JP2012045002A - スクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タウ(tau)タンパク質、特に一対のらせん状フィラメント(paired helical filament, PHF)タウタンパク質のリン酸化を調節し得る物質のスクリーニング方法、およびタウオパシーの治療におけるかかる調節物質の使用を記載する。本アッセイおよび本スクリーニング法は、PHF-タウ中の新規リン酸化部位および新規キナーゼおよび治療上の標的としてのキナーゼ類の組合せの同定、特に、タウタンパク質をリン酸化するキナーゼとしてのカゼインキナーゼ1の同定に基づくものである。
【選択図】なし
Description
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に記載のタウタンパク質、およびタウタンパク質をリン酸化し得るキナーゼを、キナーゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、タウタンパク質の1個または複数の部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度阻害するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に定義のタウタンパク質、およびタウタンパク質を脱リン酸化し得るホスファターゼを、ホスファターゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の部位を脱リン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、タウタンパク質の1個または複数の部位でタウタンパク質の脱リン酸化を促進するか否か、場合によってはどの程度促進するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質の脱リン酸化を促進する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に定義したタウタンパク質、およびカゼインキナーゼ1を、カゼインキナーゼ1が候補物質の不在下でタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、カゼインキナーゼ1によるタウタンパク質の1個または複数の部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度阻害するかを決定するステップと、
(c)1個つまたは複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも1種の候補物質、本明細書に定義したタウタンパク質、カゼインキナーゼ1(CK1)、プロテインキナーゼA(PKA)およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK-3β)を、キナーゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下で接触させるステップと、
(b)候補物質が、キナーゼによるタウタンパク質の1個または複数の部位でのタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度阻害するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法を提供する。
表1には、本発明に至る研究で発見された新規部位と、それらの部位で作用し得るキナーゼをまとめている。表2および表3は、このデータをより詳細に示したものである。
本明細書に記載したアッセイおよびアッセイ方法は、野生型タウタンパク質もしくは完全長タウタンパク質、キナーゼもしくはホスファターゼ、またはそれらの断片、活性部分もしくは誘導体を用いることができる。タウタンパク質の場合、本アッセイで用いられる材料は、上述のように非リン酸化され得るか、あるいは部分的にリン酸化され得る。
新しい薬剤の同定に至る薬剤探索は、主要化合物が発見された前後に、非常に多くの候補物質をスクリーニングすることを含み得ることはよく知られている。これは、薬学研究に非常に経費がかかり、かつ時間を要する要因の1つである。スクリーニング工程を補助する手段は、注目に値する商業上の重要性と有用性を有しているはずである。
AD脳から単離したタウタンパク質内の新規リン酸化部位を見出すために、LC/MS/MS系の方法を用いた。最初に、ヒトのAD脳材料の熱安定性調製物からいわゆるPHF-タウを抽出し、次いでさらに、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。SDS-PAGEを用いて単離し、次いで、ホスホペプチドマッピングを試みた。クーマシー染色バンドを切り出し、還元し、アルキル化し、トリプシン、キモトリプシンおよびエンドプロテアーゼAsp-Nなどの一連のプロテアーゼを用いて酵素的に消化した。次いで、得られたペプチド混合物は、200nl/分の流速でアセトニトリル勾配を用いて溶出されるペプチドを入れた75ミクロンID PepMap逆相カラムを用いて得られるペプチド分離物を用いてQ-TOFミクロ装置を使用してLC/MS/MSにより分析される。
薬剤開発では、化合物が提示した標的に対して効果を有するか否かを示すための簡単な読み取りを備えた迅速なハイスループットアッセイを開発することが望まれている。キナーゼなどの酵素機能を阻害する化合物の場合、改変のレベルを容易に検出し得る方法で、酵素により改変される標的酵素に対する人工的基質を開発することは可能である。阻害化合物の存在において、その基質は改変されず、かつそれは容易に検出することができる。
他の候補阻害剤化合物は、ポリペプチドまたはペプチド断片の三次元構造のモデル化に基づき、かつ合理的な薬剤設計を用いて、特定の分子形状、大きさおよび電荷特性を有する有望な阻害剤化合物を得ることができる。
