JPH1090263A

JPH1090263A - アルツハイマー病の診断のためのｅｒｋ−１およびｅｒｋ−２の利用

Info

Publication number: JPH1090263A
Application number: JP20040197A
Authority: JP
Inventors: A Nixon Ralf; エイ．ニクソンラルフ
Original assignee: Mclean Hospital Corp
Current assignee: Mclean Hospital Corp
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 1998-04-10

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、アルツハイマー病の診断のための
方法を提供することを課題とする。【解決手段】該方法は、アルツハイマー病患者におい
て変化していることが発見されたERK-１および／または
ERK-2を利用する。アルツハイマー病のための診断用キ
ット、および該疾患に対して有効な治療薬のスクリーニ
ング方法もまた、本発明に含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アルツハイマー病
の診断に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病（AD）は、一般的には
45歳以上の個人に発症しやすい、認識機能の破壊的な損
傷である。ADの原因は不明であり、ADの治療法は未だ存
在しない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
の患者におけるADを診断するための方法を提供すること
である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、アルツハ
イマー病でない個人と比較して、アルツハイマー病患者
から得られる生物学的試料[例えば、脳脊髄液（CSF）]
において、ERK-1およびERK-2のレベルが実質的に上昇し
ていることを示した。本発明者らは、また、ERK-1およ
びERK-2の活性型（リン酸化されている）アイソフォー
ムが、AD患者の脳組織中に非常に豊富に存在することを
示した。

【０００５】

【発明の実施の形態】第一の局面において、本発明は、
ヒトの患者におけるADを診断するための方法を提供す
る。本方法においては、患者の生物学的試料（例えばCS
F）中のERK-1またはERK-2の量を決定し、該疾患を患っ
ていない人と比較する。ERK-1またはERK-2量の実質的な
上昇（例えば、少なくとも400％）は、ADの診断の指標
となる。また、ERK-1またはERK-2のアイソフォームプロ
フィール（例えば、活性型アイソフォームと非活性型ア
イソフォームとの比率）を調べることができ、対照と比
較した、そのプロフィールの有意な変化（例えば、前述
の比率の大きな増加）もまた、ADの指標となる。

【０００６】ERK-1およびERK-2の分析は、ウェスタンブ
ロット分析、ELISA、免疫染色を含む（ただし、それら
に限定されない）イムノアッセイによって達成されう
る。それらの分析には、抗ERK-1抗体または抗ERK-2抗体
の使用が含まれる。

【０００７】本発明は、（１）ERK-1またはERK-2を認識
する一次抗体；および（２）シグナル生成標識に結合し
ており、かつ一次抗体と結合することができるか、また
は一次抗体が結合する部位とは異なるERK部位と結合す
ることのできる二次抗体；を含むキットを用いて実施す
ることができる。シグナル生成標識としては、例えば、
西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファタ
ーゼのような酵素が挙げられるが、これらに限定される
ものではない。好ましくは、酵素およびその基質の両方
がキットに含まれているのがよい。

【０００８】他の局面において、本発明は、アルツハイ
マー病治療薬の候補の有効性を評価する方法を特徴とす
る。この方法において、候補化合物はアルツハイマー病
患者に、最も好ましくはその脳組織中に投与される。こ
れらの患者からのCSF中のERK-1またはERK-2が多数の時
点で分析され（例えば、濃度またはアイソフォーム比率
の測定）、ERKの正常化（例えば、濃度の減少）が化合
物の有効性の指標となる。

【０００９】なお、本明細書において、「ERK-1」およ
び「ERK-2」は、それぞれ、細胞外シグナル制御キナー
ゼ（Extracellular Signal-regulated Kinase）1および
2を意味する。それらは、マイトジェン活性化プロテイ
ン（Mitogen Activated Protein）（または微小管関連
タンパク質2（Microtubule-Associated Protein 2））
キナーゼファミリーに属している。ERK-1およびERK-2に
は、いずれも、活性型アイソフォームおよび非活性型ア
イソフォームが存在する。活性型アイソフォームはリン
酸化されている。特に指定されない限り、「ERK-1」お
よび「ERK-2」は、本明細書において、アイソフォーム
のいずれかまたは全てをさす。

