囲の被験者から採取した(80%以上のサンプルは男性から採取した)。前記細胞を継代6〜17の間に使用した。
新規に取得した皮膚組織からの繊維芽細胞の採取と培養は以下のように実施した。nFAD患者および年齢が適合した コントロールからパンチバイオプシー皮膚組織を、Copper Ridge Institute (Sykesville, MD)およびJohns Hopkins Hospital (Baltimore, MD)で資格のある担当者が許可されたプロトコールにしたがって採取した。サンプルを1x PBS中に配置し、そして輸送用培地に入れてプロセシングを行う研究室へと輸送した。組織を、輸送用培地から取り出し、PBSでリンスし、そして1mmの外植片に切断した。外植片を、45% FBS並びに100 U/ml ペニシリン及び100 U/ml ストレプトマイシン (Pen/Strep)を含有する3 mlのバイオプシー培地を入れた通気処置(vented)T-25フラスコの成長表面(growth surface)上に個別に移した。前記組織を、10% FBSを含有している2 mlのバイオプシー培地の添加前に24時間37℃で培養した。前記培地を、48時間後に、10% FBSおよびPen/Strepを含有している標準の培養培地5 mlで置換した。前記細胞を、次に上記のように継代し、そして維持した。
繊維芽細胞をBK、および様々なインヒビターで処理した。これらには、IP3 レセプター インヒビター、ジフェニルボリックアシッド 2-アミノエチルエステル(2ABP)、蛋白質キナーゼ C インヒビター ビスインドリルマレイミド I (BiSM-1)、C-src 蛋白質チロシンキナーゼ インヒビター PP1、およびPI3 キナーゼ インヒビター LY294002が含まれる。
細胞ライセートを、等容量の2X SDSサンプルバッファー中で10分間沸騰させた。各サンプルの蛋白質を、4〜20%のミニグラジエントゲル上で分離し、そしてニトロセルロース 膜上に転写した。リン酸化したErk1/2を、スーパーシグナル ECL 検出キットを用い抗リン酸化Erk1/2で検出した。Erk1/2の総量に対するリン酸化Erk1/2量をノルマライズするために、前記抗体でブロットした同じ膜をストリッピングバッファー(62.5 mM Tris-HCl pH6.7,2% SDS および 100 mM 2-メルカプトエタノール)で60℃で45分間ストリップした。0.01% Tween-20を含有している10 mM PBS(pH 7.4)で洗浄した後(3x 10分)、前記膜を抗非リン酸化Erk1/2 抗体でブロットした。これによってゲル中にロードしたErk1/2の総量を計算することが可能である。
リン酸化および非リン酸化Erk1/2(またはCREB)から生じたシグナルを、フジフィルムLAS-1000プラススキャナーでスキャンした。各蛋白質バンドの平均光学濃度を、NIHイメージソフトウエアを用いて測定した。リン酸化Erk1/2シグナルの値を、Erk1/2の総シグナル対してそれぞれノルマライズした。ノルマライズ後、処理細胞から取得したデータを、基礎コントロールのパーセンテージへと変換し、そして統計分析に供試した。
繊維芽細胞を、0.02 mg %ポリリジンでコートしたカバーガラスの表面で成長させた。上記のようにBKでの処理後、細胞を冷PBSで迅速にリンスし、4% ホルムアルデヒド(PBS中)で室温で15分間固定し、PBSで3回(それぞれ5分間)洗浄し、そして0.1% TritonX-100(PBS中)で室温で30分間孔をあけた。10%の通常のウマ血清(PBS中)で室温で30分間インキュベート後、細胞を抗リン酸化Erk1/2 抗体 (1: 200)で4℃で一晩インキュベートした。カバーガラスをPBSで3回洗浄し、そしてフルオレセインラベルした 抗マウス IgG, 1: 200 (Vector Lab)を添加し、そして室温で60分間インキュベートさせた。PBSによる3回の洗浄、そしてベクタシールド(Vector Lab)によるシーリングに続き、細胞中の免疫染色シグナルを蛍光顕微鏡で観察した。蛍光シグナルの強度を、バイオラッドクオンティティーワン(R)ソフトウエア(バイオラッド社)で測定した。繊維芽細胞中のBK レセプターの局在観察のために、モノクローナル 抗 BK B2 抗体を正常な繊維芽細胞に適用し、次にCY5結合抗マウス IgGとインキュベーションし、そして前記細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
[ACおよびAD細胞のErk1/2のBK刺激による活性化]
