JP5058792B2 - スクリーニング方法 - Google Patents
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Description
Williamson et al., 2002 Lee et al., 2004
概して、本発明は、キナーゼとの相互作用を介した、チロシン部位におけるタウタンパク質リン酸化の調節に関する。特に、本発明は、タウタンパク質におけるチロシンリン酸化部位の同定、及びこれら部位の一部を優先的にリン酸化するキナーゼ(例えばチロシンキナーゼ)に関する。これは、候補治療薬に対するスクリーニング方法で用いられ得る、新規治療標的及び相互作用を同定する。1つの側面において、本発明は、PHFタウの394位のチロシンリン酸化における、タンパク質チロシンキナーゼc−Ablが担う役割の同定に基づく。これは、以前には、従来技術で開示されていない。本発明より前の従来技術では、別のSrcファミリータンパク質チロシンキナーゼであるFynにより、394位のチロシンがリン酸化されることが提案されていた。従って、Fynキナーゼの阻害により394位のチロシンを阻害できる化合物のスクリーニングに基づく従来技術のアプローチと比較して、1つの側面において、本発明は、c−Ablの阻害剤であって、AD又は他のタウオパチーの治療に有用である物質に対するスクリーニング方法を提供する。
Fynは、コレステロール及びスフィンゴ脂質に富む細胞膜の領域である脂質ラフトと関連することが知られている。Triton X100などのある種の界面活性剤中、4℃で細胞を可溶化することにより、脂質ラフトを単離することができる。なぜなら、これらのコレステロールに富む領域は不溶性のままであって、その低い浮遊密度により他の細胞成分から分離され得るからである。従って、脂質ラフトは、超遠心分離によるショ糖溶液浮遊法により単離される。さらに、膜へのAβの結合は、少なくとも一部分においてはコレステロールにより媒介され、膜コレステロールレベルの上昇と、神経細胞及び内皮細胞に対するAβ毒性との間には、正の相関が認められることが報告されている(Eckert et al., 2000;Subasinghe et al., 2003;Wang et al., 2001;Yip et al., 2001)。脂質ラフトの構成成分であるフロチリン(flotillin)は、アルツハイマー脳の、濃縮体を有するニューロンに蓄積し、これにより、罹患脳における脂質ラフトの異常性が示され(Girardot et al., 2003)、実際に、アルツハイマー脳から単離された脂質ラフトのタンパク質組成は異常であることが報告されている(Ledesma et al., 2003)。我々は、Aβ神経毒性との関連において、脂質ラフトを研究した。
Fynは、タウとFynとを共トランスフェクションした細胞において、タウをリン酸化することが以前に示されている(Lee et al., 1998)。上述のとおり、我々は、in vitroにおいて、Fyn及びLckが、ヒトタウに存在する5つのチロシンのうち、ヒトタウの4つのチロシン(Y18、Y197、Y310、Y394)をリン酸化することを以前に発見した(Scales et al., 2002)。我々は、現在、5つのチロシンのそれぞれが、フェニルアラニンに個々に突然変異されているか(F18、F29、F197、F310、F394)、又は単一のチロシンのみがそのままであって、他の4つのチロシンがフェニルアラニンに置換されているか(Y18のみ、Y29のみ、Y197のみ、Y310のみ、Y394のみ)のいずれかである、一連のタウ突然変異形態を作製した。
in vitroにおいて、Lckによるタウのリン酸化が、FynのSH2ドメインに対する結合部位をもたらすことを我々は発見した。要約すると、2つ以上のチロシンキナーゼがタウをリン酸化し、異なるキナーゼは、異なるチロシン残基を優先的にリン酸化しており、Aβは、少なくともこれらのキナーゼの一部を活性化できるということを証拠は示している。データはまた、タウのチロシンリン酸化が、少なくとも1つのチロシンキナーゼに対する結合部位をもたらすことも実証しており、これにより、タウが、微小管重合タンパク質としてのその役割に加えて、重要な細胞シグナリングタンパク質であり得るということが示唆される。
