KR20070084247A

KR20070084247A - 알츠하이머 질환의 진단 및 치료를 위한 포스파타제 2ａ(ｐｐ2ａ)의 비정상

Info

Publication number: KR20070084247A
Application number: KR1020077011049A
Authority: KR
Inventors: 웨이-퀸 자오; 다니엘 엘 앨콘
Original assignee: 블랜체트 록펠러 뉴로사이언시즈 인스티튜트
Priority date: 2007-05-15
Filing date: 2004-11-15
Publication date: 2007-08-24

Abstract

본 발명은 알츠하이머 질환을 진단하는 방법 및 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 대조군 세포와 비교하여 알츠하이머 질환 세포에서 단백질 포스파타제 2A (PP2A) 기능 및 관련 분자 현상에서 새롭게 발견된 차이를 토대로 한다. 일 태양으로, 알츠하이머 세포에서 기저 PP2A 유전자 발현의 차이를 대조군과 비교한다. 또 다른 태양으로, PP2A 단백질 및 효소 활성의 차이를 시험 세포 및 대조군 세포와 비교한다. 또 다른 태양으로, PP2A 기능을 억제하는 물질에 대한 반응의 차이를 비교한다. 또 다른 태양은 정상 세포 및 알츠하이머 질환 세포에서 PP2A의 기질인 인산화된 Erk1/2의 아세포 분포에서의 차이를 검출한다. 말초 조직에서 PP2A 기능 및 관련 현상에서의 알츠하이머 질환-특이적 차이의 검출은, 알츠하이머 질환의 조기 진단을 위한 매우 실용적이고 효율적인 시험 및 진단 시험 키트의 기반을 제공할 뿐아니라, 약물 개발을 위한 치료 표적을 동정하기 위한 생화학적 기반을 제공한다.

알츠하이머 질환, PP2A, GAPDH, 섬유아세포, 브래디키닌

Description

알츠하이머 질환의 진단 및 치료를 위한 포스파타제 2Ａ (ＰＰ2Ａ)의 비정상{Abnormalities of phosphatase 2A (PP2A) for diagnosis and treatment of Alzheimer's disease}

본 발명은 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 대조군 세포에 비해 알츠하이머 질환을 가진 환자의 세포 중의 단백질 포스파타제 2A (PP2A) 발현 또는 기능 및 관련 분자 현상에서 새롭게 발견된 차이점을 토대로 한다. 말초 조직에서 PP2A 발현 및 기능의 알츠하이머 질환-특이적 차이점의 검출은 알츠하이머 질환의 조기 진단 및 치료적 약물 개발을 위한 매우 실용적이고 효율적인 시험의 토대를 제공한다.

단백질 인산화의 기능장애, 특히 포스파타제 경로의 손상으로 인한 단백질 인산화의 기능장애는 알츠하이머 질환 (AD)의 분자 병리학과 연관이 있다. 이러한 비정상의 주요 예 중의 하나는, 알츠하이머 질환의 뇌에서 가장 현저한 병소 중의 하나를 나타내는 신경섬유 엉킴 (NFT: neurofibrillary tangle)를 구성하는 미세관-연결된 tau 단백질의 과인산화이다 [참조 문헌: Cummings et al., 1998; Jellinger and Bancher, 1998]. 정상 뉴런에서, tau는 튜뷸린에 결합하여, 미세관 조립에 관여한다. tau의 인산화는 미세관 결합을 감소시켜, 뉴런의 세포골격의 불안정화를 유도한다 [참조 문헌: Lee, 1995; Billingskey and Kincaid, 1997]. tau가 과인산화되면, 이는 미세관에 결합하는 능력을 상실하고, 자가-조립하여 쌍을 이룬 나선 미세섬유 (PHF)를 형성하는 것으로 여겨지는데, 이는 비정상적 세포골격 단백질 과정의 징후이다 [참조 문헌:Lee, 1995; Billingsley and Kincaid, 1997; Saito et al., 1995; Mandelkow et al., 1995].

