KR20040086145A - 유사분열 촉진인자-활성화 단백질 키나제 인산화에 근거한알쯔하이머병 진단 - Google Patents

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Abstract

환자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법은 활성인자 화합물로의 자극 후 상기 환자의 세포에서 지시인자 단백질의 인산화 수준이 기초 인산화 수준과 비교해서 비정상적으로 상승되는지를 결정하는 단계를 포함하는데, 여기서 지시인자 단백질은 Erk1/2이고 활성인자 화합물은 예를 들어, 브라디키닌이다.

Description

유사분열 촉진인자-활성화 단백질 키나제 인산화에 근거한 알쯔하이머병 진단{Alzheimer's disease diagnosis based on mitogen-activated protein kinase phosphorylation}
축적된 연구 결과는 알쯔하이머병(AD)의 초기 병인론이, AD 뇌에서의 신경세포 사멸과 흥분성 독성으로부터 비롯되는 산화적 스트레스 수준 증가 및 세포내 칼슘 항상성 교란과 관련이 있는 것으로 지시하고 있다[참조: Putney, 2000; Yoo etal., 2000; Sheehan et al., 1997]. 브라디키닌 수용체의 활성화와 K+채널의 불활성화에 반응하여 말초 세포에서 뿐만 아니라 AD 뇌에서의 세포내 Ca2+수준 상승 증강에 대한 연구 결과가 보고된 바 있다[참조: Ito et al., 1994; Etcheberrigaray et al., 1994; Hirashima et al., 1996; Gibson et al., 1996; Etcheberrigaray et al., 1998]. 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 프레세닐린 1 및 프레세닐린 2(이들의 돌연변이는 AD의 병인론과 연관이 있다)와 같은 중요한 단백질이 IP3 수용체(IP3R)와 리아노딘 수용체-(RYR-) 매개된 세포내 Ca2+항상성 둘 다의 조절장애(dysregulation)를 유발시키는 것으로 보고되었다[참조: Yoo et al., 2000; Leissring et al., 1999; 2000; Mattson et al, 2000; Barrow et al., 2000]. 세포질 Ca2+농도 변화는, 플라크 형성과 관계된 신경독성 42 아미노산 β-아밀로이드 펩티드(APβ) 생성 증가, 신경원섬유 농축체 형성과 관계된 tau 단백질의 과인산화, 및 세포 사멸되기 쉬운 신경세포의 취약성 증가를 포함한, AD의 병태생리의 원인이 되는 것으로 여겨진다.
브라디키닌(BK)은 각종 염증성 질환 과정시 발생되는 강력한 혈관작용성 노나펩티드이다. BK는 특이적 세포막 BK 수용체와 결합하여 이를 활성화시킴으로써, "유사분열 촉진인자 활성화 단백질 키나제"(MAPK; 하기 참조)로서 공지된 단백질의 인산화를 유발시키는 세포내 사건의 케스케이드(cascade)를 촉발시킨다. 단백질의 인산화, 즉 Ser, Thr 또는 Tyr 잔기에의 포스페이트 그룹의 부가는 총괄하여 단백질 키나제로서 공지된 상당 수의 효소에 의해 매개된다. 인산화는 통상적으로, 특정 단백질의 기능을 변형시키고, 통상 이를 활성화시킨다. 항상성은 인산화가 일시적인 과정이고, 기질을 탈인산화시키는 포스파타제 효소에 의해 역전되어야 함을 요한다. 인산화 또는 탈인산화 과정에서의 어떠한 이상(aberration)도 생화학적 경로와 다중 세포 기능을 파괴시킨다. 이러한 파괴로 인해, 특정의 뇌 질병이 유발될 수 있다.
BK에 반응하여 세포내 Ca2+수준이 증가하는 것은 적어도 "2형" BK 수용체(BKb2R), 즉 G-단백질-커플링된 수용체에 의해 매개된다. BKb2R을 BK로써 자극하면 포스포리파제 C(PLC)가 활성화되어, 세포내 Ca2+수준 조절과 관계된 제2의 메신저인 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3)와 디아실글리세롤(DAG)이 생성되고, 단백질 키나제 C(PKC)가 활성화된다. 이러한 PLC/인지질/PKC 경로는 또한, MAPK 경로를 활성화시키는 Ras 시그날링 경로와 상호작용한다. MAPK(또는 MAP 키나제)는 "유사분열 촉진인자 활성화 단백질 키나제"(이의 중요한 구성원이 "세포외 시그날-조절된 키나제" 1형 또는 2형("Erk1/2")이다)로 명명된 효소 계열을 지칭한다[참조: Berridge, 1984; Bassa et al., 1999]. Erk1/2는 다수의 시그날 전달(signal transduction) 경로로부터 시그날을 접수하고, 이는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP)-반응성 요소 결합성 단백질(CREB)을 포함한 수 많은 전사 인자를 통하여 유전자 발현을 조절함으로써 세포 증식과 분화를 유발시키는 경로의 일부분이다.
Erk1/2는 tau의 미세소관-결합성 영역인 Ser262 및 Ser356을 포함한 다중 Ser/Thr 부위[참조: Reynolds et al., 2000]에서 tau 단백질을 인산화시킨다. Ser262의 인산화는 미세소관을 집합시키고 안정화시키는 tau의 능력을 현저하게 손상시킨다[참조: Biernat et al., 1993' Lu et al., 1993]. 산화적 스트레스 증가, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 이상(aberrant) 발현, 및 APβ에 대한 노출은 MAPK의 활성화를 유발시키고[참조: McDonald et al., 1998; Ekinci and Shea, 1999; Grant et al., 1999] tau 인산화를 증강시킨다[참조: Greenberg et al., 1994].
문헌[참조: Young LT et al., Neurosci Lett, 1988, 94:198-202]에서는 AD를 앓는 피험자 10명과 연령상 적합한 대조군 10명으로부터의 부검 뇌에서의 IP3 수용체 결합 부위에 관해 연구하였다. 두정 피질과 해마에서는, [3H]-IP3 결합이 50 내지 70% 상실된 반면, 전두, 후두 및 측두 피질, 미상(caudate) 또는 편도(amygdala)에서는 유의적 변화가 전혀 관찰되지 않았다. 스캐차드(scatchard) 분석 결과, 친화성 변화 보다는 오히려 수용체 밀도 감소가 확인되었다. 또한, 많은 신경전달인자, 호르몬 및 성장 인자가 공동메신저 IP3과 디아실글리세롤(DAG)을 발생시키는 포스파티딜-이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2)의 포스포디에스테라제 가수분해를 자극시키기 위해 막 수용체에서 작용한다. DAG는 PKC를 자극하는 반면, IP3은 초기에, 아마도 소포체로부터의 세포내 칼슘의 방출을 유발시키는 특이적 반응을 활성화시키는 것으로 추정되었다.
초기 연구 자료에는, 간 및 부신 마이크로솜, 및 침투된 호중구 및 간 세포에 대한32P-IP3 결합을 검출하였다고 보고되어 있긴 하지만, 솔로몬 스나이더(Solomon Snyder) 그룹은 IP3 수용체를 처음으로 국재화하고, 분리 및 분석하였으며, 나중에는 이를 클론닝하였다. 문헌[참조: Worley PF et al., Nature 1987; 325:159-161]에는,3H- 및32P-표지된 IP3에 대한 높은 친화도의 선택적인 결합 부위가 말초 조직에서 관찰된 것 보다 100 내지 300배 높은 수준으로 뇌에서 관찰되었다고 보고되어 있다. 이들 수용체는 생리학적으로 관련이 있는 것으로 간주되는데, 이는 IP3 결합 부위에서의 각종 미오이노시톨 동족체의 효능이 마이크로솜으로부터 칼슘을 방출시키는데 있어서의 이들의 효능에 부합되기 때문이다. 뇌 자가방사기록에 의하면, IP3 수용체의 독특한 이종 국재화가 입증되었다. 1988년에, 상기 그룹[참조: Supattapone S et al., J Biol Chem, 1988, 263:1530-1534]은 랫트 소뇌로부터 IP3 수용체를 가용화시키고, 균질하도록 정제시키며, 이를 성상 확인하였다고 보고하였다. 이와 같이 정제된 수용체는 전기영동시 Mr이 260kDa인 하나의 단백질 밴드로서 이동하는 구상 단백질이었다. 문헌[참조: Snyder et al., Cell Calcium, 1989, 10:337-342]에는, 상기 정제된 수용체 단백질에 대한 항혈청을 이용한 면역조직화학 연구가 해당 수용체를, 시냅스 영역 내에서 및 핵 막과 단단히 연합하여 생성되는 조면 소포체의 세분으로 위치시켰다고 고찰되어 있다. IP3 수용체 단백질은 cAMP-의존적 단백질 키나제에 의해 선택적으로 인산화되었다. 이러한 인산화로 인해, 뇌 막으로부터 칼슘을 방출시키는데 있어서의 IP3의 능력이10배 감소되었다. 나중 문헌[참조: Ferris CD et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1991 88:2232-2235]에서는, (단백질 키나제를 억제시킬 수 있는 세정제를 제거하기 위해) 리포솜 내에서 재구성된 정제된 수용체 단백질을 이용한 IP3 수용체의 인산화가 연구되어 있다. IP3 수용체는 단백질 키나제 C(PKC) 및 CaM 키나제 II 뿐만 아니라 단백질 키나제 A(PKA)에 의해 화학량론적으로 인산화되었다. IP3 수용체는 부가적이고 상이한 펩티드 서열을 포함하는 상기 3가지 효소에 의해 촉매된 인산화에 의해 조절된다. (1) Ca2+및 DAG에 의해 자극된 PKC에 의한 인산화 및 (2) Ca2+를 요구하는 CaM 키나제 II에 의한 인산화는, 이노시톨 인지질 전환(turnover) 동안 형성된 Ca2+및 DAG가 IP3 수용체를 조절해주는 수단을 제공해준다. 문헌[참조: Chadwick CC et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1990 87:2132-2136]에는 Mr이 224kDa인 단일 폴리펩티드의 올리고머인 IP3 수용체를 평활근으로부터 분리하는 방법이 기재되어 있다. 문헌[참조: Furuichi T, et al., FEBS Lett, 1990 267:85-88]에서는 마우스 조직에서의 IP3 수용체 mRNA의 분포도에 대해 검사하였다. 이의 농도는 소뇌 조직에서 가장 높다. 적당한 양의 IP3 수용체 mRNA가 다음의 기타 뇌 조직에 존재한다: 흉선, 심장, 폐, 간, 비장, 신장 및 자궁. 소량의 IP3 수용체 mRNA가 골격근 및 고환 조직에서 관찰되었다. 원위치(in situ) 하이브리드화에 따르면, 상당한 양의 IP3 수용체 mRNA가 평활근 세포, 예를 들면, 동맥, 세기관지, 난관 및 자궁의 평활근 세포에 국재되어 있다. 문헌[참조: Ferris CD et al., J Biol Chem, 1992, 267:7036-7041]에는 정제되고 재구성된 IP3 수용체의 세린 자가인산화 과정이 기재되어 있으며, 여기서 특이적 펩티드 기질에 대한 IP3 수용체의 세린 단백질 키나제 활성이 밝혀졌다. 상기 연구가들은 IP3 수용체 단백질과 인산화 활성이 동일한 분자에 존재한다고 결론지었다. 문헌[참조: Ross CA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:4265-4269]에서는 마우스 태반 cDNA 라이브러리로부터 3가지 IP3R cDNA(IP3R-II, -III 및 -IV로 명명됨)를 클로닝하였다. 이들 3가지 모두는 막-스패닝 도메인 M7 및 M8에 있어서, 주로 세포질성 도메인에 분기된 본래의 클로닝된 소뇌 IP3R-I과 강력한 상동성을 나타내었다. 일반적으로, 상기 3가지 부가의 IP3R에 대한 mRNA 수준은 IP3R-I에 대한 것 보다 실질적으로 낮은데, 단 위장관의 경우는 예외인데, 여기서는 이들 수준이 필적할 만하다. 소뇌 푸르키니에(Purkinje) 세포는 2가지 이상, 가능하게는 3가지의 별개의 IP3R을 발현하였는데, 이는 단일 세포 내에서의 IP3 작용의 이원성(heterogeneity)을 제시해준다. 문헌[참조: Sharp AH, Neuroscience, 1993, 53:927-42]에는 면역조직화학 방법을 사용하여 랫트 뇌 및 척수에서의 IP3 수용체의 분포도를 상세히 검사하였다. IP3 수용체는 척수의 후구, 시상 핵 및 배면 각을 포함한 CNS 전반에 걸쳐, 심실주변 기관 및 신경내분비 구조물, 예를 들면, 후지, 맥락막 총, 부교련 기관, 송과체 선 및 뇌하수체 영역에 광범위하게 분포되어 있으면서, 신경세포, 섬유 및 말단에 존재한다. 포스포이노시톨 제2 메신저 시스템에 의해 매개된 Ca2+방출은 다양한 생리학적 과정을 제어하는데 있어 중요하다. 스나이더 그룹에 의한 림프구(T 세포)에서의 IP3 수용체에 관한 연구는 이들 수용체를 혈장 막에 위치시켰다. 시그날변환과 연관이 있는 T 세포 수용체-CD3 복합체의 캡핑은 IP3 수용체를 캡핑시킴으로써 수반되었다. T 세포 상의 IP3 수용체는 증식 반응을 개시하는 Ca2+의 유입에 관여하는 것으로 여겨진다[참조: Khan, AA et al., Science, 1992, 257:815-818].