BKは、コントロール 被験者のヒト 皮膚繊維芽細胞中で顕著であるが、一時的なErk1/2のリン酸化を惹起させた(図1)。リン酸化のピークは、刺激に後の約2.5分で生じ、その後Erk1/2のリン酸化は衰退し、そして刺激後の10分までにコントロールレベルまで戻った。BK処理後の20分で、Erk1/2のリン酸化は、コントロールの68%であった(図1)。しかしながら、ADを有する被験者の細胞では、Erk1/2の増加したリン酸化レベルが、著しく長期化した期間にわたって維持されていた(図1)。
BKは、IP3-感受性ストアからのCa2+ 放出を刺激する(Cruzblanca et al., 1998;Pascale et al., 1999)。本研究では、BK誘導Erk1/2 リン酸化における、Ca2+ 放出(IP3 レセプターからの)の関与を調査した。2ABP(IP-3Rの強力な膜透過型インヒビター)の添加は、ACおよびAD細胞双方のBK刺激によるErk1/2 リン酸化を完全に無効化した(図4A)。二元配置ANOVAにより、処理効果が高度に有意(F1,36 = 187.4, p < 0.0001)であったことが示された。この結果は、Erk1/2のリン酸化およびその後の分子カスケードが、前記細胞におけるIP-3R-感受性 Ca2+ 上昇の下流であることを証明している。
この実験において、ACおよびAD細胞をBKの前に特異的なPKC インヒビター BiSM-1とプレインキュベートした。図4Bに示されるように、BK刺激によるErk1/2のリン酸化は、再度無効化された(ACおよびAD細胞双方ににおいて)。二元配置ANOVAは、有意な処理効果を示した。この結果は、PKC 活性が、ACおよびAD細胞双方におけるErk1/2のBK刺激による活性化に必要とされることを示している。
非レセプター PTKであるC-srcがBKによるErk1/2の活性化に関与しているかどうかを試験するために、ACおよびAD細胞をBK前に10μM PP1でプレインキュベートした。上記の2ABPおよびBiSM-1と同様に、PP1はBK誘導によるErk1/2 リン酸化を完全に阻害した(図4C)。二元配置ANOVAは、有意な処理効果(F1,40 = 234; p < 0.0001)を示した。この結果は、それ故にC-src PTK 活性もBKによるErk1/2の活性化に関与していたことを示している。
PI3 キナーゼ活性がBK刺激によるErk1/2 活性化に関与しているかどうかを試験するためこの研究が実施された。繊維芽細胞をBK前に5μM LY294002とインキュベートした。
CREBの活性化におけるBKの効果(通常はErk1/2の下流)を試験した。図5に示されるように、10 nM BKは、ACおよびAD細胞双方において、高度に有意なCREBのリン酸化を誘導した。増加したリン酸化は、BK 刺激後5分程度で検出され、そして10分で更に増加した(図5A)。二元配置ANOVAは、有意な時間効果を示した(F1,28=14.09, p < 0.001)が、グループ効果は示さなかった。図5Bは、ACおよびAD細胞において、BK処理後の10分で同様に上昇したCREB リン酸化を示している。BK処理は、10分でCREB 蛋白質総量の著しい減少化をも生じた(図5C)(p < 0.001)。要約すると、ACおよびAD細胞の間の総CREBのBK誘導によるCREB リン酸化または減少化において有意差はなかった。
繊維芽細胞をPKC インヒビターであるBiSM-1で治療することにより、BK刺激によるCREB リン酸化を完全に無効化した(図6A)。二元配置ANOVAは、有意な処理効果 (F1,30=53.76, p < 0.0001)を示したが、グループ効果を示されなかった。同様に、c-src インヒビター PP1は、BK刺激によるCREB リン酸化を阻害した(図6B)。これらの結果は、この場合もPKCおよびc-srcの双方が、BKがErk1/2およびCREB双方を活性化するシグナリング 経路に関与していることを示している。PI3 キナーゼ インヒビターであるLY294002は、Erk1/2での効果と同様に、ACにおいてCREB リン酸化を部分的に阻害したが、AD細胞におけるCREB リン酸化に如何なる効果も有していなかった(図6C)。二元配置ANOVAは、有意な処理効果 (F1,30 = 36.23 ; p < 0.0001)およびグループ効果(F1,30=4.7 ; p < 0.05)を示した。
BKに応答して増強したErk1/2およびCREBのリン酸化が、AD細胞上で発現されるBK レセプターの数の増加によるものかどうかを試験するために、ADおよびコントロール AC細胞中のBK レセプター発現を、タイプ 2 BK レセプター (BKb2R)に特異的な抗体を用いたウエスタンブロットにより測定した。レセプター発現に関して有意差は認められなかった。