AD-관련 분자 비정상을 일으키는 기전에 대한 연구에서, 많은 관심이 tau 인산화를 조절하는 단백질 키나제 및 포스파타제에 집중되어왔다. 글리코겐 신타제 키나제-3 (GSK-3) 및 미토겐-활성화된 단백질 (MAP) 키나제를 포함한 여러 단백질 키나제가 tau를 인산화시킨다는 것이 밝혀졌다. MAP 키나제의 정상 활성은 세포 증식 및 분화를 조절하고 (Force and Bonventre, 1998; Roovers and Assoian, 2000), 뇌 기능, 예를 들어 학습 및 기억에서 중요한 역할을 한다 (Valijent et al., 2001; Sweatt, 2001; Zhao et al., 1999). 다른 한편으로, 비정상적으로 지속된 MAP 키나제 활성화는 tau 과인산화 및 뉴런 아폽토시스를 일으키므로 해로울 수 있다 (Guise et al., 2001). MAP 키나제 계열의 일원인 세포외 시그널-조절된 키나제 (Erk)의 지속된 활성화는 설치류 해마 뉴런에서 β-아밀로이드에 의해 유도되었으며 (Rapoport and Ferreira, 2000; Dineley et al., 2001), 이는 다시 tau 인산화, 신경돌기 퇴행 및 뉴런 사멸을 증가시켰다 (Rapoport and Ferreira, 2000). 추가로, 연장된 Erk1/2 인산화가 강력한 염증 매개인자인 브래드키 닌(bradykinin)에 의해 유도된 AD 섬유아세포에서 발견되었으며 (Zhao et al., 2002), 활성화된 Erk2와 신경섬유 엉킴 사이의 관련성이 사람 뇌에서 입증되었다 (Knowles et al., 1999).

포스파타제 활성의 기능장애는 또한 AD에서 비정상 단백질 인산화에 결정적으로 기여할 수 있다. 유기 세포의 세린/트레오닌 단백질 포스파타제의 4개의 주요 유형 (포스파타제-1, 2A, 2B, 및 2C) 중에서, 포스파타제 2A (PP2A) 이소형(isoform)은 뇌에서 과도하게 발현되어, 신경미세섬유 (Saito et al., 1995; Janssens and Goris, 2001) 및 미세관-연결 단백질 (Mandelkow et al., 1995; Janssens and Goris, 2001)와 같은 세포내 단백질의 특정 부위에 표적화된다. tau 및 MAP2와 같은 미세관 단백질에 결합하여 인산화를 조절함으로써, PP2A는 미세관 안정성을 유지하는데 중요한 역할을 한다 (Mandelkow et al., 1995). 추가로, PP2A가 시험관내 및 생체내에서 과인산화된 tau의 특정 부위를 탈인산화시킨다는 것이 밝혀졌다 (Goedert et al., 1992; Wang et al., 1995; Gong et al., 2000; Planel et al., 2001). 예를 들면, 이는 이미 형성된 PHF에서 과인산화된 tau를 탈인산화시켜, 탈인산화된 tau를 PHF에서 분리시켜, 단백질분해가 가능하게 된다 (Wang et al., 1995). 건강한 PP2A 시스템은 정상 세포의 세포골격 안정성의 유지에 필수적일 뿐만 아니라, 세포 스트레스 및 고 칼슘 독성과 같은 병리 상태 하에서 비정상적으로 증가된 단백질 인산화를 치료하는데 필수적이다. AD의 최종 단계에서, PP2A 유전자 발현 및 활성은 현저하게 감소된다 (Gong et al., 1995; Vogelsberg-Ragaglia et al., 2001). 또 다른 연구에서, 마우스 뇌에서 PP2A의 돌 연변이형의 발현이 PP2A 활성의 현저한 감소를 일으켰고, 특정 세린/트레오닌 잔기에서 tau의 AD-유사 과인산화를 유도했다 (Kins et al., 2001).

PP2A가 여러 세포 유형에서 MAP 키나제의 불활성화를 일으킨다는 것이 밝혀졌으며 (Alessi et al., 1995; Braconi Quintaje et al., 1996; Chung and Brautigan, 1999), 이는 PP2A가 Erk2 활성의 네가티브 조절인자로서 작용할 수 있다는 것을 암시한다. 최근의 연구는, PP2A에 의한 MAP 키나제의 불활성화가 PP2A의 R2/B 조절 아단위에 의해 특이적으로 조절된다는 것을 보여주었다 (Silverstein et al., 2002). 본원 발명자들은 예전에, 브래디키닌-자극된 Erk1/2 인산화가 AD 세포에서 비정상적으로 연장된다는 것을 보여주었다 (Zhao et al., 2002).

