KR20100132997A - 알츠하이머병 특이적 Ｅｒｋ1/Ｅｒｋ2 인산화 비의 변경 - 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ＡＤＳＭＢ) - Google Patents

Abstract

본 발명은 알츠하이머병의 진단 방법, 및 피검체의 알츠하이머병의 존재 또는 부재의 확인 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 비알츠하이머 세포를 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉시키고, 상기 세포를 단백질 키나제 C 활성제로 자극하고, 상기 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 측정함으로써 알츠하이머병의 치료에 유용한 납 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 단백질 키나제 C 활성제로 자극시킨 후의 세포 중의 특정 인산화 MAP 키나제 단백질의 비 변화를 검출함으로써 피검체의 알츠하이머병을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 알츠하이머병의 진단, 피검체의 알츠하이머병의 진행 모니터링, 및 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 사용하는 알츠하이머병의 존재 또는 부재의 검출 및 진단용 시약에 대한 스크리닝 방법에 유용하다. 또한 본 발명은, 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 사용하는 알츠하이머병의 존재 또는 부재의 검출 및 진단용 시약을 함유하는 키트에 관한 것이다.

Description

알츠하이머병 특이적 Ｅｒｋ1/Ｅｒｋ2 인산화 비의 변경 - 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ＡＤＳＭＢ) {Alzheimer's disease-specific alterations of the Erk1/Erk2 phophorylation ratio - Alzheimer's disease-specific molecular biomarkers(ADSMB)}

본원은 2005년 10월 11일자로 출원된 동시 계류중인 출원 제PCT/US2005/036014호의 일부 계속 출원인, 2006년 6월 7일자로 출원된 동시 계류중인 출원 제PCT/US2006/022156호의 일부 계속 출원이며, 두 출원 모두 본원에 전문이 참조로 인용된다.

본 발명은 알츠하이머병을 진단하거나 피검체의 알츠하이머병의 존재 또는 부재를 확인하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 데 유용한 치료제의 개발에 사용될 수 있는 납 화합물에 대한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 단백질 키나제 C 활성제로 자극 후 세포 중의 특정 포스포릴화 MAP 키나제 단백질 비의 변경을 검출함으로써 피검체의 알츠하이머병을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB)는 알츠하이머병의 진단, 질환 진행 모니터링 및 납 화합물의 확인용 스크리닝 방법에 유용하다. 또한 본 발명은, 알츠하이머병의 치료에 대한 증가된 반응성을 갖는 환자를 선택하는 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병(AD)의 병인에 세포외 칼슘 항상성의 동요, 산화 스트레트의 증가된 수준 및 자극적 독성 및 신경 세포사를 발생시키는 염증 메카니즘이 그 원인이 된다고 제안된 바 있다(참조: Ito et al., 1994, Putney, 2000; Yoo et al., 2000; Sheehan et al., 1997; De Luigi et al., 2001; Anderson et al., 2001; Remarque et al., 2001). 세포외 Ca^{2 +} 수준 및 기타 세포 과정에서의 다수의 AD 관련된 이상은 자극으로서 브래디키닌을 사용한 연구로부터 유도되었다. 강력한 염증 매개체로서, 브래디키닌(BK)은 외상, 발작, 허혈 통증 및 천식 등의 병리생리학적 상태하의 뇌 및 말초 세포에 의해 생성된다(참조: Regoli et al., 1993; Bockmann & Paegelow, 2000; Ellis et al., 1989; Kamiya et al., 1993). G-단백질 커플링된 수용체인, B2 브래디키닌 수용체(BK2bR)에 대하여 작용함으로써 BK는 포스포리파제 C(PLC)의 활성을 통하여 포스파디딜리노시톨(PI) 전도를 촉발시키고, 이는 차례로 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트(IP3) 민감성 스토어로부터의 세포외 Ca²⁺ 방출을 증가시키는 IP3를 생성한다(참조: Noda et al., 1996; Venema et al., 1998; Wassdal et al., 1999; Cruzblanca et al., 1998; Ricupero et al., 1997; Pascale et al., 1999). 동일한 경로를 통하여, BK는 또한 미토겐 활성화 단백질(MAP) 키나제의 활성화를 통하여 기타 전염증성 시토카인의 생성을 촉발시킨다(참조: Hayashi et al., 2000; Schwaninger et al., 1999; Phagoo et al., 2001). 세포외 Ca^{2 +} 수준의 강화된 상승이, 브래디키닌의 자극과 K⁺ 채널의 불활성화에 반응하여 AD 뇌 세포 뿐만 아니라 AD 말초 세포에서 발견되었다(참조: Etcheberrigaray et al., 1993, 1998; Hirashima et al., 1996; Gibson et al., 1996(a)).

BK2bR 활성화 이후의 PLC의 자극은 또한, 증가된 세포외 Ca^{2 +}와 함께 단백질 키나제 C(PKC) 이소형을 활성화시는 디아실글리세롤의 생성을 유도한다. BK 활성화 PLC/인지질-Ca^{2 +}/PKC 캐스케이드는 Ras/Raf 신호전달 경로와 상호 작용하며, 이는 MAP 키나제 계통의 아형인 세포외 신호 조절된 키나제 1/2(Erk1 및 Erk2, 함께 "Ekr1/2"라고 함)를 활성화시킨다(참조: Berridge, 1984; BAssa et al., 1999; Hayashi et al., 2000; Blaukat et al., 2000, Zhao et al., Neurobiology of Disease 11, 166-183, 2002). Erk1/2는 다중 신호 전달 경로로부터 신호를 수용하여, AP-1, NF-κB 및 사이클릭 AMP-반응성 요소 결합 단백질(CREB)을 포함하는, 다수의 전사 인자를 통한 유전자 발현의 조절에 의해 세포 증식 및 분화를 유도한다. Erk2는 주요 키나제 중의 하나로서 작용함으로써, Ser-262 및 Ser-356을 포함하는 다중 세린/트레오닌 부위에서 tau를 인산화시킨다(참조: Reynolds et al., 1993; Lu et al., 1993). 또한, PKC-활성화 MAP 키나제 및 BK 수용체 결합된 경로는 상이한 실험들에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(sAPP)의 가용성 형태의 형성 및 분비를 조절하는 것으로 나타났다(참조: Desdouits-Magnen et al., 1998; Gasparini et al., 2001; Nitsch et al., 1994, 1995, 1996, 1998). 이러한 발견은 BK-결합된 sAPP 공정이 PKC-MAP 키나제 경로에 연결될 수 있는 가능성을 제안하였다. 다른 한편으로, 바이러스성 감염, 증가된 산화 스트레스, APP의 비정상적 발현 및 APβ로의 노출과 같은 병리학적 상태가 MAP 키나제의 활성화(참조: Rodems & Spector, 1998; McDonald et al., 1998; Ekinci et al., 1999; Grant et al., 1999) 및 강화된 tau 인산화(참조: Greenberg et al., 1994; Ekinci & Shea, 1999; Knowles et al., 1999)를 발생시킨다. 이러한 효과는 AD의 병인에 있어서의 MAP 키나제 신호전달 경로(들)의 교란을 관련시킨다.

미토겐 활성화 단백질 키나제(예: Erk1 및 Erk2)는 미소관 관련된 단백질 tau의 인산화 및 아밀로이드 단백질 β의 아밀로이드의 가공을 조절하며, 두 경우 모두 알츠하이머병의 병리생리학에 결정적이다. 브래디키닌에 반응하여 강화되고 연장된 Erk1/2 인산화는 연령 대비된 대조군이 아닌, 가족성 및 산발성 둘 다의 알츠하이머병의 섬유아세포에서 검출되었다(참조: Zhao et al., Neurobiology of Disease 1 1, 166-183, 2002). 브래디키닌에 의해 유도된 지속적 Erk1/2 인산화는 이전에 알츠하이머병 섬유아세포에서 발견된 바 있으며, 본원에서 전체적으로 참고로 인용된, 제WO 02/067764호의 주제이다.

알츠하이머병을 진단하고 알츠하이머병의 치료 및 예방에 유용한 화합물을 스크리닝하는 매우 민감하고 매우 특이적인 시험에 대한 요구가 존재한다. 본 발명자들은 최초로, 이전에 공지된 진단 시험에 비해 매우 민감하고 매우 특이적인 방식으로 알츠하이머병의 진단에 유용한 독특한 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 밝혀내었다. 따라서, 본원에 기재된 독특한 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 알츠하이머병의 검출 및 진단에 대한 고도의 민감성 및 특이성을 갖는 진단 방법에 대한 기초로서 알맞다. 본 발명의 독특한 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 또한 알츠하이머병의 치료 및 예방에 치료제로서 사용될 수 있는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법에도 유용하다.

[발명의 요약]

특정 양태에서, 본 발명은 환자로부터의 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키고, 상기 세포에서 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값을 측정함을 포함하는 알츠하이머병의 치료에 대한 증가된 반응성을 갖는 환자를 선택하는 방법으로서, 상기 세포의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값이 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 높은 양의 값(high positive value)인 경우에, 상기 환자의 알츠하이머병의 치료에 대한 상기 증가된 반응성이 나타나는 방법에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 상기 세포는 말초 세포이다. 특정한 바람직한 양태에서, 상기 세포는 피부 세포, 피부 섬유아세포, 혈구 및 협점막 세포로 이루어진 그룹으부터 선택된다.

특정 양태에서, 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 상기 높은 양의 값은 치매 0 내지 1년, 또는 0 내지 2년, 또는 0 내지 3년, 또는 0 내지 4년, 또는 0 내지 5년, 또는 0 내지 6년을 나타낸다.

특정 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정 양태에서, 본 발명은 환자로부터의 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키고, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값을 측정함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료에 증가된 반응성을 갖는 환자를 선택하는 방법으로서, 상기 세포의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 상기 값이 대조 세포로부터의 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값보다 큰 경우에, 상기 환자의 알츠하이머병의 치료에 대한 증가된 반응성이 나타나는 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 상기 세포는 말초 세포이다. 특정한 바람직한 양태에서, 상기 세포는 피부 세포, 피부 섬유아세포, 혈구 및 협점막 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정 양태에서, 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 높은 양의 값은 치매 0 내지 1년, 또는 0 내지 2년, 또는 0 내지 3년, 또는 0 내지 4년, 또는 0 내지 5년, 또는 0 내지 6년을 나타낸다.

특정 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

특정 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료에 대한 증가된 반응성을 갖는 것으로 확인된 환자에게 치료학적 유효량의 약제를 투여함을 포함하는, 본원에 기재된 방법들 중의 어느 하나에 의한 상기 환자의 치료 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 피검체의 알츠하이머병의 존재 또는 부재를 결정하거나 확인하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 피검체로부터의 세포를 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉시키고, 당해 접촉 단계가 상기 세포의 알츠하이머병 표현형을 유도하는지를 측정함을 포함하며, 여기서, 상기 피검체의 알츠하이머병의 부재는, 알츠하이머병 표현형이 접촉 단계에 의해 세포에서 유도되는 경우 달성되거나 나타난다. 특정 양태에서, 상기 피검체의 알츠하이머병의 존재는, 상기 아밀로이드 베타 펩티드를 사용한 배양이 상기 세포에 있어서 알츠하이머병 표현형의 현저한 변경 또는 변화를 발생시키는 경우, 달성되거나 나타난다. 알츠하이머병 표현형의 현저한 변경 또는 변화가 없다는 것은, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값이, 상기 세포가 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉하기 전의 이의 값과 비교하여 변하지 않거나, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 상기 값이 상기 세포가 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉 전의 이의 값과 비교하여 약 15% 미만, 또는 약 14% 미만, 또는 약 13% 미만, 또는 약 12% 미만, 또는 약 11% 미만, 또는 약 10% 미만, 또는 약 9% 미만, 또는 약 8% 미만, 또는 약 7% 미만, 또는 약 6% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 4% 미만, 또는 약 3% 미만, 또는 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만, 또는 약 0.25% 미만 변화되거나 변경됨을 의미한다.

특정 양태에서, 상기 아밀로이드 베타 펩티드는 Aβ(1-42)이지만, 어떠한 아밀로이드 베타 펩티드라도 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, 상기 방법은 상기 세포를 단백질 키나제 C 활성제와 접촉시킴을 포함한다. 추가의 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 추가의 양태에서, 상기 세포는 말초 세포이다. 추가의 양태에서, 상기 세포는 섬유아세포, 타액, 혈액, 뇨, 피부 세포, 협점막 세포 및 뇌척수액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본원에 기재된 모든 방법은 생체내에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 시험관 내에서 수행된다.

본 발명의 특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 표현형은, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값이 0을 초과하는 양수인 경우, 상기 세포에서 유도된다.

본 발명의 바람직한 양태는 피검체로부터의 세포를 Aβ(1-42)와 접촉시키고; 상기 세포를 브래디키닌과 접촉시키고; 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값을 측정함을 포함하는 피검체의 알츠하이머병의 존재의 결정 또는 확인 방법으로서, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 상기 값이 0을 초과하는 양수인 경우에 상기 피검체의 알츠하이머병의 부재가 달성되거나 나타나는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 상기 아밀로이드 베타 펩티드를 사용한 항온배양의 결과 상기 세포에서 알츠하이머병 표현형의 현저한 변경 또는 변화가 발생하지 않는 경우에, 상기 피검체의 알츠하이머병의 존재는 달성되거나 나타난다. 알츠하이머병 표현형의 현저한 변경 또는 변화가 없다는 것은 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 상기 값이 상기 세포가 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉하기 전의 이의 값과 비교하여 변하지 않거나, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값이 세포가 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉 전의 이의 값과 비교하여 약 15% 미만, 또는 약 14% 미만, 또는 약 13% 미만, 또는 약 12% 미만, 또는 약 11% 미만, 또는 약 10% 미만, 또는 약 9% 미만, 또는 약 8% 미만, 또는 약 7% 미만, 또는 약 6% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 4% 미만, 또는 약 3% 미만, 또는 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만, 또는 약 0.25% 미만 변화되거나 변경됨을 의미한다. 추가의 더욱 바람직한 양태에서, 상기 세포는 말초 세포이다. 추가의 더욱 바람직한 양태에서, 상기 세포는 섬유아세포, 타액, 혈액, 뇨, 피부 세포, 협점막 세포 및 뇌척수액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또한 본 발명은, 상기 비알츠하이머 세포를 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉시키는 단계, 동일 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키는 단계, 상기 세포를 시험 화합물과 추가로 접촉시키는 단계 및 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값을 측정하는 단계를 포함하여 알츠하이머병의 치료에 유용한 납 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 한 양태에서, 상기 아밀로이드 베타 펩티드는 Aβ(1-42)이지만, 어떠한 아밀로이드 베타 펩티드라도 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 비알츠하이머 세포는 섬유아세포, 타액, 혈액, 뇨, 피부 세포, 협점막 세포 및 뇌척수액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 상기 값은, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값이 상기 시험 화합물과 접촉한 적이 없는 대조 세포로부터 측정한 유사한 분자 바이오마커의 값보다 작은 경우, 알츠하이머병의 치료에 유용한 화합물을 나타낸다. 바람직한 양태에서, 상기 대조 세포는 아밀로이드 베타 펩티드와 접촉시켰다. 기타 바람직한 양태에서, 상기 아밀로이드 베타 펩티드는 Aβ(1-42)이지만, 어떠한 아밀로이드 베타 펩티드라도 사용될 수 있다. 기타 더욱 바람직한 양태에서, 상기 대조 세포는 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시켰다.