− Fyn:Semba, K. et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5459−5463。Genbank NM 002037を参照されたい。2つの主なアイソフォームがある。本発明は、主として、脳で発現しているアイソフォームに関するが、例えばT細胞などの造血細胞で発現している他のアイソフォームにも、本明細書で開示するスクリーニング方法における使用が認められ得る。
− Syk:Law, C. L. et al., J. Biol. Chem. 269, 12310−12319。Genbank L28824を参照されたい。
− c−Abl:Fainstein, E., Einat, M., Gokkel, E., Marcelle, C., Croce, C. M., Gale, R. P. and Canaani, E. (1989) Oncogene 4, 1477−1481。Genbank X16416及びM14752を参照されたい。N末端を伴うが、類似の触媒ドメインを有するいくつかのアイソフォームが存在する。
(a)少なくとも1つの候補物質と、本明細書に開示の1つ又は複数の部位でタウタンパク質をリン酸化できるキナーゼと、前記キナーゼの基質とを接触させる工程;
(b)前記候補物質が、前記キナーゼによる基質のリン酸化を阻害するかどうか、及び任意選択でその程度を測定する工程;及び
(c)前記基質のリン酸化を阻害する前記候補物質を選択する工程、
を含む方法を提供する。
(a)少なくとも1つの候補物質と、本明細書に開示の1つ又は複数の部位でタウタンパク質を脱リン酸化できるホスファターゼと、前記ホスファターゼの基質とを接触させる工程;
(b)前記候補物質が、前記ホスファターゼによる基質の脱リン酸化を促進するかどうか、及び任意選択でその程度を測定する工程;及び
(c)前記基質の脱リン酸化を促進する前記候補物質を選択する工程、
を含む方法を提供する。
(タウタンパク質)
本明細書に開示のアッセイ及びアッセイ方法では、野生型又は全長タウタンパク質、キナーゼ又はホスファターゼ、又はそれらのフラグメント、活性部分、若しくは誘導体を用いることができる。タウタンパク質の場合には、本アッセイで用いられる物質は、上述のとおり、リン酸化されていなくても、部分的にしかリン酸化されていなくてもよい。
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(%G+C)−0.63(%ホルムアミド)−600/#bp(二本鎖)。
新規薬剤の同定につながる製剤研究は、先導化合物が発見される前、及び後であってさえも、非常に多くの候補物質のスクリーニングを伴い得ることが周知である。これが、製剤研究を非常に高価なものにし、その研究に多大な時間を必要とさせる、1つの要因である。スクリーニング工程を助けるための手段は、かなりの商業的重要性及び有用性を有し得る。
LC/MS/MS系ストラテジーを用いて、AD脳から単離されたタウタンパク質内の新規リン酸化部位を発見した。いわゆるPHF−タウを、初めに、ヒトAD脳物質の熱安定性調製物から抽出し、それに続いて、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。SDS−PAGEを用いて分離した後、ついで、ホスホ−ペプチドマッピングを行った。クマシー染色されたバンドを切り出し、還元し、アルキル化し、トリプシン、キモトリプシン、及びエンドプロテイナーゼAsp−Nなどの一連のプロテアーゼを用いて、酵素消化した。ついで、得られたペプチド混合物を、75ミクロンID PepMap逆相カラムを用いて、200nL/分の流速で、アセトニトリルのグラジエントを用いてペプチドを溶離することにより、ペプチドを分離し、Q−TOF micro装置を用いたLC/MS/MSにより分析する。