알츠하이머 질환 (AD)의 비교적 초기 단계의 뇌에서 두드러진 병리학적 특징은 신경섬유 엉킴 (NET)이라 불리는 신경섬유내 병소이다. AD에서, NFT 병소의 95%는 쌍을 이룬 나선 미세섬유 (PHF)로부터 형성된다. PHF의 주요 성분은, 세포골격 단백질의 불안정성을 일으키는 과인산화된 미세관-연결된 단백질 tau이다. 포스파타제 2A (PP2A)는 tau의 탈인산화에 관여하는 주요 효소이다. tau의 탈인산화를 조절함으로써, PP2A는 정상 세포에서 정상적 미세관 안정성의 유지에 관여하고, 병리 상태에서 이미 형성된 PHF 중의 비정상적으로 인산화된 tau를 감소시킨다. PP2A는 또한 MAP 키나제 계열의 일원인 Erk1/2를 탈인산화시키는 2개의 포스파타제 중의 하나이다. 분열촉진 또는 염증 자극 후 Erk1/2를 적시에 탈인산화시킴으로써, PP2A는 아폽토시스로부터 세포를 보호하는데 1차적인 역할을 한다.

본 발명은 부분적으로, PP2A 기능의 손상이 AD 발병을 일으키는 분자 기전 중의 하나와 연관이 있다는 발견을 토대로 한다. 살아있는 사람의 뇌 중의 뉴런에 직접 접근하는 것이 불가능하기 때문에, AD의 조기 진단은 극히 어렵다. PP2A의 AD-특이적 비정상 및 관련 분자 현상, 예를 들면 AD 환자의 피부 세포에서 Erk1/2 인산화 및 분포를 시험함으로써, 본 발명은, 구체적 태양으로서, AD의 조기 진단을 위한 매우 실용적이고 효율적인 시험뿐 아니라, 진단 시험 키트 및 치료 약물 개발 방법에 관한 것이다.

발명의 개시

일 태양에서, 본 발명은 사람 세포를 사용하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은, 본원 발명자들이 발견한, 대조군 세포와 비교하여 알츠하이머 질환 세포에서 PP2A 발현과 기능 및 관련 분자 현상의 차이점을 토대로 한다. 본 발명의 진단 방법 중 일부 또는 전부가, 본원에 참조로 전문이 인용된 WO 02/067764에 기재된 진단 방법 중 일부 또는 전부와 함께 사용될 수 있다고 생각되어 진다. 일 태양에서, 브래디키닌과 같은 제제에 의한 자극 후 세포외 시그널-조절된 키나제 1형 또는 2형 (Erk1/2)의 비정상적으로 증가된 인산화를 이용한 알츠하이머 질환의 진단 방법, 및 WO 02/067764에 기재된 알츠하이머 질환을 진단하는 관련 방법은 본원에 기재된 알츠하이머 질환의 진단 방법과 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 알츠하이머 질환의 검출용 진단 시험의 특이성 및 효율성을 향상시키는 PP2A에 관한 다수의 기준을 제공한다. 말초 조직에서 PP2A 기능의 알츠하 이머 질환-특이적 차이점의 검출은 또한 알츠하이머 질환 치료용 약물 개발의 치료적 표적을 동정하기 위한 생화학적 기반을 제공한다.

일 양상으로, 본 발명은 대조군 세포와 비교하여 알츠하이머 질환 세포에서 PP2A 유전자 발현 수준의 차이점을 검출하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 태양은, 가족성 및 산발성 AD의 환자로부터 유래된 섬유아세포에서, 연령이 일치하는 개체로부터의 정상 세포와 비교하여, PP2A 유전자 발현의 기저 수준이 현저히 더 높다는 본원의 발명자들의 발견을 토대로 한다. 바람직하게는, PP2A 유전자 발현의 검출은, 역 전사 정량적 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 수행한다. 바람직한 태양에서, PP2A를 암호화하는 mRNA를 시험 세포에서 정량화하고, 비-알츠하이머 대조군 세포에서 측정된 수준과 비교한다.