IP3에 관한 추가의 연구[참조: Wilcox RA et al., Trends Pharmacol Sci, 1998, 19:467-475]에서는 IP3을 발생시키기 위한 PLC의 수용체-매개된 활성화 과정이 포유류 시스템에서 편재성 시그날링 경로라는 사실이 인지되었다. 3가지 IP3 수용체 아유형 단량체 계열은 기능적 4량체를 형성하는데, 이는 IP3 효과인자로서 작용하여, Ca2+이온이 세포내 구획 사이를 이동하도록 해주는 리간드-게이트 채널을 제공해준다. IP3 수용체는 전부는 아니지만 주로 소포체 막 내에 위치하기 때문에, IP3은 각종의 생리학적 및 병태생리학적 현상의 원인이 되는 세포내 저장소(store)로부터 Ca2+를 고정화시키는 제2의 메신저인 것으로 간주된다. 문헌[참조: Patel S et al., Cell Calcium, 1999, 25:247-264]에는 IP3 수용체의 분자상 특성이 고찰되어 있다. 몇 가지 Ca2+-결합성 부위와 Ca2+-칼모둘린-결합 도메인을 I형 IP3 수용체 내에 지도화하였으며, 정제된 소뇌 IP3 수용체에 대한 연구 결과는 제2의 Ca2+-독립적 칼모둘린-결합성 도메인을 제시해주었다. IP3 수용체의 과발현은, 세포 내에 존재하는 개개의 IP3 수용체 이소형(isoform)의 조절과, IP3-의존적 Ca2+시그날의 발생에 있어서의 이들의 역할에 대한 추가의 실마리를 제공해주었다.IP3 수용체는 증식 및 세포소멸과 같은 세포내 과정에 관련될 수 있다. 문헌[참조: Abdel-Latif AA, Exp Biol Med (Maywood) 2001 Mar:226(3):153-63]에는 비혈관성 평활근과 혈관성 평활근 둘 다를 대상으로 한 결과, 각각의 단백질 키나제를 통한 사이클릭 뉴클레오티드 cAMP 및 cGMP와, 효능제-유도된 수축과 관련된 Ca2+-의존적 및 Ca2+-독립적-시그날링 경로 간에 혼선이 있었다는 증거가 제시되어 있다. 이들에는 IP3-Ca2+-CaM-미오신 경쇄 키나제(MLCK) 경로 및 Ca2+-독립적 경로(PKC, MAP 키나제 및 Rho-키나제 포함)가 포함된다. 문헌[참조: Mikoshiba K et al., Sci STKE 2000 Sep 26;2000(51):P]에는 IP3 수용체에 의한 세포내 저장소로부터의 칼슘의 방출 조절과, 이러한 방출 기전이 저장소-작동된 칼슘 채널을 통한 세포외 환경으로부터의 칼슘 유입과 관계가 있다는 것이 기재되어 있다. 상기 저자들은 세포내 및 혈장 막 칼슘 채널의 기능적 및 물리적 커플링 모델을 기술하였다.
AD가 이의 심각한 뇌 손상과 기억력 상실에 대해서 널리 공지되어 있긴 하지만, 그 밖의 신체 상의 병리학적 변화도 현저하게 나타나며, 이는 세포성 수준으로 검출 가능하다. 피부 심부 층에 있는 피부 섬유아세포는 AD 손상의 특징적인 세포성 및 분자상 비정상적 징후를 나타낸다. 피부 섬유아세포는 진단 목적으로 용이하게 수득 가능하고 배양된다[참조: 2000년 8월 22일자로 허여된 미국 특허 제6,107,050호, "Diagnostic Test for Alzheimer's Disease"; 이는 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 그러나, 알쯔하이머병을 진단하기 위한 보다 간단하면서도 경제적이며 정교하면서 신뢰성 있는 방법이 여전히 요구된다.
세포내 Ca2+방출의 활성인자의 차별적 효과를 측정할 수 있다는 것이, 예를 들어, 미국 특허 제6,107,050호로부터 공지되어 있다. 건강한 세포 유형과 알쯔하이머병 세포 유형 둘 다는 저장소로부터의 칼슘 방출을 나타내지만, 알쯔하이머병 세포는 훨씬 더 많은 방출을 나타낸다. Ca2+방출을 측정하기 위한 공지된 방법에는 형광성 지시인자, 흡광 지시인자 또는 Ca2+"패치 클램프(patch clamp)" 전극이 포함되며, 이러한 방법을 진단 목적에 사용할 수 있다. 그러나, 진단, 연구 및 임상 목적을 위해, IP3R 활성인자의 차별적 효과를 측정하기 위한 보다 효과적인 기술에 대한 필요성이 상당히 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 특정 환자의 세포를, 지시인자 단백질의 인산화를 자극하는 특정 화합물로 활성화시킨 후, 상기 환자의 세포 내에 비정상적으로 상승된 수준의 인산화된 지시인자 단백질이 존재 또는 부재하는지를 검출하는 단계(이러한 상승된 수준의 존재는 알쯔하이머병에 대한 양성 진단을 지시한다)를 포함하여, 이러한 환자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법을 제공해준다.
상기 진단 방법은 환자의 세포를 활성인자 화합물로 자극한 후 예정된 시간에 상기 환자의 세포 내에서 지시인자 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계, 및 자극이 없는 기초 인산화 수준과 비교해서 비정상적으로 상승된 자극의 비교 결과를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 (a) 특정 피험자로부터의 세포에서의 지시인자 단백질의 인산화 기초 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 피험자로부터의 세포를 활성인자 화합물과 접촉시키는데, 상기 활성인자 화합물 및 지시인자 단백질은, 상기 접촉을 개시한 후 예정된 시간에 비-알쯔하이머 대조군 피험자로부터의 세포에서 활성화된 인산화 반응과 비교해서 피험자의 세포에서 지시인자 단백질의 활성화된 인산화의 차별적 반응을 상기 활성인자가 유발시키도록 선택되는 단계; (c) 접촉을 개시한 후 예정된 시간에 상기 피험자 세포 내에서 지시인자 단백질의 활성화된 인산화 수준을 측정하는 단계; (d) 단계 (a)의 기초 인산화 수준에 대한, 단계 (c)에서 결정된 활성화된 인산화 수준의 비율을 산정하는 단계; 및 (e) 상기 단계 (d)의 산정 비율을, 예정된 시간에서 공지된 알쯔하이머병 세포로부터 측정된 앞서 결정된 활성화된 인산화 비율 및 공지된 비-알쯔하이머병 세포로부터 측정된 앞서 결정된 활성화된 인산화 비율과 비교하는 단계[상기 산정 비율이 상기 공지된 알쯔하이머병 세포에 대해 앞서 결정된 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 양성이고/이거나 산정 비율이 공지된 비-알쯔하이머병 세포에 대해 앞서 결정된 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 음성이다]를 포함하는, 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법을 제공해준다.
본 발명은 추가로, 피험자의 세포에서, 지시인자 칼슘 시그날링 경로 단백질(이의 인산화는 상기 세포에서 IP-3R-민감성 Ca2+상승과 연관이 있다)의 배경 인산화 수준을 측정하는 단계; 비-알쯔하이머 대조군 세포에서의 수준과 비교해서 알쯔하이머병 피험자의 세포에서 지시인자 단백질의 인산화 수준에 있어서의 차별적 반응을 유발시키는 IP3R 효능제와 접촉시킴으로써, 이러한 피험자의 세포를 자극하는 단계; 그 후, 상기 접촉된 세포 내에서 지시인자 단백질의 반응 인산화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 배경 수준과 비교한 지시인자 단백질의 반응 인산화 수준이 알쯔하이머병 피험자로부터의 세포 또는 건강한 대조군 세포에 대해 공지된 반응 수준에 부합되는지를 결정하는 단계를 포함하여, 상기 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법을 제공해준다.
상기 방법은 먼저, 세포 배양물에서 지시인자 단백질의 배경 인산화 수준을 측정한 다음, IP3R 효능제를 상기 배양물에 가하는 단계; 및 반응 인산화 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 상기 방법은 제1 분취량의 세포에서 배경 수준을 측정하고, 유사한 분취량의 세포를 자극한 다음, 상기 분취량에서 반응 수준을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
활성인자 화합물은 브라디키닌, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α및 바소프레신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 IP3-R 효능제일 수 있다.
상기 세포는 섬유아세포, 볼 점막 세포, 신경세포 및 혈액 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 특정 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법은 (a) 피험자로부터 세포를 수득하는 단계; (b) 상기 세포에서 지시인자 단백질의 기초인산화 수준을 측정하는 단계; (c) 상기 세포를 지시인자 단백질의 인산화 활성인자와 접촉시키는 단계; (d) 상기 접촉 개시 후 예정된 시간에서 상기 세포 내에서의 지시인자 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및 (e) 단계 (b)에서 측정된 수준에 대한 단계 (d)에서 측정된 수준의 제1 비율을 산정하고, 이러한 제1 비율을, 공지된 알쯔하이머병 세포로부터 예정된 시간에 수득된 앞서 결정된 상기 수준의 제2 비율 및 공지된 비-알쯔하이머병 세포로부터 예정된 시간에 수득된 상기 수준의 제3 비율과 비교하는 단계[여기서, (i) 단계 (e)의 제1 비율이 앞서 결정된 제2 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 양성이고 (ii) 단계 (e)의 제1 비율이 앞서 결정된 제3 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 음성이다]를 포함한다. 단계 (d)의 예정된 시간은 단계 (e)의 제2 비율과 제3 비율 간의 차이가 가장 클 때일 수 있다.
본 발명의 방법에서, 측정 단계는 파괴된 세포의 면역검정을 포함할 수 있고, 피험자의 세포를 인산화된 지시인자 단백질에 특이적인 항체와 접촉시킴으로써 상기 항체가 지시인자 단백질과 결합되도록 하여, 지시인자 단백질에 결합된 항체를 검출할 수 있다. 이러한 면역검정은 방사성 면역검정, 웨스턴 블롯 검정, 면역형광성 검정, 효소 면역검정, 면역침전 검정, 화학발광성 검정, 면역조직화학적 검정, 도트 블롯 검정, 또는 슬롯 블롯 검정일 수 있다.
피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 추가의 본 발명의 방법은
(a) 상기 피험자로부터의 세포를, 희석제 중의 특정 화합물(이러한 화합물은 지시인자 단백질의 칼슘 시그날링 경로-매개된 인산화를 자극함으로써, 자극된 세포를 생성시킨다)과 함께 항온처리하는 단계;
(b) 단계 (a) 이전, 이와 동시에 또는 이후에, 상기 피험자로부터의 동일한 유형의 세포를 대조군 화합물 또는 상기 희석제와 함께 항온처리함으로써, 자극되지 않은 대조군 세포를 생성시키는 단계; 및
(c) 자극된 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 수준을, 자극되지 않은 대조군 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 수준과 비교하는 단계[여기서, 자극되지 않은 세포와 비교해서 자극된 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 수준 증가는 알쯔하이머병의 존재를 지시해준다]를 포함한다.
비교 단계 (c)는 다음 단계들을 포함할 수 있다: (i) 상기 자극된 세포 및/또는 자극되지 않은 세포로부터의 단백질 샘플을, 인산화된 지시인자 단백질을 인식하는 항체와 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 지시인자 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계.
상기 방법은 상기 자극된 세포 및/또는 자극되지 않은 세포로부터의 단백질 샘플을, 인산화되지 않은 형태의 지시인자 단백질을 인식하는 항체와 접촉시키는 단계; 및 인산화되지 않은 지시인자 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 검출하고, 단백질 수준을 표준화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 비교 단계는 상기 자극된 세포 및 자극되지 않은 세포로부터 단백질 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
피험자에게서 알쯔하이머병의 존재 여부를 진단하는 방법은 a) 상기 피험자로부터의 세포를, 지시인자 단백질의 인산화를 증가시키는 활성인자 화합물로 자극시키는 단계; 및 b) 자극된 세포에서의 인산화되지 않은 지시인자 단백질 및 인산화된 지시인자 단백질의 수준을, 상기 피험자로부터의 동일한 유형의 자극되지 않은 세포에서의 인산화되지 않은 지시인자 단백질 및 인산화된 지시인자 단백질의 수준과 비교하는 단계[여기서, 자극되지 않은 세포와 비교해서 자극된 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 상대적 수준 증가는 알쯔하이머병이 존재한다는 것을 지시한다]를 포함할 수 있다.
본 발명은 특정 피험자로부터의 세포를, 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 수용체를 통하여 세포내 칼슘 방출을 촉발시키는 제제와 접촉시키는 단계; 이러한 접촉 단계 후 1회 이상의 시점에서 상기 피험자의 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을 측정하는 단계; 및 1회 이상의 시점에서 상기 피험자의 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을, 대조군 세포를 상기 제제와 접촉시킨 후 동일한 시점에서 비-알쯔하이머 대조군 피험자로부터의 세포에서의 인산화 양을 비교하는 단계[여기서, 대조군 세포와 비교하여 피험자의 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양의 증가는 알쯔하이머병의 진단지표이다]를 포함하여, 상기 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법을 제공해준다.
본 발명의 방법에서, 상기 제제는 브라디키닌 또는 브라디키닌 수용체 효능제, 또는 봄베신일 수 있고, 이는 IP3-매개된 Ca2+방출을 유도하는 효능제일 수 있다.
인산화 양은 접촉 단계 후 단일 시점에서 측정할 수 있다. 본 발명에 따르면, 측정 단계는 접촉 단계 후 제1 시점에서 상기 피험자의 제1 분취량에서의 인산화 양을 측정하고; 접촉 단계 후 제2 시점에서 상기 피험자의 제2 분취량에서의 인산화 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 시점은 세포 유형, 활성인자 및 지시인자 단백질의 몇몇 조합물에 대해 약 0.5분 이하, 1분, 2분, 2.5분, 5분, 10분, 20분, 30분, 45분 또는 1시간 이상일 수 있다.