タウタンパク質のリン酸化または脱リン酸化を調節または作用する物質の同定後、さらにその物質について研究することができる。さらに、その物質を製造し、かつ/または調製(すなわち、薬品、医薬組成物または薬剤などの組成物の製造または製剤化)に用いることができる。これらは個体に投与することができる。
質量分析
データ収集
SDS-PAGEの後、PHF-タウに関係のあるゲルバンドを切り出し、還元し、アルキル化し、トリプシンで消化した。ペプチドは、一連のアセトニトリルおよび水溶液洗浄によりゲル断片から抽出した。抽出物を最初の上清とともにプールし、凍結乾燥した。次いで、各試料を50mMの重炭酸アンモニウム6ml中に再懸濁し、LC/MS/MSにより分析した。クロマトグラフィーによる分離は、Ultimate LC系(Dionex, UK)を用いて実施した。ペプチドは、75mm径C18 PepMapカラムの逆相クロマトグラフィーにより分離した。0.05%ギ酸に溶解したアセトニトリルの勾配を送達して、200nl/分の流速でペプチドを溶出した。ペプチドは、Q-Tofmicro (Micromass,UK)に適したZスプレー源を用いて、エレクトロスプレーイオン化によりイオン化した。この装置は、衝突誘起断片形成によるシークエンシングにおいて、自動切替型でそれらの輝度に基づいた前駆イオンを選択して運転するように設定した。
質量スペクトルデータはピークリストに加工され、Mascotソフトウエア(Matrix Science, UK)を用いて、タウ-6の完全長配列(アミノ酸441個;分子量45847)に対して探索した。リン酸化ペプチドは、探索するパラメーター内の可変的な改変としてリン酸塩を選択することにより同定した。セリン、スレオニンおよびチロシンのリン酸化をすべて検討した。各ペプチド内の改変の正確な位置は、産生された断片イオンのパターンによって決定した(さらなる説明については下記を参照されたい)。
決定的な証拠を取得し、リン酸化の正確な部位を決定すること目的として、逆相クロマトグラフィーによりペプチドを単離し、タンデム型MS/MSによりシークエンスした。これらの実験では、各ホスホペプチドに関係のある前駆イオンを個別に選択し、それを衡突解離(CID)に供した。そのようにして得られた断片イオンはホスホペプチドの配列を示し、改変の部位はその関連断片イオンの分子量によって決定される。反対に、特定のホスホペプチド内のリン酸化の他の可能性のある部位は、MS/MSスペクトル内の他の断片イオンの存在により除外することもできる。
一対のらせん状フィラメント(PHF)タウは、Hangerら(1998)に記載されているようにしてアルツハイマー病脳から精製した。簡単に説明すれば、脳組織をホモゲナイズし、不溶性PHF-タウを分画遠心法により回収した。グアニジン中に可溶化した後、再生バッファーに対して透析し、PHF-タウを陰イオン交換および逆相クロマトグラフィーにより精製した。
最大タウアイソフォーム(2N4R)を発現するプラスミドを用いて、以前Mulotら(1994)に記載されているようにして組換え型ヒトタウを調製し精製した。簡単に説明すれば、2N4Rタウを発現する細菌細胞溶解物を加熱し、遠心分離にかけ非耐熱性タンパク質を除去した。硫酸アンモニウムで上清を分画し、沈殿した原料を可溶化し、バッファーに透析した後、陽イオン交換クロマトグラフィーにかけた。NaClでタンパク質を溶出し、タウを含有する画分をプールし、重炭酸アンモニウムに対して透析した後、凍結乾燥した。
30℃で6時間、3mMのATPの存在下で、組換え型ヒトタウ(40μg/ml)を、各所定濃度で、67U/mlカゼインキナーゼ1(CK1)、67U/mlカゼインキナーゼ2(CK2)、167U/mlサイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)、67U/mlグリコーゲン合成酵素-3β(GSK-3β)、または4種類のキナーゼすべての組合せとインキュベートした。各キナーゼは、New England Biolabsから精製組換え形態で入手した。
PHF-タウまたはインビトロにおけるリン酸化タウタンパク質を10%(wt/vol)ポリアクリルアミドゲル上で単離し、コロイド性クーマシーブルーGで染色した。タウに対応するタンパク質バンドを切り出し、カルバミドメチル化し、タンパク分解酵素(トリプシンまたはAsp-N)で消化した。一連のアセトニトリルおよび水溶液洗浄によりゲル断片からペプチドを抽出し、乾燥させ、50mMの重炭酸アンモニウム中に再懸濁した。
ラットおよびヒトの皮質ニューロンを1〜10分間、Aβペプチド(25〜35)またはリバースAβペプチド(35〜25)で処理した。ホスホチロシンを含有するタンパク質を免疫沈降させ、SDS-PAGEにより単離した。ニューロン培養物および免疫沈降物の熱安定性抽出物のウェスタンブロットをタウに対する抗体で探索した。
PHF-タウで発見した新規部位
今日の文献では、PHF-タウ中に、直接的手段により同定された25個の周知のリン酸化部位(すべてセリンまたはスレオニンである)が報告されている(Hangerら、1998)。さらに、抗体の反応性のみによって同定された2〜3個の部位がある。本発明者らは、PHF-タウにさらに12個のリン酸化部位を見出したが、そのうちの1個はチロシン残基(tyr394)であり、部位の合計は37個になった。新規部位の4個はこれまでに報告されている部位よりもタウ中のアミノ末端にあり、また3個の部位はこれまでに発見されたものよりもカルボキシ末端である。12個の新規部位のうち、4個はタウの選択的スプライス領域中にあり、したがって、特異的タウアイソフォーム中にのみ存在し、これまで同定されたすべてのPHF-タウリン酸化部位は、すべてのタウアイソフォーム中に存在する。PHF-タウ中の12個の新規部位の1個だけ(thr414またはser416のいずれか)が正常な脳由来のタウで検出される(ser416)。
表1も参照されたい。