또 다른 양상으로, 본 발명은, PP2A의 유전자 발현을 포함하여 PP2A를 후속적으로 활성화시키는 시그널 전달 연쇄증폭과정(cascade)의 일부인 Erk1/2와 같은 단백질의 인산화를 자극하는 화합물에 반응한, 시험 세포 및 대조군 세포에서 PP2A 유전자 발현의 차이점을 검출함으로써 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 자극되지 않은 세포에 비해 자극된 세포에서 PP2A 발현 증가가 결여된다는 것은 알츠하이머 질환의 존재를 암시한다. PP2A가 직접 Erk1/2를 탈인산화시키기 때문에, Erk1/2가 PP2A의 기질이다. 또한, PP2A는 다수의 다른 단백질을 탈인산화시킨다. 한편, Erk1/2는 또한, PP2A 외에, 다른 포스파타제에 의해 탈인산화될 수 있다. 그러나, 비정상 PP2A 활성 및 유전자 발현은, 브래디키닌 자극에 반응하여 알츠하이머 섬유아세포에서 증가된 Erk1/2 인산화와 특이적으로 관련이 있다. 특 정 태양에서, 자극제는 브래디키닌이다. 다른 가능한 자극제로는 인슐린, 포볼(phobol) 에스테르, 리소포스파티딜콜린, 리포폴리사카라이드, 안트라사이클린 다노루비신 (anthracycline dannorubicin) 및 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate) 등이 포함되며, 이들은 모두 상류 시그널 전달 경로를 통해 MAP 키나제 인산화를 활성화시킨다. 이러한 태양은, 정상 세포가 PP2A 유전자 발현을 상향조절함으로써 브래디키닌과 같은 화합물에 의한 자극에 반응한다는 발견을 토대로 한다. 대조적으로, 이러한 정상 반응이 알츠하이머 질환 세포에는 결여된다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 대조군 세포와 비교하여 알츠하이머 질환 세포에서 PP2A 단백질 수준 및/또는 효소 활성을 검출하며, 이때 PP2A 단백질 수준 및/또는 효소 활성의 감소가 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 태양은, 정상 세포에 비해 알츠하이머 질환 세포에서 PP2A 단백질 수준 및 PP2A 효소 활성이 현저히 감소된다는 본원 발명자들의 발견을 토대로 한다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 PP2A 억제제의 존재하에서 브래디키닌과 같은 제제에 의한 자극에 대한 세포의 반응을 산정함으로써 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적 태양에서, PP2A 억제제는 오카디아산 (okadiac acid)이다. 이러한 태양은 오카디아산의 존재하에서 브래디키닌으로 처리한 정상 세포가 Erk1/2 인산화를 연장시키며, 그렇지 않은 경우, 브래디키닌 자극 후 약 10분이 지나면, 기저 수준으로 복귀된다는 발견을 토대로 한다. 이러한 정상 반응은 알츠하이머 질환 세포에는 부존재한다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 세포 내의 인산화된 Erk1/2의 아세포(subcellular ) 분포를 평가함으로써 피험자의 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 태양은 인산화된 Erk1/2가 정상 세포의 핵에 농축되지만, 알츠하이머 질환 세포에서는 인산화된 Erk1/2가 핵외 영역 (즉, 시토졸 구획)에 분포된다는 발견을 토대로 한다.

본원에 기재된 방법들은, 알츠하이머 질환을 진단하기 위한 매우 특이적이고 효율적인 시험으로서 단독으로 사용되거나 또는 조합하여 사용될 수 있다.

또 다른 양상으로, 본 발명은 본원에 기재된 시험을 사용하여 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방을 위한 치료 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 당해 스크리닝 방법은 본원의 발명자들에 의해 발견된 PP2A에서의 알츠하이머 질환-관련 비정상 및 본원에 추가로 기재된 관련 분자 현상을 토대로 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 진단 방법을 수행하는데 유용한 물질을 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명의 진단 방법 및 알츠하이머 질환을 치료하기 위한 치료 방법은 본원의 발명자들에 의해 처음으로 발견된 아래의 관찰을 토대로 한다.

연령이 일치하는 개체로부터의 정상 세포에 비해, 가족성 및 산발성 AD의 환자로부터의 섬유아세포에는 PP2A 유전자 발현의 기저 수준이 현저히 높다.

연령이 일치하는 정상 대조군 (AC) 세포는 BK 자극에 반응하여 PP2A 유전자 발현을 상향조절한다. 이러한 정상 반응이 AD 세포에는 결여된다.

AD 세포에서 PP2A 단백질 수준 및 효소 활성은 AC 세포에 비해 현저히 감소 된다.

PP2A 억제제인 오카디악 산(OA)의 존재하에서 AC 세포를 BK로 처리하면, Erk1/2 인산화가 연장되며, 그렇지 않은 경우 BK 자극 후 약 10분이 지나면 기저 수준으로 복귀된다. BK-자극된 Erk1/2 인산화가 정상 탈인산화 기전의 억제로 인해 AD 세포에서 지속되기 때문에, OA의 적용은 Erk1/2 인산화 정도에 추가적 영향을 미치지 못한다. 따라서, AC 세포에서 +0A/-0A Erk1/2 인산화 비는 AD 세포에서의 비 보다 현저히 높다.