繊維芽細胞をADおよび他の遺伝疾患の有用なモデルとして使用した、なぜならこれらの細胞(全身に局在する)は、脳の疾患に関連する遺伝的な異常を提示する可能性があるからである。BK レセプターの刺激がAD 繊維芽細胞のMAPK 経路に異常 シグナル伝達を生じさせるという証拠を本研究は提供した。BKは、最も強力な内在性で疼痛性(algesic)の前炎症物質の1つである。BKは、疾患、損傷およびCNS同様に末梢の炎症において必要な重要な機能を担っている。本研究において、BK 刺激は、IP3 レセプターを介したCa2+ 放出に依存する様式で、AD細胞中のErk1/2 リン酸化を増強させ及び長期化させた。この結果は、上昇したIP3感受性 Ca2+ 放出が、BK 刺激後にAD 皮膚繊維芽細胞において検出されたという以前の報告(Gibson et al., 1996; Etcheberrigaray et al., 1998)と整合性のある結果である。しかしながら、このAD Erk1/2の長期化したリン酸化は、BKb2 レセプターまたはErk1/2の増加した発現によるものではなかった。これはこれら2つの蛋白質の発現または濃度が、コントロールとAD細胞とで差がなかったことから確かめられた。ADのBK レセプター および/または IP3 レセプターの特性または感受性に対する特異的な他の変化、加えて、このシグナル伝達 経路に関わる他の分子の変化をも除外することはできない。
Claims (45)
- インビトロ試験で被験者がアルツハイマー病である可能性を予測するためのデータを収集する方法であって、該方法は:
(a)前記被験者の皮膚繊維芽細胞のMAPK蛋白質のリン酸化の基礎レベルを測定する工程と;
(b)前記被験者の細胞をアクチベータ化合物と接触させる工程と(ここで、前記アクチベータ化合物は次ぎのように選択される、即ち、前記アクチベータが前記被験者の細胞中の前記MAPK蛋白質の異なる活性化したリン酸化応答を、接触開始後の規定時間に、非アルツハイマーコントロール被験者の皮膚繊維芽細胞における活性化したリン酸化応答と比べて、惹起するように選択される);
(c)前記被験者の細胞中の前記MAPK蛋白質の活性化したリン酸化レベルを、接触開始後の規定時間に測定する工程と;および
(d)工程(a)のリン酸化の基礎レベルと、工程(c)で決定した活性化したリン酸化レベルとの比率を計算する工程と;および
(e)前記規定時間にアルツハイマー病細胞であると判明している皮膚繊維芽細胞およびアルツハイマー病細胞ではないと判明している皮膚繊維芽細胞から測定した予め決定した活性リン酸化比率と、工程 (d)で計算された比率とを比較する工程と;を具備し、
前記計算された比率と前記アルツハイマー病細胞であると判明している皮膚繊維芽細胞に関して予め決定した比率とを比べて統計学的に差異がないならば、アルツハイマー病である可能性が高いと予測され、および/または前記計算された比率と前記非アルツハイマー病細胞と判明している皮膚繊維芽細胞に関して予め決定した比率とを比べて統計学的差異がないならば、アルツハイマー病である可能性が低いと予測されるデータを収集する方法。 - インビトロ試験で被験者がアルツハイマー病である可能性を予測するためのデータを収集する方法であって、該方法は:
(a)前記被験者の皮膚繊維芽細胞において、MAPK蛋白質のバックグランドのリン酸化レベルを測定することと;
(b)前記被験者の細胞をIP3R アゴニスト(アルツハイマー被験者の皮膚繊維芽細胞の前記MAPK蛋白質のリン酸化レベルにおいて、非アルツハイマーの皮膚繊維芽コントロール細胞における前記レベルと比べて異なる活性化されたリン酸化応答を惹起する)と接触させることにより刺激することと;
(c)その後に、接触させた細胞における前記MAPK蛋白質の応答リン酸化レベルを測定することと;並びに
(d)前記バックグランドレベルと対比させた前記MAPK蛋白質の前記応答リン酸化レベルが、アルツハイマー被験者に又は健常コントロールに由来することが判明している皮膚繊維芽細胞の前記応答レベルに匹敵するかどうかを決定することと;
を含む方法。 - 請求項2に記載の方法であって、最初に細胞の培養物における前記MAPK蛋白質のバックグランドリン酸化レベルを測定することと、次に前記培養物に前記IP3R アゴニストを添加することと、および前記応答リン酸化レベルを測定することと、を含む方法。