本発明者らは、Aβペプチドによるニューロンの治療が、タウを含有するニューロンタンパク質のチロシンリン酸化を増加させることを見出した。このAβによって誘導されるホスホチロシンの増加は、タウにおける基本レベルの約4倍であった。
インビトロにおけるPHF-タウリン酸化を再現するために、他の個別のリン酸化部位とプロテインキナーゼの組合せを同定する。タウオパシーに関与したキナーゼとしては、GSK-3α、ERK1およびERK2、cdk5、cdc2キナーゼ、JNK、SAPキナーゼファミリーのいくつかのメンバー(1γ、2a、2b、3、4)、p38MAPキナーゼ、カルモデュリン依存性キナーゼ、PKC、MARK、PKN、PKB、TTK、DYRK、Rhoキナーゼ、およびホスホリラーゼキナーゼが挙げられる。
Claims (52)
- (a)タウタンパク質のリン酸化においてカゼインキナーゼ1の活性を阻害し得る候補化合物、または(b)カゼインキナーゼ1に結合して、タウタンパク質との相互作用を阻害し得る候補化合物のスクリーニングのための、カゼインキナーゼ1またはカゼインキナーゼ1をコードする核酸分子の使用。
- 前記カゼインキナーゼ1が、配列番号1に包含されるアミノ酸1からアミノ酸428に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1の断片または誘導体である、請求項1に記載の使用。
- 前記カゼインキナーゼ1が、配列番号1に包含されるアミノ酸1からアミノ酸428に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1と80%を超える配列同一性を有する、請求項1または2に記載の使用。
- 前記カゼインキナーゼ1をコードする核酸分子が、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、請求項1または2に記載の使用。
- 前記タウタンパク質が一対のらせん状フィラメントタウである、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記タウタンパク質が、配列番号2に包含されるアミノ酸1からアミノ酸441に記載のアミノ酸配列を有する完全長タウタンパク質の断片または誘導体である、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記タウタンパク質が、配列番号2に包含されるアミノ酸1からアミノ酸441に記載のアミノ酸配列を有する完全タウタンパク質と80%を超える配列同一性を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
- タウタンパク質をコードする核酸分子が、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する完全長タウタンパク質をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
- 前記カゼインキナーゼ1が、タウタンパク質の(S46/T50)、S113、S131、T149、T169、S184、S208、(S210/T212)、S214、S237、S238、S241、S258、S262、T263、S285、S289、S305、S341、S352、S356、T361、T373、T386、(S412/S413/T414)、S416、S433、およびS435からなる群から選択される1個または複数の部位でタウタンパク質をリン酸化する、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用。
- 前記タウタンパク質の部位がS262および/またはS356から選択される、請求項9に記載の使用。
- 1個または複数の部位の前記タウタンパク質の部位が、S113、S258、S289、S416、S433、およびS435からなる群から選択される、請求項9に記載の使用。
- 前記スクリーニングが、同時にまたは連続して候補化合物とカゼインキナーゼ1に適用される、候補化合物とキナーゼの組合せとの接触の効果を決定することを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の使用。
- 前記キナーゼの組合せが、カゼインキナーゼ2(CK2)、プロテインキナーゼA(PKA)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3α(GSK-3α)またはグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK-3β)の1種または複数と組み合わせたカゼインキナーゼ1(CK1)を含む、請求項12に記載の使用。
- 前記キナーゼの組合せが、PKAおよびGSK-3βと組み合わせたカゼインキナーゼ1(CK1)を含む、請求項12に記載の使用。
- 前記スクリーニングが、候補化合物がカゼインキナーゼ1による基質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度カゼインキナーゼ1による基質のリン酸化を阻害するかを決定することを含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の使用。
- 前記カゼインキナーゼ1の基質がタウタンパク質またはその断片ではない、請求項15に記載の使用。
- 前記スクリーニングが、最初のスクリーニングで選択された候補化合物が、候補化合物の不在下でカゼインキナーゼ1がタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下において、タウタンパク質のリン酸化を阻害する特性を有しているか否かを確認するステップをさらに含む、請求項15または16に記載の使用。
- 質量分光法または部位特異的認識物質を使用して、タウタンパク質の1個または複数の部位におけるリン酸化の有無または程度を決定する、請求項1から17のいずれか一項に記載の使用。
- 前記部位特異的認識物質がモノクローナル抗体である、請求項18に記載の使用。