특정 양태에서, 상기 알츠하이머병의 치료에 유용한 납 화합물을 확인하는 방법은, 알츠하이머병의 치료에 유용한 것으로 확인된 화합물을 개질시켜 개질되지 않은 화합물의 안전성 및 효능과 비교하여 이의 안전성 및 효능을 최적화시키거나 개선시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 양태에서, 확인된 개질된 화합물은 알츠하이머병의 치료에 유용하다.

또한 본 발명은, 치료학적 유효량의 개질된 화합물을 이를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은, 비알츠하이머 대조 세포를 Aβ(1-42)(그러나 어떠한 아밀로이드 베타 펩티드라도 사용될 수 있음)와 접촉시키고, 상기 동일한 대조 세포를 브래디키닌과 접촉시키고, 상기 대조 세포를 시험 화합물과 추가로 접촉시키고, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값을 측정하여 알츠하이머병의 치료에 유용한 화합물을 확인함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료에 유용한 화합물의 확인 방법에 관한 것이다.

본 발명은, 특정한 양태에서, 피검체로부터 수득한 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키는 단계 및 상기 세포 중의 특정 인산화 MAP 키나제 단백질의 비를 측정하여 상기 피검체의 알츠하이머병을 진단하는 단계를 포함하는, 피검체의 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 특정 인산화 MAP 키나제 단백질의 비는 두 인산화 MAP 키나제 단백질 사이의 비이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 진단 방법은 시험관내 검정을 포함한다. 진단 방법의 추가의 더욱 바람직한 양태에서, 특정 인산화 MAP 키나제 단백질은 서로에 대한 서열 변이이고 단백질의 동일 계통에 속한다.

본 발명의 특정 양태에서, 특정 인산화 MAP 키나제 단백질의 비는 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비이고, 인산화 Erk1의 정규화된 양을 인산화 Erk2의 정규화된 양으로 나누어 계산한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 특정 양태에서, 진단 검정에 사용되는 세포는 말초 세포이다. 바람직한 양태에서, 상기 세포는 피부 세포, 피부 섬유아세포, 혈구 또는 협점막 세포일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 세포는 뇌척수액으로부터 분리되지 않는다. 기타 바람직한 양태에서, 상기 세포는 뇌척수액을 포함하지 않는다. 기타 더욱 바람직한 양태에서, 상기 세포는 척수 천자 또는 요추 천자에 의해 수득되지 않는다.

진단 방법의 특정 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 혈청을 포함한 매질 중의 세포와 접촉시킨다. 본 발명의 기타 바람직한 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 무혈청 매질 중의 세포와 접촉시킨다.

본 발명의 진단 방법의 특정 양태에서, 인산화 MAP 키나제 단백질은 면역검정에 의해 검출한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 면역검정은 방사면역검정, 웨스턴 블럿(Western blot) 검정, 면역형광 검정, 효소 면역검정, 면역침전 검정, 화학발광 검정, 면역조직화학적 점정, 면역전기영동 검정, 도트 블럿(dot blot) 검정 또는 슬로트 블럿(slot blot) 검정일 수 있다. 본 발명의 진단 방법의 추가의 바람직한 양태에서, 단백질 어레이 또는 펩티드 어레이 또는 단백질 마이크로어레이가 진단 방법에 사용될 수 있다.

특정 양태에서, 본원에 기재된 진단 방법들 중의 어느 하나를 사용하여 알츠하이머병의 음성 진단이 달성되거나 나타난 경우(즉, 알츠하이머병의 존재를 나타내는 결과의 부재 또는 결핍), 알츠하이머병의 부재를 결정하는 것에 대한 본원에 기재된 진단 방법을 사용하여 추가의 확인적 진단 방법이 수행될 수 있다. 이러한 확인적 진단 방법은 본원에 기재된 진단 방법들 중의 어느 하나와 함께 또는 후속적으로 수행될 수 있다. 유사하게, 본원에 기재된 진단 방법들 중의 어느 하나를 사용하여 알츠하이머병의 양성 진단이 나타난 경우(즉, 결과는 알츠하이머병의 존재를 나타냄), 알츠하이머병의 존재를 결정하는 데 대한 본원에 기재된 진단 방법을 사용하여 추가의 확인적 진단 방법이 수행될 수 있다. 이러한 확인적 진단 방법은 본원에 기재된 진단 방법들 중의 어느 하나와 함께 또는 후속적으로 수행될 수 있다.

본 발명의 진단 방법의 특정 양태에서, 피검체로부터의 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시킨 다음 인산화 제1 MAP 키나제 단백질 대 인산화 제2 MAP 키나제 단백질의 비를 측정함으로써(여기서, 인산화 제1 및 인산화 제2 MAP 키나제 단백질은 단백질 키나제 C 활성제와 접촉시킨 후 세포로부터 수득한다) 피검체에서 알츠하이머병이 진단될 수 있다. 본 발명의 진단 방법의 추가의 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제와 접촉한 적이 없는 피검체로부터의 세포 중의 인산화 제1 MAP 키나제 단백질 대 인산화 제2 MAP 키나제 단백질의 비가 측정되고, 상기 비는, 단백질 키나제 C 활성제와 접촉한 후의 세포로부터 수득한 인산화 제1 및 제2 MAP 키나제 단백질의 비로부터 감산하여, 상기 비들 사이의 차이를 기준으로 하여 상기 피검체의 알츠하이머병의 존재를 진단한다. 본 발명의 진단 방법의 바람직한 양태에서, 상기 비의 차이는 차이가 양의 값인 경우, 상기 차이는 피검체의 알츠하이머병을 진단하는 것이다.

본 발명의 진단 방법의 기타 바람직한 양태에서, 당해 차이가 음의 값 또는 0인 경우, 이러한 차이는 피검체의 알츠하이머병의 부재를 진단하는 것이다.

본 발명의 특정 양태는 피검체의 알츠하이머병 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태에서, 상기 키트는 단백질 키나제 C 활성제이고, 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 키트는 인산화 제1 MAP 키나제 단백질에 특이한 항체를 함유할 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 키트는 인산화 제2 MAP 키나제 단백질에 특이한 항체를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 키트는 상기한 것들의 임의 조합을 함유할 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 피검체의 알츠하이머병 진단용 상기 키트는 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 키나제 C 활성제를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 키트는 상기한 것들의 임의 조합을 함유할 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 피검체의 알츠하이머병 진단용 상기 키트는 인산화 Erk1 또는 인산화 Erk2 또는 이들 둘 다에 특이한 항체를 함유할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 키트는 항-포스포-Erk1 항체를 함유할 수 있다. 본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 상기 키트는 항-포스포-Erk2 항체를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에서, 상기 키트는 상기한 것들의 임의 조합을 함유할 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 진단용 키트는 아밀로이드 베타 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 아밀로이드 베타 펩티드는 Aβ(1-42)일 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 피검체의 알츠하이머병 존재 또는 부재의 진단용 키트는 아밀로이드 베타 펩티드; 인산화 제1 MAP 키나제 단백질 특이성 항체; 및 인산화 제2 MAP 키나제 단백질 특이성 항체를 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 아밀로이드 베타 펩티드는 Aβ(1-42)이다. 바람직한 양태에서, 상기 키트는 상기한 것들의 임의 조합을 함유할 수 있다.

본 발명의 특정 양태는, 알츠하이머병으로 진단된 피검체로부터 분리한 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키고(여기서, 접촉은 시험 화합물(또는 납 화합물)의 존재하에 수행된다); 인산화 제1 MAP 키나제 단백질 대 인산화 제2 MAP 키나제 단백질의 비를 측정하고(여기서, 인산화 제1 및 인산화 제2 MAP 키나제 단백질은 접착 후 세포로부터 수득한다); 상기 시험 화합물(또는 납 화합물)과 접촉한 적이 없는 피검체로부터의 세포 중의 인산화 제1 MAP 키나제 단백질 대 인산화 제2 MAP 키나제 단백질의 비를 측정하고; 상기 시험 화합물(또는 납 화합물)의 존재하에 수행된 접촉 단계로부터 수득한 비에서 상기 시험 화합물(또는 납 화합물)의 부재하에 수행된 접촉 단계로부터 수득한 비를 감산하고; 당해 비의 차이를 기준으로 하여, 알츠하이머병의 치료에 유용한 시험 화합물(또는 납 화합물)을 확인함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 시험 화합물(또는 납 화합물)의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 시험 화합물(또는 납 화합물)의 스크리닝 방법의 바람직한 양태에서, 상기 비의 계산된 차이는, 상기 차이가 음의 값 또는 0인 경우, 알츠하이머병에 유용한 시험 화합물(또는 납 화합물)을 나타낸다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 시험 화합물(또는 납 화합물)의 스크리닝 방법(여기서, 당해 방법은 시험관내 검정을 포함한다)에 관한 것이다.

알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 시험 화합물(또는 납 화합물)의 스크리닝 방법의 바람직한 양태에서, 제1 MAP 키나제 단백질은 Erk1이고, 제2 MAP 키나제 단백질은 Erk2이다. 본 발명의 추가의 더욱 바람직한 양태에서, 상기 비는, 인산화 Erk1의 정규화된 양을 인산화 Erk2의 정규화된 양으로 나누어 계산한다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 세포는 말초 세포이다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 말초 세포는 피부 세포, 피부 섬유아세포, 혈구 및 협점막 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 세포는 뇌척수액으로부터 분리되지 않는다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 세포는 뇌척수액을 포함하지 않는다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 세포는 척수 천자 또는 요추 천자에 의해 수득되지 않는다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 혈청을 포함하는 매질 중의 세포와 접촉시킨다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 무혈청 매질 중의 세포와 접촉시킨다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 인산화 MAP 키나제 단백질은 면역검정에 의해 검출된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 면역검정은 방사능 면역검정, 웨스턴 블럿 검정, 면역형광 검정, 효소 면역검정, 면역침전 검정, 화학발광 검정, 면역조직화학적 점정, 면역전기영동 검정, 도트 블럿 검정 또는 슬로트 블럿 검정이다. 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 측정은 단백질 어레이, 펩티드 어레이 또는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 수행된다.

특정 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 측정함을 포함하는 피검체의 알츠하이머병 진행의 모니터링 방법에 관한 것이다. 특정한 바람직한 양태에서, 당해 방법은 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 1개 초과의 시점에서 측정함을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 6개월 이상 분리된 시점에서, 보다 바람직하게는 12개월 이상 분리된 시점에서 측정한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 수치 감소(즉, 보다 적은 양의 값)는 상기 피검체의 알츠하이머병 진행을 나타낸다.

특정 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물의 스크리닝 방법들 중의 어느 하나에 의해 확인된 화합물을 포함하는 알츠하이머병의 치료에 유용한 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 조성물은, 본원에 기재된 화합물의 스크리닝 방법들 중의 어느 하나에 의해 확인된 화합물의 치료학적 유효량을 포함하는 이를 필요로 하는 피검체의 알츠하이머병을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 약제학적 조성물 중의 어느 하나의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 피검체에 투여함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 방법에 관한 것이다.