薬剤開発においては、化合物が、提案される標的に効果を有するかどうかを示すための単純な読み取りを有する、高速ハイスループットアッセイを開発することが望ましい。キナーゼなどの酵素機能を阻害する化合物の場合には、変形レベルを容易に検出できる方法で、酵素により変形される、標的酵素に対する人工基質を開発することが可能である。阻害剤化合物の存在下では基質は変形されず、これもまた容易に検出することができる。
ひとたび、候補化合物が本発明のアッセイ及びスクリーニングで発見されれば、それらは、薬剤としての開発のための模倣化合物の設計に用いられ得る。既知の医薬活性化合物に対する模倣物の設計は、「先導」化合物に基づく医薬品開発への公知のアプローチである。これは、活性化合物を合成することが困難又は高価である場合、又は活性化合物が、特定の投与方法に適さない場合、例えば、ペプチドが、消化管内のプロテアーゼにより急速に分解される傾向にあるために、経口組成物には適さない活性薬剤である場合などに所望され得る。模倣物の設計、合成、及び試験は、通常、標的特性に対する、多数の分子の無作為なスクリーニングを避けるために用いられる。
「阻害剤」という用語は、広義に用いられ、キナーゼの発現又はキナーゼ活性を、部分的又は全体的に、遮断、阻害、又は中和する分子のいずれもがその用語に含まれる。好ましくは、キナーゼ阻害剤は、他のキナーゼに影響を及ぼすことなく、所望のキナーゼの発現又は活性を阻害する、特異的又はほぼ特異的な阻害剤である。
遺伝子のコード配列に相補的な配列である核酸配列(「アンチセンス」核酸)の発現は、その遺伝子由来のタンパク質産物の産生を阻害できる。どのようにしてこれが生じるのかは、正確にはわかっていないが、アンチセンス核酸配列が、細胞内mRNAとハイブリダイズし、二本鎖分子を形成すると考えられている。細胞は、この二本鎖形態のmRNAを翻訳せず、従って、翻訳が阻害される。アンチセンス核酸は、転写阻害及びスプライシング阻害を含む、他の効果を有するかもしれない。
RNA干渉(RNAi)は、動物及び植物における、配列特異的な、転写後遺伝子サイレンシングプロセスであって、サイレンシングされる遺伝子に相同な配列である、二本鎖RNA(dsRNA)により開始される。RNAiは、短い二本鎖RNA分子(低分子干渉RNA、すなわちsiRNA)により媒介される。siRNAは、10〜15bpの短いRNAオリゴヌクレオチドとして、又はsiRNAを産生するためにその後切断される、より長いdsRNAとして、細胞内に導入され得る。RNAは、RNAとして細胞内に導入されてよく、又はDNA若しくはRNAベクターから転写されてもよい。
タウタンパク質のリン酸化又は脱リン酸化を調節するか又はそれらに影響を及ぼす基質の同定後、基質をさらに調べてよい。さらに、例えば、医薬(medicament)、医薬組成物、又は薬剤(drug)などの組成物の調製、すなわち、製造又は配合において、これを製造及び/又は使用してよい。これらは、個体に投与されてよい。
(アルツハイマー脳由来のPHF−タウの精製)
対螺旋状フィラメント(PHF)タウを、Hanger et al, 1998に記載のとおり、アルツハイマー脳から精製した。簡単に述べると、脳組織をホモジナイズし、不溶性PHF−タウを、分画遠心法により回収した。グアニジンでの可溶化及び再生(re−naturing)バッファーに対する透析後、アニオン交換及び逆相クロマトグラフィーにより、PHF−タウを精製した。
単一のチロシンをフェニルアラニンでそれぞれ置換した、5つのタウ構築物を作製するために、QuikChange XL site−directed mutagenesis kit(Stratagene、Amsterdam、The Netherland)を用いた。