Erk1/2가 AC 세포에서 인산화되는 경우에, 이는 핵에 농축되지만, AD 세포에서는 인산화된 Erk1/2가 핵외 영역에 분포된다.

AC와 AD 세포 간의 상기한 모든 차이점은, 알츠하이머 질환 진단을 위한 임상 시험 및 진단 키트 뿐 아니라, 본원에 기재된 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방용 화합물을 스크리닝하는 방법에 대한 기반을 형성한다.

본 발명의 바람직한 태양으로, 사람 피부 섬유아세포가 본 발명의 시험 및 진단 검정에 사용되지만, 혈액 세포가 사용될 수도 있다. 일 태양으로, 동일한 개체로부터의 세포가 약리학적 처리를 위해 여러 플라스크에서 배양될 수 있다.

일 태양으로, PP2A 유전자 발현은, 384- 또는 96-웰 마이크로플레이트가 구비된 Taqman^R 실시간 PCR 장치를 사용하여, 역 전사 정량적 PCR (RVQ-PCR)에 의해 평가한다. 특정 태양으로, 진핵 세포에서 풍부하게 발현되는 참조 유전자, 예를 들어 GAPDH를 동시에 증폭하고 정규화를 위해 사용한다.

일 태양으로, PP2A 단백질 수준 및 Erk1/2 인산화를 웨스턴 블롯 또는 ELISA 로 평가한다.

일 태양으로, Erk1/2의 핵 전위가 측정된다. 세포들을 BK로 자극하고 활성화된 Erk1/2의 핵 분포를 면역세포화학에 의해 또는 핵과 시토졸 간의 포스포-Erk1/2의 시험비를 측정함으로써 평가한다.

세린/트레오닌 포스파타제 2A (PP2A)가, 미세관-연결된 단백질 tau 및 미토겐-활성화된 단백질 (MAP) 키나제의 탈인산화를 조절하는데 있어서 중요한 역할을 하기 때문에, 알츠하이머 질환 (AD)의 병인과 연관이 있다. 본원의 발명자들은 PP2A가 BK 자극에 의한 활성화 후 세포외 시그널-조절된 키나제 1/2 (Erk1/2)의 탈인산화에 관여한다는 것을 밝혀내었다. 또한, 본원의 발명자들은 PP2A의 비정상적 유전자 및 단백질 발현뿐 아니라 비정상적 PP2A 활성이 AD 섬유아세포에서 비정상적으로 연장된 Erk1/2/인산화에 기여한다는 것을 밝혀내었다. 오카디악산에 의한 PP2A의 억제는 BK 자극 후 Erk1/2 인산화를 증가시키고 더욱 지속시키는 반면에, PP2B 및 FK-결합 단백질의 억제제인 FK506은 BK-자극된 Erk1/2 인산화를 억제한다. 게다가, 인산화된 Erk1/2가 AC 세포의 핵 내에 농축되는 한편, 이는 AD 세포의 핵외 구획에 주로 분포된다. 본원의 발명자들은 BK-자극된 활성화 후 AD 세포에서 Erk1/2의 지연된 탈인산화가 PP2A 활성의 결핍 및 인산화된 Erk1/2의 손상된 핵 전위로 인한 것이라는 것을 밝혀내었다.

도 1A-1D: RTQ-PCR을 통한 PP2A 및 GAPDH 유전자 발현의 검출: 사람 섬유아 세포 배양물로부터의 전체 RNA를 추출하고, 제1 쇄 cDNA를 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다. PP2A 및 GAPDH 표준 곡선에 대한 직선 도표는 도 1A 및 1B에 제시되어있다. 도 1C는 PP2A 및 GAPDH의 상이한 융점에 대한 해리 곡선 도표를 도시한다. 도 1D에서, 예상된 서열 크기를 갖는 PP2A 및 GAPDH의 최종 PCR 산물이 TBE 겔 상에 나타나 있다 (레인 2 및 4). 역전사효소의 부재하에서 역전사가 행해진 샘플로부터 어떠한 PCR 산물도 증폭되지 않았다 (레인 1 및 3).

도 2A-2B: RTQ-PCR에 의한 PP2A 유전자 발현의 정량화: 실시간 PCR 동안에, PP2A 및 GAPDH mRNA의 수준은, 동일한 PCR 작업 중에 동시에 수행된 각 유전자에 대한 표준 곡선에 근거하여, 상기 장치에 의해 자동적으로 계산되었다. 각각의 AC 및 AD 세포주로부터 GAPDH 수준에 대한 PP2A mRNA 수준의 비를 계산하여 도 2A에 제시하였다. t-테스트를 이용한 통계학적 분석은 AC와 AD 세포 간의 PP2A mRNA 수준에서 유의적인 차이점을 나타낸다 (P < 0.01). 약 10분 동안 10 nM BK로 처리하는 경우에, PP2A mRNA의 상향조절이 AC 세포에서는 관찰되었으나, AD 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 2B). t-테스트는 AC와 AD 세포간의 유의적인 처리 효과를 보여준다 (^* P = 0.016).