도 1은 코리얼 셀 리포지토리(Coriell Cell Repository)로부터 입수한 뱅킹된 피부 섬유아세포 및 천공 피부 생검(punch skin biopsy) 샘플(이는, 조직 배양액에 즉시 위치시키고 검시 확인된 피검체로부터 수득된다)에서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB)의 측정 결과를 나타낸다. AD는 알츠하이머병 세포를 말하고; 혼합 AD/PD/LBD는 알츠하이머병, 파킨슨병 및/또는 루이 소체병의 혼합된 병리를 갖는 환자로부터 채취한 세포를 말하고; AC는 비치매 연령 매칭된 대조 세포를 말하고; 비-ADD는 비알츠하이머병성 치매(예: 헌팅톤병 또는 파킨슨병 또는 임상적 정신분열증)로 진단된 피검체로부터 채취한 세포를 말한다. 시험된 AD 세포에서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 약 0.02 초과 약 0.4 미만에 속하는 양의 값이었다. 혼합 AD/PD/LBD에서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 매우 낮은 양의 값, 즉 약 0.02 미만 또는 약 0.03 미만에서 함께 밀집되었다. 비치매 연령 매칭된 대조 세포에서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 음성 또는 매우 낮은 양성의 값, 즉 약 0.01 미만이었다. 비-ADD 세포에서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 음의 값이었다. 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 [브래디키닌으로 자극시킨 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비] - [브래디키닌이 결핍된 매질로 자극시킨 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비]를 결정함으로써 측정하였다. 이는 다음과 같이 표현한다: 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커 = {(pErk1/pErk2)_{브래디키닌}} - {(pErk1/pErk2)_비히클}. ADSMB(도면에는 "식별 인자"(D.F.)라고 기록함)을 4가지 상이한 환자들에 대하여 플롯팅하였다: 코리얼 셀 리포지토리 및 검시 확인된 세포주에 대한 알츠하이머병(AD), 혼합 AD/PD/DLV(확인된 검시에 의한 알츠하이머병, 파킨슨병 및 루이 소체병의 혼합된 진단), 연령 매칭된 대조군(AC) 및 비-AD 치매(파킨슨병 및 헌팅톤병).
도 2는 치매 년수의 함수로서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 선형 회귀 분석을 나타낸다. 상기 선형 회귀법은 치매의 년수와 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 양의 규모 사이의 역 상관관계를 나타내는 약 -0.01의 음의 경사를 나타낸다. 치매의 년수가 증가함에 따라(즉, 알츠하이머병이 진행됨에 따라), 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 보다 작은 양의 수치가 된다. 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 측정은, 더 높은 양의 값이 상기 질환의 조기 단계를 나타내기 때문에, 알츠하이머병의 조기 진단을 가능하게 한다. 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 [브래디키닌으로 자극시킨 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비] - [브래디키닌이 결핍된 매질로 자극시킨 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2 의 비]를 결정함으로써 측정하였다. 이는 다음과 같이 표현한다: 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커 = {(pErk1/pErk2)_{브래디키닌}} - {(pErk1/pErk2)_비히클}. 검시 확인된 경우의 질환 지속 기간의 함수로서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB)의 선형 회귀 분석은 상기 질환의 초기 년수에 보다 유효하다. 이는 본 발명이 알츠하이머병의 초기 진단에 보다 유효함을 나타낸다.
도 3은 AD 및 대조 세포주에 대한 브래디키닌(BK+) 처리 및 비히클(DMSO, 브래디키닌 비함유, BK-) 후의 p-Erk1/2(인산화 Erk1 및 Erk2)의 웨스턴 블럿 데이터를 나타낸다. 브래디키닌 처리(BK+)에 대해서는, 무혈청(24시간) 세포를 37℃에서 10분 동안 10nM 브래디키닌으로 처리하였다. 상응하는 비히클 처리(BK-), 무혈청(24시간) 세포는 동량의 DMSO(BK 비함유)로 37℃에서 10분 동안 처리하였다. 10분 후, p-Erk1/2 밴드는 AD 세포주에 대하여 BK- 처리보다 BK+에 대하여 어두웠지만, 이는 대조 세포주에 대해서는 반대이다. 이는 Erk의 BK 유도된 활성이 AD 세포주에 대해서 보다 높음을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 본원에서 논의된 바와 같이 계산한 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB)(도면에는 "식별 인자"(D.F.)라고 기록함)를 나타낸다. ADSMB를, 코리얼 리포지토리(Coriell Institute of Medical Research, Camden, New Jersey)로부터의 세포주(A) 및 뉴롤로직 인코포레이티드(Neurologic Inc.)에 의해 제공된(검시 확인됨) 세포주(B)인, AD(알츠하이머병), AC(연령 매칭된 대조군) 및 비-ADD(비 AD 치매, 예를 들면, 파킨슨병 또는 루이 소체병) 세포주에 대하여 플롯팅하였다. 상기 결과는 AD 경우에 대한 ADSMB가 AC 및 비-ADD 경우에 대해 보다 일관되게 높았다.
도 5a 및 5b는 가용성 Aβ가 사람 섬유아세포의 알츠하이머 표현형을 유도하고 브리오스타틴 처리가 사람 섬유아세포의 알츠하이머 표현형을 역전시킴을 나타낸다. (A) 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(도면에는 "식별 인자"(D.F.)라고 기록함)를 본원에 기재된 대조(비-AD) 세포주(AG07723, AG11363, AG09977, AG09555 및 AG09878)에 대하여 측정하여 작은 음의 값으로 나타났다. 1.0μM Aβ-42 처리(ADSMB)를 기재된 바와 같이 다시 측정하여 더 높은 양의 값으로 나타났다. 이는, 브레디키닌 유도된, 활성화 Erk1/Erk2 비가 1.0μM Aβ(1-42) 처리 후에 더 높아짐을 나타낸다. AC 세포주는 Aβ(1-42) 처리 후의 AD 표현형과 같이 거동한다. (B) ADSMB("식별 인자"(D.F.))는 AC 세포주에 대하여 24시간 동안 1.0μM Aβ(1-42) 처리 후에 측정하였다. ADSMB 값은 초기에 나타낸 것더 높은 양의 값이었다. 동일한 세포주를 우선 1.0μM Aβ(1-42)로 24시간 동안 처리한 후, 20분 동안의 0.1nM 브리오스타틴 처리가 후속되었다. ADSMB(D.F.) 값을 다시 측정하여 작은 음의 값으로 나타났다. 이는 가용성 Aβ 유도된 변화가 브리오스타틴 치료에 의해 역전될 수 있음을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 ADSMB의 결정(decision) 매트릭스 분석을 나타낸다. 바이오마커의 민감성 및 특이성을 플롯팅하여 코리얼 세포 리포지토리(A) 및 검시 확인된(B) 세포에 대한 질환을 검출하는 유효성을 나타낸다.

본 발명은, 특정한 측면에서, 시험 및 진단에 대하여 확인된 피검체로부터 취한 사람 세포의 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 진단은 독특한 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 발견을 기초로 한다. 특정 측면에서, 본 발명은 알츠하이머병 진행의 모니터링 방법 및 알츠하이머병의 치료 또는 예방용 납 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명은 피검체 또는 피검체로부터 취한 샘플에서의 알츠하이머병의 존재 또는 부재를 결정하거나 확인하는 방법에 관한 것이다.

살아있는 사람의 뇌의 뉴런에 직접 접근하는 것은 불가능하기 때문에, 알츠하이머병의 초기 진단은 매우 어렵다. 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 측정함으로써, 본 발명은 매우 실질적이고, 매우 특이하며 매우 선택적인 알츠하이머병의 초기 진단용 시험을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 다음 질환 진행 및 알츠하이머병의 치료 및 예방에 대한 목표된 약제 개발용 치료제를 확인하기 위한 근거를 제공한다.

본 발명자들은 알츠하이머병의 진단에 대한 매우 민감하고 매우 특이한 진단 검정에 유용한 말초(비-CNS) 조직을 사용하는 알츠하이머병에 대한 독특한 분자 바이오마커를 밝혀내었다. 본 발명의 큰 이점은 본원에 기재된 검정 및 방법에 사용된 조직이 최소의 침해 공정을 사용하여, 즉 척수 천자를 사용하지 않고 피검체로부터 수득할 수 있다는 것이다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 단백질 키나제 C 활성제(예: 브래디키닌)에 의해 유도된, Erk1 인산화 대 Erk2 인산화의 내부 조절된 비가 사람 세포, 예를 들면, 피부 섬유아세포, 또는 기타 말초 세포, 예를 드면, 혈구 중의 성장 매질에 대한 기준선 정규화 반응을 사용하는 특이 항체로 측정하는, 피검체의 알츠하이머병의 조기 검출을 위한 검정 또는 시험에 관한 것이다.

본 발명의 방법에서, 개인 또는 환자로부터 채취한 세포는 어떠한 생존 가능한 세포라도 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 피부 섬유아세포이지만, 그 밖의 말초 조직 세포(즉, 중추 신경계 외부의 조직 세포)가 수득 또는 가공하기에 보다 편리한 경우, 이러한 세포를 본 발명의 시험에 사용할 수 있다. 기타 적합한 세포는, 이들로 제한하려는 것은 아니지만, 혈구, 예를 들면, 적혈구 및 림프구, 협점막 세포, 신경 세포, 예를 들면, 후각 뉴런, 뇌척수액, 뇨, 및 그 밖의 기타 말초 세포 유형을 포함한다. 또한, 비교를 목적으로 사용된 세포는 반드시 건강한 공여자로부터의 세포일 필요는 없다.

세포는 새로운 것일 수 있거나 배양될 수 있다(미국 특허공보 제6,107,050호 참조, 이는 본원에 전문이 참조로 인용됨). 특정 양태에서, 천공 피부 생검을 사용하여 피검체로부터의 피부 섬유아세포를 수득할 수 있다. 당해 섬유아세포는 본원에 기재된 기술을 사용하여 직접 분석하거나 세포 배양 상태로 도입할 수 있다. 수득한 배양된 섬유아세포는 이어서, 실시예 및 명세서에 걸쳐 기재된 바와 같이 분석한다. 분석에 사용되는 세포의 기타 유형, 예를 들면, 협점막 세포, 신경 세포, 예를 들면, 후각 세포, 혈구, 예를 들면, 적혈구 및 림프구 등을 제조하기 위해, 기타 단계가 요구될 수 있다. 예를 들면, 혈구는 말초 정맥으로부터의 채혈로 용이하게 입수할 수 있다. 이어서, 세포는 표준 공정(예: 세포 분류기, 원심분리 등을 사용함)에 의해 분리한 후 분석할 수 있다.

따라서, 특정 측면에서, 본 발명은, 피검체의 알츠하이머병의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 진단 방법은 단백질 키나제 C 활성제인 제제로 자극시킨 피검체로부터 채취한 세포 중의 2개의 특정한 별개의 인산화 MAP 키나제 단백질의 비를 측정함을 기반으로 한다. 또한, 특정 양태에서, 본 발명은 상기 알츠하이머병의 검출 또는 진단에 유용한 시약을 함유하는 키트에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료에 유용한 납 화합물을 확인하는 스크리닝 방법 뿐만 아니라 이를 필요로 하는 피검체의 알츠하이머병을 치료 또는 예방하는 약제학적 제형 중의 당해 화합물 또는 납 화합물의 화학적 유도체의 사용 방법에 관한 것이다.

I. 정의

본원에 사용된 바와 같이, 의학적 스크리닝 및 진단과 관련된 용어 "민감성"은, 상기 시험이 밝히려는 질환에 대한 양성 시험 결과를 제공하는 병에 걸린 개인의 비율, 즉, 통상적으로 백분율로 표시되는, 정 양성 결과(true positive result)를 정 양성 결과와 오 음성 결과(false positive result)로 나눈 비율을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 의학적 스크리닝 및 진단과 관련된 용어 "특이성"은, 상기 시험이 밝히려는 질환에 대한 음성 시험 결과를 제공하는 병에 걸린 개인의 비율, 즉, 통상적으로 백분율로 표시되는, 정 음성 결과를 정 음성 결과와 오 양성 결과로 나눈 비율을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "매우 민감성"은 약 50% 이상 민감성, 또는 약 55% 이상 민감성, 또는 약 60% 이상 민감성, 또는 약 65% 이상 민감성, 또는 약 70% 이상 민감성, 또는 약 75% 이상 민감성, 또는 약 80% 이상 민감성, 또는 약 85% 이상 민감성, 또는 약 90% 이상 민감성, 또는 약 95% 이상 민감성, 또는 약 96% 이상 민감성, 또는 약 97% 이상 민감성, 또는 약 98% 이상 민감성, 또는 약 99% 이상 민감성, 또는 약 100% 민감성인 진단 방법을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "매우 특이성"은 약 50% 이상 특이성, 또는 약 55% 이상 특이성, 또는 약 60% 이상 특이성, 또는 약 65% 이상 특이성, 또는 약 70% 이상 특이성, 또는 약 75% 이상 특이성, 또는 약 80% 이상 특이성, 또는 약 85% 이상 특이성, 또는 약 90% 이상 특이성, 또는 약 95% 이상 특이성, 또는 약 96% 이상 특이성, 또는 약 97% 이상 특이성, 또는 약 98% 이상 특이성, 또는 약 99% 이상 특이성, 또는 약 100% 특이성인 진단 방법을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, "납 화합물"은 본원에 기재된 화합물의 스크리닝 방법을 사용하여 확인된 화합물이다. 납 화합물은, 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를, 본원에 기재된 검정에서 정상의 건강한 세포를 사용하여 측정된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커에 대하여 계산된 값으로 이동시키는 데 있어서의 활성을 가질 수 있다. 알츠하이머병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 사용하기 위한 이의 활성을 최적화시키거나 강화시키도록, 납 화합물은 후속적으로 화학적 개질시킬 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "서열 변종"은 구조적으로 및 기능적으로 둘 다 각각에 관련된 단백질이다. 특정 양태에서, 서열 변종은 아미노산 서열의 수준에서 구조적 유사성을 공유하고 효소 활성의 수준에서 기능적 특성을 공유하는 단백질이다. 특정 양태에서, 서열 변종은 기타 단백질의 인산화를 촉매하는 MAP 키나제 단백질이다.

본원에 사용된 바와 같이, "알츠하이머병의 부재"는 피검체 또는 피검체로부터 채취한 세포가 측정 가능하거나 검출 가능한 알츠하이머병 표현형을 나타내지 않음을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 피검체 또는 세포 샘플에서의 "알츠하이머병 표현형"은 이들로 제한되지는 않지만, 0을 초과하는 양의 값을 갖는 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "아밀로이드 베타 펩티드"는 아밀로이드 베타 펩티드의 임의 단편 또는 전체 길이의 아밀로이드 베타 펩티드이다.

본원에 사용된 바와 같이, "치료에 대한 증가된 반응성"은, 치료에 양성적 방식으로 반응하여, 치료에 대한 증가된 반응성을 나타내지 않는 환자들보다 증상을 보다 신속하게 유효하게 완화시키는 능력을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, "조기 단계 알츠하이머병"은 질환의 단계를 의미한다. 조기 단계 알츠하이머병 및 관련 치매를 앓는 사람은 질환의 증상으로 인하여 약한 손상만을 갖는다. 이들은 여전히 노동하고 운전할 수 있으며 일상 생활의 특정 활동에 최소한의 도움만을 필요로 할 뿐이다. 이러한 단계의 개인은 종종 이들의 진단 및 능력을 자각한다.

단계화 시스템은 알츠하이머병이 전개될 수 있는 방법을 이해하고 장래 계획을 세우는 데 대해 참조할 만한 유용한 프레임을 제공한다. 그러나, 모든 사람이 동일한 증상 또는 진행을 동일한 속도로 경험하는 것은 아니라는 것을 주지하는 것이 중요하다. 알츠하이머병을 앓는 사람들은 진단한지 평균 4 내지 6년 후에 사망하지만, 상기 질환의 지속 기간은 3 내지 20년으로 다양할 수 있다.