【００１０】「正常」または「対照」は、ADを患ってい
ない個人を意味する。

【００１１】「脳脊髄液」または「CSF」は、「医療の
生理学的基礎（Physiological Basisof Medical Practi
ce）」（eg. J. B. West, WilliamsおよびWilkins、バ
ルチモア、メリーランド州、1985年）で記載されてい
るように、神経系全体を取り囲む液を意味する。脳脊髄
液には、脳室および腰部のCSFが含まれる。

【００１２】「イムノアッセイ」は、抗体の使用を含
む、タンパク質またはペプチドを検出するためのすべて
の方法を意味する。

【００１３】本発明の他の特徴および利点は、以下の実
施例および請求の範囲から明らかとなると思われる。

【００１４】以下に示す分析法は例示のためのものであ
り、本発明の方法を限定するものではない。当業者には
明白である、免疫診断において通常行われる他の適当な
条件の変更や適応は、本発明の精神および範囲に含まれ
る。

【００１５】

【実施例】I. ヒトからの生物学的試料中のERK-1また
はERK-2の分析ヒトからの生物学的試料の採取本発明において用いられるヒトからの生物学的試料に
は、末梢血、脳脊髄液および脳組織が含まれる。これら
の試料を採取する手法は、当技術分野においてよく知ら
れている（例えば、「Appleyardら、1987, Brain 110:
1309」; および「Westerら、1990, J. Neurochem. 54:
1148」を参照）。本実施例では、CSFを死後24時間以内
の脳の側脳室から、16ゲージの脊髄針を用いて採取し
た。試料中の細胞破片を、15,000xｇの遠心処理で除去
した。腰部CSFも、同様の手法で単離することができる
（例えば、メルクマニュアル（The Merck Manual）、17
46〜1748、第12版、D.N. Holvey編、Merck, Sharp, and
Dohne Research Publishing、ニュージャージー、1972
年を参照）。診断の目的で腰部CSFまたは末梢血を利用
することの利点は、それらが生存している患者から得ら
れることである。

【００１６】ERK-1またはERK-2の検出上述の生物学的試料中のERK-1またはERK-2のレベルは、
イムノアッセイを利用することにより測定することがで
きる。これらの分析では、ERK-1と抗ERK-１抗体間の結
合量、または、ERK-2と抗ERK-2抗体間の結合量を測定す
る。その結合量は、抗ERK抗体に直接的に結合した、ま
たは抗ERK抗体に結合する二次抗体に結合した、シグナ
ルを生成する酵素標識、色素標識、放射能標識または蛍
光標識を使用することによって測定される。イムノアッ
セイには、ウェスタンブロットおよびドットブロット分
析、免疫沈降、ELISA（液体試料、例えば腰部CSFに特に
有効）、および免疫染色（固体試料、例えば脳組織に特
に有効）が含まれるが、それらに限定されるものではな
い。これらの分析法のすべては、当業者にはすでに公知
であり、すべての試薬は商業的に入手できる（Harlow
ら、抗体の実験マニュアル（Antibodies, A Laboratory
Manual）、Cold Spring Harbor Press、コールドスプ
リングハーバー、ニューヨーク）。例えば、モノクロー
ナル抗体、ERK-1（C-16）は、「Santa Cruz Biotechnol
ogy, Inc.」（サンタクルス、カリフォルニア州）から
入手できる。この抗体は、ウェスタンブロット分析で、
44kDaのERK-1タンパク質と反応し、程度は弱いが、42kD
aのERK-2タンパク質とも反応する。同社から入手できる
モノクローナル抗体、ERK-2（C-14）もまた、ERK-2の検
出に使用できる。これら2つの抗体は、それらの標的タ
ンパク質の活性型アイソフォームおよび非活性型アイソ
フォームの両方に結合する。その他の抗体は、ERK-1、E
RK-2、またはそれらの免疫原性断片を免疫原として用い
て作製することができる。