상기 세포는 전형적으로 말초 조직으로부터 유래된 것, 예를 들면, 피부 섬유아세포일 수 있다.
본 발명의 방법에서의 측정 단계는 시험관 내에서 피험자의 세포의 용해물에서 인산화를 측정하는 것을 임의로 포함하고, 항-포스포-MAPK 항체 및/또는 항-레귤러 MAPK 단백질 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅, 전기영동을 포함할 수 있다.
인산화 증가는 단일 시점에서의 인산화된 단백질의 양 상승일 수 있거나 또는 인산화된 단백질의 존속 기간 증가일 수 있다.
상기 방법은 알쯔하이머병의 임상적 징후가 결여된 피험자를 진단하는데 유효하다.
본 발명에 따르면, 상기 방법은 피험자의 세포를, 단백질 키나제 C 활성 억제제, PI-3 키나제 활성 억제제, C-src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제, IP-3 수용체의 억제제 및 단백질 포스파타제의 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 억제제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 특히 구별되는 양태를 특징화함으로써, 당해 방법은 피험자의 세포를, 단백질 키나제 C 활성 억제제, C-src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제, PI-3 키나제 활성 억제제 및 IP-3 수용체의 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 억제제와 접촉시킴으로써 억제된 인산화 증가를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 방법에서는, 상기 억제제가 BiSM-1, PP1 및 2-아미노에톡시디페닐 보레이트로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로,
AD 피험자로부터의 시험 세포를, 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계;
이러한 접촉 단계 전, 동안 또는 후에, 상기 시험 세포를, 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 수용체를 통하여 세포내 칼슘 방출을 촉발시키는 제제로 자극하는 단계;
상기 시험 세포의 자극 후 1회 이상의 시점에서 시험 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을 측정하는 단계; 및
1회 이상의 시점에서 시험 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을, 상기 화합물과 접촉되지 않은 AD 피험자로부터의 대조군 세포에서 동일한 1회 이상의 시점에서 인산화의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 알쯔하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 선도(lead) 화합물로서 인산화 증가를 억제 또는 방지하는 화합물을 채택하는 단계; 인산화 증가를 억제 또는 방지하지 않는 화합물을 거부하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 방법에서와 같이, 상기 제제는 브라디키닌 또는 브라디키닌 수용체 효능제일 수 있고, MAPK 단백질은 Erk1/2일 수있다. 상기 방법은 접촉 단계 후 단일 시점에서 인산화의 양을 측정하는 것을 포함할 수 있다.
추가의 양태는 자극-반응 검정에서 활성인자 화합물로서 유용한지를 알아보기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하는데, 이는 AD 세포 및 대조군 세포에서 지시인자 단백질의 인산화에 대한 상기 화합물의 효과를 측정하는 단계; 및 대조군 세포와 비교하여, AD 세포에서의 양 및/또는 존속 기간에 있어서 지시인자 단백질의 인산화를 증가시키는 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 항-포스포-MAPK 단백질 항체와 브라디키닌을 포함하는, 알쯔하이머병용 진단 시험 키트이다.
한 양태는 가능한 치료학적 화합물을 선별하는 단계; 이러한 가능한 치료학적 화합물을 알쯔하이머병 환자에게 투여하는 단계; 및 지시인자 단백질의 인산화를 자극시키는 화합물로 상기 세포를 활성화시킨 후, 상기 환자의 세포에서 인산화된 지시인자 단백질의 비정상적으로 상승된 수준의 존재 또는 부재를 검출하는 단계[여기서, 상승된 수준의 존재는 가능한 치료학적 화합물이 환자에 유효하지 않다는 것을 지시해주고, 상승된 수준의 부재는 가능한 치료학적 화합물이 환자에 대해 치료학적이라는 것을 지시해준다]를 포함하는, 알쯔하이머병 환자에 대한 약제를 선별하는 방법을 제공해준다. 상기 방법은 환자에 대해 치료학적인 것으로 밝혀진 화합물을 피험자에게 투여함으로써 상기 피험자에게서 알쯔하이머병을 치료 또는 예방함을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은
(a) 대조군 세포와 비교해서 피험자의 세포에서 비정상적으로 상승된 MAPK 단백질의 인산화 수준을 억제 또는 방지하고/시키거나
(b) 상기 MAPK 단백질의 비정상적으로 상승된 인산화로 인해 유발된 사건을 억제시키는 약제의 유효량을 투여함을 포함하여, 피험자에게서 알쯔하이머병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 약제는 Erk1/2 인산화를 억제시킬 수 있고, 이는 단백질 키나제 C 활성 억제제, src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제, 또는 IP-3 수용체의 억제제일 수있다. 상기 억제제는 BiSM-1, PP1 및 2ABP로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
특히, 본 발명은
(a) 피험자 및 비-알쯔하이머병의 대조군 피험자로부터의 피부 섬유아세포를, 인산화를 자극하기에 유효한 농도의 브라디키닌과 접촉시키는 단계;
(b) 포스포-Erk1/2에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해, 2분, 5분, 10분, 20분 및 30분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1회 이상의 시점에서 상기 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을 측정하는 단계;
(c) 포스포-Erk1/2에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해, (b)에서와 동일한 시점에서 비-알쯔하이머병의 대조군 피험자로부터의 세포에서 인산화된 Erk1/2의 양을 측정하는 단계[여기서, 단계 (b) 및 (c)에서 인산화된 Erk1/3의 양을 상기 세포에 존재하는 단백질의 양에 대해 표준화시킨다]; 및
(d) 상기 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을, 상기 시점에서 대조군 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양과 비교하는 단계[여기서, 상기 1회 이상의 시점에서 대조군 세포와 비교해서 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양이 증가한다는 것은 알쯔하이머병의 진단지표이다]를 포함하여, 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법을 제공해준다.
상기 방법은 피험자의 세포를, 단백질 키나제 C 활성 억제제인 BiSM-1; C-src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제인 PP1; 및 IP-3 수용체의 억제제인 2-아미노에톡시디페닐 보레이트로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 억제제와 접촉시키는 단계[여기서, 대조군 세포와 비교해서 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양의 브라디키닌-유도된 증가는 상기 억제제에 의해 저하된다]를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는
(a) AD 피험자로부터의 시험용 피부 섬유아세포를, 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계;
(b) 상기 피험자로부터의 대조군 피부 섬유아세포를, 상기 화합물에 대한 제어 제제와 접촉시키거나, 또는 이러한 대조군 섬유아세포를 상기 화합물 또는 제어 제제의 부재 하에 항온처리하는 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b) 전, 동안 또는 후에, 상기 시험용 및 대조군 섬유아세포를, 인산화를 자극하는데 유효한 농도의 브라디키닌으로 자극하는 단계;
(d) 포스포-Erk1/2에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해, 2분, 5분, 10분, 20분 및 30분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1회 이상의 시점에서상기 시험용 및 대조군 섬유아세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을 측정하는 단계[여기서, 인산화된 Erk1/3 양은 상기 시험용 및 대조군 섬유아세포에 존재하는 단백질의 양에 대해 표준화시킨다]; 및
(e) 시험용 섬유아세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을, 대조군 섬유아세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양과 비교하여, 해당 단백질이 대조군 세포와 비교해서 시험 세포에서 Erk1/2의 인산화에 있어서의 브라디키닌-유도된 증가를 억제 또는 방지시키는지를 결정하는 단계[여기서, 인산화 증가를 억제 또는 방지시키는 화합물이 알쯔하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 동정된다]를 포함하여, 알쯔하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공해준다.
본 발명의 방법은 특정의 사람 세포를, 대조군 세포에서의 수준으로 인산화 수준을 감소시키기에 유효한 MAPK의 인산화 억제제와 접촉시킴을 포함하여, 대조군 사람 세포와 비교해서 MAPK 단백질의 IP3 수용체 매개된 인산화 증가를 나타내는 사람 세포에서 tau 단백질의 인산화, 아밀로이드 전구체 단백질의 단백질 분해 및/또는 아밀로이드 단백질 β의 분비를 저하시키는 방법이다.
본원에 인용된 본 발명의 요소들은 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기재된 특정의 양태를 조합하거나 이들 중의 일부를 없앨 수도 있다.
본 발명은 알쯔하이머병("AD")에 대한 진단 및 스크리닝 시험 방법을 제공한다. 이러한 시험의 한 예는 연령상 적합한 대조군으로부터의 세포와 비교해서, AD 환자로부터의 피부 섬유아세포를 브라디키닌(bradykinin) 등의 효능제, 또는 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 수용체를 자극하는 기타 제제로 자극한 후 상기 AD 환자로부터의 피부 섬유아세포 내에서 세포외 시그날-조절된 키나제 1형 또는 2형("Erk1/2")의 비정상적으로 증강된 인산화도를 검출하는 것을 포함한다. 증강된 인산화도는 인산화된 단백질에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯, 또는 기타 유사한 접근법에 의해 측정할 수 있다.
도 1A1, 1A2 및 1B. 시간에 따른 Erk1/2의 BK-자극된 활성화. AD 세포와연령상 적합한 정상 대조군("AC")으로부터의 세포를 10nM BK로 상이한 시간 동안 처리하고, 본 실시예에 기재된 바와 같이 반응을 종결시킨다. 각 세포주에 대한 대조군에 동일 용적의 PBS를 가한다. 상단 영상은 AD 및 AC 세포로부터의 활성화 Erk1/2(P-Erk1/2)에 대한 대표적인 웨스턴 블롯이다. 각 샘플의 평균 밀도를 단백질 총량에 대해 표준화시키는데, 이는 항-"레귤러 MAP 키나제" 항체(R-Erk1/2)를 사용하여 결정하였다. 짝을 이루지 않은 스튜던츠(Student's) t-시험에 의해, 11개의 독립적인 세포주로부터 값의 통계적 유의성을 평가하였다. 결과가 요약되어 있고 하단 그래프로 제시된다.
도 2A 및 2B. BK 자극한지 10분 후의 AD 세포와 AC 세포 간의 Erk1/2의 스캐터 플롯-비교 인산화(도 2A). 20명의 AD 환자와 22명의 연령상 적합한 대조군으로부터의 세포를 BK로 처리하고, 도 1에 관한 설명에 기재된 바와 같이 처리하였다. 활성화 Erk1/2 및 전체 Erk1/2은 적당한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅함으로써 검출하였다. 결과를 도 1에 대해 기재된 바와 같이 처리하고 분석하였다. 도 2B는 무작위로 선별된 각각의 세포주를 대상으로 하여 3가지 독립적인 복제 과정으로부터의 BK-자극된 Erk1/2 인산화를 나타낸다.
도 3A1, 3A2, 3B1 및 3B2. 사람 섬유아세포에서 활성화 Erk1/2의 면역세포화학적 염색. AD 환자 및 연령상 적합한 대조군으로부터의 섬유아세포를 유리 커버 슬립 상에서 배양하고 10nM BK로 10분 동안 자극시킨다. 항-포스포-Erk1/Erk2 항체를 사용하여, 활성화 Erk1/2를 검출한다. 그 결과, BK 처리 전과 처리 후 간에는 AC 세포에 있어 명백한 차이가 없는 것으로 나타났다(상단 영상). 그러나,AD 세포에서는 BK-처리된 세포에서 고도로 증강된 면역형광성 시그날(우측 하단 영상, 3B2)이 관찰되었다(10분).
도 4A1, 4A2, 4B1, 4B2, 4C1, 4C2, 4D1 및 4D2. Erk1/2의 BK-자극된 활성화에 대한 상이한 억제제의 효과: AD 환자 및 연령상 적합한 대조군으로부터의 섬유아세포를 37℃에서 50μM 2APB와 함께 30분 동안 예비항온처리하고(도 4A); 5μM BiSM-1과 함께 15분 동안 예비항온처리하며(도 4B); 10μM PP1와 함께 15분 동안 예비항온처리하고(도 4C); 5μM LY294002와 함께 15분 동안 예비항온처리한다(도 4D). 각 세포주의 제2 플라스크 세포를 동일한 용적의 DMSO 비히클과 함께 항온처리한다. 항온처리가 끝날 무렵, 세포를 10nM BK로 5분 동안 처리한 후, 반응을 종결시킨다. 이어서, 활성화 형태 및 "레귤러" 형태의 Erk1/2를, 앞서 기재된 2개의 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. 좌측 패널은 대표적인 웨스턴 블롯을 나타내고, 우측 그래프는 AD와 AC 둘 다로부터의 11개 세포주로부터 수득된 결과가 요약되어 있다. **p<0.001; *p<0.05.
도 5A, 5B1, 5B2, 5C1 및 5C2. BK 자극 후의 CREB의 인산화 변화 및 양 변화. AC 및 AD 세포를 10nM BK로 5 또는 10분 동안 처리한다. 웨스턴 블롯 상에서 항-포스포-CREB-Ser133 항체를 사용하여, 인산화 CREB(P-CREB)를 측정한다. 항-"레귤러 CREB" 항체를 사용하여, P-CREB의 평균 밀도를 CREB의 총량에 대해 표준화시키고, 통계적으로 분석한다. 도 5A는 처리 후 5 및 10분에서 BK-유도된 CREB 인산화를 나타낸 것이다. 도 5B는 BK 처리한지 10분 후 P-CREB의 대표적인 블롯을 나타낸 것이다. 도 5C는 BK 처리한지 10분 후에 CREB의 총량이 상당히 감소하였다는 것을 나타낸다.