プライマー(Sigma−Genosisによるカスタム合成)は、以下のとおりであった:18位のチロシンをフェニルアラニンへと変換(タウ構築物Y18Fをもたらす)するためのフォワードプライマー5'−CAC GCT GGG ACG TTC GGG TTG GGG GAC−3'(プライマーA)、及びリバースプライマー5'−GTC CCC CAA CCC GAA CGT CCC AGC GTG−3';29位のチロシンをフェニルアラニンへと変換(Y29Fをもたらす)するためのフォワードプライマー5'−GAT CAG GGG GGC TTC ACC ATG CAC CAA G−3'(プライマーB)、及びリバースプライマー5'−C TTG GTG CAT GGT GAA GCC CCC CTG ATC−3';197位のチロシンをフェニルアラニンへと変換(Y197Fをもたらす)するためのフォワードプライマー5'−GAT CGC AGC GGC TTC AGC AGC CCC GG−3'(プライマーC)、及びリバースプライマー5'−CC GGG GCT GCT GAA GCC GCT GCG ATC−3';310位のチロシンをフェニルアラニンへと変換(Y310Fをもたらす)するためのフォワードプライマー5'−GGC AGT GTG CAA ATA GTC TTC AAA CCA GTT GAC CTG AG−3'(プライマーD)、及びリバースプライマー5'−CT CAG GTC AAC TGG TTT GAA GAC TAT TTG CAC ACT GCC−3';並びに、394位のチロシンをフェニルアラニンへと変換(Y394Fをもたらす)するためのフォワードプライマー5'−GCG GAG ATC GTG TTC AAG TCG CCA GTG G−3'(プライマーE)、及びリバースプライマー5'−C CAC TGG CGA CTT GAA CAC GAT CTC CGC−3'。全長の挿入配列を、それぞれの構築物について決定した(Lark Technologies)。
最も大きなタウアイソフォーム(2N4R)を発現するプラスミドを用いて、以前に記載されたとおりに(Mulot et al., 1994)、組み換えヒトタウを作製し、精製した。簡単に述べると、2N4Rタウを発現する細菌性細胞溶解物を加熱し、遠心分離して、非耐熱性タンパク質を除去した。上清を硫安分画し、沈殿物質をバッファーに可溶化して、透析し、カチオン交換クロマトグラフィーに供した。タンパク質をNaClで溶出し、タウを含む画分をプールし、Mesバッファー(pH 6.25)及び5mMのDTTに対して透析し、凍結貯蔵した。
活性タンパク質キナーゼを含むラット脳抽出物を、以下を含む氷冷バッファー(脳1g当たり2mLのバッファー)でラット脳をホモジナイズすることにより調製した:25mMのTris−HCl(pH 7.5)、5mMのEGTA、2mMのジチオスレイトール(DTT)、2μMのオカダ酸、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤。ホモジネートを、100,000gで1時間遠心分離し、2mMのATP及び10μMのオカダ酸とともに、氷上で30分間インキュベートした。この抽出物(ラット脳上清、RBS)には、7mg/mLのタンパク質が含まれた(Bradford)。
組み換えヒトタウ(1μg)を、30μLのキナーゼバッファー(1mMのATPの存在下、HEPES 50mM pH7.4、10mMのMnCl2)中、50ngのAbl又はSyk(Upstate)のいずれかとともに、30℃、30分間インキュベートした。30μLのSDS−PAGEサンプルバッファーを添加し、反応を停止した。
組み換え2N4Rタウタンパク質(440μg/mL)を、以下とともに30℃でインキュベートした:精製組み換えLck(20〜100μg/mL)、40mMのβ−グリセロホスフェートバッファー(pH 7.5)、3mMのATP、25mMのMgCl2、5mMのMnCl2、1mMのDTT、100μMのEDTA、1mMのオルトバナジン酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤。6時間後、チューブを100℃で5分間加熱し、氷上で10分間冷却し、16000gで10分間遠心分離した。4G10抗ホスホチロシン抗体(Upstate, Inc)及び抗タウ抗体(Dako)を用いて、ウエスタンブロッティングにより、チロシンリン酸化について上清を確認した。