【００１７】イムノアッセイは、生物学的試料中のERK-
1およびERK-2のレベルを測定できるのみならず、ERK-1
およびERK-2の活性型アイソフォームと非活性型アイソ
フォームの比率も測定できる。ウェスタンブロット分析
は、その2つのアイソフォームを分離でき、したがって
それらを定量することができるので、特に便利である。
そのような分析法は当技術分野においてよく知られてい
る（CookおよびMcCormick, Science 262: 1069, 199
3）。

【００１８】II. アルツハイマー病の診断のための抗E
RK-1抗体または抗ERK-2抗体の使用ウェスタンブロットイムノアッセイを使用して（上述の
ように；「Takeuchiら、Journal of Neurochemistry 5
8: 1526, 1992」;「Schwagerlら、Journal of Neuroche
mistry 64: 443, 1995」）、本発明者らは、非神経学的
な対照と比較して、アルツハイマー病患者から採取した
脳室CSF中のERK-1およびERK-2のレベルが、実質的に高
い（少なくとも400％）ことを証明した（表１）。脳室C
SF試料は、「Brain Tissue Resource Center, McLean H
ospital」（ベルモント、マサチューセッツ州）から入
手した。70mlのCSFから得られる50〜70mgの全タンパク
質を、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動によってサイズ
分画した。ゲル上のタンパク質を、次にポリビニリデン
ジフルオライド膜（Immobilon-P、Millipore Corp.、ベ
ッドフォード、マサチューセッツ州、米国）にトランス
ファーした。ブロットを、ERK-1 （C-16）またはERK-2
（C-14）抗体と共にインキュベートし、次にそれら一次
抗体と結合する二次抗体と共にインキュベートした。二
次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Amersham）に
結合していた。そのペルオキシダーゼ活性は、いずれの
一次抗体を使用したかに依存して、ブロット上のERK-1
またはERK-2の量に正の相関を示しており、H₂O₂、４-ク
ロロ-１-ナフトールおよびN,N'-ジメチル-p-フェニレン
ジアミンで蛍光検出された。蛍光シグナルは、濃度計で
定量した。

【００１９】

【表１】 ────────────────────────── アルツハイマー病患者対照平均±SEM 平均 ERK-1 11503±2668.1 1585 ERK-2 29051±6582.6 2902 ────────────────────────── 非神経学的対照（精神分裂病、心筋梗塞）：n＝2 アルツハイマー病：n＝6 実験に基づいて、本発明者らは、患者の生物学的試料
（例えば、CSF）中のERK-1および／またはERK-2のレベ
ルが、該疾患を患っていない個人と比較して有意に高い
場合（例えば、少なくとも400％）、それがADの指標と
なると結論づけた。ERK-1およびERK-2レベルは、抗ERK-
1抗体および／または抗ERK-2抗体の使用を含むイムノア
ッセイによって測定することができる。診断は、分析を
実施するのに必要な試薬を含むキットの使用によってよ
り簡便に行うことができる。

【００２０】CSFおよび脳中のERK-1およびERK-2のレベ
ル増加に加えて、AD患者は、脳中のERK-1およびERK-2の
活性型アイソフォームアイソフォームの増加を示した。
したがって、ERK-1またはERK-2の活性型アイソフォーム
の非活性型アイソフォームに対する比率（例えば、増
加）もまた、ADの指標とすることができる。この比率
は、上述のウェスタンブロット分析および他の方法によ
って測定できる。ウェスタンブロット分析は、適当な条
件下で（CookおよびMcCormick, Science 262: 1069, 19
93）、活性型アイソフォーム（リン酸化型）と非活性型
アイソフォーム（脱リン酸化型、したがって速く移動す
る）を分離できるので、好ましい方法である。2つの分
離されたアイソフォームは濃度計で定量することがで
き、その比率が計算できる。ERK-1またはERK-2のアイソ
フォーム比率に基づく診断は、必要な試薬を含むキット
の使用によって、より簡便に行うことができる。