도 6A1, 6A2, 6B1, 6B2, 6C1 및 6C2. CREB의 BK-자극된 인산화에 대한 상이한 억제인자의 효과. AC 및 AD 세포를 37℃에서 5μM BiSM-1과 함께 15분 동안 예비항온처리하며(도 6A); 10μM PP1(도 6B) 또는 5μM LY294002(도 6C)와 함께 15분 동안 예비항온처리한 후, 10nM BK와 함께 10분 동안 항온처리한다. 도 5A 내지 5C에서와 같이 표준화 과정을 수행하고, 2원 ANOVA에 의해 통계적 유의차를 평가하였다. **p<0.0001; *p<0.05.
도 7A 및 7B. 사람 피부 섬유아세포에서의 BKb2 수용체의 분포도. 섬유아세포를 항-BKb2 수용체 항체와 함께 항온처리한 후, 플루오레세인-표지된 2차 항체와 함께 항온처리한다. 상단 패널은 해당 세포의 미분 간섭 콘트라스트(DIC) 영상을 나타낸 것이고, 하단 패널은 섬유아세포에서의 BK b2 수용체의 면역형광성을 나타낸 것이다.
도 8. 헌팅톤 치매(Huntington's dementia: HD)에 걸린 개개인으로부터의 섬유아세포 상의 Erk1/2의 인산화에 대한 브라디키닌의 효과. N=4 및 P=0.39, t-시험.
본 발명에 따르면, 활성인자, 또는 IP3 매개된 세포내 칼슘 방출을 자극하는 제제는 '배경기술' 식별항목에 기재된 바와 같이, IP3 수용체 및 관련 경로에 관한 공개된 정보를 근거로 하여 본원에 기재된 방법을 사용하여 당업자에 의해 동정될수 있는 것이다.
비정상적으로 상승된 수준 또는 자극된/자극되지 않은 인산화 수준의 비율은 공지된 비-알쯔하이머병 세포에 대해 앞서 결정된 수준을 초과하는 양인데, 이러한 양은 알쯔하이머병 세포에 대해서는 통계상 유의적으로 특징적이지만, 비-알쯔하이머병 세포에 대해서는 특징적이지 않다.
일반적으로 본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 지시인자 단백질 또는 MAPK 단백질은 활성인자 화합물의 투여에 반응하여 칼슘 시그날링 경로의 일부로서 인산화되고 이의 인산화도가 대조군 세포 보다 AD 세포에서 차별적으로 더 큰 단백질을 의미한다. 지시인자 단백질은, 이의 인산화가 해당 세포에서의 IP3R-민감성 Ca2+상승과 연관이 있는 칼슘 시그날링 경로 단백질일 수 있다. 지시인자/MAPK 단백질에는 IP3R 매개된 칼슘 방출에 반응하여 인산화되는 것, 예를 들면, Erk1/2이 포함된다.
세포의 활성화 또는 자극은 본래의 세포를, 전형적으로 활성인자 화합물을 함유하는 용액을 부가함으로써 시험관 내에서 활성인자와 접촉시키거나, 또는 당업자에게 공지된 바와 같이 접촉시키는 것을 의미한다.
활성인자 화합물은 사람 세포에 도입될 때, 지시인자 단백질의 인산화를 자극시키는 화합물이다. 활성인자 화합물은 비-알쯔하이머 피험자의 대조군 세포에서의 수준과 비교해서 알쯔하이머 피험자의 세포에서의 지시인자 단백질의 인산화 수준에 있어서 차별적 반응을 유발시킨다. 활성인자 화합물은 세포 배양 배지 중에서 전달될 때 효과적이다. 활성인자 화합물은 IP3R 효능제로서 지칭될 수 있는데, 이는 이들이 IP3R 매개된 세포내 Ca2+상승을 직접 또는 간접적으로 유도시키기 때문이다.
지시인자 단백질의 인산화 수준은 일반적으로, 인산화된 지시인자 단백질의 양 및 임의로, 인산화되지 않은 지시인자 단백질의 양을 측정하고, 이러한 인산화된 단백질의 양을 분석하고자 하는 샘플 내의 지시인자 단백질의 총량에 대해 표준화시킴으로써 결정한다. 따라서, 산정된 반응 인산화 수준 및 기초 또는 배경 인산화 수준은 소정의 시간에서 지시인자 단백질의 절대량 차이에 의해서는 영향을 받지 않는다.
세포를 활성인자 화합물로 자극시킨 후 예정된 시간 또는 차별 시점은 공지된 AD 세포와 공지된 대조군 세포에서의 지시인자 단백질의 인산화 수준 간의 보정된 통계상 유의차를 달성하도록 선택된다. 이러한 차이는 예정된 시간에서 최대일 수 있지만, 반드시 그렇치는 않고 기타 시험 파라미터에 좌우된다.
소정의 어떠한 활성인자 화합물에 대해서도, 한정된 수의 적합한 지시인자 단백질이 있고, 그 반대의 경우도 가능하다. 본 발명에 따르면, 활성인자 화합물과 지시인자 단백질의 조합은, 해당 세포를 활성인자와 접촉시킨 후 예정된 시간에서 건강한 대조군 세포에서의 수준과 비교하여 알쯔하이머 피험자의 세포에서의 지시인자 단백질의 인산화 수준에 있어서의 차별적 반응을 활성인자가 유발시키도록 선별된다. 당업자는 이러한 차별적 인산화가 일어나는지를 결정함으로써, 적합한지시인자 단백질과 활성인자 화합물을 선별할 수 있다. 한 세트의 지시인자 단백질과 활성인자 화합물을 선택한 경우에는, 차별 시점, 상기 단백질 및 활성인자의 적합한 농도, 인단백질 또는 인산화되지 않은 단백질에 대한 적합한 항체, 또는 기타 검출 수단 등에 대해 검정 파라미터를 최적화시킬 수 있다.
기초 인산화 수준에 대한 활성화 인산화 수준의 비율 산정을 물론, 역으로 수행할 수도 있다. 즉, 편의상, 본 발명자들은 활성화/기초 비율이 공지된 수준 보다 더 높다고 가정하고, 상기 비율의 분자와 분모를 역으로 바꾸면, 활성화되지 않은 인산화 견지에서 이것이 공지된 수준 보다 더 낮은 것으로 간주되는 경우에 동일한 결과를 제공하리라는 것은 당업자에게 명백한 일이다. 따라서, 비율 산정이 한 가지 방식으로 본원에 기재된 경우, 당업자에게 명백한 바와 같은 역 방식으로의 산정을 또한 포함하는 것으로 인지되어야 한다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 비율 산정이 유용한 비교 수치를 제공하는데 유리한 경우에는, 활성화 인산화 수준과 기초 인산화 수준간의 절대차, 및 시험 피험자와 대조군 피험자 간의 절대차 산정을 또한 이용할 수도 있고, 이는 본 발명에 따라서 유효할 수 있을 것이다.
예정된 시간 또는 차별 시점에서 공지된 알쯔하이머병 세포 및 비-알쯔하이머병 세포에 대해 앞서 결정된 비율은 차트로 기록되거나 또는 컴퓨터 데이터베이스로 제시될 수 있으며, 이로부터 진단 결과를 결정할 수 있다. 따라서, 실제적으로, 진단 시험을 수행하고, 활성화/기초 인산화 비율을 산정하며, 이러한 산정된 비율이 공지된 알쯔하이머병 세포에 대해 앞서 결정된 비율과 동일하거나 이 보다 더 큰 경우에는, 해당 진단이 양성이다. 산정된 비율이 공지된 비-알쯔하이머병세포에 대해 앞서 결정된 비율 보다 낮을 경우에는, 해당 진단이 음성이다.
본 발명은 BK 자극에 대한 MAP 키나제(MAPK) 단백질의 반응을 측정하는 것을 포함하는, AD에 대한 진단 시험을 제공한다. AD 세포에서의 반응을 연령상 적합한 대조군[이에는 기타 질병(치매와 연관된 기타 질병 포함)을 앓는 피험자가 포함될 수 있다]으로부터의 세포에서의 반응과 비교한다. 바람직한 양태에서는, 상기 시험이, 해당 세포를 BK로 자극시킨 후(가족형과 비-가족형 둘 다의) AD가 존재하는지를 진단하기 위해 피부 섬유아세포에서 Erk1/Erk2가 비정상적으로 높게 인산화되는지를 검출하는 것에 근거한다. 인산화 수준의 상승은 웨스턴 블롯팅 또는 기타 접근법에 의해 검출할 수 있다.
인산화는 포스페이트 그룹을 특정 단백질의 Ser, Thr 또는 Tyr 잔기에 부가하는 생화학적 반응이고, 이는 단백질 키나제 효소에 의해 촉매된다. 인산화는 통상적으로, 표적 단백질의 기능을 변형시켜, 전형적으로 활성화를 유발시킨다. 세포의 항상성 기전의 일부로서, 인산화는 단지 일시적인 과정이며, 이는 포스파타제로 불리우는 기타 효소에 의해 역전된다. 반응의 어느 한 측면(인산화 대 탈인산화)에서의 어떠한 이상 징후도 세포성 기능을 파괴시킬 수 있다. 이들 파괴로 인해, 각종 뇌 질병이 유발될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 칼슘 시그날링 경로 조정인자(modulator)에 반응하여 지시인자 단백질의 인산화 상승을 가져다 주는 비정상적인 인산화 활성을 진단 분석으로 AD 환자에게서 검출할 수 있다. 이러한 비정상은 건강한 환자의 세포에서의 수준과 비교하여 소정의 시간에 인산화 수준이 증가 또는 감소하는 것이다. 모든말초 조직(즉, 중추신경계 바깥)에서 MAPK의 AD-특이적 차이를 검출하는 것은 AD를 초기에 진단하고 약물 개발을 위해 치료학적 표적을 스크리닝 및 동정하기 위한 경제적인 시험에 대한 기반을 제공한다. 따라서, 본 발명은 AD의 존재 또는 부재를 검출하는 방법, 시약 및 키트를 제공한다.
MAPK 효소는 유전자 발현의 제어를 유도하는 세포 핵에 세포외 시그날을 전송하는데 있어서 중추적인 역할을 한다. 이들은 또한, AD의 병인론에 결정적인 사건인 β 아밀로이드 단백질의 발생과 분비, 및 미세소관-연관된 단백질 tau의 인산화를 조절하는 것에 관여한다. 본 발명에 따르면, 비정상적으로 증강된 MAPK Erk1/2의 인산화가, 연령상 적합한 대조군과 비교할 때 BK에 의한 자극에 반응하여 AD 섬유아세포에서 발생되고 검출된다.
본 발명자들이 자극인자로서 BK를 사용하여 초기 시험을 수행하였지만, BK는 세포성 IP3 수용체의 자극을 달성하기 위한 한 가지 방법을 나타낼 뿐이라는 것을 인지해야 한다. 따라서, 본원에서 BK를 인용한 것은 기타 적합한 활성인자 또는 자극인자 화합물을 포괄하는 것으로 해석해야 한다. 이러한 자극은 AD의 특징적인 증강된 Erk1/2 인산화를 가져다 주는 공통의 단계로서 작용한다. 실제로, IP3 수용체의 억제가 BK-자극된 Erk1/2 인산화를 완전히 소멸시킨 것으로 관찰되었는데, 이는 IP3-민감성 Ca2+방출로 이러한 결과가 밝혀졌다는 것을 제시해준다. Erk1/2 인산화의 AD-특이적 증가는 또한, AD 세포에서 PKC 및 MAP 키나제 키나제(또한, "MAPK/Erk 키나제 또는 MEK") 이소형에 대한 유전자의 발현 증강 뿐만 아니라 미세소관-연관된 단백질 tau 및 MAPK를 탈인산화시키는 포스파타제 1, 2A 및 2B에 대한 유전자의 발현 저하와 연관이 있다. AD 세포에서의 유전자 발현 변화는 상기 AD-특이적 연장된 Erk1/2 활성화를 유발시킬 수 있을 뿐만 아니라 AD 뇌에서 신경원섬유 농축체를 형성하는 tau의 과인산화를 유발시킬 수 있는 포스파타제와 단백질 키나제 간의 활성의 균형을 변화시킬 수 있다. 피부 섬유아세포에서의 이들 Erk1/2 비정상적 활성 검출은 뇌에서의 유사한 변화를 반영해주므로, AD의 초기 인산화의 진단지표이다.
따라서, 본 발명에 따르면, BK 자극은 AD 섬유아세포에서 Erk1/2의 비정상적으로 연장된 인산화 증가를 불러일으키는데, 이는 IP3 수용체-매개된 Ca2+방출에 따라 좌우되는 변화이다. IP3 키나제가 비-AD 대조군으로부터의 세포에서 BK-자극된 Erk1/2 인산화에 관여하는 것으로 여겨지긴 하지만, 이러한 AD 세포에서의 Erk1/2의 인산화는 IP3 키나제-독립적이다.
Erk1/2 인산화의 AD-특이적 증가에 이어 IP3-매개된 Ca2+가 방출된다. 단백질 키나제 C(PKC) 및 비-수용체 단백질 티로신 키나제(PTK) c-Src는 Erk1/2 활성화의 상단부(upstream) 시그날링 경로에 관여하는데, 이는 PKC 억제제 비스인돌릴말레이미드-1과 c-Src 억제제 PP1 둘 다가 BK-자극된 Erk1/2 인산화를 완전히 소멸시켰다는 결과로써 지시된다. PI-2 키나제 LY924002는 대조군인 비-AD 세포에서 BK-자극된 Erk1/2 인산화를 부분적으로 억제시켰지만, AD 세포에서는 어떠한 효과도 나타내지 못하였는데, 이는 BK-유도된 Erk1/2 인산화가 PI-3 키나제와 독립적인 시그날링 경로과 관련이 있을 수 있다는 것을 제시해준다.