다음은 알츠하이머병의 단계에 대한 일반적인 설명을 제공하며, 약한, 보통의, 조금 심각한, 그리고 심각한 알츠하이머병의 널리 사용되는 개념에 상응한다. 또한, 어느 단계가 초기, 중기 및 후기 범주의 보다 일반적 구분에 속하는지가 주목된다.

단계 1: 손상 없음(정상 기능)

온전한 개인은 기억 문제를 경험하지 않고 의학적 면담 동안 보건 의료 전문가에게 나타나는 것이 없다.

단계 2: 매우 약한 인지 감퇴(정상적 연령 관련 변화 또는 알츠하이머병의 최초 징후일 수 있음)

개인은 기억 착오가 있다고 느낄 수 있고, 특히 친숙한 단어 또는 명칭이나 열쇠, 안경 또는 기타 일상 용품의 위치를 잊는다고 느낄 수 있다. 그러나, 이러한 문제는 의학적 검사 동안 나타나지 않거나 친구, 가족 또는 동료들에게 명백하지 않다.

단계 3: 약한 인지 감퇴

초기 알츠하이머병이 이러한 증상을 갖는 일부 개인에게 있어서 진단될 수 있으나 전체 개인에 있어서는 아니다.

친구, 가족 또는 동료들이 결함을 주목하기 시작한다. 기억 또는 집중과 관련된 문제는 임상적 시험에서 측정 가능하거나 상세한 의학적 면담 동안 인식 가능할 수 있다. 일반적인 어려움은 다음을 포함한다:

가족 또는 절친한 동료들에게 주목되는 단어 또는 명칭을 찾는 문제

새로운 사람을 소개받을 때 이름을 기억하는 능력의 감소

가족, 친구 또는 동료들에게 주목되는 사회적 또는 근무 환경에서의 수행 문제

구절을 읽고 작은 소재를 기억해 두는 것

귀중한 물건을 잃어버리거나 잘못 둠

계획하거나 조직하는 능력의 감퇴

단계 4: 중간 인지 감퇴

(약한 또는 초기 알츠하이머병)

이 단계에서는, 주의깊은 의학적 면담을 통해 다음의 영역에서 뚜렷한 결함이 간파된다:

최근의 행사 또는 현재의 사건에 대한 지식 감소

도전적 암산, 예를 들면, 75부터 7씩 역산을 수행하는 능력 손상

복잡한 업무, 예를 들면, 손님을 위한 저녁식사를 계획, 청구서 지불 및 재정 관리를 수행하는 능력 감소

개인사에 대한 기억 감소

병에 걸린 개인은 특히 사회적으로 또는 정신적으로 도전적인 상황에서 순응하고 포기하는 것처럼 보일 수 있음

단계 5: 약간의 심각한 인지 감퇴

(중간 또는 중기 알츠하이머병)

인지 기능에 있어서 주요 결함 및 부족이 나타난다. 일상적인 활동에 어느 정도의 보조가 필수적이 된다. 이 단계에서는 개인은 다음과 같을 수 있다:

의학적 면담 동안 현재의 주소, 전화 번호 또는 졸업한 대학 또는 고등학교 이름을 생각해 낼 수 없음

현재 위치 또는 현재 날짜, 주 또는 계절에 대해서 혼동하게 됨

덜 도전적 암산, 예를 들면, 40부터 4씩 또는 20부터 2씩 역산하는 데 힘이 듬

계절 또는 행사에 적합한 옷을 선택하는 데 도움이 필요함

통상적으로 자신들에 대한 상당한 기억을 보유하고 자신의 이름 및 배우자 또는 자녀의 이름을 알고 있음

통상적으로 식사 및 화장실 사용에는 도움을 필요로 하지 않음

단계 6: 심각한 인지 감퇴

(약간의 심각한 또는 중기 알츠하이머병)

기억 곤란이 계속 악화되고, 현저한 성격 변화가 나타날 수 있으며, 병에 걸린 개인은 통상의 일상 활동에 광범위한 도움을 필요로 한다. 이 단계에서, 개인은 다음과 같을 수 있다:

최근의 경험 및 사건 뿐만 아니라 주변 상황에 대한 대부분의 자각 상실

개인사를 불완전하게 회상하지만, 일반적으로 자신의 이름은 생각해 냄

때로는 배우자 또는 일차 간병인의 이름을 잊어버리지만, 일반적으로 익숙한 얼굴을 낯선 얼굴과 구별할 수 있음

적합하게 옷 입는 데 도움을 필요로 하고, 통제 없이는, 낮에 입는 옷 위에 파자마를 착용하거나 신발을 잘못된 발에 착용하는 등의 오류를 범할 수 있음

정상적 수면/기상 순환의 붕괴를 경험

화장실 사용의 처리 세부 사항(변기 물 내리기, 티슈를 적절하게 닦아 버리기)에 도움을 필요로 함

요실금 또는 대변 실금 회수가 증가됨

의심 및 망상(예를 들면, 간병인이 사기꾼이라고 믿음)을 포함한, 현저한 성격 변화 및 거동적 증상 경험; 환각(실제로 거기 없는 것을 보거나 들음); 또는 손 떨기 또는 티슈 갈가리 찢기와 같은 강제적, 반복적 거동

헤매고 길을 잃어버리는 경향이 있음

단계 7: 매우 심각한 인지 감퇴

(심각한 또는 후기 알츠하이머병)

이는 개인이 이의 환경에 반응하는 능력, 말하는 능력 및 궁극적으로, 운동을 조절하는 능력을 상실하는 경우의 질환의 최종 단계이다.

종종 개인은 인식 가능한 말하기 능력을 상실하지만, 단어 또는 구가 때때로 입 밖으로 나올 수 있음

개인은 식사 및 화장실 사용에 도움을 필요로 하고 일반적으로 요실금이 있음

개인은 도움 없이 걷는 능력, 이어서 지지 없이 앉는 능력, 웃는 능력 및 고개를 드는 능력을 상실함. 반사 작용은 비정상이 되고 근육은 점점 굳음. 삼키기가 손상됨.

II. 알츠하이머병의 진단 방법

특정 양태에서, 본 발명은, 상기 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것이다. 특정한 바람직한 양태에서, 상기 진단 방법은, 피검체로부터 세포 샘플을 입수하는 단계, 상기 세포 샘플을 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포 샘플 중의 특이 인산화 MAP 키나제 단백질의 비율을 측정하여 상기 피검체의 알츠하이머병을 진단하는 단계를 수반한다. 특정한 구체적 양태에서, 본원에 기재된 진단 검정은 시험관내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 구체적 양태에서, 상기 단백질 키나제 C 활성제는 브래디키닌이다. 추가의 구체적 양태에서, 특이 인산화 MAP 키나제 단백질의 비율은 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비이며, 이는 인산화 Erk1의 상대적 양 또는 정규화된 양을 인산화 Erk2의 상대적 양 또는 정규화된 양으로 나누어 계산한다.

알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커

본원에 기재된 진단 방법 및 알츠하이머병의 치료에 유용한 화합물의 스크리닝 방법은 알츠하이머병에 대한 독특한 분자 바이오마커에 대한 본 발명자들의 발견을 기반으로 한다. 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 수치는 특정 변수, 예를 들면, 검정에 사용된 세포, 검정에 사용된 단백질 키나제 C 활성제, 및 인산화 비의 측정을 목표로 한 특정 MAP 키나제 단백질에 좌우된다.

구체적 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는, 단백질 키나제 C 활성제에 의해 자극된 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 측정하고, 이로부터, 단백질 키나제 C 활성제가 결핍된 대조 용액(비히클)으로 자극된 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 감산하여 측정할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 차이가 0을 초과하는 경우, 즉 양수인 경우, 이는 알츠하이머병의 진단이다. 추가의 바람직한 양태에서, 상기 차이가 0 이하인 경우, 이는 알츠하이머병의 부재를 나타낸다.

기타 양태에서, 본 발명의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는. 세포를 단백질 키나제 C 활성제로 자극시킨 후 2개의 인산화 MAP 키나제 단백질의 비를 결정하여 측정한다. 상기 분자 바이오마커는, 단백질 키나제 C 활성제에 의해 자극된 세포 중의 제1 인산화 MAP 키나제 단백질 대 인산화 제2 MAP 키나제 단백질의 비를 결정하고, 이로부터, 단백질 키나제 C 활성제가 결핍된 대조 용액(비히클)으로 자극된 세포 중의 인산화 제1 MAP 키나제 단백질 대 인산화 제2 MAP 키나제 단백질의 비를 감산하여 측정할 수 있다. 특정한 바람직한 양태에서, 상기 차이가 0을 초과하는 경우, 즉 양의 값인 경우, 이는 알츠하이머병의 진단이다. 추가의 바람직한 양태에서, 상기 차이가 0 이하인 경우, 이는 알츠하이머병의 부재를 나타낸다.

특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 알츠하이머병으로 진단된 환자로부터 채취한 세포 샘플(AD 세포) 중의 양의 수치이다. 특정한 바람직한 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커가 브래디키닌으로 자극된 AD 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 결정함으로써 측정되는 경우, AD 세포에서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커에 대한 양의 수치는 약 0 내지 약 0.5의 범위일 수 있다.

특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는, 비알츠하이머병성 치매, 예를 들면, 파킨슨병 또는 헌팅톤병 또는 임상적 정신분열증으로 진단된 피검체로부터 채취한 세포(비-ADD 세포)에서 측정하는 경우 음의 수치이다. 특정한 바람직한 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커가 브래디키닌으로 자극된 비-ADD 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 결정하여 측정하는 경우, 음의 수치는 0 내지 약 -0.2 또는 약 -0.3의 범위일 수 있다.

특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 알츠하이머병을 앓지 않는 환자로부터 채취한 연령 매칭된 대조 세포(AC 세포)로부터의 세포 샘플에서 음의 수치, 0 또는 매우 낮은 양의 수치일 수 있다. 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커가 브래디키닌으로 자극된 AC 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 결정하여 측정되는 경우, AC 세포에서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 약 0.05 미만 내지 약 -0.2의 범위일 수 있다.

본 발명의 특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 브래디키닌으로 자극된 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비 - 브래디키닌이 결핍된 용액으로 자극된 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 계산하여 측정할 수 있다. 이는 다음과 같이 표현된다: 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커 = {(pErk1/pErk2)_{브래디키닌}} - {(pErk1/pErk2)_비히클}

단백질 키나제 C 활성제

본 발명의 진단 방법, 키트 및 화합물을 확인하는 스크리닝 방법에 사용하기 위하여 구체적으로 계획된 단백질 키나제 C 활성제는 이들로 제한되지는 않지만, 다음을 포함한다: 브래디키닌; α-APP 조절제; 브리오스타틴 1; 브리오스타틴 2; DHI; 1,2-디옥타노일-sn-글리세롤; FTT; 그니디마크린(Gnidimacrin), 스텔레라 차매자스메 L.(Stellera chamaejasme L.); (-)-인돌락탐 V; 리폭신 A₄; 린비아톡신 A, 미크로모노스포라 종(Micromonospora sp .); 올레산; 1-올레일-2-아세틸-sn-글리세롤; 4α-포르볼; 포르볼-12,13-디부티레이트; 포르볼-12,13-디데카노에이트; 4α-포르볼- 12,13-디데카노에이트; 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트; L-α-포스파티딜리노시톨-3,4-비스포스페이트, 디팔미토일-, 펜타암모늄 염; L-α-포스파티딜리노시톨-4,5-비스포스페이트, 디팔미토일-, 펜타암모늄 염; L-α-포스파티딜리노시톨-3,4,5-트리포스페이트, 디팔미토일-, 헵타암모늄 염; 1-스테아로일-2-아라키도노일-sn-글리세롤; 티멜레아톡신, 티멜레아 히르수타 L.(Thymelea hirsute L.); 인슐린, 포르볼 에스테르, 리소포스파티딜콜린, 리포폴리사카라이드, 안트라사이클린 단노루비신 및 반다딜 설페이트. "브리올로그(bryologue)"라고 공지된 화합물도 포함된다. 브리올로그는 예를 들면, 문헌[참조: Wender et al., Organic letters(United States) May 12, 2005, 7(10) p1995-8; Wender et al., Organic letters(United States) Mar 17 2005, 7 (6) p1177-80; Wender et al., Journal of Medicinal Chemistry(United States) Dec 16 2004, 47 (26) p6638-44]에 기재되어 있다. 단백질 키나제 C 활성제는 본원에 기재된 진단 방법, 키트 및 화합물 스크리닝 방법에서 단독으로 사용되거나 또는 다른 단백질 키나제 C 활성제와 함께 사용될 수 있다.

브래디키닌은 다양한 염증 상태 동안에 발생되는 강력한 혈관 작용성 노나펩티드이다. 브래디키닌은 특정 세포막 브래디키닌 수용체(들)에 결합되고 상기 수용체(들)을 활성화시켜 "미토겐 활성화 단백질 키나제"(MAPK)라고 공지된 단백질의 인산화를 유도하는 일련의 세포내 이벤트를 촉발시킨다. 포스페이트 그룹을 Ser, Thr 또는 Tyr 잔기에 가하는, 단백질의 인산화는 집단적으로 단백질 키나제로 공지된 다수의 효소에 의해 매개된다. 인산화는 통상적으로 단백질의 기능을 개질시키고 일반적으로 이를 활성화시킨다. 항상성은 인산화가 일시적 공정인 것을 필요로 하며, 이는 기질을 탈인산화시키는 포스파타제 효소에 의해 역전된다. 인산화 또는 탈인산화에서의 어떠한 이상(aberration)이라도 생화학적 경로 및 세포 기능을 붕괴시킬 수 있다. 이러한 붕괴는 특정한 뇌 질환에 대한 근거가 될 수 있다.

인산화 단백질의 측정 또는 검출 수준

본원에 기재된 알츠하이머병의 진단 방법 및 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 제제를 확인하는 화합물의 스크리닝 방법은 본 발명의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 측정에 좌우된다.

바람직한 양태에서, 세포에 존재하는 인산화 단백질의 수준은 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. 인산화 Erk1 또는 인산화 Erk2의 단백질 수준은 항-Erk1, 항-Erk2, 항-포스포-Erk1 및 항-포스포-Erk2 항체를 사용하여 섬유아세포에서 측정할 수 있다(세포 신호전달 기술). 상이한 단백질 수준은 또한 정규화에 대한 참조 단백질과 동일한 샘플에서 측정할 수도 있다. 가능한 참조 단백질의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 아넥신-II 또는 액틴을 포함한다.