【００２１】III. アルツハイマー病治療薬候補の同定本発明は、アルツハイマー病治療薬候補を同定するため
の方法を提供する。上述のように、ERK-1およびERK-2の
レベルは、アルツハイマー病患者からのCSFおよび脳中
で異常に高い。それゆえに、候補化合物の有効性は、ア
ルツハイマー病患者からの生物学的試料（例えば、CS
F）中の上昇したERK-1および／またはERK-2レベルを減
少させる能力によって、確かめることができる。また、
候補化合物の有効性は、AD患者からの生物学的試料（例
えば、CSFおよび脳組織）中におけるERK-1および／また
はERK-2の活性型アイソフォームと非活性型アイソフォ
ームの比率を正常化する能力によっても確かめられる。
候補化合物は、その化合物に適した方法によって、例え
ば、経口的に、または静脈、非経口、皮膚、粘膜を通し
て、患者に投与することができる。治療用量は、それぞ
れの化合物について特別に決定される。それは、ほとん
どの場合、0.001〜100.0mg/kg体重の範囲内か、または
当業者によって臨床的に適切と判断される範囲内であ
る。

【００２２】

【発明の効果】本発明により、アルツハイマー病患者か
ら得られる生物学的試料[例えば、脳脊髄液（CSF）]に
おいて、アルツハイマー病でない個人と比較して、ERK-
1およびERK-2のレベルが実質的に上昇していること、な
らびにERK-1およびERK-2の活性型（リン酸化されてい
る）アイソフォームが、AD患者の脳組織中に非常に豊富
に存在することが示され、それによりヒト患者において
ADを診断するための方法が提供された。また、アルツハ
イマー病治療薬の候補化合物を、アルツハイマー病患者
に、最も好ましくはその脳組織中に投与し、該患者のCS
F中のERK-1またはERK-2が多数の時点で分析（例えば、
濃度またはアイソフォーム比率の測定）することによ
り、ERKの正常化（例えば、濃度の減少）を指標とし
て、該治療薬の候補の有効性を評価する方法が提供され
た。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者からの生物学的試料中のERK-1を分
析することを含む、対照との比較におけるERK-1の変化
をアルツハイマー病の診断の指標とする、ヒトの患者に
おけるアルツハイマー病の診断方法。
【請求項２】生物学的試料が腰部ＣＳＦである、請求
項１記載の方法。
【請求項３】生物学的試料が脳室ＣＳＦである、請求
項１記載の方法。
【請求項４】生物学的試料が脳組織である、請求項１
記載の方法。
【請求項５】分析が量の測定であり、変化が量の増加
である、請求項１記載の方法。
【請求項６】生物学的試料が腰部ＣＳＦである、請求
項５記載の方法。
【請求項７】生物学的試料が脳室ＣＳＦである、請求
項５記載の方法。
【請求項８】生物学的試料が脳組織である、請求項５
記載の方法。
【請求項９】測定が、ERK-1をERK-1と特異的に結合す
ることのできる抗体と接触させること、および該結合量
を測定することを含むイムノアッセイを利用することに
より行われる、請求項５記載の方法。
【請求項１０】接触がウェスタンブロット分析により
行われる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】接触がＥＬＩＳＡにより行われる、請
求項９記載の方法。
【請求項１２】接触が免疫染色法により行われる、請
求項８記載の方法。
【請求項１３】分析が、活性型アイソフォームの非活
性型アイソフォームに対する比率の測定である、請求項
１記載の方法。
【請求項１４】変化が比率の増加である、請求項１３
記載の方法。
【請求項１５】生物学的試料が脳室または腰部のＣＳ
Ｆである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】生物学的試料が脳組織である、請求項
１３記載の方法。
【請求項１７】測定が、ERK-1をERK-1の活性型アイソ
フォームもしくは非活性型アイソフォームまたはその両
方と特異的に結合することのできる抗体と接触させるこ
と、および該比率を測定することを含むイムノアッセイ
を利用することより行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】接触がウェスタンブロット分析により
行われる、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】 ERK-1の活性型アイソフォームもしく