Ser-133에서 인산화 증가로서 측정된, cAMP-반응성 요소 결합성 단백질(CREB)의 활성화가 또한, BK 자극 후에 관찰되었다. Erk1/2 인산화와 유사하게, BK-유도된 CREB 인산화는 AD 세포와 AD 세포 둘 다에서 PKC 및 c-src의 억제제에 의해 완전히 억제되었다. AD 세포가 아닌 AC 세포에서의 CREB 인산화만이 IP-3 키나제 억제제 LY-294002에 의해 부분적으로 억제되었다.
이들 결과는 비정상적으로 증강되고 연장된 Erk1/2 인산화 및 활성화를 유발시키는 AD 세포에서의 BK에 반응하여 시그날링 경로가 혼란해지고, 이는 결국, 유전자 전사, APP(아밀로이드 전구체 단백질) 프로세싱 및 tau 단백질 인산화(이들 모두가 AD 병인론에 해당된다)를 교란시킨다. 이들 경로의 변화를 이해하는 것이 AD의 특징인 초기 기억력 상실을 설명하는데 도움을 줄 수도 있다. 게다가, 말초 조직에서 MAPK의 AD-특이적 차이를 검출하는 것은 (1) AD의 초기 진단에 효율적인 수단 및 (2) 약물 개발을 위한 치료학적 표적을 동정하기 위한 생화학적 토대를 제공해준다.
전술한 기재 내용에 비추어 보고, 또한 동일한 세포는 상이한 외부 메시지를 암호화하는 세포내 Ca2+-방출 메신저의 상이한 조합을 사용할 수 있기 때문에, 칼슘의 내부 저장소의 방출을 유발시키기 위해 IP3 수용체를 자극할 수 있는 어떠한 제제도 본 발명의 시험에서, AD 세포의 Erk1/2 인산화 증가 특징에 대한 유도인자로서 사용될 수 있다. 다시 언급하면, BK는 이러한 제제 중의 하나일 뿐이고, 기타BK 수용체 효능제도 유사하게 유용하다. IP3 수용체에 대한 리간드인 분자를 사용할 수도 있다. IP3 수용체는 ATP, 칼슘, 및 단백질 키나제 A, 단백질 키나제 C 및 Ca2+칼모둘린-의존적 단백질 키나제 II(CaM 키나제 II)에 의한 인산화에 의해 조절되기 때문에, ATP 또는 이들 키나제의 수준 또는 활성을 조정하는 제제가 유사한 효과를 달성시킬 수 있으며, 본 발명에서 BK에 대한 대체물일 수 있다.
이러한 제제 중의 하나가 14개 아미노산 펩티드 봄베신[참조: Anastasi A. et al., Arch Biochem Biophys, 1972, 148:443-446; Woodruff GN et al., Ann N Y Acad Sci, 1996, 780:223-243], 또는 이의 생물학적으로 활성인 동족체 또는 단편[참조: River JE et al., Biochemistry, 1978, 17:1766-71; Orloff MS et al., Peptide, 1984 5:865-70; Walsh, JH et al., Peptides, 1985, 6 Suppl 3:63-68]이다. 또 다른 것은 콜레시소키닌이다. IP3 및 IP3 수용체를 통한 봄베신 및 콜레시토키닌 유도된 칼슘 시그날링에 대해서는 다음 문헌을 참조할 수 있다[Cook SJ et al., Biochem J, 1990, 265:617-620; Schulz I et al., Biol Chem, 1999, 380:903-908; Burdakov D, et al., Curr Biol, 2000, 10:993-996]. 피부 섬유아세포를 사용하는 시험이 본원에 예시되긴 하였지만, 수득하기가 보다 편리한 기타 세포 및 과정을 본 발명의 시험에 사용할 수 있으므로, 혈액 세포, 바람직하게는 림프구 또는 단핵구가 말초혈로부터 용이하게 제조되어 본 발명에 따라서 사용된다. 당업자는 적합한 지시인자 단백질과 활성인자 화합물을 사용하여, 상기 세포에 근거한 진단 방법을 수득하는데 적합한 시점과 실험 조건을 보정할 수 있다.
본 발명자들은 유사분열 촉진인자-활성화 단백질 키나제(MAP 키나제)인 중요한 효소 MAPK의 활성이, 연령상 적합한 대조군으로부터의 세포와 비교해서 알쯔하이머병 피부 섬유아세포에서 비정상적으로 연장된 간격 동안 자극되었다는 사실을 발견하였다. 다음 실시예는 Erk1/2의 인산화가 BK로의 자극시 AD 섬유아세포에서 연장되었다는 것을 보여준다. IP3 수용체-매개된 Ca2+방출, 및 PKC 활성과 비-수용체 단백질 티로신 키나제(PTK) c-Src의 활성이 이러한 Erk1/2 인산화에 필수적이다. IP3 키나제가 AD 세포에서 BK-자극된 Erk1/2 인산화에 관여하는 것으로 여겨지긴 하지만, AD 세포에서의 동일한 인산화는 IP3 키나제-독립적이다.
본 발명에 따르면, 세포를, 세포내 칼슘을 방출시키도록 IP3 수용체를 자극시키는 제제로 자극시키는데, 이러한 제제의 예가 BK 및 이의 동족체이다. BK는 특이적 BK 수용체와 결합하여 이를 활성화시킴으로써, IP3 수용체의 자극 및 MAPK 단백질의 인산화를 포함한 세포 내부의 분자상 사건의 케스케이드를 촉발시키는 강력한 노나펩티드이다. 인산화는 포스페이트 그룹을 특정 단백질에 부착시키는 생화학적 반응이고, 이는 단백질 키나제로 불리우는 효소에 의해 개시된다. 인산화는 통상적으로, 표적 단백질의 기능을 변형시켜, 통상 단백질의 활성화를 유발시킨다. 세포는 이들의 기능을 위해 조화된 시스템을 유지할 필요가 있기 때문에, 인산화는 단지 일시적인 과정이며, 이는 포스파타제로 불리우는 또 다른 효소에 의해 역전될 필요가 있다. 반응의 어느 한 측면(인산화 대 탈인산화)에서의 어떠한 이상 징후도 분자 네트워크 실체를 파괴시키고 세포성 기능을 파괴시킬 수 있다. 이들 파괴로 인해, 각종 뇌 질병이 유발될 수도 있다.
AD 섬유아세포에서 MAPK의 인산화가 장기간 지속된다는 것은 이들 세포에서 상기 효소의 활성이 비정상적으로 증강되었다는 것을 지시해준다. 이러한 AD-특이적 효과는 기타 비정상적 세포성 및 효소적 활성과 관련이 있는 것으로 여겨진다. 상기 연장된 MAPK 인산화는 세포 내부의 특정한 저장소로부터 IP3 수용체에 의해 매개된 과도한 Ca2+방출보다 2차적이다.
MAPK의 인산화는 PI3 키나제 활성에 부분적으로 의존적이고, PI3 키나제-의존적 기전은 AD 세포에서 MAPK의 인산화와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.
AD 세포에서 유전자 발현 프로필을 연령상 적합한 대조군 세포와 비교해 본 결과, 본 발명자들은 PKC 및 MEK의 발현이 AD 세포에서 증가하였다는 사실을 밝혀내었다. PKC와 MEK 둘 다는 MAPK의 인산화를 촉매하는 상단부 분자이다. 본 발명자들은 또한, MAPK를 탈인산화시키는 몇가지 포스파타제의 발현 저하를 밝혀내었다. 따라서, 불균형, 즉 MAPK 인산화를 조절하는 효소의 양과 활성에 있어서의 조합된 변화가 AD 세포에서 진단적으로 유용한 차이 - 연장된 MAPK 인산화 - 를 설명해준다.
이는 AD에서 비정상적으로 증강된 MAPK 활성을 처음으로 발견한 것이다. MAPK 계열의 효소는 세포 막에서부터 핵까지의 세포 시그날링에 있어 중요한 단계를 수행한다. 이들은 성장과 발생 뿐만 아니라 상해 또는 질병에 의해 손상된 세포의 대체 및/또는 수복에 요구되는 과정인 세포 분열(유사분열)을 유발시키고 세포 표면에서 작용하는 각종 시그날(예: 유사분열 촉진인자)에 의해 자극된다.
MAPK는 또한, 학습력과 기억력과 같은 기능의 기초가 되는 신경세포에서 시그날을 전송하는데 있어 중요한 역할을 한다. MAPK는 또한, 뇌 세포에서 아밀로이드 펩티드 βAP의 분비와 tau 단백질의 인산화를 조절한다. 신경 세포 외부에 βAP가 축적되고 tau가 과도하게 인산화되는 것은 신경세포에 대해 매우 독성이며, 이로써 플라크와 신경원섬유 농축체(NFT)가 각각 유발된다. 실제로, 이들은 AD 뇌에서 특징적인 2가지 병리학적 양상이다.
본 발명에 따르면, 비정상적으로 증강된 MAPK 활성이 비정상적 아밀로이드 프로세싱과 tau 단백질 기능의 원인이 된다. 본 발명의 결과는 뇌에서의 정상적인 기억 형성에 대한 분자상 기질 뿐만 아니라 AD의 병인론에 대해 새롭게 고찰하도록 해주었다. 이러한 후자를 이해하는 것이 질병의 예방과 치료를 위한 신규한 분자상 표적을 동정할 수 있게 해주는 것으로 예상된다.
보다 실제적으로, 본 발명의 결과는 즉각적인 임상적 진단 유의성을 지니고 있다. (a) 피부 섬유아세포는 가족성 AD 및 비-가족성 AD 둘다의 특징인 MAPK 활성 변화를 현저히 나타내며 (b) 피부 섬유아세포는 용이하게 수득(뇌 조직에 비해)되기 때문에, 피부 섬유아세포 상에서 수행된 MAPK에 근거한 진단 시험은 AD의 초기 진단을 위한 간단하면서도 경제적인 시험을 제공해준다.
본 발명의 신규한 발견은 과도한 칼슘 시그날링이 BK-자극된 AD 섬유아세포에서 검출 가능하였다는 기존의 발견과도 부합된다[참조: Ito et al., 1994; Gibson et al., 1996; Etcheberrigaray et al., 1998].
실시예 1
본 연구는 연령이 52세부터 67세인 20명의 AD 환자 및 연령상 적합한 대조군 22명으로부터의 피부 섬유아세포를 사용하였다. 이들 샘플 중의 몇몇은 미리 저장시킨 세포이지만, 다른 것은 사람 피부로부터 신선하게 수집하여 배양한 것이다.
재료 및 방법
가족성 AD(FAD) 및 비-가족성 AD(nFAD) 환자, 및 연령상 적합한 대조군로부터의 저장된 피부 섬유아세포는 다음 공급원[Coriell Institute for Medical Research]으로부터 구입하였다. 배지는 태아 송아지 혈청(FBS; Bio Fluids)이 보충된 둘벡코 변형된 이글즈 배지(DMEM; Gibco BRL)이다. 브라디키닌, 디페닐붕산 2-아미노에틸 에스테르(2ABP), 프로테아제 및 포스파타제 억제제는 공급원[Sigma]로부터 구입한 것이고; 비스인돌릴말레이미드-1(BiSM-1) 및 LY294002는 공급원[Alexis]로부터 구입한 것이며; PP1은 공급원[Dr Anthony Bishop, Priceton University]로부터 구입한 것이다. 항-포스포-Erk1/2, 항-포스포-CREB 및 항-CREB 항체는 공급원[Cell Signaling Technology]로부터 구입한 것이다. 항-Erk1/2 항체는 공급원[Upstate Biotechnology]로부터 구입한 것이다. 4-20% SDS-미니 겔은 공급원[Invertrogen Novex]로부터 구입한 것이다. 니트로셀룰로즈 막은 공급원[Schleicher & Schuell]로부터 구입한 것이다. 모든 SDS 전기영동 시약은 공급원[BioRad]로부터 구입한 것이다. 슈퍼시그날 화학발광성 기질 키트는공급원[Pierce]으로부터 구입한 것이다.
AC 및 AD 섬유아세포의 배양:가족형(FAD) 및 비-가족형(nFAD) 유형 둘 다를 포함한 알쯔하이머병 환자, 및 연령상 적합한 대조군(AC)로부터의 저장된 섬유아세포를 유지시키고 DMEM + 10% FBS를 함유한 T-25/T75 플라스크에서 계대배양(passage)시킨다. 세포는 52세 내지 67세 연령의 피험자로부터의 것이고, 샘플의 80% 이상이 남성의 것이다. 이 세포를 계대 6 내지 7 동안 사용하였다.
신선한 생검으로부터 섬유아세포의 프로세싱 및 배양:신선하게 수득된 피부 조직으로부터 섬유아세포를 수집 및 배양하는 것은 다음과 같이 수행한다: nFAD 환자 및 연령상 적합한 대조군으로부터의 생검 피부 조직에 구멍을 뚫는 것은 승인된 프로토콜 하에 쿠퍼 릿지 인스티튜트(Copper Ridge Institutu; Sykesville, MD) 및 존스 홉킨스 호스피탈(Johns Hopkins Hospital; Baltimore, MD)의 전문 직원이 수행한다. 샘플을 1x PBS에 놓아두고, 전이 배지에서 프로세싱을 위해 실험실로 전송한다. 조직을 전이 배지로부터 제거하고, 이를 PBS로 세정하며, 1mm 외식편으로 절단한다. 이 외식편을 45% PBS 및 100U/ml 페니실린 및 100U/ml 스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유하는 생검 배지 3ml가 있는 구멍있는 T-25 플라스크의 성장 표면으로 개별적으로 전이시킨다. 상기 조직을 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 10% PBS를 함유하는 생검 배지 10ml를 부가한다. 48시간 후, 상기 배지를, 10% PBS 및 Pen/Strep를 함유하는 레귤러 배양 배지 5ml로 대체시킨다. 이어서, 상기 세포를 상기와 같이 계대배양하고 유지시킨다.