PHF−タウ又はin vitroリン酸化タウタンパク質を、10%(wt/vol)ポリアクリルアミドゲルで分離し、コロイド状のクマシーブルーGで染色した。タウに相当するタンパク質バンドを切り出し、カルバミドメチル化し、タンパク質分解酵素(トリプシン又はAsp−N)で消化した。一連のアセトニトリル及び水性洗浄により、ペプチドをゲル片から抽出し、乾燥し、50mMの重炭酸アンモニウムに再懸濁した。
ラット及びヒトの初代皮質神経細胞培養を、線維状Aβ25〜35又はAβ1〜42で、1〜30分間処理した。1つ80cm2のフラスコから、プロテアーゼ阻害剤を含む25mMのMes(pH 6.5)中、2mLの1%Triton X−100へと細胞を擦り取ることにより、コントロールの未処理神経細胞培養及びAβ処理神経細胞培養から脂質ラフトを調製した。Dounceホモジナイゼーションにより細胞を破砕した。ホモジネートを、25mMのMes、150mMのNaCl(pH6.5)中、2mLの90%ショ糖(w/v)と混合し、12mLの遠心分離管に入れた。ホモジネート混合物を、4mLの35%(w/v)ショ糖溶液、それに続いて4mLの5%(w/v)ショ糖溶液とともに重ねることにより、5〜35%のショ糖のステップ勾配を形成した。ついで、これを、Beckman SW41ローターで、39,000rpm、18時間遠心分離した。それぞれの勾配の上部から、1mLの画分を回収した。脂質ラフト画分は、5%(w/v)ショ糖層と35%(w/v)ショ糖層との界面に分画され、画分4及び5であった。脂質ラフト画分(4及び5)を、10mLのdd H2Oとともに混合し、Beckman SW41ローターで、39,000rpm、2時間遠心分離することにより、脂質ラフト画分を濃縮した。上清を吸引し、残ったペレットを、100μLの2×サンプルバッファーに再懸濁した。脂質ラフトタンパク質のウエスタンブロットを、フロチリンに対する抗体でプローブし、スキャニングデンシトメトリーにより、タンパク質負荷を修正した。抗タウポリクローナル抗体(DAKO)を用いて、脂質ラフトタンパク質のウエスタンブロットをプローブすることにより、脂質ラフト中のタウを検出した。
実験の第一セットにおいて、COS−7細胞を、V5タグのヒトタウ最長アイソフォーム、又はV5タグのタウ変異体であって、1つのチロシンが1つのフェニルアラニンで置換されている構築物(すなわち、Y18F、Y29F、Y197F、Y310F、及びY394F)で、一過的にトランスフェクトした。実験の第二セットにおいて、COS−7細胞を、V5タグのタウ(441)構築物、又はV5タグのタウ変異体であって、1つのチロシンのみがそのままであり、4つの他のチロシンがフェニルアラニンで置換されているもの(すなわち、そのままであるチロシンに従って、Y18のみ、Y29のみ、Y197のみ、Y310のみ、及びY394のみ)で、一過的にトランスフェクトした。
Fyn cDNAは、D. Markby(Sugen, San Francisco)から譲り受け、Src cDNAは、Upstate社(Src cDNA Allelic Pack)のものであり、Abl及びAblΔXB cDNA(SH3ドメインの大部分を欠失している、Ablの構成的活性型)は、Richard A. Van Etten(Molecular Oncology Research Institute, Boston)からのものであり、Syk cDNAは、H. Band(Bringham and Women's Hospital, Boston)から譲り受けた。共トランスフェクション実験のために、CHO細胞を用いた。COS細胞を、V5タグのヒトタウ最長アイソフォーム、及びV5タグのタウ変異体であって、1つのチロシンが1つのフェニルアラニンで置換されている構築物(すなわち、Y18F、Y29F、Y197F、Y310F、及びY394F)で、一過的にトランスフェクトした。全ての実験において、細胞を、エンプティーベクター、又はタンパク質チロシンキナーゼ発現ベクター(Fyn、Src、Abl、又はAblΔXB)で共トランスフェクションした。細胞を採取して、「過バナジン酸で処理された培養細胞における、タウのチロシン残基のリン酸化」のセクションに記載のとおり、免疫沈降及びウエスタン分析を行った。