- 前記スクリーニングが、複数の基質が固定されている固相を用いて多重アッセイで実施される、請求項1から19のいずれか一項に記載の使用。
- 前記基質がタウタンパク質のリン酸化部位に対応する、請求項20に記載の使用。
- カゼインキナーゼ1(CK1)によるタウタンパク質のリン酸化を阻害し得る物質のスクリーニング方法であって、前記タウタンパク質が1個または複数のリン酸化部位を含み、
(a)カゼインキナーゼ1が候補物質の不在下でタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下で、少なくとも1種の候補物質、タウタンパク質、およびカゼインキナーゼ1を接触させるステップと、
(b)候補物質が、カゼインキナーゼ1によるタウタンパク質の1個または複数の部位でのタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度カゼインキナーゼ1によるタウタンパク質の1個または複数の部位でのタウタンパク質のリン酸化を阻害するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法。 - 前記カゼインキナーゼ1が、配列番号1に包含されるアミノ酸1からアミノ酸428に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1の断片または誘導体である、請求項22に記載の方法。
- 前記カゼインキナーゼ1が、配列番号1に包含されるアミノ酸1からアミノ酸428に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1と80%を超える配列同一性を有する、請求項22または23に記載の方法。
- 前記カゼインキナーゼ1をコードする核酸分子が、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する完全長カゼインキナーゼ1をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、請求項22または23に記載の方法。
- 前記タウタンパク質が一対のらせん状フィラメントタウである、請求項21から25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質が、配列番号3に包含されるアミノ酸1からアミノ酸441に記載のアミノ酸配列を有する完全長タウタンパク質の断片または誘導体である、請求項21から24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質が、配列番号3に包含されるアミノ酸1からアミノ酸441に記載のアミノ酸配列を有する完全タウタンパク質と80%を超える配列同一性を有する、請求項21から27のいずれか一項に記載の方法。
- タウタンパク質をコードする核酸分子が、配列番号3に記載のアミノ酸配列を有する完全長タウタンパク質をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、請求項21から28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記カゼインキナーゼ1が、タウタンパク質の(S46/T50)、S113、S131、T149、T169、S184、S208、(S210/T212)、S214、S237、S238、S241、S258、S262、T263、S285、S289、S305、S341、S352、S356、T361、T373、T386、(S412/S413/T414)、S416、S433、およびS435からなる群から選択される1個または複数の部位でタウタンパク質をリン酸化する、請求項21から29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タウタンパク質の部位がS262および/またはS356から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記1個または複数の部位のタウタンパク質の部位が、S113、S258、S289、S416、S433、およびS435からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 同時にまたは連続して候補物質とカゼインキナーゼ1に適用される、候補物質とキナーゼの組合せとの接触の効果を決定するステップを含む、請求項21から32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キナーゼの組合せが、カゼインキナーゼ2(CK2)、プロテインキナーゼA(PKA)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3α(GSK-3α)またはグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK-3β)の1種または複数と組み合わせたカゼインキナーゼ1(CK1)を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記キナーゼの組合せが、PKAおよびGSK-3βと組み合わせたカゼインキナーゼ1(CK1)を含む、請求項33に記載の方法。
- ステップ(b)で候補物質がカゼインキナーゼ1による基質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度カゼインキナーゼ1による基質のリン酸化を阻害するかを決定するステップを含む、請求項21から35のいずれか一項に記載の方法。
- カゼインキナーゼ1の基質がタウタンパク質またはその断片ではない、請求項36に記載の方法。
- 最初のスクリーニングで選択された候補物質が、候補物質が不在下でカゼインキナーゼ1がタウタンパク質の部位をリン酸化し得る条件下において、タウタンパク質のリン酸化を阻害する特性を有しているか否かを確認するステップをさらに含む、請求項36または37に記載の方法。