하나의 양태에서, ELISA는 다음의 과정에 따라 수행한다: 1) 섬유아세포 용해물을 이중 또는 삼중으로 처리 후, 항-Erk 항체로 미리 피복한 96-웰 마이크로플레이트에 가한다. 2) 샘플을 실온에서 약 2시간 동안 마이크로플레이트 웰에서 배양한다. 3) 샘플을 흡인시키고 웰을 인산염 완충 염수(PBS)계 세척 완충액으로 세척한다. 4) 항-포스포-Erk1/2 또는 항-정규 Erk1/2 항체의 작업 희석액을 각각의 웰에 가하고, 실온에서 약 1시간 동안 항온배양시킨다. 5) 웰을 흡인시키고 세척 완충액으로 세척한다. 6) 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)로 공액시킨 제2 항체의 작업 희석액을 각각의 웰에 가하고, 실온에서 약 30분 동안 항온배양시킨다. 7) 웰을 흡인시키고 이를 세척 완충액으로 세척한다. 8) 안정화 색원체, 예를 들면, 디아미노벤지딘(DAB)을 가하고, 실온에서 약 30분 동안 항온배양시킨다. 9) 정지 용액을 가하고, 450nm에서 흡광도를 측정한다. 정규화 후 Erk1/2의 인산화를 검정한다: NR = A_P/A_R[여기서, NR은 정규화 비이고; A_P는 포스포-Erk1/2에 대한 흡광도 값이며; A_R은 전체 (정규) Erk1/2에 대한 흡광도이다].

바람직한 양태에서, Erk1/2의 인산화는 항-포스포-Erk1/2 항체를 사용하여 웨스턴 블럿에서 검정한다. 인산화 Erk1/2에 대한 면역반응 신호의 수준은 밀도계 주사를 통하여 정량화시킨다. 포스포-Erk1/2 신호의 평균 밀도는, 개별적인 웨스턴 블럿에서 항-정규 Erk1/2 항체를 사용하여 동일한 세포 용해물 샘플로부터 검출한 전체 Erk1/2 신호의 평균 밀도로 정규화시킨다. 정규화 식은 다음과 같다: NR = D_P/D_R[여기서, NR(정규화 비)은 Erk1/2 인산화 범위이고; D_P는 포스포-Erk1/2에 대한 평균 밀도이고, D_R은 동일한 샘플로부터 웨스턴 블럿에서 검출된 Erk1/2의 총량에 대한 평균 밀도이다].

단백질 검출을 위한 본 발명의 면역검정은 면역형광 검정, 방사능 면역검정, 웨스턴 블럿 검정, 효소 면역검정, 면역 침전, 화학발광 검정, 면역 조직화학 검정, 도트 또는 슬로트 블럿 검정 등일 수 있다[참조: "Principles and Practice of Immunoassay"(1991), Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Press, New York, New York, Ausubel et al. (eds)(1987), "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, New York]. 검출은 색도계 또는 방사성 방법 또는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 기타 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. ELISA에 대하여 당해 기술분야에 공지된 표준 기술은 문헌[참조: Methods in Immunodiagnosis, 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, New York 1980; Campbell et al., Methods of Immunology,, W.A. Benjamin, Inc., 1964, 둘 다 본원에서 참조로 인용됨]에 기재되어 있다. 이러한 검정은 당해 기술분야에 기재된 바와 같은 직접적, 간접적, 경쟁적 또는 비경쟁적 면역검정일 수 있다[참조: "Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Pres, NY, NY; Oellirich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904; Ausubel, et al., (eds) 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York].

세포 타입, 단백질 분리 및 항체

이전에 기재한 바와 같이, 진단되는 환자로부터 채취한 세포는 어떠한 세포라도 될 수 있다. 사용될 수 있는 세포의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 피부 세포, 피부 섬유아세포, 협점막 세포, 혈구, 예를 들면, 적혈구, 림프구 및 림프아형 세포 및 신경 세포, 및 Erk1/2 단백질을 발현하는 그 밖의 기타 세포를 포함한다. 검시 샘플 및 병리학 샘플 또한 사용될 수 있다. 뇌 조직 또는 뇌 세포를 포함하는 상기 세포를 포함하는 조직이 또한 사용될 수 있다. 세포는 새로운 것이거나 배양된 것이거나 냉동된 것일 수 있다. 단백질 샘플은 세포로부터 분리하거나 조직은 진단 검정 또는 화합물 스크리닝 방법에 즉시 사용하거나 이후에 사용하기 위하여 냉동시킬 수 있다. 바람직한 양태에서 섬유 아세포가 사용될 수 있다. 섬유아세포는 피부 천공 생검에 의해 수득할 수 있다.

단백질은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 세포로부터 분리할 수 있다. 바람직한 방법에서는 환자로부터 분리한 세포를 세척하고 인산염 완충 염수(PBS)에서 펠릿화시킨다. 이어서, 펠릿을 50nM NaF, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 20㎍/㎖ 류펩틴, 50㎍/㎖ 펩스타틴, 10mM TRIS-HCl, pH = 7.4를 포함하는 "균질화 완충액"으로 세척하고, 원심분리로 펠릿화시킨다. 상청액을 폐기하고, "균질화 완충액"을 펠릿에 가한 후 ㅅ상기 릿을 초음파처리한다. 단백질 추출물은 바로 사용하거나 이후의 분석을 위하여 -80℃에서 저장할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 기재된 면역검정에 사용된 항체는 근원적으로 단일클론 또는 다클론성일 수 있다. 항체를 발생시키는 데 사용되는 인산화 및 비인산화 Erk1/2 단백질 또는 이의 일부는 천연 또는 재조합 원료로부터 입수하거나 합성에 의해 생성될 수 있다. 천연 Erk1/2 단백질은 통상적인 방법에 의해 생물학적 샘플로부터 분리할 수 있다. Erk1/2 단백질을 분리하는 데 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 피부 세포, 예를 들면, 섬유아세포, 섬유아세포주, 예를 들면, 콜리얼 셀 리포지토리즈(Camden, N.J.)를 통하여 시판중이고, 국립 노화 기구 1991 세포주 카탈로그, 국립 일반 의료 과학 기구 1992/1993 세포주 카탈로그에 열거된(NIH Publication 92-2011 (1992)) 알츠하이머병 섬유아세포주 및 대조 섬유아세포주를 포함한다.

III. 알츠하이머병의 진단용 키트

본 발명은 위에서 기재된 진단 시험들 중의 어느 하나를 수행하는 데에 이용될 수 있는 키트에 관한 것이라는 것이 추가로 고려된다. 키트는 단일 진단 시험 또는 본원에 기재된 시험들 중의 어느 조합이라도 함유할 수 있다. 키트는 정규 Erk1/2(비인산화 Erk1 또는 비인산화 Erk2) 또는 인산화 Erk1/2(인산화 Erk1 또는 인산화 Erk2)를 인지하는 항체를 포함할 수 있다. 키트는 정규 MAP 키나제 단백질 뿐만 아니라 인산화 MAP 키나제 단백질을 인지하는 항체를 함유할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기재된 단백질 키나제 C 활성제(예를 들면, 브래디키닌 또는 브리오스타틴) 중의 어느 하나 이상이라도 함유할 수도 있다. 항체는 단일클론 또는 다클론성일 수 있다. 키트는 하나 이상의 생검, 예를 들면, 천공 피부 생검을 수행하는 데 필요한 기구, 완충액 및 저장 용기를 함유할 수 있다. 키트는 또한 본 발명의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 확인하는 데 사용되는 비의 결정 뿐만 아니라 진단 시험에 항체 또는 기타 구성 성분을 사용하는 데 대한 설명서를 함유할 수도 있다. 설명서는 생검, 예를 들면, 천공 피부 생검을 수행하는 과정이 설명되어 있을 수도 있다. 키트는 또한 정규화에 사용되는 참조 단백질의 검출용 항체와 같은 진단 시험을 수행하기 위한 기타 시약을 함유할 수도 있다. 가능한 참조 단백질을 인지하는 항체의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 아넥신-II 또는 악틴을 인지하는 항체를 포함한다. 키트는 또한 완충액, 2차 항체, 대조 세포 등을 포함할 수도 있다.

IV. 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 화합물의 스크린링 방법

또한 본 발명은, 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 물질의 스크리닝 및 확인 방법에 관한 것이다. 당해 양태에 따라, 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 역전시키거나(즉, 정상 세포에서 발견되는 수준으로 돌림) 개선시키는 물질이 잠재적으로 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 물질로서 확인되고 선택될 것이다.

예를 들면, 치료 물질을 확인하는 이러한 한 가지 스크리닝 방법은, 알츠하이머병 환자로부터의 샘플 세포를 본원에 기재된 단백질 키나제 C 활성제 중의 어느 하나의 존재하에 스크리닝되는 물질과 접촉시키는 단계 및 이어서 본원에 기재된 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커 중의 어느 하나를 측정하는 단계를 수반할 것이다. 정상 세포(즉, 알츠하이머병이 없는 피검체로부터 채취한 세포)에서 발견되는 수준으로 돌리는 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 역전시키거나 개선시키는 제제는, 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 잠재적으로 유용한 물질로서 확인되고 선택될 것이다.

특정 양태에서, 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커를 역전시키거나 개선시키는 제제는 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커에 대해 양의 값으로 감소시키고/시키거나 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커에 대해 보다 음의 값으로 이동시키는 제제이다.

V. 알츠하이머병의 진행의 모니터링 방법

또한 본 발명은, 피검체의 알츠하이머병의 진행의 모니터링 방법에 관한 것이다. 도 2는 치매의 지속 기간 년수의 함수로서의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 선형 회귀 분석을 제공한다. 선형 회귀 분석은 치매 년수와 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 양성 등급 사이의 역 상관 관계를 나타내는 약 -0.01의 음의 경사도를 나타낸다. 치매 년수가 증가함에 따라(즉, 알츠하이머병이 진행됨에 따라) 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 덜 양성인 수치가 된다. 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 측정으로 알츠하이머병의 초기 진단이 가능한데, 이는 특정 양태에서는 더 높은 양의 값이 상기 질환의 초기 단계를 나타내기 때문이다. 특정 양태에서, 상기 알츠하이머병이 피검체에서 진행됨에 따라, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는 덜 양성인 값이 된다.

알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커는, 특정 양태에서, 브래디키닌으로 자극시킨 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비 - 브래디키닌이 결핍된 매질로 자극시킨 세포 중의 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 결정함으로써 측정한다. 이는 다음과 같이 표현한다: 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커 = {(pErk1/pErk2)_{브래디키 닌}} - {(pErk1/pErk2)_비히클}.

VI. 아밀로이드 베타 펩티드

용어 "아밀로이드 베타 펩티드", "베타 아밀로이드 단백질", "베타 아밀로이드 펩티드", "베타 아밀로이드", "A. 베타" 및 "A. 베타 펩티드"는 본원에서 호환적으로 사용된다. 몇몇 형태에서, 아밀로이드 베타 펩티드(예: A. 베타 39, A. 베타 40, A. 베타 41, A. 베타 42 및 A. 베타 43)는, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)이라고 하는, 보다 큰 막횡단 당단백질의 39-43 아미노산의 약 4-kDa 내부 단편이다. APP의 다중 이소형태, 예를 들면, APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ 및 APP⁷⁷⁰이 존재한다. 사람에 존재하는 것으로 현재 공지된 APP의 특정 이소형의 예는 "정상" APP로 지정된 문헌[참조: Kang et al., (1987) Nature 325:733-736]에 기재된 695 아미노산 폴리펩티드; 문헌[참조: Ponte et al., (1988) Nature 331:525-527(1988) and Tanzi et al., (1988) Nature 331:528-530]에 기재된 751 아미노산 폴리펩티드 및 문헌[참조: Kitaguchi et al., (1988) Nature 331:530-532]에 기재된 770 아미노산 폴리펩티드이다. 생체 내에서 또는 동일반응계 내에서 상이한 세크레타제 효소에 의한 APP의 단백질 가수분해 가공의 결과, A. 베타는 길이가 "단형"인 40 아미노산 및 길이가 "장형"인 42-43 범위의 아미노산 둘 다에서 발견된다. APP의 소수성 도메인의 일부는 A. 베타의 카복시 말단에서 발견되며, A. 베타의 응집 능력의 원인이 될 수 있으며, 특히 장형 A. 베타의 경우, 펩티드는 정상인 및 아밀로이드 형성 장애를 앓는 개인 둘 다를 포함하는 사람 및 기타 포유동물의 체액, 예를 들면, 뇌척수액에서 발견되거나 이로부터 정제될 수 있다.

용어 "아밀로이드 베타 펩티드", "베타 아밀로이드 단백질", "베타 아밀로이드 펩티드", "베타 아밀로이드", "A. 베타" 및 "A. 베타 펩티드"는 APP의 세크레타제 분열(cleavage)로부터 수득한 펩티드 및 분열 생성물과 동일하거나 본질적으로 동일한 서열을 갖는 합성 펩티드를 포함한다. 본 발명의 A. 베타 펩티드는 다양한 소스, 예를 들면, 조직, 세포주 또는 체액(예: 혈청 또는 뇌척수액)으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, A. 베타는 예를 들면, 문헌[참조: Walsh et al., (2002), Nature, 416, pp 535-539]에 기재된 바와 같은 차이니즈 햄스터 난소(CHO)와 같은 APP 발현 세포로부터 유도될 수 있다. A. 베타 제조는 이전에 기재된 방법을 사용하여 조직 소스로부터 유도될 수 있다(참조: Johnson-Wood et al., (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550). 또는, A. 베타 펩티드는 당업자에게 익히 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W.H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p 77]을 참조한다. 그러므로, 펩티드는, 예를 들면 어플라이드 바이오시스템즈 펩티드 신디사이저(Applied Biosystems Peptide Synthesizer) 모델 430A 또는 431에서 측쇄 보호된 아미노산을 사용하는 t-Boc 또는 F-moc 화학에 의해 보호된 아미노 그룹으로 고체 상 합성하는 자동화 메리필드(Merrifield) 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 보다 긴 펩티드 항원은 익히 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들면, 펩티드 또는 융합 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성되거나 분자적으로 클론화되고, 적합한 숙주 세포에 의한 이종 발현 및 형질감염을 위한 적합한 발현 벡터에 삽입될 수 있다. A. 베타 펩티드는 또한 A. 베타, 정상 유전자의 영역에 돌연변이로부터 발생된 관련 A. 베타 서열을 말한다.