(PHF−タウで発見された、チロシンリン酸化の新規部位)
現在の文献では、PHF−タウにおいて、直接的手段により同定された25個の既知のリン酸化部位(すべて、セリン又はスレオニン)が報告されている(Hanger et al., 1998)(Morishima−Kawashima et al., 1995)。抗体反応性のみにより同定されている、さらに2〜3個の部位が存在する。抗体標識化に基づき、18位のチロシンが、AD脳におけるPHF−タウの一部でリン酸化されていることが報告されている。我々は、PHF−タウにおいて、さらに12個のリン酸化部位を発見し、そのうちの1つが、チロシン残基(394位のチロシン)であることを発見し、部位の総数を37個にした。我々はまた、394位のチロシンが、ヒト胎児脳から単離されたタウにおいてリン酸化されていることも発見した。
ラット脳の上清を用いた、リン酸化されているタウのタンパク質消化物の質量分析により、多くのセリン及びスレオニンに加えて、310位及び394位のチロシンのリン酸化が実証された。
初代ラット神経細胞培養のAβ25〜35及びAβ1〜42処理により、脂質ラフトの神経タンパク質成分のチロシンリン酸化において、急速な増加がもたらされた。Aβ処理の後、脂質ラフトタンパク質のホスホセリン又はホスホスレオニン含量の増加は、全く観察されなかった。チロシンリン酸化の増加は、脂質ラフトへのFyn、タウ、及びチューブリンの分配(partitioning)の増加に付随した。焦点接着キナーゼ(FAK)レベルは、Aβに反応して、脂質ラフト内で一過的に増加したが、典型的な脂質ラフトタンパク質であるフロチリンのレベルは、変化しないままであった。チロシンキナーゼ阻害剤であるPP2でのチロシンリン酸化の阻害により、脂質ラフトタンパク質のチロシンリン酸化におけるAβ誘導性の増加、及び脂質ラフトへのタウの分配におけるAβ誘導性の増加は無効化された。
1つのチロシン残基がフェニルアラニンに交換されている5つの変異体(Y18F、Y29F、Y197F、Y310F、及びY394F)の第一セットを、COS−7細胞にトランスフェクトし、細胞を過バナジン酸で20分間処理した。4G10抗ホスホチロシン抗体を用いて、免疫沈降したタウにウエスタン分析を行ったところ、Y394F変異構築物が、野生型コントロールのおよそ10%までチロシンリン酸化を低下させるという顕著な効果をもたらす、唯一の単一チロシン変異体であることが示される。Y18F、Y29F、及びY310F構築物のチロシンリン酸化は、野生型コントロールと顕著な差を生じなかった。Y197F変異構築物に関して、チロシンリン酸化の減少が、この構築物を用いて実施された5つの実験のうちの2つで観察されたことが、指摘されるべきである。これらの結果を確認するために、我々は、単独のチロシンとして、ただ1つのチロシン残基が残り、他の4つのチロシンはフェニルアラニンで置換されている(Y18のみ、Y29のみ、Y197のみ、Y310のみ、及びY394のみ)変異体の第二セットを、COS−7細胞にトランスフェクトした。ホスホチロシン抗体を用いた分析により、Y18のみ、Y29のみ、及びY310のみ変異構築物においては、いずれのチロシンリン酸化も、過バナジン酸により誘起され得なかったが、その一方、過バナジン酸は、野生型タウで観察されたものと同様の、Y394のみのチロシンリン酸化の増加を誘起する。Y197のみの変異構築物を用いてなされた4つの実験のうちの2つで、わずかではあるが明確なホスホチシン免疫反応性が検出可能であった。総合すれば、これらの結果から、過バナジン酸処理されたCOS−7細胞におけるタウのチロシンリン酸化の大部分が、394位のチロシンで起こることが示唆される。
野生型タウ、及び1つのチロシン残基がフェニルアラニンに交換されている5つの変異体(Y18F、Y29F、Y197F、Y310F、及びY394F)の第一セットを、エンプティーベクター、又はFyn発現ベクターを用いて、CHO細胞に共トランスフェクションした。4G10ホスホチロシン抗体を用いて、免疫沈降したタウにウエスタン分析を行ったところ、Y18F及びY310F変異構築物が、それぞれ、野生型コントロールのおよそ50%までチロシンリン酸化を低下させるという顕著な効果をもたらす、2つの単一チロシン変異体であることが示される。総合すると、これらの結果から、18位及び310位のチロシンが、Fynによりリン酸化される主な部位であることが示唆される。