- タウタンパク質の1個または複数の部位におけるリン酸化の有無または程度を決定する前記ステップが、リン酸化された部位と非リン酸化部位とを区別可能な質量分光法または部位特異的認識物質を使用する、請求項21から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部位特異的認識物質がモノクローナル抗体である、請求項39に記載の方法。
- 前記スクリーニングが、複数の基質が固定されている固相を用いて多重アッセイで実施される、請求項21から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質がタウタンパク質のリン酸化部位に対応する、請求項41に記載の方法。
- 候補物質をカゼインキナーゼ1の阻害剤として確認した後、候補物質の構造を最適化するさらなるステップを含む、請求項21から42のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項21から43のいずれか一項に記載の方法により候補物質を同定した後、前記物質を製造するさらなるステップ、および/または医薬組成物に前記物質を製剤化するさらなるステップを含む方法。
- (i)請求項1から43のいずれか一項に記載のカゼインキナーゼ1阻害剤を同定するステップと;
(ii)カゼインキナーゼ1阻害剤の構造を最適化するステップと;
(iii)最適化したカゼインキナーゼ1阻害剤を含有する医薬組成物または薬剤を調製するステップと
を含む、医薬組成物または薬剤の調製方法。 - 請求項1から43のいずれか一項に記載の方法により取得可能な物質。
- タウオパシーの治療用薬剤の調製のための請求項46の物質の使用。
- タウオパシーが、アルツハイマー病、第17番染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴った前頭側頭型痴呆(ETDP-17)、進行性核上性麻痺(PSP)、ピック病、大脳皮質基底核変性症、多重系委縮(MSA)、鉄蓄積に伴う神経基底の退化、1型(Hallervorden-Spatz)、嗜銀性グレイン型痴呆、ダウン症候群、石灰化を伴った散在性神経原線維変化、ボクサー痴呆、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン-ピック病タイプC、進行性皮質下グリオーシス、プリオン蛋白質大脳アミロイド脈管障害、神経原線維変化のみを示す痴呆、脳炎後パーキンソニスム、亜急性硬化性汎脳炎、クロイツフェルト-ヤコブ病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソン症候群痴呆複合体、神経原線維変化/痴呆を伴った非グアム型運動ニューロン疾患、およびパーキンソン病である、請求項47に記載の使用。
- (a)Y394に対応する位置のタウタンパク質のリン酸化においてfynの活性を阻害し得るか、あるいは、(b)fynに結合して、Y394のタウタンパク質との相互作用を阻害し得る、fynまたはfynをコードする核酸分子の、候補化合物のスクリーニングにおける使用。
- fynによる位置Y394のリン酸化部位におけるタウタンパク質のリン酸化を阻害し得る物質のスクリーニング方法であって、
(a)fynが候補物質の不在下でタウタンパク質の位置Y394をリン酸化し得る条件下において、少なくとも1種の候補物質、タウタンパク質およびfynを接触させるステップと、
(b)候補物質が、fynによるタウタンパク質の位置Y394でのタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度リン酸化を阻害するかを決定するステップと、
(c)位置Y394でのタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップとを含む方法。 - S68、T69、T71、(T111/S113)、S191、S258、S289、(T414/S416)、T427、S433、S435、およびY394からなる群から選択されるタウタンパク質の1個または複数の部位でキナーゼによるリン酸化を阻害し得る物質のスクリーニング方法であって、
(a)キナーゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の1つまたは複数の部位をリン酸化し得る条件下で、少なくとも1種の候補物質、1個または複数のリン酸化部位を含むタウタンパク質、およびタウタンパク質をリン酸化し得るキナーゼを接触させるステップと、
(b)候補化合物がタウタンパク質の1個または複数でタウタンパク質のリン酸化を阻害するか否か、場合によってはどの程度タウタンパク質の1個または複数でタウタンパク質のリン酸化を阻害するかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質のリン酸化を阻害する候補物質を選択するステップと
を含む方法。 - S68、T69、T71、(T111/S113)、S191、S258、S289、(T414/S416)、T427、S433、S435、およびY394からなる群から選択されるタウタンパク質の1個または複数の部位でホスファターゼによるタウタンパク質の脱リン酸化を促進し得る物質のスクリーニング方法であって、
(a)ホスファターゼが候補物質の不在下でタウタンパク質の1個または複数の部位を脱リン酸化し得る条件下で、少なくとも1種の候補物質、1個または複数のリン酸化部位を含むタウタンパク質、およびタウタンパク質を脱リン酸化し得るホスファターゼを接触させるステップと、
(b)候補物質がタウタンパク質の1個または複数の部位でタウタンパク質の脱リン酸化を促進するか否か、場合によってはどの程度促進するのかを決定するステップと、
(c)1個または複数の前記部位でタウタンパク質の脱リン酸化を促進する候補物質を選択するステップと
を含む方法。
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