- 請求項2に記載の方法であって、細胞の第一アリクウォットにおける前記バックグランドレベルを測定することと、前記細胞の同様のアリクウォットを刺激することと、および前記アリクウォットにおける前記応答レベルを測定することと、を含む方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記測定が免疫アッセイを含む方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記測定が崩壊した細胞の免疫アッセイを含む方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記IP3-Rアゴニストが、ブラジキニン、ボンベシン、コレシストキニン、トロンビン、プロスタグランジン F2α、およびバソプレシンからなる群から選択される方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記アクチベータが、ブラジキニン、ボンベシン、コレシストキニン、トロンビン、プロスタグランジン F2αおよびバソプレシンからなる群から選択される方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記測定が免疫アッセイで実施され、且つ前記被験者の細胞をリン酸化MAPK蛋白質に特異的な抗体と接触させ、これにより前記抗体が前記MAPK蛋白質に結合することが可能となり、前記MAPK蛋白質に結合した前記抗体が検出される方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記免疫アッセイがラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、ケミルミネッセンスアッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイである方法。
- インビトロ試験で被験者がアルツハイマー病である可能性を予測するためのデータを収集する方法であって、該方法は次ぎの工程:
(a)前記被験者の皮膚繊維芽細胞を、希釈剤中の化合物とインキュベートする工程と(ここで、前記化合物はカルシウムシグナリング経路が媒介するMAPK蛋白質のリン酸化を刺激し、これによって刺激された細胞が産生される);
(b)工程(a)の前に、同時に又は後に、前記被験者の同じタイプの細胞をコントロール化合物と又は前記希釈剤とインキュベートし、これにより非刺激コントロール細胞を産生する工程と;
(c)前記刺激された細胞のリン酸化MAPK蛋白質のレベルを前記非刺激コントロール細胞のリン酸化MAPK蛋白質のレベルと比較する工程と;を具備し、
前記非刺激細胞と比べて前記刺激された細胞のリン酸化MAPK蛋白質の前記レベルの増加によって、アルツハイマー病である可能性が高いと予測されるデータを収集する方法。 - 請求項11に記載の方法であって、前記比較する工程(c)が、次ぎの工程:
(i)前記刺激および/または前記非刺激細胞からの蛋白質サンプルを前記リン酸化MAPK蛋白質を認識する抗体と接触させる工程と;および
(ii)前記抗体の前記MAPK蛋白質に対する結合を検出する工程と;
を含む方法。 - 請求項12に記載の方法であって、更に前記刺激および/または前記非刺激細胞からの蛋白質サンプルを前記MAPK蛋白質の非リン酸化形態を認識する抗体と接触させることと、並びに前記抗体と非リン酸化MAPK蛋白質との結合を検出することと、を含む方法。
- 請求項11に記載の方法であって、前記比較する工程が、更に前記刺激および前記非刺激細胞から蛋白質サンプルを取得する工程を含む方法。
- インビトロ試験で被験者がアルツハイマー病である可能性を予測するためのデータを収集する方法であって、該方法は:
前記被験者の皮膚繊維芽細胞を、イノシトール 1,4,5-三リン酸(IP3)レセプターを介した細胞内のカルシウム放出を惹起する薬剤と接触させる工程と、
前記の接触させる工程後の1以上のタイムポイントで前記被験者の細胞のMAPK蛋白質のリン酸化量を測定する工程と、並びに
1以上のタイムポイントでの前記被験者の細胞におけるMAPK 蛋白質のリン酸化量を、非アルツハイマーコントロール被験者の皮膚繊維芽細胞に前記薬剤を接触させた後に同じタイムポイントで測定した前記リン酸化量と比較する工程と、を具備し、
前記被験者の細胞におけるMAPK 蛋白質のリン酸化の前記コントロールの細胞と比較した増加によって、アルツハイマー病である可能性が高いと予測されるデータを収集する方法。 - 請求項15に記載の方法であって、前記薬剤がブラジキニンまたはブラジキニンレセプターアゴニストである方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記薬剤がボンベシンである方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記アゴニストがIP3媒介Ca2+ 放出を誘導するものである方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記MAPK蛋白質がErk1/2である方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記リン酸化量が前記接触させる工程後の1タイムポイントで測定される方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記測定する工程が、