섬유아세포를 상이한 약리학적 제제로 처리함:섬유아세포를 BK 및 각종 억제제로 처리한다. 이들에는 IP3 수용체 억제제, 디페닐붕산 2-아미노에틸 에테르(2ABP), 단백질 키나제 C 억제제인 비스인돌릴말레이미드 1(BiSM-1), C-src 단백질 티로신 키나제 억제제 PP1, 및 PI3 키나제 억제제 LY294002가 포함된다.
저장시킨 AC 및 AD 섬유아세포를 80 내지 100% 밀집도(confluence)가 되도록 성장시킨 후, 이들을 혈청-무함유 DMEM에서 밤새 "고갈"시킨다. 세포를 37℃에서 상이한 간격 동안 10nM BK로 처리하여, 시간에 따른 BK 효과를 정립시킨다. 동일한 용적의 PBS를 각 주의 세포의 대조군 플라스크에 가한다. 배지를 제거하고, 세포를 예비-냉각된 PBS(pH 7.4)로 신속하게 세정한 다음, 플라스크를 드라이 아이스/에탄올 상으로 옮김으로써, 상기 반응을 종결시킨다.
신선한 생검 조직으로부터의 세포를 37℃에서 10분 동안 BK의 최적의 농도인 0.1nM과 함께 항온처리한다.
억제 연구를 위해, 세포를 37℃에서 다음 농도의 억제제와 함께 지시된 간격 동안 예비항온처리하였다: 2ABP(50μM 30분); PP1(10μM 15분); LY294002(5μM 15분); 및 BiSM-1(5μM 15분). 평행한 대조군 플라스크를 동일 용적의 DMSO 비히클과 함께 항온처리한다. 이러한 항온처리가 끝날 무렵, 지시된 농도의 동일한 억제제를 가한 다음, BK를 10nM의 최종 농도가 되로록 즉시 가한다. BK(10nM)를 또한 DMSO 대조군에 가한다. 기준 대조군은 BK와 억제제가 전혀 부가되지 않은 세포이다. 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후, 반응을 상기와 같이 종결시킨다.
세포 용해물을 각종 그룹의 세포로부터 제조한다. 플라스크를 드라이 아이스/에탄올로부터 빙수로 이동시킨다. 각 플라스크에 1ml의 용해 완충액[10mM 트리스 pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, pH 8, 0.5% NP-40, 1% 트리톤 X-100, 1% 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma), 세린/트레오닌(Ser/Thr) 포스파타제 억제제 및 티로신(Tyr) 포스파타제 억제제의 1% 칵테일(Sigma)]을 접종시켰다. 냉장실에서 30분 동안 말단-대-말단 진탕기 상에서 진동시킨 후, 세포 스크래퍼를 이용하여 각 플라스크로부터 세포를 수집한다. 세포를 초음파처리하고, 5000rpm으로 5분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액 샘플을 웨스턴 블롯팅시킨다.
웨스턴 블롯팅:세포 용해물을 등 용적의 2X SDS-샘플 완충액에서 10분 동안 비등시킨다. 각 샘플로부터의 단백질을 4-20% 미니 구배 겔 상에서 분해시키고, 니트로셀룰로즈 막 상으로 옮긴다. 슈퍼시그날 ECL 검출용 키트를 사용하여 항-포스포-Erk1/2 항체로 인산화된 Erk1/2를 검출하였다. 인산화된 Erk1/2의 양을 Erk1/2의 총량에 대해 표준화시키기 위해, 상기 항체로 블롯팅시킨 동일한 막을 60℃에서 45분 동안 스트립핑 완충액(62.5mM 트리스-HCl pH 6.7, 2% SDS 및 100mM 2-머캅토에탄올)으로 스트립핑시킨다. 0.01% 트윈-20을 함유하는 10mM PBS pH 7.4로 세척한 후(3X, 10분), 상기 막을 항-비-포스포-Erk1/2 항체로 블롯팅하여, 상기 겔 상에 부하된 Erk1/2의 총량을 산정할 수 있다.
유사한 방법을 사용하여 CREB를 검출하였다.
데이터 분석:인산화된 및 인산화되지 않은 Erk1/2(또는 CREB)로부터의 시그날을 후지필름 LAS-1000 플러스 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다. NIH 영상 소프트웨어를 사용하여 각 단백질 밴드의 평균 광밀도를 측정하였다. 포스포-Erk1/2 시그날로부터의 수치를 Erk1/2의 총 시그날에 대해 각각 표준화시켰다. 표준화시킨 후, 처리된 세포로부터의 데이터를 기준 대조군의 퍼센트(%)로 전환시키고, 통계적으로 분석하였다.
면역세포화학:섬유아세포를 0.02mg% 폴리리신으로 피복된 유리 커버슬립의 표면 상에서 성장시킨다. 앞서와 같이 BK로 처리한 후, 세포를 찬 PBS로 신속하게 세정하고, 실온에서 15분 동안 PBS 중의 4% 포름알데히드로 고정시키며, PBS로 매 5분마다 3회 세척한 다음, 실온에서 30분 동안 PBS 중의 0.1% 트리톤X-100으로 침투시킨다. 실온에서 30분 동안 10% 정상적 말 혈청과 함께 항온처리한 후, 세포를 4℃에서 밤새 항-포스포-Erk1/2 항체(1:200)와 함께 항온처리한다. 커버슬립을 PBS로 3회 세척하고, 플루오레세인-표지된 항-마우스 IgG, 1:200(Vector Lab)를 가한 다음, 실온에서 60분 동안 항온처리시킨다. PBS로 3회 세척하고, Vectashield(Vector Lab)로 밀봉시킨 후, 세포 내에서의 면역염색 시그날을 형광 현미경으로 관찰하였다. BioRad Quantity One® 소프트웨어(BioRad)를 사용하여, 형광성 시그날의 세기를 측정하였다. BK 수용체를 섬유아세포에 국재시키기 위해, 모노클로날 항 BK B2 항체를 정상적인 섬유아세포에 적용한 다음, CY5-접합된 항-마우스 IgG와 함께 항온처리하고, 세포를 형광 현미경으로 검사하였다.
결과
AC 및 AD 세포에서 Erk1/2의 BK-유도된 활성화
BK는 대조군 피험자로부터의 사람 피부 섬유아세포에서 현저하긴 하지만 일시적인 Erk1/2의 인산화를 유발시켰다(도 1). 최대 인산화는 자극시킨지 약 2.5분 후에 도달하였으며, 이후에는 Erk1/2의 인산화가 저하되어, 자극시킨지 10분 뒤에는 대조군 수준으로 복귀하였다. BK 처리시킨지 20분 후에는, Erk1/2의 인산화가 대조군의 68% 수준이다(도 1). 그러나, AD를 앓는 피험자로부터의 세포에서는, Erk1/2의 인산화 수준 증가가 상당히 장시간 동안 유지되었다(도 1). 5분에서 통계적 유의차(스튜던츠 시험; p<0.01)가 있었으며, 10분에서 가장 큰 분기점이 나타났다(p<0.0001). AD와 AC 세포 간의 이러한 차이는, BK 처리한지 20분 후에 측정되었을 때 상당한(유의적) 것으로 나타났다(P=0.002).
도 2는 AD 환자 및 연령상 적합한 대조군으로부터 취한 신선한 조직 샘플 뿐만 아니라 AD 및 AC 그룹으로부터의 저장된 세포주로부터의 피부 섬유아세포로 자극시킨지 10분 후에 BK-유도된 Erk1/2 인산화를 조사한 결과를 나타낸 것이다. AD 섬유아세포에서의 Erk1/2 인산화는 연령상 적합한 대조군과 비교해서 지속적으로 상승되었다(도 2A). 유사하게, 세포주에서의 BK-자극된 Erk1/2 인산화는 도 2B에 도시된 바와 같이 AD 세포주에서 재생가능한 수준으로 상승되었는데, 이는 3가지 독립적인 복제(무작위로 선택된 AC 및 AD 주로부터 기원됨)를 예시해준다.
섬유아세포를 항-P-Erk1/2 항체로 면역염색시킨 경우, BK 처리한지 10분 후에 AD 세포에서는 증가된 수준의 인산화된 Erk1/2가 관찰되었지만, AC 세포에서는 관찰되지 않았다(도 3). 이들 증강된 시그날은 부핵(para-nuclear) 영역에 집중되어 있다(도 3, 하단 우측 패널).
BK-유도된 Erk1/2 인산화에 대한 IP3 수용체 억제제의 효과
BK는 IP3-민감성 저장소로부터의 Ca2+방출을 자극한다[참조: Cruzblanca etal., 1998; Pascale et al., 1999]. 본 연구에서는, BK-유도된 Erk1/2 인산화에 있어서의, IP3 수용체로부터의 Ca2+방출의 관련성에 대해 조사하였다. BK가 AC 및 AD 세포 모두에서 BK-자극된 Erk1/2 인산화를 완전히 소멸시키기 전에, IP-3R의 강력한 막-투과성 억제제인 2ABP를 세포에 부가한다(도 4A). 2원 ANOVA는 상기 처리 효과가 상당히 유의적이라는 것을 나타냈다(F1,36= 187.4, p<0.0001). 이러한 결과는 Erk1/2의 인산화와 후속 분자상 케스케이드가 해당 세포에서 IP-3R-민감성 Ca2+상승의 하류 부분(downstream)이라는 것을 입증해준다.
BK-유도된 Erk1/2 인산화에 대한 PKC 억제제 BiSM-1의 효과
본 실험에서는, AC 및 AD 세포를 특이적 PKC 억제제 BiSM-1과 함께 예비항온처리한 후에 BK와 함께 예비항온처리한다. 도 4B에 도시된 바와 같이, BK-유도된 Erk1/2 인산화가 다시 제거되었다(AC 및 AD 세포 모두에서). 2원 ANOVA는 유의적 처리 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 AC 세포와 AD 세포 둘 다에서 BK-자극된 Erk1/2 활성화를 위해서는 PKC 활성이 요구된다는 것을 지시해준다.
BK-유도된 Erk1/2 인산화에 대한 C-src 단백질 티로신 키나제 억제제 PP1의 효과
비-수용체 PTK, C-src가 BK에 의한 Erk1/2의 활성화에 관여하는지를 시험하기 위해, AC 및 AD 세포를 10μM PP1과 함께 예비항온처리한 후에 BK와 예비항온처리한다. 상기 2ABP 및 BiSM-1과 유사하게, PP1은 BK-유도된 Erk1/2 인산화를 완전히 억제시켰다(도 4C). 2원 ANOVA는 유의적 처리 효과를 나타내었다(F1,40= 234, p<0.0001). 따라서, 이러한 결과는 C-src PTK 활성이 또한, BK에 의한 Erk1/2의 활성화에 관여한다는 것을 제시해준다.
BK-유도된 Erk1/2 인산화에 대한 PI3 키나제 억제제 LY294002의 효과
PI3 키나제 활성이 BK-자극된 Erk1/2 활성화에 관여하는지를 시험하기 위한 연구를 수행하였다. 섬유아세포를 5μM LY294002와 함께 항온처리한 다음 BK와 항온처리하였다. IP-3R, PCK 및 C-src의 억제제의 효과와는 대조적으로, LY294002는 AC 세포에서 적당하긴 하지만 유의적인 Erk1/2 인산화 억제를 유발시킨 반면(도 4D), AD 세포에서 BK-유도된 Erk1/2 인산화는 억제시키지 못하였다(도 4D). 2원 ANOVA는 유의적 처리 효과(F1,20= 136.2, p<0.001) 및 그룹 효과(F1,20= 11.55, p<0.05)를 나타내었다. 이러한 결과는 PI3 키나제 활성이 AD 환자의 세포에서 BK-유도된 Erk1/2 인산화에 관여하지 않는다는 것을 제시해준다.
사이클릭-AMP 반응 요소 결합성 단백질(CREB)의 활성화에 대한 BK의 효과
통상적으로 Erk1/2의 하단 부분인 CREB의 활성화에 대한 BK의 효과를 시험하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 10nM BK는 AC와 AC 세포 둘 다에서 고도로 유의적인 CREB 인산화를 유도하였다. 인산화 증가는 BK 자극한지 5분 후 정도로 초기에 검출되었으며, 10분 후에는 추가로 증가하였다(도 5A). 2원 ANOVA는 유의적 시간 효과(F1,28= 14.09, p<0.001)를 나타내었지만, 그룹 효과는 나타내지 못하였다. 도 5B는 AC 및 AD 세포에서 BK 처리한지 10분 후에 유사하게 상승된 CREB 인산화를나타낸다. BK 처리는 또한, 10분에서 CREB 단백질 총량의 현저한 감소를 유발시켰다(도 5C)(p<0.001). 요약하면, AC와 AD 세포 간에는 총 CREB의 감소 또는 BK-유도된 CREB 인산화의 유의적 차가 없다.
BK-유도된 CREB 인산화에 대한 PKC, C-src 및 PI3 키나제 억제제의 효과
섬유아세포를 PKC 억제제 BiSM-1로 처리하면, BK-자극된 CREB 인산화가 완전히 제거되었다(도 6A). 2원 ANOVA는 유의적 처리 효과(F1,30= 53.76, p<0.0001)를 나타내었지만, 그룹 효과는 나타내지 않았다. 유사하게, c-src 억제제 PP1은 BK-자극된 CREB 인산화를 억제하였다(도 6B). 이들 결과는 PKC와 c-src가 둘 다 시그날링 경로에 관여하고, BK에 의해서 Erk1/2와 CREB가 모두 활성화된다는 사실을 다시 한번 지시해준다. Erk1/2를 이용한 효과와 유사하게, PI3 키나제 억제제 LY294002는 AC 세포에서 CREB 인산화를 부분적으로 억제시켰지만, AD 세포에서 CREB 인산화에 대해서는 어떠한 효과도 나타내지 못하였다(도 6C). 2원 ANOVA는 유의적 처리 효과(F1,30= 36.23, p<0.0001) 및 그룹 효과(F1,30= 4.7, p<0.05)를 나타내었다.