도 3A-3B: AC 및 AD 섬유아세포에서 PP2A 단백질 수준 및 효소 활성: AC 및 AD 세포로부터의 세포 용해물을 본원에 기재된 바와 같이 수득하였다. 도 3A에는, SDS-샘플 완충제로 처리한 후 8개의 AC 세포주 및 8개의 AD 세포주로부터의 동일한 샘플 용적을 각각 SDS-PAGE 상에서 분석하였다. 각 샘플로부터의 PP2A 발현 수준을 항-PP2A 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 측정하였다. ECL로 나타내어진 PP2A의 면역반응성 시그널을 농도계측 스캔에 적용하고, UN-SCAN-IT 소프트웨어로 정량하였다. 안넥신(annexin) II에 대한 면역반응 시그널을 PP2A 시그널의 정규화에 사용하였다. PP2A 단백질 수준에서의 유의적인 차이가 AC 세포와 AD 세포 간에 보였다 (P < 0.01, t 테스트). 도 3B는 AD 세포에서 PP2A 활성이 AC 세포에서와 비교하여 유의적으로 감소하였다 (^* P < 0.001).

도 4: BK-자극된 MAP 키나제 인산화에 미치는 오카디악 산 (OA)의 효과: AC 세포를 10 nM OA의 존재 또는 부재하에서 약 5분 및 약 10분 동안 약 10 nM BK으로 처리하였다. 수득된 Erk1/2 인산화를 웨스턴 블롯으로 평가하였다. Erk1/2 인산화의 수준을 정상(regular) (총량)의 Erk1/2의 수준으로 정규화하였다. 상단 구획은 웨스턴 블롯의 대표적 결과를 보여준다. 아래 구획의 막대 그래프 5개의 상이한 AD 세포의 결과를 요약한 것이다 (^**P < 0.001). BK, 브래디키닌; OA, 오카디악산; P-Erk1/2, 포스포-Erk1/2.

도 5A-5B: AC 세포 및 AD 세포에서 BK-증가된 Erk1/2 인산화에 미치는 OA 및 FK506의 효과의 비교: AC 세포 및 AD 세포를 약 10 nm OA 또는 약 20 nM FK506의 존재 또는 부재하에서 약 10분 동안 약 10 nM BK로 처리하였다. 각 세포주로부터 각 조건하에 수득된 Erk1/2 인산화를 본원에 기재된 바와 같이 측정하였다. 도 5A는 좌측 구획에 대표적인 웨스턴 블롯 결과를 보여주고, 우측에서 9개의 AC 및 AD 세포주의 결과를 요약한 막대 그래프를 보여준다. 도 5B에서, OA 또는 FK605의 존재하에서 BK-자극된 Erk1/2 인산화의 비가 OA 또는 FK605의 부재하의 것들에 대하 여 계산되었고 AC 및 AD 세포 간에 비교되었다. AC 및 AD 세포 간의 이들 비에는 유의적인 차이가 있다. BK, 브래디키닌; OA, 오카디악산; P-Erk1/2, 포스포-Erk1/2, 정상(regular) Erk1/2.

도 6A-6B: 면역세포화학적 염색: (Fig. 6A) AC 및 AD 세포를 약 5 분 또는 약 10분 동안 약 10 nM BK로 처리하였다. 상이한 플라스크에서, 세포를 약 10분간 BK 처리하기 전에 약 10 nM OA와 함께 예비항온처리하였다. 반응 종료 후, Erk1/2의 인산화를 본원에 기재된 바와 같이 항-포스포-Erk 항체를 사용하여 면역세포화학적 염색으로 검출하였다. 확대된 영상에서 화살표는 증가된 Erk1/2 인산화를 표시한다. (도 6B) AC 및 AD 세포를 약 10 nM OK의 존재 또는 부재하에서 약 10nM BK로 처리하였다. 이어서, 세포를 마우스 항-포스포-Erk1/2 및 래빗(rabbit) 항-정상(regular) Erk1/2 항체를 사용하여 동시에 이중 면역형광 염색하였다. 이어서, 플루오레세인-표지된 항-마우스 (녹색) 및 텍사스 레드(Texas red)-표지된 (적색) 항-래빗 2차 항체로 염색하였다. BK, 브래드키닌; OA, 오카디악산; P-Erk1/2, 포스포-Erk1/2; r- Erk1/2, 정상 Erk1/2.