は非活性型アイソフォームまたはその両方と特異的に結
合することのできる抗体を含有する、アルツハイマー病
のインビトロ診断のためのキット。
【請求項２０】アルツハイマー病と診断された患者へ
化合物を投与すること、および該患者から得られる生物
学的試料中のERK-1を分析することを含む、ERK-1の変化
を該化合物がアルツハイマー病の治療薬となりうること
の指標とする、アルツハイマー病の治療における化合物
の有効性を決定するための方法。
【請求項２１】生物学的試料が腰部または脳室の脳脊
髄液である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】分析が量の測定であり、変化が量の減
少である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】分析が、活性型アイソフォームの非活
性型アイソフォームに対する比率の測定である、請求項
２０記載の方法。
【請求項２４】患者からの生物学的試料中のERK-2を
分析することを含む、対照との比較におけるERK-2の変
化をアルツハイマー病の診断の指標とする、ヒトの患者
におけるアルツハイマー病の診断方法。
【請求項２５】生物学的試料が腰部ＣＳＦである、請
求項２４記載の方法。
【請求項２６】生物学的試料が脳室ＣＳＦである、請
求項２４記載の方法。
【請求項２７】生物学的試料が脳組織である、請求項
２４記載の方法。
【請求項２８】分析が量の測定であり、変化が量の増
加である、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】生物学的試料が腰部ＣＳＦである、請
求項２８記載の方法。
【請求項３０】生物学的試料が脳室ＣＳＦである、請
求項２８記載の方法。
【請求項３１】生物学的試料が脳組織である、請求項
２８記載の方法。
【請求項３２】測定が、ERK-2をERK-2と特異的に結合
することのできる抗体と接触させること、および該結合
量を測定することを含むイムノアッセイを利用すること
により行われる、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】接触がウェスタンブロット分析により
行われる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】接触がＥＬＩＳＡにより行われる、請
求項３２記載の方法。
【請求項３５】接触が免疫染色法により行われる、請
求項３１記載の方法。
【請求項３６】分析が、活性型アイソフォームの非活
性型アイソフォームに対する比率の測定である、請求項
２４記載の方法。
【請求項３７】変化が比率の増加である、請求項３６
記載の方法。
【請求項３８】生物学的試料が脳室または腰部のＣＳ
Ｆである、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】生物学的試料が脳組織である、請求項
３６記載の方法。
【請求項４０】測定が、ERK-2をERK-2の活性型アイソ
フォームもしくは非活性型アイソフォームまたはその両
方と特異的に結合することのできる抗体と接触させるこ
と、および該比率を測定することを含むイムノアッセイ
を利用することにより行われる、請求項３６記載の方
法。
【請求項４１】接触がウェスタンブロット分析により
行われる、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】 ERK-2の活性型アイソフォームもしく
は非活性型アイソフォームまたはその両方と特異的に結
合することのできる抗体を含有する、アルツハイマー病
のインビトロ診断のためのキット。
【請求項４３】アルツハイマー病と診断された患者へ
化合物の投与すること、および該患者から得られる生物
学的試料中のERK-2を分析することを含む、ERK-2の変化
を該化合物がアルツハイマー病の治療薬となりうること
の指標とする、アルツハイマー病の治療における化合物
の有効性を決定するための方法。
【請求項４４】生物学的試料が腰部または脳室の脳脊
髄液である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】分析が量の測定であり、変化が量の減
少である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】分析が、活性型アイソフォームの非活
性型アイソフォームに対する比率の測定である、請求項
４３記載の方法。