섬유아세포에서의 BK B2 수용체의 발현
BK에 반응하여 증강된 Erk1/2 및 CREB 인산화가 AD 세포 상에서 발현된 BK 수용체의 수 증가로 인한 것인지를 시험하기 위해, 유형 2 BK 수용체(BKb2R)에 대한 특이적 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 AD 및 대조군 AC 세포에서의 BK 수용체 발현을 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 수용체 발현에서는 유의차가 전혀관찰되지 않았다.
면역형광성 염색에 의하면, BK2bR이 섬유아세포의 세포질, 핵 및 부핵 영역에서 나타났다(도 7). 그러나, AD 대 AC 세포에서는 BK2bR의 세기 또는 분포 패턴 상의 명백한 차이가 관찰되지 않았다.
실험 결과의 토의
섬유아세포는 AD 및 기타 유전성 질병을 연구하는데 유용한 모델로서 제공되어 왔는데, 이는 신체 전반에 위치하는 이들 세포가 몇몇 뇌 질환과 연관된 유전적 비정상(이상)을 발현할 수 있기 때문인 것으로 추정된다. 본 발명의 연구는 BK 수용체 자극으로 인해, AD 섬유아세포에서 MAPK 경로에 의한 비정상적 시그날전달이 일어났다는 증거를 제공해주었다. BK는 가장 강력한 내인성 동통(algesic) 및 전염증성 물질 중의 하나이고, 상해, 질병 및 CNS 뿐만 아니라 말초 염증을 수반하는데 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는, BK 자극은 IP3 수용체로부터의 Ca2+방출에 의존적인 방식으로 AD 세포에서 Erk1/2 인산화를 증강 및 연장시켰다. 이는 IP3-민감성 Ca2+방출 증가가 BK 자극 후 AD 피부 섬유아세포에서 검출되었다는 기존의 보고 내용과 부합된다[참조: Gibson et al., 1996; Etcheberrigaray et al., 1998]. 그러나, 이러한 AD Erk1/2의 인산화 연장이 BKb2 수용체 또는 Erk1/2의 발현 증가로부터 비롯된 것은 아닌데, 이는 이들 두 가지 단백질의 발현이나 농도 어떠한 것도 대조군과 비교해서 AD 세포에서 상이하지 않기 때문이다. 상기 시그날 변환 경로에 관련된 기타 분자 상의 변화 이외에, AD에서 BK 수용체 및/또는 IP3수용체의 특성 또는 민감도 상의 기타 특정한 변화를 제외시키는 것은 가능하지 않다.
BK2bR의 활성화로 인해, PLC 시스템의 활성화가 자극되어, 이는 세포내 Ca2+상승과 함께, PKC 활성화를 유도시킨다. 또한, 몇몇 G 단백질-커플링된 수용체("GPCRs")는 c-src PTK 활성을 자극시키는 것으로 공지되어 있는데, 이는 세포성 시그날링에서 주요 중간체로서, Erk1/2의 활성화에도 참여할 수 있다. 본 연구는 PKC와 c-src PTK 둘 다가 BK-유도된 Erk1/2 인산화에 관여하는지 여부를 시험하였다. 이러한 인산화가 PKC 억제제인 BiSM-1 및 c-src 억제제인 PP1에 의해 소멸된다는 사실은 Erk1/2 활성이 다중 상단부 단백질 키나제의 수렴(convergence)에 의해 조절된다는 것을 지시해준다. IP3 수용체 억제제인 2ABP와 마찬가지로, BiSM-1과 PP1 둘 다는 AD 및 대조군 세포에서 유사하게 Erk1/2 인산화를 소멸시켰다. 따라서, AD와 연관된 Erk1/2 인산화 증강이 PKC 또는 c-src PTK 활성 상승으로부터 비롯된 것으로는 추정되지 않는다.
Erk1/2 인산화의 AD-특이적 증강의 기초가 되는 시그날링 경로(들)을 분석하는데 있어서, 본 발명자들은 GPCRs에 의한 Erk1/2 활성화에 관여한 또 다른 효소인 PI-3 키나제의 관련성에 대해 시험하였다. 각종 시스템에서의 연구에 근거해 보면, GPCR 자극 후의 PI-3 키나제의 활성화는 PKC의 활성화, Ras의 하단부 및 c-src PTK의 관련성에 좌우된다. 특이적 PI-3 키나제 억제제인 LY294002는 단지, 대조군 섬유아세포에서는 BK-유도된 Erk1/2 인산화을 적당한 수준으로 억제시켰지만, AD세포에서는 전혀 효과를 발휘하지 못하였다. 이는 PI-3 키나제가 정상적인 섬유아세포에서는 BK-활성화 Erk1/2 인산화에 부분적으로 기여하긴 하지만, AD 세포에서의 Erk1/2 인산화는 상기 효소와 독립적인 것으로 여겨진다는 사실을 제시해준다.
Erk1/2/MAPK의 주요 기능은 전사 인자의 조절에 의한 유전자 발현의 활성화이다. CREB의 활성화가 또한 본 연구에서 관찰되었다(Ser133의 인산화). BK 처리시킨지 10분 미만 동안 지속되는, 대조군 세포에서의 Erk1/2의 인산화와는 달리, AD와 대조군 세포 모두에는 BK 처리시킨지 10분 후에 고도로 인산화된 CREB가 존재하였는데, 이는 상이한 시간에 따른 CREB 활성화를 제시해준다. PKC, c-src 및 PI3 키나제의 억제제는 Erk1/2 인산화 억제와 유사한 방식으로 CREB의 인산화를 억제시키는데, 이는 CREB 활성화가 동일한 시그날 경로에 의해 조절된다는 사실을 제시해준다. PP1이 BK-자극된 CREB 인산화를 완전히 억제시키긴 하지만, 이로써 대조군 세포에서의 CREB 단백질 발현이 증가되는데, 이는 정상적인 상보성 피드백 기전을 반영하는 것으로 추정된다. 그러나, 이러한 PP1의 효과가 AD 세포에서는 관찰되지 않았는데, 이는 CREB의 발현 조절이 AD에서는 손상될 수 있다는 것을 제시해준다.
본 결과는 AD 병인론이 도 6에 요약되어 있는 바와 같이 MAPK와 연관된 분자상 케스케이드의 혼란과 관련이 있다는 증거를 제공해준다. 그 밖의 최근의 결과는 MAPK가 신경세포 가소성, 예를 들면, 학습력 및 기억력과 관계된 뇌 기능에 중요하다는 것을 제시해준다. Erk는 tau의 미세소관-결합성 영역 내에 있는, Ser262 및 Ser356을 포함한 다중 Ser/Thr 부위[참조: Reynolds et al., 2000]에서 tau 단백질을 인산화시킨다. Ser262의 인산화는 미세소관을 집합시키고 안정화시키는 tau의 기능상 능력을 현저하게 상쇄시킨다. MAPK와 관련된 상쇄된 시그날링 경로를 사용할 경우, 세포는 수 많은 기타 단백질의 이상 발현을 유도함으로써 세포외 및 세포내 시그날에 반응할 수 있다.
MAPK 인산화 증강 또는 연장과 같은 분자상 시그날링에서의 이상 징후가 전신에 발현되는 것은 행위/인식 결과에 흠을 내는 CNS 상의 이상, 예를 들면, 기억력 상실을 반영할 수 있다. 따라서, 피부 섬유아세포로써 예시된, 용이하게 접근 가능한 말초 부위에서 발견된 세포에서 MAPK의 AD-특이적 비정상 및 이의 관련된 시그날링 경로를 검출하는 것은, AD를 초기에 진단해줄 뿐만 아니라 약물 개발을 위한 치료학적 표적을 동정하는데 있어 효율적이면서 신뢰성 있는 수단을 제공해준다.
실시예 2
헌팅톤 치매(HD)에 걸린 개개인으로부터의 피부 섬유아세포를 사용하여, BK-유도된 연장된 Erk1/2 활성이 AD 특이적인지를 결정하기 위한 시험을 수행하였다. 도 8은 섬유아세포 상에서 Erk1/2 인산화에 대한 브라디키닌의 효과를 나타낸 것이다. N=4 및 P=0.39, t 시험. 상기 HD 세포를 10nM BK로 10분 동안 처리하였다. 도 8은 HD 세포를 10nM BK로 10분 동안 처리할 경우, Erk1/2의 인산화가 연령상 적합한 대조군의 것과 상이하지 않다는 것을 나타내는데, 이는 BK-유도된 Erk1/2 활성 증강이 헌팅톤 치매에는 존재하지 않는다는 것을 지시해준다. 따라서, 본 발명에 따르는 알쯔하이머병에 대한 MAP 키나제 검정은 헌팅톤 치매에 대해 음성의 진단을 제공해주는데, 이는 본 검정이 알쯔하이머병에 대해 특이적이라는 것을 제시해준다.
본 발명의 바람직한 양태를 기재하는데 있어서, 이를 명확히 하기 위해 특정의 용어가 이용되었다. 그러나, 본 발명은 이와 같이 선택된 특정 용어로 제한되지 않는다. 각각의 특정 요소는, 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 작동하는 모든 기술적 등가물을 포함한다는 것을 인지해야 한다.
상기 언급된 본 발명의 양태는 상기 교시에 비추어 볼 때 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 본 발명으로부터 벗어나지 않고서도 변형 또는 변화될 수 있고, 요소들이 부가 또는 생략될 수 있다. 본원에 인용된 각 참조문헌은, 각각이 개별적으로 참조문헌으로 삽입된 바와 같이 본원에 참조문헌으로서 삽입되어 있다.
참조 문헌
2001년 2월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/312,064호 및 하기 문헌들은 본원에서 참조로 인용된다.

Claims (57)

  1. (a) 특정 피험자로부터의 세포에서의 지시인자 단백질의 인산화 기초 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 피험자로부터의 세포를 활성인자 화합물과 접촉시키는데, 상기 활성인자 화합물 및 지시인자 단백질은, 상기 접촉을 개시한 후 예정된 시간에 비-알쯔하이머 대조군 피험자로부터의 세포에서 활성화 인산화 반응과 비교해서 피험자의 세포에서 지시인자 단백질의 활성화 인산화의 차별적 반응을 상기 활성인자가 유발시키도록 선택되는 단계;
    (c) 접촉을 개시한 후 예정된 시간에 상기 피험자 세포 내에서 지시인자 단백질의 활성화 인산화 수준을 측정하는 단계;
    (d) 단계 (a)의 기초 인산화 수준에 대한, 단계 (c)에서 결정된 활성화 인산화 수준의 비율을 산정하는 단계; 및
    (e) 단계 (d)의 산정 비율을, 예정된 시간에서 공지된 알쯔하이머병 세포로부터 측정된 앞서 결정된 활성화 인산화 비율 및 공지된 비-알쯔하이머병 세포로부터 측정된 앞서 결정된 활성화 인산화 비율과 비교하는 단계[여기서, 상기 산정 비율이 상기 공지된 알쯔하이머병 세포에 대해 앞서 결정된 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 양성이고/이거나 산정 비율이 공지된 비-알쯔하이머병 세포에 대해 앞서 결정된 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 음성이다]를 포함하는, 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법.
  2. (a) 피험자의 세포에서, 지시인자 칼슘 시그날링 경로 단백질(이의 인산화는 상기 세포에서 IP-3R-민감성 Ca2+상승과 연관이 있다)의 배경 인산화 수준을 측정하는 단계;
    (b) 비-알쯔하이머 대조군 세포에서의 수준과 비교해서 알쯔하이머병 피험자의 세포에서 지시인자 단백질의 인산화 수준에 있어서의 차별적 반응을 유발시키는 IP3R 효능제와 접촉시킴으로써, 이러한 피험자의 세포를 자극하는 단계;
    (c) 상기 접촉된 세포 내에서 지시인자 단백질의 반응 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 배경 수준과 비교한 지시인자 단백질의 반응 인산화 수준이 알쯔하이머병 피험자로부터의 세포 또는 건강한 대조군 세포에 대해 공지된 반응 수준에 부합되는지를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 먼저, 세포 배양물에서 지시인자 단백질의 배경 인산화 수준을 측정한 다음, IP3R 효능제를 상기 배양물에 가하고, 반응 인산화 수준을 측정함을 포함하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 제1 분취량의 세포에서 배경 수준을 측정하고, 유사한 분취량의 세포를 자극한 다음, 상기 분취량에서 반응 수준을 측정함을 포함하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 측정 단계가 면역검정을 포함하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 측정 단계가 파괴된 세포의 면역검정을 포함하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, IP3-R 효능제가 브라디키닌, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α및 바소프레신으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 세포가 섬유아세포, 볼점막 세포, 신경세포 및 혈액 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  9. (a) 특정 피험자로부터 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 세포에서 지시인자 단백질의 기초 인산화 수준을 측정하는 단계;
    (c) 상기 세포를 지시인자 단백질의 인산화 활성인자와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 접촉 개시 후 예정된 시간에서 상기 세포 내에서의 지시인자 단백질의 인산화 수준을 측정하는 단계; 및
    (e) 단계 (b)에서 측정된 수준에 대한 단계 (d)에서 측정된 수준의 제1 비율을 산정하고, 이러한 제1 비율을, 공지된 알쯔하이머병 세포로부터 예정된 시간에수득된 앞서 결정된 상기 수준의 제2 비율 및 공지된 비-알쯔하이머병 세포로부터 예정된 시간에 수득된 상기 수준의 제3 비율과 비교하는 단계[여기서, (i) 단계 (e)의 제1 비율이 앞서 결정된 제2 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 양성이고 (ii) 단계 (e)의 제1 비율이 앞서 결정된 제3 비율과 통계상 상이하지 않을 경우에는, 진단이 음성이다]를 포함하는, 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계 (d)의 예정된 시간이, 단계 (e)의 제2 비율과 제3 비율 간의 차이가 가장 클 때인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 활성인자가 브라디키닌, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α및 바소프레신으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 측정 단계가 면역검정에 의해 수행되고, 피험자의 세포를 인산화된 지시인자 단백질에 특이적인 항체와 접촉시킴으로써 상기 항체가 지시인자 단백질과 결합되도록 하여 지시인자 단백질에 결합된 항체를 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 면역검정이 방사성 면역검정, 웨스턴 블롯 검정, 면역형광성 검정, 효소 면역검정, 면역침전 검정, 화학발광성 검정, 면역조직화학적검정, 도트 블롯 검정, 또는 슬롯 블롯 검정인 방법.