Erk 1/2 지수의 A. 베타 유도된 이상(알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커)은 알츠하이머병의 존재 또는 부재에 대한 확인 시험으로서 사용될 수 있다. 즉, 음성 아밀로이드 베타-지수 반응은 질환의 존재를 나타내는 한편, 양성 반응은 질환의 부재를 나타낸다. 즉, 알츠하이머병 표현형이 배양 또는 아밀로이드 베타 펩티드와의 접촉시 세포에 유도되는 경우, 이는 시험 세포 또는 치료되는 피검체의 질환의 부재를 나타낸다. 대조적으로, 배양 또는 아밀로이드 베타 펩티드와의 접촉시 세포에서의 변화가 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커에서 전혀 또는 거의 유도되지 않는 경우, 이는 시험 세포 또는 치료되는 피검체의 질환의 존재를 나타낸다.

아밀로이드 베타(1-42){즉, Aβ(1-42)}가 바람직한 유도 자극제인 한편, 그 밖의 기타 아밀로이드 베타 단편, 예를 들면, (1-39), (1-40), (1-41), (1-43), (25-35), (16-22), (16-35), (10-35), (8-25), (28-38), (15-39), (15-40), (15-41), (15-42), (15-43) 또는 기타 그 밖의 아밀로이드 베타 단편이 또한 본원에 기재된 방법 또는 키트 중의 어느 하나에 사용될 수도 있다.

VII. 알츠하이머병의 치료에 유용한 조성물

또한 본 발명은, 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 조성물에 관한 것이다. 본원에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 확인된 화합물은 이를 필요로 하는 피검체에게 투여하기 위한 약제학적 조성물로서 제형화시킬 수 있다.

본원에 기재된 스크리닝 방법을 사용하여 확인된 본 발명의 약제학적 조성물 또는 화합물(또는 납 화합물의 화학적 유도체)은, 예를 들면, 공지된 방법에 따라 약리학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 경구, 피하, 경진피, 경피 또는 비경구(예: 국소, 직장 또는 정맥내) 투여용의, 약제학적 조성물, 예를 들면, 정제(당의정 및 필름 코팅정 포함), 산제, 입제, 캡슐(연질 캡슐 포함), 액체, 주사제, 좌제, 지연 방출제 등을 제공함으로써 안전하게 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 약리학적으로 허용되는 담체의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 고형 제제용 부형제, 윤활제, 결합제 및 붕해제, 및 액상 제제용 용매, 가용화제, 현탁제, 등장제, 완충제, 수딩제 등을 포함하는, 다양한 통상적인 유기 또는 무기 담체를 포함한다. 필요한 경우, 통상적인 첨가제, 예를 들면, 방부제, 산화방지제, 착색제, 감미료, 흡수제, 습윤제 등을 적합한 양으로 적절하게 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 부형제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 락토스, 수크로즈, D-만니톨, 전분, 옥수수 전분, 결정성 셀룰로스, 약한 무수 규산, 다당류, 이당류, 탄수화물, 트레할로스 등의 제제를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 윤활제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 스테아르산마그네슘, 스테아르산칼슘, 활석, 콜로이드성 실리카 등과 같은 제제를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 결합제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 결정성 셀룰로스, 수크로스, D-만니톨, 덱스트린, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 전분, 수크로스, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 나트륨 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 붕해제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 전분, 카복시메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 칼슘, 나트륨 카복시메틸 전분, L-하이드록시프로필셀룰로스 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 용매의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 주사용수, 알콜, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수유, 올리브유 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 가용화제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, D-만니톨, 벤질 벤조에이트, 에탄올, 트리스-아미노메탄, 콜리스테롤, 트리에탄올아민, 탄산나트륨, 시트르산나트륨 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 현탁제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 계면활성제, 예를 들면, 스테아릴 트리에탄올아민, 나트륨 라우릴 설페이트, 라우릴 아미노프로피오네이트, 레시틴, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 글리세릴 모노스테아레이트 등; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 등장제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 글루코스, D-소르비톨, 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 완충제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 포스페이트, 아세테이트, 카보네이트, 시트레이트 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 수딩제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 벤질 알콜 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 방부제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, p-옥시벤조에이트, 클로로부탄올, 벤질 알콜, 펜에틸 알콜, 데하이드로아세트산, 소르브산 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 산화방지제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 설피트, 아스코르브산, α-토코페롤 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물이 주사제로서 사용되는 경우의 특정 양태에서, 사용되는 주사용 담체는 다음 중의 임의의 것 또는 모든 것을 포함할 수 있다: 용매, 가용화제, 현탁제, 등장제, 완충제, 수딩제 등. 용매의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 주사용수, 생리 염수, 링거액 등을 포함한다. 가용화제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, D-만니톨, 벤질 벤조에이트, 트리스아미노메탄, 콜레스테롤, 트리에탄올아민, 탄산나트륨, 시트르산나트륨 등을 포함한다. 등장제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 글루코스, D-소르비톨, 염화나트륨, 글리세린, D-만니톨 등을 포함한다. 완충제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 포스페이트, 아세테이트, 카보네이트, 시트레이트 등과 같은 완충제를 포함한다. 수딩제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 벤질 알콜 등을 포함한다. pH 조절제의 예는, 이들로 제한되지는 않지만, 염산, 인산, 시트르산, 수산화나트륨, 중탄산나트륨, 탄산나트륨 등을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명의 주사용 조성물은 무균적으로 처리된 냉동 건조기에서 냉동 건조시키고 분말 상태로 보존할 수 있거나, 주사용 용기(예: 앰풀)에 밀봉시켜 보존시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 사용시 위에서 언급한 주사용 담체로 희석할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 활성 화합물의 함량은 제제의 형태에 따라 변화할 수 있지만, 일반적으로 전체 제제의 약 0.01 내지 약 99중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 50중량%, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 20중량%이다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 비이온성 계면활성제의 함량은 제제의 형태에 따라 변화할 수 있지만, 일반적으로 전체 제제의 약 1 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 약 10 내지 약 90중량%, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 70중량%이다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 에탄올, 벤질 알콜 또는 디메틸아세트아미드의 함량은 제제의 형태에 따라 변화할 수 있지만, 일반적으로 전체 제제의 약 1 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 약 10 내지 약 90중량%, 보다 바람직하게는 약 30 내지 약 90중량%이다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 비이온성 계면활성제와 에탄올의 혼합 비(중량비)는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 비이온성 계면활성제:에탄올 = 약 0.01 내지 99.99:99.99 내지 0.01, 바람직하게는 약 1 내지 99:99 내지 1, 보다 바람직하게는 약 10 내지 90:90 내지 10 등이다. 보다 바람직하게는, 비이온성 계면활성제:에탄올 = 약 10 내지 80:90 내지 20, 약 50 내지 80:50 내지 20 등이고, 특히, 약 20:80, 약 65:35 등이 바람직하다

본 발명의 약제학적 조성물 중의 물에 즉시 용해성인 사이클로덱스트린 유도체의 함량은 제제의 형태에 따라 변화되지만, 일반적으로 전체 조성물의 약 1 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 약 10 내지 약 99.99중량%, 보다 바람직하게는 약 20 내지 약 97중량%, 특히 바람직하게는 약 50 내지 약 97중량%이다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 기타 첨가제의 함량은 제제의 형태에 따라 변화될 수 있지만, 일반적으로 전체 조성물의 약 1 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 약 10 내지 약 90중량%, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 70중량%이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 활성 화합물, 비이온성 계면활성제 및 물에 즉시 용해성인 사이클로덱스트린 유도체를 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다. 이러한 경우, 각각의 성분, 즉 활성 화합물, 비이온성 계면활성제 및 물에 즉시 가용성인 사이클로덱스트린 유도체는 위에서 언급한 범위와 동일하다.

VIII. 알츠하이머병의 치료 방법

또한 본 발명은, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 사용하여 알츠하이머병을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 화합물은 경구, 비경구(예: 근육내, 복막내, 정맥내, ICV, 수조내 주사 또는 주입, 피하 주사 또는 이식), 흡입 스프레이, 비내, 질내, 장내, 설하 또는 국소 투여 경로에 의해 투여할 수 있고, 각각의 투여 경로에 적합한 통상적인 비독성의 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 함유하는 적합한 투여 단위 제형 중에서 단독으로 또는 함께 제형화시킬 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 및 방법은 통상적으로 알츠하이머병의 처리에 적용되는 기타 치료학적 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다.

알츠하이머병의 치료 또는 예방에 적합한 투여 수준은 일반적으로 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있는 환자 체중 1kg당 1일 약 0.001 내지 100mg이다. 바람직하게는, 투여 수준은 1일 약 0.01 내지 약 25mg/kg; 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 약 10mg/kg일 수 있다. 적합한 투여 수준은 1일 약 0.01 내지 25mg/kg, 약 0.05 내지 약 10mg/kg, 또는 약 0.1 내지 5mg/kg일 수 있다. 이러한 범위 내에서 투여량은 1일 약 0.005 내지 약 0.05mg/kg, 0.05 내지 0.5mg/kg 또는 0.5 내지 5mg/kg일 수 있다. 경구 투여를 위하여, 조성물은 치료되는 환자에 대한 증상적 투여 조절을 위하여 바람직하게는 활성 성분을 1 내지 1000mg, 특히 약 1mg, 5mg, 10mg, 15mg, 20mg, 25mg, 50mg, 75mg, 100mg, 150mg, 200mg, 250mg, 300mg, 400mg, 500mg, 600mg, 750mg, 800mg, 900mg 및 1000mg 함유하는 정제의 형태로 제공된다. 화합물은 1일 1 내지 4회, 바람직하게는 1일 1 또는 2회의 투약 계획으로 투여할 수 있다.

그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정한 용량 수준 및 투약 빈도는 변화될 수 있으며, 사용되는 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 화합물의 활성 기간, 연령, 체중, 일반적 건강, 성별, 식이, 투여 방식 및 시간, 배설 속도, 병용 약제, 특정 상태의 중증도 및 치료를 받는 숙주를 포함한 다양한 인자에 좌우됨을 이해한다.

본 명세서에 언급된 모든 참조 문헌, 특허 문헌 및 인쇄물은 이로써 본원에서 전체적으로 참조로 인용된다.

다음 실시예는 본 발명의 특정한 바람직한 양태를 추가로 설명하기 위하여 예시로서 제공되며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

실시예 1: 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB)

브래디키닌(10nM, 10분, 37℃)은 알츠하이머(AD) 섬유아세포 대 비-AD 치매 및 비치매 대조 섬유아세포에서 Erk1/2의 보다 큰 인산화를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 AD 섬유아세포에 대한 이러한 증가된 Erk1/2 인산화는 추가의 콜리얼 세포주로 여기서 관찰될 수 있는 한편, 이러한 측정에서 발견된 고유한 변화성은 개선된 정량, 신뢰도 및 재생산성에 대한 요구를 나타내었다. 그러므로, 여기서, 섬유아세포 세포주의 성장 속도에서의 고유한 차이 뿐만 아니라 겔에 적용된 단백질 추출물의 정확한 정량의 차이에 대해 대조하기 위하여, 본 발명자들은 새로운 인산화 측정법, 즉 BK+ 자극 전후의 Erk1/2 비를 사용하여 모든 환자 샘플에 있어서 Erk1을 Erk2 인산화와 비교하는 측정법을 도입한다. Erk1/Erk2 인산화 비의 이러한 측정법, 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB)는 모든 비치매 대조 섬유아세포를 모든 AD 섬유아세포와 완전히 구별하였다(도 1 및 4A). 대조 케이스(BK-)에 대한 p-Erk1의 명백한 보다 높은 수준(도 3)은 모든 환자에 대해서 일정하지는 않았다. 비-AD 치매의 몇 가지 케이스는 구별되지 않았으나, 이는 임상적 진단의 검시 확인 부족으로 인한 것일 수 있다. 이러한 해석은 검시 확인된 진단을 한 환자로부터의 섬유아세포로 수득된 ADSMB 측정의 결과에 의해 지지되었는데(도 1 및 4B), 여기서 ADSMB는 모든 AD 케이스를 비-AD 치매 및 AD와 기타 비-AD 병인, 예를 들면, 파킨슨병 둘 다로 인한 "혼합" 치매의 케이스와도 정확히 구별하였다. AD를 비-AD 치매 및 비-치매 대조 환자와 구별하는 데 있어서의 이러한 높은 정확도는 코리얼 세포 샘플 및 검시 확인된 샘플 둘 다를 고려하는 ADSMV의 현저한 민감성 및 특이성에 반영된다(도 6). 검시 확인된 진단만이 고려되는 경우, 민감성 및 특이성은 100% 수준에 있다.

질환 지속 기간에 따른 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB) 변화

질환 지속 기간(즉, 증상(들) 개시 시간으로부터의 ADSMB 측정 시간)이 유효한 환자의 샘플에 대하여, 본 발명자들은 ADSMB 크기와 질환 지속 기간과의 관계를 검사하였다. 나타낸 바와 같이(도 2), 기간이 증가함에 따라 ADSMB 규모의 현저한(선형 회귀 분석으로) 역 상관관계가 존재하였다. 이러한 결과는 질환 동안 측정된 시기가 이를수록 MAP 키나제 인산화 ADSMB가 보다 현저함을 제안한다.