野生型タウ、及び1つのチロシン残基がフェニルアラニンに交換されている5つの変異体(Y18F、Y29F、Y197F、Y310F、及びY394F)の第一セットを、エンプティーベクター、又はAblΔXB発現ベクターを用いて、CHO細胞に共トランスフェクションした。4G10ホスホチロシン抗体を用いて、免疫沈降したタウにウエスタン分析を行ったところ、Y394Fが、野生型コントロールのおよそ25%までチロシンリン酸化を低下させるという最も強力な効果を有するチロシン変異体であることが示される。Y197F及びY310F変異構築物もまた、それぞれ、野生型コントロールのおよそ70%までチロシンリン酸化を低下させるという顕著な効果を有する。対照的に、Y18F及びY29F変異構築物では、野生型コントロールとの差は生じなかった。総合すると、これらの結果から、Ablは、主に、394位のチロシンでタウをリン酸化し、このキナーゼにより、197位と310位のチロシンもまたリン酸化されることが示唆される。対照的に、Ablは、18位及び29位のチロシンをリン酸化しない。
野生型タウ、及び1つのチロシン残基がフェニルアラニンに交換されている5つの変異体(Y18F、Y29F、Y197F、Y310F、及びY394F)の第一セットを、エンプティーベクター、又はSyk発現ベクターを用いて、CHO細胞に共トランスフェクションした。4G10ホスホチロシン抗体を用いて、免疫沈降したタウにウエスタン分析を行ったところ、タウの単一変異体(すなわち、1つのチロシンがフェニルアラニンに変異され、他の4つのチロシンはそのまま存在する)は、タウチロシンリン酸化の顕著な低下を全く示さなかったことが示される。Y18のみ、Y29のみ、Y197のみ、又はY394のみの変異体は、それぞれ、野生型で見られたレベルの20〜25%までリン酸化され得、これは、Sykが、これらの部位のそれぞれでタウをリン酸化できることを示している。
グルタチオンビーズに結合されたGST−SH2タンパク質を用いた共沈降実験により、コントロールの非リン酸化タウは、FynのSH2ドメインに結合できないが、チロシンリン酸化タウはFynのSH2ドメイン(アイソフォームB)に結合できることが実証された。
メシル酸イマチニブ、Gleevec(登録商標)、Glivec、以前はCGP 57148B、化学名4−[(4−メチル−1−ピペラジニル)メチル]−N−[4−メチル−3−[[4−(3−ピリジニル)−2−ピリミジニル]アミノ]−フェニル]ベンズアミドメタンスルホン酸塩としても知られる、化合物STI 571は、チロシンタンパク質キナーゼの公知の阻害剤であり、有効な抗白血病薬である。これはAbl選択性であるが、血小板由来増殖因子受容体及びc−Kitを含む、少数の他のチロシンタンパク質キナーゼも阻害する。
我々の仮説は、タウ及び特定のタンパク質チロシンキナーゼの関与を必須とするメカニズムにより、Aβがニューロンに対して神経毒性であるというものであり;恐らく、候補チロシンキナーゼには、Fyn及びAblが含まれるが、他のものが必要とされる場合もある。我々は、Aβへのニューロンの暴露が、1つ又は複数のこれらのキナーゼの活性化を誘起し、ついで、タウがリン酸化され、これにより、例えば、Fynに対するSH2結合部位を含む、他の細胞シグナリングタンパク質に対する結合部位が生じる、というメカニズムを予想する。ついで、チロシンリン酸タウが、病的な量で、細胞膜の脂質ラフト構成成分に結合し、これが、神経変性及び細胞死をもたらす、未知ではあるが有害な細胞シグナリングプロセスを誘引する。
Claims (19)
- チロシンキナーゼによるタウタンパク質のリン酸化を阻害できる物質のスクリーニング方法であって、前記タウタンパク質が1つ又は複数のリン酸化部位を含み、以下の工程:
(a)少なくとも1つの候補物質と、前記タウタンパク質と、チロシンキナーゼとを、前記候補物質の不在下で前記チロシンキナーゼが前記タウタンパク質の部位をリン酸化できるという条件下で、接触させる工程;
(b)前記候補物質が、前記チロシンキナーゼによる前記タウタンパク質の1つ又は複数の部位でのタウタンパク質のリン酸化を阻害するかどうか、及び/又はその阻害の程度を測定する工程;並びに
(c)前記部位の1つ又は複数で前記タウタンパク質のリン酸化を阻害する前記候補物質を選択する工程、
を含み、ここで、前記チロシンキナーゼが、c−Ablである、方法。 - 前記タウタンパク質が、対螺旋状フィラメントタウである、請求項1記載の方法。
- 前記タウタンパク質が、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタウタンパク質のフラグメント又は誘導体である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記タウタンパク質が、配列番号1に示すアミノ酸配列を有するタウタンパク質と、80%を超える配列同一性を有する、請求項1乃至3のいずれか一項記載の方法。
- c−Ablが、タウタンパク質のY197、Y310、及びY394からなる群から選択される1つ又は複数の部位でタウタンパク質をリン酸化する、請求項1乃至4のいずれか一項記載の方法。
- c−Ablが、タウタンパク質のY394でタウタンパク質をリン酸化する、請求項5記載の方法。
- 前記方法が、工程(b)において、前記候補化合物が、前記チロシンキナーゼによる基質のリン酸化を阻害するかどうか、及び/又はその阻害の程度を測定する工程を含む、請求項1乃至6のいずれか一項記載の方法。
- 前記チロシンキナーゼの基質が、タウタンパク質又はそのフラグメントではない、請求項7記載の方法。
- 前記方法が、工程(b)において、前記候補物質が、前記チロシンキナーゼによる基質のリン酸化を阻害するかどうか、及び/又はその阻害の程度を測定する工程を含む、請求項1乃至8のいずれか一項記載の方法。
- 前記チロシンキナーゼの基質が、タウタンパク質又はそのフラグメントではない、請求項9記載の方法。
- 前記方法が、初めのスクリーニングで選択された候補物質が、前記候補物質の不在下で前記チロシンキナーゼが前記タウタンパク質の部位をリン酸化できるという条件下で、前記タウタンパク質のリン酸化を阻害する特性を有するかどうかを確認する工程をさらに含む、請求項9又は10記載の方法。
- 前記タウタンパク質の1つ又は複数の部位でのリン酸化の存在、不在、又は程度を測定する工程が、質量分析、又はリン酸化部位と非リン酸化部位とを区別できる部位特異的に認識する作用物質を用いる、請求項1乃至11のいずれか一項記載の方法。
- 前記部位特異的に認識する作用物質が、モノクローナル抗体である、請求項12記載の方法。
- 前記スクリーニングが、複数の基質が固定された固相を用いた多重アッセイで実施される、請求項1乃至13のいずれか一項記載の方法。
- 前記基質が、タウタンパク質のリン酸化部位に対応する、請求項14記載の方法。
- 前記リン酸化部位が、タウタンパク質のY197、Y310、及びY394からなる群から選択される1つ又は複数の部位である、請求項15記載の方法。
- 前記方法が、前記チロシンキナーゼの阻害剤としての候補物質を同定した後、前記候補物質の構造を最適化するさらなる工程を含む、請求項1乃至16のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1乃至17のいずれか一項記載の方法により候補物質を同定した後、前記物質を製造するさらなる工程、及び/又は医薬組成物中に前記物質を配合するさらなる工程を含む方法。
- 以下の工程:
(i)請求項1乃至17のいずれか一項に規定される、チロシンキナーゼ阻害剤を同定する工程;
(ii)前記チロシンキナーゼ阻害剤の構造を最適化する工程;及び
(iii)前記最適化されたチロシンキナーゼ阻害剤を含む医薬組成物又は医薬を製造する工程、
を含む、医薬組成物又は医薬の製造方法。
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