前記接触させる工程の後の第1タイムポイントで前記被験者の細胞の第1アリクウォットにおけるリン酸化量を測定することと、および
前記接触させる工程の後の第2タイムポイントで前記被験者の細胞の第2アリクウォットにおけるリン酸化量を測定することと、
を含む方法。 - 請求項15に記載の方法であって、前記タイムポイントが、1以上の約0.5分、1分、2分、2.5分、5分、10分、20分、および30分から選択される方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記測定する工程が前記被験者の細胞のライセート中のリン酸化を検出することを含む方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記測定する工程がインビトロで実行される方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記測定する工程がゲル電気泳動を含む方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記測定する工程がウエスタンブロッティングを含む方法。
- 請求項26に記載の方法であって、前記ウエスタンブロッティングが抗リン酸化MAP キナーゼ 抗体を使用することを含む方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記リン酸化の増加が1タイムポイントにおけるリン酸化蛋白質の量の上昇である方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記リン酸化の増加がリン酸化蛋白質の持続時間の増加である方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記被験者がアルツハイマー病の臨床徴候を欠失している方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記被験者の細胞を、蛋白質キナーゼ C活性のインヒビター、PI-3 キナーゼ活性のインヒビター、C-src 蛋白質チロシンキナーゼ活性のインヒビター、IP-3 レセプターのインヒビターおよび蛋白質ホスファターゼのインヒビターからなる群から選択される1以上のインヒビターと接触させることを更に含む方法。
- 請求項15に記載の方法であって、前記リン酸化の増加が、前記被験者の細胞を蛋白質キナーゼC活性の、C-src 蛋白質チロシンキナーゼ活性の、PI-3 キナーゼ活性の、およびIP-3 レセプターのインヒビターからなる群から選択されるインヒビターと接触させることによって阻害される方法。
- 請求項32に記載の方法であって、前記インヒビターがBiSM-1、PP1、および2−アミノエトキシジフェニルボラートからなる群から選択される方法。
- 化合物をスクリーニングしてアルツハイマー病の治療または予防に有用な化合物を同定するための方法であって:
AD被験者の皮膚繊維芽細胞の試験細胞を、スクリーニングする化合物と接触させることと、
前記接触させる工程の前、途中、または後に、前記試験細胞を、PKCアクチベータで刺激することと、
前記試験細胞におけるMAPK蛋白質のリン酸化量を、前記試験細胞を刺激した後の1以上の タイムポイントで測定する工程と、
前記1以上のタイムポイントでの前記試験細胞におけるMAPK蛋白質のリン酸化量を、前記化合物と接触させなかったAD被験者の皮膚繊維芽細胞のコントロール細胞における同じ1以上のタイムポイントでのリン酸化量と比較する工程と、並びに増加したリン酸化を阻害または阻止する化合物をリード化合物として承認する工程と、並びに増加したリン酸化を阻害または阻止しない化合物を棄却する工程と、
を含む方法。 - 請求項33に記載の方法であって、前記薬剤がブラジキニンまたはブラジキニンレセプターアゴニストである方法。
- 請求項33に記載の方法であって、前記MAPK蛋白質がErk1/2である方法。
- 請求項33に記載の方法であって、前記接触させる工程の後の1タイムポイントで前記リン酸化量を測定することを含む方法。
- 請求項33に記載の方法であって、前記測定する工程が前記被験者の細胞のライセート中のリン酸化を検出することを含む方法。
- インビトロ試験で被験者がアルツハイマー病である可能性を予測するためのデータを収集する方法であって、