Aβ(1-42)에 의한 알츠하이머 표현형의 유도

Aβ(1-42) 수준은 초기 AD에 가장 결정적으로 수반될 가능성이 크고, 관찰된 ADSMB는 초기 AD 진단 강도를 갖는 데이터에 의해 나타났기 때문에, 본 발명자들은 여기서 상승된 Aβ(1-42)가 정상 대조 환자로부터의 MAP 키나제 D.F. 섬유아세포주의 이상을 유도할 것이라는 가능성을 검사하였고, 따라서 24시간 동안 1.0μM Aβ(1-42)에 노출하였다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, 예상한 대로 Aβ(1- 42)로 예비 배양하면 정상(음성) ADSMB 표현형이 모든 AD 표현형에 대하여 관찰된 이상 양의 값의 ADSMB 표현형으로 전환되었다. 이러한 결과는 AD 환자에서의 이러한 ADSMB 표현형이 사실상 Aβ(1-42)의 상승된 수준으로부터 발생한 것임을 제안한다.

PKC 활성제, 브리오스타틴에 의한 알츠하이머 표현형의 역전

먼저 논의된 바와 같이, MAP 키나제 인산화(ADSMB에 의해 측정됨)는 PKC 활성화에 의해 조절되고, 이는 차례로 Aβ의 상승된 수준에 대한 취약성을 나타낸었다. 추가로, 잠재적 PKC 활성제, 마크로락톤, 브리오스타틴은 사람 섬유아세포에서 PKC 활성화를 강화시킬 뿐만 아니라 사람 AD 유전자로 이식유전자 도입한 마우스의 뇌에서 Aβ(1-42) 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 이러한 발견을 기초로 하여, 본 발명자들은 Aβ(1-42)에 대한 브리오스타틴(0.1nM)의 효과, 즉 처리된 사람 섬유아세포를 시험하였다. 나타낸 바와 같이(도 5b 및 표 1), 브리오스타틴은 Aβ(1-42)에 의해 정상 섬유아세포에 유도된 MAP 키나제 인산화의 변화를 완전히 역전시켰다. 브리오스타틴은 Aβ 처리된 섬유아세포의 비정상, 양의 값을 이전에 비-AD 섬유아세포에 대하여 관찰된 정상, 음의 값인 ADSMB로 변화시켰다. 브리오스타틴의 이러한 "처리" 효능은 만성 브리오스타틴 처리에 노출시킨 AD-이식유전자 마우스의 크게 증가된 생존율과 일치한다.

알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커(ADSMB)를 AC(대조 세포주)(대조군), 아밀로이드 베타(Aβ) 유도된 세포 및 아밀로이드 베타(Aβ) 유도된 세포 + 브리오스타틴 처리(Aβ+BY)에 대하여 측정하였다

세포주	ADSMBa
	대조군*	Aβ#	Aβ+BY#
AG06959	ㅡ	0.13	0.0
AG07732	-0.11	0.12	-0.13
AG11363	0.0	0.16	0.09
AG09977	-0.15	0.13	0.01
평균±SE	-0.09±0.05	0.13±0.01	-0.01±0.05

^* P<0.01, ^# P<0.01

^a ADSMB는 당해 연구에 의한 방법 사용에 따라 계산하였다.

^* T-시험은 대조군과 Aβ 처리된 세포 사이에서 수행하였다.

^# T-시험은 Aβ 처리된 세포와 Aβ + 브리오스타틴 처리된 세포 사이에서 수행하였다.

AD를 진단하는 MAP 키나제 인산화의 ADSMB 측정의 높은 민감성 및 특이성은 치매의 임상적 검정에 도움이 되는 AD에 대한 실험실용 시험으로서 중요한 잠재성을 제안한다. 이제까지, 임상적으로 진단된 치매의 검시 확인은 통상적으로 오랫동안 지속된 질환을 가진 환자에게만 통상적으로 이용 가능하다. AD가 8 내지 15년 동안 지속될 수 있다는 점을 고려하면, 짧은 지속 기간의 AD에 대한 임상적 진단은 질환 진행에서 이후의 임상적 진단과 비교하고 이어서 검시 확인시키는 경우, 높은 부정확도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 말초 바이오마커, 여기서는 사람 섬유아세포에 대한 MAP 키나제 인산화 비는 치매에 대한 치료학적 전략에 이르는 실제 이용성을 갖는다.

이론으로 제약하려는 것은 아니지만, Erk1 대 Erk2 인산화의 비가 Aβ 대사의 AD 특이적 차이로 인해 이상에 민감할 수 있는 이유를 고려하는 것도 흥미롭다. 이것과 AD에 대한 말초 바이오마커의 과거 연구에 대한 한 가지 의미는 AD의 병리생리학이 뇌를 수반할 뿐만 아니라, 다양한 기타 기관계도 수반한다는 점이다. AD의 이러한 계통적 병리생리학적 관점은 아밀로이드 및 tau 대사 경로가 인체에 편재하고 있으며 혈액, 타액, 피부 및 뇌 외부 조직에서 나타난다는 관찰과 일치한다.

본원에서 나타낸 Erk1/Erk2 비와 AD와의 밀접한 상관 관계는 또한 AD 신호전달의 "리드-아웃(read-out)"으로서 당해 기질에 대한 주의에 초점을 맞춘다. 예를 들면, PKC 동위효소는 MAP 키나제에 수렴하는 몇 개의 분자 표적을 조절한다. PKC는 다음을 활성화시킨다: (1) s-APP의 α-세크레타제 증가 및, 이에 따른, 간접적인 β-아밀로이드의 감소; (2) β-아밀로이드는 MAP 키나제 인산화를 증가시키는 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)를 활성화시킴; (3) PKC는 GSK-3β를 억제함; (4) PKC 자체는 GSK-3β를 인산화시킴; (5) PKC는 BK 및 기타 AD 개시된 이벤트에 반응할 수 있는 시토카인 염증성 신호를 활성화시킴; (6) 독성 콜레스테롤 대사물(예: 17-OH 콜레스테를)은 균형 상태에서는 Aβ를 감소시키고 인산화 tau를 감소시키는 PKC를 억제함.

PKC 동위효소 자체의 기능장애가 AD 공정의 초기 개시에 기여할 수 있다는 증거는, 따라서 위의 신호전달 이벤트 전체를 통하여 Erk1/2 인산화 비의 이상에 영향을 미친다.

최종적으로, 이는 어떻게 AD 인산화 이상의 특이성이 사람 섬유아세포주의 연속적인 통과를 통하여 유지될 수 있는지에 대한 미스테리이기도 하다. 이러한 현상은 PKC/MAP 키나제 수준과 섬유아세포 게놈의 상호 작용을 통하여 설명될 수 있었다. PKC 및 MAP 키나제는 유전자 발현을 조절한다는 것이 공지되어 있다. 그러므로, 이의 자체의 합성의 PKC/MAP 키나제 자극의 개시 사이클이 사람 섬유아세포의 하나의 발생으로부터 그 다음 발생까지 MAP 키나제 인산화 및 PKC 수준의 이상을 영속시킬 수 있음이 가능할 수 있다.

실시예 2: Aβ 처리

Aβ(1-42) 용액의 제조: 처음에 Aβ(1-42) 1mg을 헥사-플루오로이소프로판올(Sigma, St. Louis, MO)에 3mM의 농도로 용해시키고, 멸균 마이크로원심분리 관에서 분취량으로 분리하였다. 헥사-플루오로이소프로판올을 진공하에 제거하고, 냉동 건조시켰다. Aβ(1-42) 필름을 -20℃에서 건조 상태하에 사용시까지 저장하였다. 5mM Aβ(1-42) 저장 용액을 실험 직전에 저장된 DMSO 중의 Aβ(1-42)로부터 제조하였다. 1.0μM 저장 용액을 DMSO 저장 용액으로부터의 Aβ(1-42)를 용해시켜 DMEM 매질(10% 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충됨) 중에서 제조하였다. 1.0μM Aβ(1-42)를 함유하는 DMEM 매질을 25㎖ 배양 플라스크 속에서 비-AD 대조(AC) 세포에 90 내지 100% 컨플루언스 단계에서 가하고, 세포 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 24시간 동안 유지시켰다. 세포를 무혈청 매질(DMEM) 중에서 "스타빙(starving)시켰다. 1OnM 브래디키닌(DMSO 중의) 용액을 10% 혈청을 포함한 DMEM 매질 중에서 제조하였다. 10nM BK 용액 7㎖를 25㎖ 배양 플라스크에 가하고, 37℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 대조를 위하여, 동량의 DMSO를 10% 혈청을 포함한 DMEM 매질 중에서 가하였다. DMSO(<0.01%)를 포함한 당해 매질 7㎖를 25㎖ 배양 플라스크에 가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 냉(4℃) 1X PBS로 4회 세척한 후, 플라스크를 드라이아이스/혼합물 속에 15분 동안 유지시켰다. 플라스크를 드라이 아이스/혼합물로부터 옮긴 다음, 세포 용해 완충액(10mM Tris, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 1% 프로테아제 억제제 칵테일, 1% ser/thr/티로신 포스파타제 억제제 칵테일) 100㎕를 각각의 플라스크에 가하였다. 플라스크를 냉실(4℃)에서 30분 동안 엔드-투-엔드(end-to-end) 진탕기에서 유지시키고, 셀 스크레이퍼로 각각의 플라스크로부터 세포를 회수하였다. 세포를 초음파처리한 다음, 14000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 전체 단백질 검정 후 상청액을 웨스턴 블로팅에 사용하였다. 전체 Erk1, Erk2, 및 Erk1과 Erk2의 인산화 형태(p-Erk1, p-Erk2)는 특이 항체인, 항-정규 Erk1/2 및 항-포스포 Erk1/2를 사용하여 측정하였다. 3개 이상의 브래디키닌 처리된 플라스크(BK+) 및 상응하는 3개의 대조 플라스크(BK-)를 각각의 세포주에 대하여 배양하여 측정 오차를 최소화시켰다.

브리오스타틴 처리

0.1nM 브리오스타틴 용액을 DMSO 저장 용액으로부터의 정규 DMEM 매질(10% 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충됨) 중에서 제조하였다. Aβ 처리 후, 세포를 정규 배양 매질(10% 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충됨)로 4회 세척하였다. 0.1nM 브리오스타틴을 세포에 가하고, 배양 플라스크를 세포 배양기(37℃, 5% CO₂) 속에서 20분 동안 유지시켰다. 무혈청 매질로 5회 세척한 후, 플라스크를 배양기(37℃, 5% CO₂) 속에서 무혈청 상태하에 16시간 동안 유지시켰다. 브래디키닌 유도된 MAPK 검정을 위에서 논의한 바와 같이 수행하였다.

데이터 분석

웨스턴 블럿 단백질 밴드의 신호를 Fuji LAS-100 플러스 스캐너로 주사하였다. Erk1, Erk2, p-Erk1 및 p-Erk2를 본 연구소(Blanchette Rockefeller Neurosciences Institute, Rockville, MD)의 넬슨(Nelson) 박사가 개발한 특수 고안된 소프트웨어로 주사 단백질 밴드로부터 측정하였다. 스트립 밀도계로 강도를 측정하였다. 단백질 밴드를 스트립에 의해 선택하고, 각각의 화소 밀도를 소프트웨어에 의해 배경을 뺀 후 계산하였다. p-Erk1/p-Erk2의 비를 샘플(BK+) 및 대조군(BK-) 각각으로부터 계산하였다. 다음의 식을 사용하여 AD와 비-AD 케이스 사이를 구별하였다(여기서, ADSMB는 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커이다):

ADSMB= [p-Erk1/p-Erk2]^{BK +} - [p-Erk1/p-Erk2]^{BK -}

실시예 3: 인산화 Erk1 대 인산화 Erk2의 비를 결정하는 피부 섬유아세포의 시험관내 검정

머리얼 인스티튜트 오브 베디컬 리서치로부터의, 뱅킹된 피부 섬유아세포[알츠하이머병(AD), 비AD 치매(비-ADD)(예: 헌팅톤 및 파킨슨병 및 임상적 정신분열증] 및 연령 매칭된 대조 세포(AC)를 90 내지 100% 컨플루언스 단계로 배양하였다. 세포를 무혈청 매질(DMEM) 중에서 16시간 동안 "스타빙"시켰다. 정규 매질 중에서의 DMSO 중의 브래디키닌(BK) 10nM을 37℃에서 0 내지 10분 동안 가하였다. 대조를 위하여, 동량의 DMSO를 가하였다.

냉(4℃) 1X PBS로 4회 세척한 후, 플라스크를 드라이아이스/에탄올 혼합물 중에서 15분 동안 유지시켰다. 플라스크를 드라이아이스/에탄올 혼합물로부터 옮긴 다음, 세포용해 완충액(10mM Tris, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 1% 프로테아제 억제제 칵테일, 1% ser/thr/티로신 포스파타제 억제제 칵테일) 80㎕를 각각의 플라스크에 가하였다.

플라스크를 냉실(4℃)에서 30분 동안 엔드-투-엔드 진탕기에서 유지시키고, 셀 스크레이퍼로 각각의 플라스크로부터 세포를 회수하였다. 세포를 초음파처리한 다음, 14000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 전체 단백질 검정 후 상청액을 웨스턴 블로팅에 사용하였다.

전체 Erk1, Erk2 및 Erk1 및 Erk2의 인산화 형태(p-Erk1, p-Erk2)는, 특이 항체인, 항-정규 Erk1/2 및 항-포스포 Erk1/2를 사용하여 측정하였다.

실시예 4: 피부 섬유아세포

AD 환자 및 연령 매칭된 대조군으로부터의 뱅킹된 피부 섬유아세포를 코리얼 인스티튜트 포 메디컬 리서치로부터 구입한다. 검시 확인된 피부 섬유아세포를 개별적으로 입수한다. 환자는 심한 치매, 진행성 기억 손실 및 기타 손상된 인지 기능으로 임상적으로 발병된 상태이다. 당해 환자들로부터의 뇌는 비정상 EEG 및 CAT 또는 CT 주사에 의한 상이한 정도의 대뇌 위축을 나타낸다. 근접한 연령으로 매칭된 정상 개인으로부터의 세포를 대조군으로서 사용한다.

새로이 채취한 피부 섬유아세포. 새로이 입수한 피부 조직으로부터의 섬유아세포의 회수 및 배양을 다음과 같이 수행한다: 비-FAD(n-FAD) 환자 및 연령 매칭된 대조군으로부터의 천공 생검 피부 조직을 자격을 갖춘 인원에 의해 입수한다. 모든 환자(또는 대표자)는 통지한 동의 형식에 서명한다.