  14. (a) 피험자로부터의 세포를, 희석제 중의 특정 화합물(이러한 화합물은 지시인자 단백질의 칼슘 시그날링 경로-매개된 인산화를 자극함으로써 자극된 세포를 생성시킨다)과 함께 항온처리하는 단계;
    (b) 단계 (a) 이전, 이와 동시에 또는 이후에, 상기 피험자로부터의 동일한 유형의 세포를 대조군 화합물 또는 상기 희석제와 함께 항온처리함으로써, 자극되지 않은 대조군 세포를 생성시키는 단계; 및
    (c) 자극된 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 수준을, 자극되지 않은 대조군 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 수준과 비교하는 단계[여기서, 자극되지 않은 세포와 비교해서 자극된 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 수준 증가는 알쯔하이머병의 존재를 지시해준다]를 포함하는, 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 비교 단계 (c)가
    (i) 상기 자극된 세포 및/또는 자극되지 않은 세포로부터의 단백질 샘플을, 인산화된 지시인자 단백질을 인식하는 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (ii) 상기 지시인자 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 자극된 세포 및/또는 자극되지 않은 세포로부터의 단백질 샘플을, 인산화되지 않은 형태의 지시인자 단백질을 인식하는 항체와 접촉시키고 인산화되지 않은 지시인자 단백질에 대한 상기 항체의 결합을 검출함을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 비교 단계가, 상기 자극된 세포 및 자극되지 않은 세포로부터 단백질 샘플을 수득함을 추가로 포함하는 방법.
  18. 특정 피험자로부터의 세포를, 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 수용체를 통하여 세포내 칼슘 방출을 촉발시키는 제제와 접촉시키는 단계;
    이러한 접촉 단계 후 1회 이상의 시점에서 상기 피험자의 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을 측정하는 단계; 및
    1회 이상의 시점에서 상기 피험자의 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을, 대조군 세포를 상기 제제와 접촉시킨 후 동일한 시점에서 비-알쯔하이머 대조군 피험자로부터의 세포에서의 인산화 양과 비교하는 단계[여기서, 대조군 세포와 비교하여 피험자의 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양의 증가는 알쯔하이머병의 진단지표이다]를 포함하는, 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제제가 브라디키닌 또는 브라디키닌 수용체 효능제인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 제제가 봄베신인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 효능제가 IP3-매개된 Ca2+방출을 유도하는 제제인 방법.
  22. 제18항에 있어서, MAPK 단백질이 Erk1/2인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 인산화 양이 접촉 단계 후 단일 시점에서 측정되는 방법.
  24. 제18항에 있어서, 측정 단계가, 접촉 단계 후 제1 시점에서 제1 분취량의 피험자 세포에서의 인산화 양을 측정하고, 접촉 단계 후 제2 시점에서 제2 분취량의 피험자 세포에서의 인산화 양을 측정함을 포함하는 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 시점이 하나 이상의 약 0.5분, 1분, 2분, 2.5분, 5분, 10분, 20분 및 30분 중에서 선택되는 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 세포가 말초 조직으로부터 유래되는 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 세포가 피부 섬유아세포인 방법.
  28. 제18항에 있어서, 측정 단계가, 피험자의 세포의 용해물에서 인산화를 검출함을 포함하는 방법.
  29. 제18항에 있어서, 측정 단계가 시험관 내에서 수행되는 방법.
  30. 제18항에 있어서, 측정 단계가 겔 전기영동을 포함하는 방법.
  31. 제18항에 있어서, 측정 단계가 웨스턴 블롯팅을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 웨스턴 블롯팅이 항-포스포-MAP 키나제 항체를 사용함을 포함하는 방법.
  33. 제18항에 있어서, 인산화 증가가 단일 시점에서의 인산화된 단백질량의 상승인 방법.
  34. 제18항에 있어서, 인산화 증가가 인산화된 단백질의 존속 기간 증가인 방법.
  35. 제18항에 있어서, 피험자에서 알쯔하이머병의 임상적 징후가 결여된 방법.
  36. 제18항에 있어서, 피험자의 세포를, 단백질 키나제 C 활성 억제제, PI-3 키나제 활성 억제제, C-src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제, IP-3 수용체의 억제제 및 단백질 포스파타제의 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 억제제와 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제18항에 있어서, 인산화 증가가, 피험자의 세포를, 단백질 키나제 C 활성 억제제, C-src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제, PI-3 키나제 활성 억제제 및 IP-3 수용체의 억제제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 억제제와 접촉시킴으로써 억제되는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 억제제가 BiSM-1, PP1 및 2-아미노에톡시디페닐 보레이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  39. 알쯔하이머병 피험자로부터의 시험 세포를, 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계;
    이러한 접촉 단계 전, 동안 또는 후에, 상기 시험 세포를, 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 수용체를 통하여 세포내 칼슘 방출을 촉발시키는 제제로 자극하는 단계;
    상기 시험 세포의 자극 후 1회 이상의 시점에서 시험 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을 측정하는 단계;
    1회 이상의 시점에서 시험 세포에서의 MAPK 단백질의 인산화 양을, 상기 화합물과 접촉되지 않은 AD 피험자로부터의 대조군 세포에서 동일한 1회 이상의 시점에서 인산화의 양과 비교하는 단계; 및
    선도 화합물로서 인산화 증가를 억제 또는 방지하는 화합물은 채택하고 인산화 증가를 억제 또는 방지하지 않는 화합물은 거부하는 단계를 포함하는, 알쯔하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 제제가 브라디키닌 또는 브라디키닌 수용체 효능제인 방법.
  41. 제38항에 있어서, MAPK 단백질이 Erk1/2인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 접촉 단계 후 단일 시점에서 인산화의 양을 측정함을 포함하는 방법.
  43. 제38항에 있어서, 상기 세포가 피부 섬유아세포인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 측정 단계가 피험자의 세포의 용해물에서 인산화를 검출함을 포함하는 방법.
  45. AD 세포 및 대조군 세포에서 지시인자 단백질의 인산화에 대한 특정 화합물의 효과를 측정하는 단계; 및 대조군 세포와 비교하여, AD 세포에서 양 및/또는 존속 기간에 있어서 지시인자 단백질의 인산화를 증가시키는 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 자극-반응 검정에서 활성인자 화합물로서의 유용성에 대해 화합물을 스크리닝하는 방법.
  46. 항-포스포-MAPK 단백질 항체와 브라디키닌을 포함하는, 알쯔하이머병용 진단 시험 키트.
  47. 가능한 치료학적 화합물을 선별하는 단계;
    이러한 가능한 치료학적 화합물을 알쯔하이머병 환자에게 투여하는 단계; 및
    지시인자 단백질의 인산화를 자극시키는 화합물로 상기 세포를 활성화시킨 후, 상기 환자의 세포에서 인산화된 지시인자 단백질의 비정상적으로 상승된 수준의 존재 또는 부재를 검출하는 단계[여기서, 상승된 수준의 존재는 가능한 치료학적 화합물이 환자에 유효하지 않다는 것을 지시해주고, 상승된 수준의 부재는 가능한 치료학적 화합물이 환자에 대해 치료학적이라는 것을 지시해준다]를 포함하는, 알쯔하이머병 환자용 약제를 선별하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 환자에 대해 치료학적인 것으로 밝혀진 화합물을 피험자에게 투여함으로써 상기 피험자에게서 알쯔하이머병을 치료 또는 예방함을 추가로 포함하는 방법.
  49. (a) 대조군 세포와 비교해서 피험자의 세포에서 비정상적으로 상승된 MAPK 단백질의 인산화 수준을 억제 또는 방지하고/하거나
    (b) 상기 MAPK 단백질의 비정상적으로 상승된 인산화로 인해 유발된 사건을 억제시키는 약제의 유효량을 투여함을 포함하여, 피험자에게서 알쯔하이머병을 치료 또는 예방하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 약제가 Erk1/2 인산화를 억제시키는 방법.
  51. 제49항에 있어서, 상기 약제가 단백질 키나제 C 활성 억제제, src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제, 또는 IP-3 수용체의 억제제인 방법.
  52. 제37항에 있어서, 상기 억제제가 BiSM-1, PP1 및 2ABP로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  53. (a) 피험자 및 비-알쯔하이머병의 대조군 피험자로부터의 피부 섬유아세포를, 인산화를 자극하기에 유효한 농도의 브라디키닌과 접촉시키는 단계;
    (b) 포스포-Erk1/2에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해, 2분,5분, 10분, 20분 및 30분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1회 이상의 시점에서 상기 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을 측정하는 단계;
    (c) 포스포-Erk1/2에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해, (b)에서와 동일한 시점에서 비-알쯔하이머병의 대조군 피험자로부터의 세포에서 인산화된 Erk1/2의 양을 측정하는 단계[여기서, 단계 (b) 및 (c)에서 인산화된 Erk1/3의 양을 상기 세포에 존재하는 단백질의 양에 대해 표준화시킨다]; 및
    (d) 상기 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을, 상기 시점에서 대조군 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양과 비교하는 단계[여기서, 상기 1회 이상의 시점에서 대조군 세포와 비교해서 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양이 증가한다는 것은 알쯔하이머병의 진단지표이다]를 포함하여, 피험자에게서 알쯔하이머병을 진단하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 피험자의 세포를,
    (a) 단백질 키나제 C 활성 억제제인 BiSM-1;
    (b) C-src 단백질 티로신 키나제 활성 억제제인 PP1; 및
    (c) IP-3 수용체의 억제제인 2-아미노에톡시디페닐 보레이트
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 억제제와 접촉시키는 단계[여기서, 대조군 세포와 비교해서 피험자의 세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양의 브라디키닌-유도된 증가는 상기 억제제에 의해 저하된다]를 추가로 포함하는 방법.
  55. a) 특정 피험자로부터의 세포를, 지시인자 단백질의 인산화를 증가시키는 활성인자 화합물로 자극하는 단계; 및
    b) 자극된 세포에서의 인산화되지 않은 지시인자 단백질 및 인산화된 지시인자 단백질의 수준을, 상기 피험자로부터의 동일한 유형의 자극되지 않은 세포에서의 인산화되지 않은 지시인자 단백질 및 인산화된 지시인자 단백질의 수준과 비교하는 단계[여기서, 자극되지 않은 세포와 비교해서 자극된 세포에서의 인산화된 지시인자 단백질의 상대적 수준 증가는 알쯔하이머병의 존재를 지시한다]를 포함하여, 피험자에게서 알쯔하이머병의 존재를 진단하는 방법.
  56. (a) 알쯔하이머병 피험자로부터의 시험 피부 섬유아세포를, 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 피험자로부터의 대조군 피부 섬유아세포를, 상기 화합물에 대한 제어 제제와 접촉시키거나, 또는 이러한 대조군 섬유아세포를 상기 화합물 또는 제어 제제의 부재하에 항온처리하는 단계;
    (c) 단계 (a) 및 (b) 전, 동안 또는 후에, 상기 시험 및 대조군 섬유아세포를, 인산화를 자극하는데 유효한 농도의 브라디키닌으로 자극하는 단계;
    (d) 포스포-Erk1/2에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해, 2분, 5분, 10분, 20분 및 30분으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1회 이상의 시점에서 상기 시험 및 대조군 섬유아세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을 측정하는 단계[여기서, 인산화된 Erk1/3 양은 상기 시험 및 대조군 섬유아세포에 존재하는 단백질의양에 대해 표준화시킨다]; 및
    (e) 시험 섬유아세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양을 대조군 섬유아세포에서의 인산화된 Erk1/2의 양과 비교하여, 해당 단백질이 대조군 세포와 비교해서 시험 세포에서 Erk1/2의 인산화에 있어서의 브라디키닌-유도된 증가를 억제 또는 방지하는지를 결정하는 단계[여기서, 인산화 증가를 억제 또는 방지하는 화합물이 알쯔하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 동정된다]를 포함하여, 알쯔하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법.
  57. 특정의 사람 세포를, 대조군 세포에서의 수준으로 인산화 수준을 감소시키기에 유효한 MAPK의 인산화 억제제와 접촉시킴을 포함하여, 대조군 사람 세포와 비교해서 MAPK 단백질의 IP3 수용체 매개된 인산화 증가를 나타내는 사람 세포에서 아밀로이드 전구체 단백질의 단백질 분해, 아밀로이드 단백질 β의 분비 및/또는 tau 단백질의 인산화를 저하시키는 방법.
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