(a)前記被験者の及び非アルツハイマーコントロール被験者の皮膚繊維芽細胞を、効果的なリン酸化刺激濃度のブラジキニンと接触させる工程と;
(b)前記被験者の細胞のリン酸化Erk1/2量を、2分、5分、10分、20分、および30分からなる群から選択される1以上のタイムポイントで、リン酸化Erk1/2に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定する工程と;
(c)非アルツハイマーコントロール被験者の細胞におけるリン酸化Erk1/2量を、(b)と同じタイムポイント(若しくは複数のタイムポイント)で、リン酸化Erk1/2に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定する工程と;(ここで、工程(b)および(c)の前記リン酸化Erk1/2量は、前記細胞に存在する蛋白質量に対してノルマライズされる);
(d) 前記タイムポイントで前記被験者の細胞のリン酸化Erk1/2量と前記コントロール細胞のリン酸化Erk1/2量とを比較する工程と;を具備し、
1以上の前記タイムポイントで前記被験者の細胞のリン酸化Erk1/2量の前記コントロール細胞と比較した増加によって、アルツハイマー病である可能性が高いと予測されるデータを収集する方法。 - 請求項39に記載の方法であって、更に前記被験者の細胞を、
(a)蛋白質キナーゼ C活性のインヒビター BiSM-l;
(b)C-src 蛋白質チロシンキナーゼ活性のインヒビター PP 1;および
(c)IP-3 レセプターのインヒビター 2−アミノエトキシジフェニルボラート;
からなる群から選択される1以上のインヒビターと接触させる工程と、を具備し、
前記コントロール細胞と比較した前記被験者の細胞におけるリン酸化Erk1/2量の前記ブラジキニン誘導性の増加が、前記インヒビターにより減少する方法。 - インビトロ試験で被験者におけるアルツハイマー病の存在を予測するためのデータを収集する方法であって、次ぎの工程:
a)前記被験者の皮膚繊維芽細胞を、MAPK蛋白質のリン酸化を増加させるアクチベータ化合物で刺激する工程と、
b)刺激された細胞における非リン酸化MAPK蛋白質およびリン酸化MAPK蛋白質のレベルを、前記被験者の同じタイプの非刺激細胞における非リン酸化MAPK蛋白質およびリン酸化MAPK蛋白質のレベルと比較する工程と、を具備し、
刺激された細胞におけるリン酸化MAPK蛋白質の非刺激細胞と比べた際の相対的レベルの増加によって、アルツハイマー病の存在する可能性が高いと予測されるデータを収集する方法。 - 化合物をスクリーニングしてアルツハイマー病の治療または予防に有用な化合物を同定するための方法であって、
(a)AD 被験者の試験皮膚繊維芽細胞をスクリーニングする化合物と接触させることと;
(b)前記被験者のコントロール 皮膚繊維芽細胞を前記化合物に対するコントロール 薬剤と接触させることと或いは前記コントロール 繊維芽細胞を非存在下で又は前記化合物もしくは前記コントロール 薬剤の何れかの存在下でインキュベーションすることと;
(c)工程 (a)および(b)の前、途中、または後に、前記試験および前記コントロール 繊維芽細胞を、効果的なリン酸化刺激濃度のブラジキニンで刺激することと、
(d)前記試験および前記コントロール 繊維芽細胞におけるリン酸化Erk1/2量を、2分、5分、10分、20分、および30分からなる群から選択される1以上の タイムポイントで、リン酸化Erk1/2に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティングにより測定することと(ここで、前記リン酸化Erk1/3量は、前記試験およびコントロール 繊維芽細胞に存在する蛋白質量に対してノルマライズされる);
(e)前記試験繊維芽細胞におけるリン酸化Erk1/2量と前記コントロール 繊維芽細胞におけるリン酸化Erk1/2量とを比較して、前記化合物が前記コントロール細胞と比較して前記試験細胞におけるErk1/2リン酸化のブラジキニン誘導性の増加を阻害するか又は阻止するかどうかを決定することと;を含み、
前記増加したリン酸化を阻害する又は阻止する化合物が、アルツハイマー病の治療または予防に有用な化合物であると同定される方法。 - 請求項34に記載の方法であって、前記アクチベータがブラジキニンまたはブラジキニンレセプターアゴニストである方法。
- 請求項34に記載の方法であって、前記MAPK蛋白質がErk1/2である方法。
- 請求項34に記載の方法であって、前記測定する工程が前記被験者の細胞のライセート中のリン酸化を検出することを含む方法。
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