헌팅턴 질환으로부터 뱅킹된 섬유아세포. 당해 섬유아세포는 헌팅턴 질환(HD) 환자로부터 채취한 것이며, 치매는 통상적인 헌팅턴 질환 증상을 동반한다. 정상 연령 미치 성별 매칭된 개인으로부터의 섬유아세포를 대조군으로서 사용한다.

실시예 5: 물질

DMEM은 기브코(Gibco) BRL로부터 구입한다. 소 태아 혈청은 바이오 플러즈(Bio Fluids)로부터 구입한다. 브래디키닌, 디페닐붕산 2-아미노에틸 에스테르(2ABP), 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일은 시그마(Sigma)로부터 구입하고; 비스인돌릴말레이미드-1 및 LY294002는 알렉시스(Alexis)로부터 구입하고; PD98059는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 구입한다. 항-포스포-Erk1/2 항체는 셀 시그널링 테크놀로지로부터 구입한다. 항-정규 Erk1/2는 업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology)로부터 구입한다. SDS 미니겔(4-20%)은 인버트로겐-노벡스(Invertrogene-Novex)로부터 구입한다. 니트로셀룰로스 막은 슐라이처 & 슈엘(Schleicher & Schuell)(Keene, NH)로부터 구입한다. 모든 SDS 전기영동 시약은 바이오-라드(Bio-Rad)로부터 구입한다. 수퍼시그널 화학발광 기질 키트는 피어스(Pierce)로부터 구입한다.

또는, 브래디키닌(M.Wt. 1060.2)은 칼바이오켐(Calbiochem)(San Diego, CA)으로부터 구입하였다. 래빗으로부터의 항 포스포-p44/p42 MAPK는 셀 시그널링 테크놀로지(Danvers, MA)로부터 입수하였다. 항-정규 Erk1/2는 업스테이트 바이오테크놀로지(Charlottesville, VA)로부터 구입하고, 항-래빗 2차 항체는 잭슨 랩(Jackson Lab)(Bar Harbor, ME)으로부터 구입하였다. 베타 아밀로이드(1-42)(M.Wt. 4514.1)는 아메리칸 펩티드(American Peptide)(Sunnyvale, CA)로부터 구입하였다. 브리오스타틴은 바이오몰(Biomol)(Plymouth Meeting, PA)로부터 구입하였다.

실시예 6: AC 및 AD 섬유아세포의 배양

FAD 및 nFAD 유형 둘 다를 포함하는 알츠하이머병 환자로부터, 및 연령 매칭된 대조군(AC)으로부터의 뱅킹된 섬유아세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM과 함께 T25/T75 중에서 유지시키고 배양한다. 세포를 6 내지 17 계대(passage) 내에서 사용한다.

실시예 7: 새로운 생검 조직 또는 뱅킹된 샘플로부터의 섬유아세포의 가공 및 배양

샘플을 1xPBS에 넣고, 이동 매질 중에서 증식용 실험실로 옮긴다. 이동 매질을 제거한 후, 피부 조직을 PBS로 세정하고, 1mm 크기의 외식편으로 초핑시킨다. 외식편을 45% FBS 및 100U/㎖ 페니실린 및 100U/㎖ 스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유하는 생검 매질 3㎖를 포함한 배기된 T25 플라스크의 성장 표면 위로 하나씩 옮긴다. 조직을 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 10% FBS를 함유하는 생검 매질 2㎖를 가한다. 매질을 10% FBS 및 100U/㎖ Pen/Strep을 함유하는 정규 배양 매질 5㎖로 48시간 동안 대체시킨다. 이어서, 세포를 계대접종시키고, 위에서 제시된 정규 과정에 따라 유지시킨다.

사람 피부 섬유아세포 배양 시스템을 또한 당해 연구에 사용하였다. 콜리얼 인스티튜트 오브 메디컬 리서치(Camden, New Jersey)로부터의 뱅킹된 피부 섬유아세포, 알츠하이머병(AD), 비 AD 치매(예: 헌팅톤 및 파킨슨병 및 임상적 정신분열증 및 연령 매칭된 대조군, AC)를 25㎖ 세포 배양된 플라스크 중에서 90 내지 100% 컨플루언스 단계로 배양하였다(10% 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충됨, 37℃, 5% CO₂). 세포를 무혈청 매질(DMEM) 중에서 16시간 동안 "스타빙"시켰다. 10nM 브래디키닌(DMSO 중의) 용액을 10% 혈청을 포함한 DMEM 매질 중에서 제조하였다. 10nM BK 용액 7㎖를 25㎖ 배양 플라스크에 가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 대조를 위하여, 동량의 DMSO를 10% 혈청을 포함한 DMEM 매질 중에서 가하였다. DMSO을 포함한 당해 용액(<0.01%) 7㎖를 25㎖ 배양 플라스크에 가하고, 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 냉(4℃) 1X PBS로 4회 세척한 후, 플라스크를 드라이아이스/에탄올 혼합물 중에서 15분 동안 유지시켰다. 플라스크를 드라이아이스/에탄올 혼합물로부터 옮긴 다음, 세포용해 완충액(10mM Tris, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 1% 프로테아제 억제제 칵테일, 1% ser/thr/티로신 포스파타제 억제제 칵테일) 100㎕를 각각의 플라스크에 가하였다. 플라스크를 냉실(4℃)에서 30분 동안 엔드-투-엔드 진탕기에서 유지시키고, 셀 스크레이퍼로 각각의 플라스크로부터 세포를 회수하였다. 세포를 초음파처리한 다음, 14000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 전체 단백질 검정 후 상청액을 웨스턴 블로팅에 사용하였다.

실시예 8: 상이한 단백질 키나제 C 활성제를 사용한 섬유아세포의 처리

브래디키닌 또는 상이한 특이 단백질 키나제 C 활성제를 섬유아세포를 처리하는 데 사용한다. 뱅킹된 AC 및 AD 피부 섬유아세포를 80 내지 100% 컨플루언스로 배양한 후, 이를 무혈청 DMEM 중에서 밤새 "스타빙"시킨다. 세포를 10nM 단백질 키나제 C 활성제로 37℃에서 상이한 시간 동안 처리하여 단백질 키나제 C 활성제 유도된 효과에 대한 시간 경과를 달성한다. 단백질 키나제 C 활성제의 적용 직후 반응이 종결되는 시점을 "0분" 후-단백질 키나제 C 할성제 처리로 정의한다. 각각의 처리 시점에서의 각각의 세포주에 대한 세포의 대조 플라스크를 동일한 용적의 PBS와 가한다. 배양 매질을 제거하여 반응을 종결시키고, 세포를 예비냉각된 PBS, pH 7.4로 신속하게 세정하고, 플라스크를 드라이 아이스/에탄올로 옮긴다. 새로운 생검 조직으로부터 수득하고 배양된 세포에 대해서, 0.1 nM 단백질 키나제 C 활성제의 농도가 사용될 수 있다. 처리 시간은 37℃에서 약 10분이다.

처리된 세포로부터 세포 용해물을 제조하기 위하여, 플라스크를 드라이 아이스/에탄올로부터 빙수로 옮긴다. 각각의 플라스크에 10mM Tris, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 1% 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma), 1% ser/thr 및 티로신 포스파타제 억제제 칵테일(Sigma)을 함유하는 세포용해 완충액 1㎖를 가한다. 냉실 속에서 엔트-투-엔드 진탕기에서 30분 동안 흔들어준 후, 셀 스크레이퍼로 각각의 플라스크로부터 세포를 회수한다. 세포를 초음파처리하고, 5000rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 웨스턴 블로팅에 대하여 상청액을 사용한다.

실시예 9: 웨스턴 블로팅

프로토콜 1: 세포 용해물을 동일한 용량의 2X SDS-샘플 완충액으로 처리하고, 10분 동안 비등시킨다. 각각의 샘플로부터의 단백질을 4-20% 미니-구배 겔에서 분해하고, 니트로셀룰로스 막 위로 옮긴다. 인산화 Erk1/2를 수퍼시그널(SuperSignal) ECL 검출 키트를 사용하여 항-포스포-Erk1/2 항체로 검출한다. Erk1/2의 총량에 대하여 인산화 Erk1/2의 양을 정규화시키기 위하여, 항-포스포-Erk1/2 항체로 블로팅한 후, 동일한 막을 62.5mM Tris-HCl, pH 6.7, 2% SDS 및 100mM 2-머캅토에탄올을 함유하는 스트립핑 완충액으로 60℃에서 45분 동안 스트립핑시킨 다음, 항-정규 Erk1/2 항체로 블로팅시킨다. 또는, SDS-PAGE에서 분해되고 니트로셀룰로스 막으로 옮겨진 이중 샘플을 항-포스포- 및 항-정규 Erk 항체로 각각 블로팅시킨다. 0.01% Tween 20(10분 동안 3회)을 함유하는 10mM PBS, pH 7.4로 세척한 후, 막을 항-정규 Erk1/2 항체로 블로팅하고, 이로부터 SDS 겔에 가중된 Erk1/2의 총량을 측정한다.

프로토콜 2: 동 용적의 2xSDS 샘플 완충액을 각각의 세포 용해물에 가하고, 비등 수욕 중에서 10분 동안 비등시켰다. 8-16% 미니-구배 겔에서 전기영동을 수행하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 총 Erk1, Erk2 및 Erk1 및 Erk2의 인산화 형태(p-Erk1, p-Erk2)를 특정 항체를 사용하여 측정하였다.

실시예 10: 데이터 분석

인산화 및 정규 형태의 Erk1/2 둘 다에 대한 신호를 후지필름 LAS-1000 플러스 스캐너로 주사한다. 각각의 단백질 밴드의 평균 광학 밀도를 NIH 이미지 소프트웨어를 사용하여 측정한다. 포스포-Erk1/2 신호로부터의 값을 총 Erk1/2 신호의 값에 대하여 각각 정규화시킨다. 정규화 후, 각각의 시험된 세포주로부터의 데이터를 기본 대조군의 백분율로 전환시키고, 통계적 분석한다.

실시예 11: 면역세포화학

섬유아세포를 0.02mg 폴리리신으로 피복된 2.5cm 직경의 유리 커버슬립의 표면에서 성장시킨다. 위에서 기재한 바와 같은 브래디키닌 또는 또 다른 단백질 키나제 C 활성제로 처리시, 상기 세포를 냉 PBS, pH 7.4로 신속하게 세정하고, PBS, pH 7.4 중의 4% 포름알데히드로 실온에서 15분 동안 고정시킨다. PBS, pH 7.4로 3회 세척한 후(각각 5분 동안 지속), 상기 세포를 PBS 중의 0.1% 트리톤 x-100, pH 7.4로 실온에서 30분 동안 침투시킨다. PBS, pH 7.4 중의 10% 정상 말 혈청으로 실온에서 30분 동안 배양한 후, 세포를 항-포스포-Erk1/2 항체(1:200)로 4℃에서 밤새 배양한다. 커버슬립 위의 세포를 PBS, pH 7.4로 3회 세척한 다음, 형광으로 표지된 항-마우스 IgG(Vector Laboratories)를 가하고(1:200), 상기 세포로 실온에서 60분 동안 배양한다. PBS로 3회 세척하고 벡타쉴드(Vectashield)(Vector Laboratories)로 밀봉 후, 세포에서의 면역염색 신호를 니콘(Nikon) 형광 현미경으로 관찰한다. 세포 이미지에서의 면역세포화학 신호의 강도를 바이오-라드 퀀티티 원 소프트웨어(Bio-Rad Quantity One softwar, BioRad) 및 틴이미지(Tnimage)로 측정한다. 피부 섬유아세포에서의 BK 또는 단백질 키나제 C 활성제 수용체의 국소화를 위하여, 단일클론 항-BK B2 항체 또는 항 단백질 키나제 C 활성제 항체는 정상 섬유아세포에 가한 다음, Cy5 공액 항-마우스 IgG로 배양한다. 수득한 면역반응성 신호를 형광 현미경으로 이미지화한다.

Claims (14)

1. a. 환자로부터의 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키고,
   b. 상기 세포에서 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값을 측정함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료에 대한 증가된 반응성을 갖는 환자를 선택하는 방법으로서,
   상기 세포의 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 상기 값이 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 높은 양의 값(high positive value)인 경우에, 상기 환자의 알츠하이머병의 치료에 대한 상기 증가된 반응성이 나타나는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포가 말초 세포인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 상기 높은 양의 값이 치매 0 내지 2년을 나타내는, 방법.
4. 제1항에 있어서, 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 상기 높은 양의 값이 치매 0 내지 3년을 나타내는, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 세포가 피부 세포, 피부 섬유아세포, 혈구 및 협점막 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 단백질 키나제 C 활성제가 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
7. a. 환자로부터의 세포를 단백질 키나제 C 활성제인 제제와 접촉시키고,
   b. 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값을 측정함을 포함하는, 알츠하이머병의 치료에 증가된 반응성을 갖는 환자를 선택하는 방법으로서,
   상기 세포의 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 상기 값이 대조 세포들로부터의 상기 알츠하이머병 특이적 분자 바이오마커의 값보다 큰 경우에, 상기 환자의 알츠하이머병의 치료에 대한 상기 증가된 반응성이 나타나는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 세포가 말초 세포인, 방법.
9. 제7항에 있어서, 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 상기 높은 양의 값이 치매 0 내지 2년을 나타내는, 방법.
10. 제7항에 있어서, 초기 단계 알츠하이머병과 상호 연관된 상기 높은 양의 값이 치매 0 내지 3년을 나타내는, 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 피부가 피부 세포, 피부 섬유아세포, 혈구 및 협점막 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
12. 제7항에 있어서, 상기 단백질 키나제 C 활성제가 브래디키닌, 브리오스타틴, 봄베신, 콜레시스토키닌, 트롬빈, 프로스타글란딘 F2α 및 바소프레신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
13. 제1항에 따르는 방법에 의해 알츠하이머병의 치료에 대한 증가된 반응성을 갖는 것으로 확인된 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 약제를 투여함을 포함하는 방법.
14. 제7항에 따르는 방법에 의해 알츠하이머병의 치료에 대한 증가된 반응성을 갖는 것으로 확인된 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 치료학적 유효량의 약제를 투여함을 포함하는 방법.

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