본 발명은, 알츠하이머 질환 섬유아세포에서 PP2A 발현, 기능 및 관련 생화학적 현상의 특이적 비정상의 발견을 토대로 한 사람 세포에서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 브래디키닌에 의해 유도된 지속적 Erk1/2 인산화는 알츠하이머 질환 섬유아세포에서 예전에 발견되었으며, 이는 본원에 참조로 이의 전문이 인용된 WO 02/067764의 주제이다. 살아있는 사람의 뇌 속의 뉴런으로 직접 접근하는 것이 불가능하기 때문에, 알츠하이머 질환의 조기 진단은 극히 어렵다. PP2A 및 관련 분자 현상의 알츠하이머 질환-특이적 비정상, 예를 들어 알츠하이머 질환 환자의 말초 세포에서 Erk1/2 인산화 및 분포를 시험함으로써, 본 발명은 알츠하이머 질환의 조기 진단을 위한 매우 실용적이고, 민감하고, 효율적인 시험을 제공한다. 또한, 본원에 기재된 알츠하이머 질환-특이적 차이점은 약물 개발용 치료적 표적을 동정하기 위한 기반을 제공한다.

본 발명은 사람 말초 세포에서 알츠하이머 질환을 판단하기 위한 수많은 진단 시험에 대한 토대로서 아래의 기준을 사용한다: 1) PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제제로 처리하거나 처리하지 않았을 때의 유전자 수준의 PP2A 발현; 2) PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제제로 처리하거나 처리하지 않았을 때의 단백질 수준 및 PP2A 효소 활성에서의 PP2A 발현; 3) PP2A 기능을 억제하는 제제가 기질 인산화의 정도에 미치는 효과; 및 4) 대조군 세포와 알츠하이머 질환 세포 간의, PP2A 기질인 인산화된 Erk1/2의 아세포 분포 (또는 전위)에서의 차이. 아래에 기재된 각 시험을 단독으로 또는 함께 사용하여 추가적 특이성을 제공할 수 있다.

기저 PP2A 유전자 발현을 평가하는 방법

일 태양으로, 본 발명은 개체로부터 세포 샘플을 수득하고 세포 샘플 중에서 PP2A 유전자 발현의 기저 수준을 검출함으로써, 개체의 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 태양은, 연령이 일치하는 개체로부터의 비-알츠하이머 질환 세포와 비교하여, 가족성 및 산발성 알츠하이머 질환의 환자로부터의 섬유아세포에서 PP2A 유전자 발현의 기저 수준이 현저히 높다는 본원의 발명자들의 발견을 토대로 한다. 따라서, PP2A의 기저 수준이 더 높다는 것은 알츠하이머 질환의 존재를 암시한다. 일 태양으로, 시험 세포에서 PP2A를 암호화하는 mRNA를 정량하고, 대조군 세포에서 PP2A를 암호화하는 mRNA 수준과 비교한다.

본 발명의 방법에서, 개체 또는 환자로부터 채취된 세포들은 임의의 생존 세포일 수 있다. 바람직하게는, 이들은 피부 섬유아세포이지만, 다른 말초 조직 세포 (즉, 중추신경계의 외부)가 수득하거나 처리하기에 더 편하다면 본 발명의 시험에 사용될 수 있다. 다른 적합한 세포로는 혈액 세포, 예를 들어 적혈구 및 림프구, 헙측 점막 세포, 신경 세포, 예를 들어 후각 뉴런, 뇌척수액, 뇨 및 기타 말초 세포 유형이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 비교 목적으로 사용된 세포는 반드시 건강한 제공자의 세포일 필요는 없다.

상기 세포는 새로운 것이거나 또는 배양될 수 있다 (참조: 미국 특허 제6,107,050호, 이는 참조로서 이의 전문이 인용됨). 구체적 태양으로, 펀치 피부를 사용하여 피험자로부터 피부 섬유아세포를 수득할 수 있다. 이들 섬유아세포를 본원에 기재된 기법을 사용하여 직접 분석하거나 또는 세포 배양 조건에 도입한다. 이어서, 수득된 배양 섬유아세포를 실시예 및 본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 바와 같이 분석한다. 분석에 사용될 수 있는 다른 유형의 세포, 예를 들어 협측 점막 세포, 후각 세포와 같은 신경 세포, 및 적혈구 및 림프구와 같은 혈액 세포 등을 수득하는데 다른 단계가 요구될 수 있다. 예를 들면, 혈액 세포는 말초 정맥으로부터 혈액을 뽑아내어 쉽게 수득할 수 있다. 이어서, 세포를 표준 공정 (예를 들어, 세포 분류기, 원심분리 등을 사용)에 의해 분리한 후, 분석할 수 있다.

바람직한 태양으로, 세포 샘플 중의 PP2A 유전자 발현의 수준을, 384- 또는 96-웰 마이크로플레이트가 구비된 Taqman^R 실시간 PCR 장치를 사용하여 역 전사 정량적 중합효소 연쇄 반응 (RVQ-PCR)에 의해 측정한다. 진핵 세포에서 풍부하게 발현되는 참조 유전자, 예를 들어 GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제)를 또한 동시에 증폭시키고 정규화에 사용한다. 본 발명에 따르면, 연령이 일치하는 개체로부터의 정상 세포에 비해 PP2A 유전자 발현의 기저 수준이 더 높다는 것은 알츠하이머 질환의 존재를 암시한다.

PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제제로 세포를 자극한 후 PP2A 유전자 발현에서의 변화를 평가하는 방법

본 발명의 추가 태양은, 피험자로부터 세포 샘플을 수득하고, 당해 샘플을 PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제제와 접촉시키고, 자극된 세포 중의 PP2A 유전자 발현의 수준을 개체로부터의 동일한 유형의 자극되지 않은 세포에서의 PP2A 유전자 발현의 수준과 비교하는 단계를 포함하여, 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 특정 태양에서, 제제는 브래디키닌이다. 이러한 태양에서, 자극되지 않은 세포와 비교하여, 자극된 세포에서 브래디키닌-유도된 PP2A 유전자 발현이 부재하다는 것은 알츠하이머 질환의 존재를 암시한다. 이 방법은 대조군 세포가 브래디키닌 자극에 반응하여 PP2A 유전자 발현을 상향조절하는 반면에, 이러한 정상적 상향조절 반응이 알츠하이머 환자의 세포에는 결여된다는 본원의 발명자들의 발견을 토대로 한다. 다른 가능한 자극제로는 인슐린, 포볼 에스테르, 리소포스파티딜콜린, 리포폴리삭카리드, 안트라사이클린 다노루비신 및 바나딜 설페이트가 포함되나, 이에 제한되지 않다.

브래디키닌은 다양한 염증 상태의 과정에서 생성된 강력한 혈관작용 노나펩티드(nonapeptide)이다. 브래디키닌은 특정 세포막 브래디키닌 수용체(들)에 결합하여 이를 활성화시켜, "미토겐 활성화된 단백질 키나제" (MAPK)로서 알려진 단백질의 인산화를 유도하는 세포내 현상의 연쇄증폭과정(cascade)을 촉발한다. 단백질의 인산화, 즉 Ser, Thr 또는 Tyr 잔기로 포스페이트 그룹의 첨가는 단백질 키나제로서 총칭되는 수많은 효소에 의해 매개된다. 인산화는 통상적으로 단백질의 기능을 변형시켜, 일반적으로 단백질을 활성화시킨다. 항상성은 인산화가 기질을 탈인산화시키는 포스파타제 효소에 의해 역전되는 일시적인 과정일 것을 요구한다. 인산화 또는 탈인산화의 모든 이상은 생화학적 경로 및 세포 기능을 파괴할 수 있다. 이러한 파괴는 특정 뇌 질환의 원인일 수 있다.

또 다른 특정 태양으로, 브래디키닌-유도된 PP2A 유전자 발현은, 바람직하게는 +브래디키닌/-브래디키닌 (BK) 비를 계산하여 산정한다. BK-자극된 세포 및 비-자극된 세포로부터의 PP2A 유전자 발현은 실시간 RT-PCR을 통해 수행된다. 내부 정규화를 위해, 동일한 세포 샘플로부터의 GAPDH 또는 S18 rRNA와 같은 "하우스키퍼(housekeeper)" 유전자의 발현을 동시에 수행한다. PP2A 및 하우스키퍼 유전자에 대한 mRNA의 농도는, cDNA 샘플의 일련의 희석액으로부터의 각 유전자에 대해 수득된 표준 곡선에 따라 실시간 PCR 장치에 의해 자동적으로 계산된다. PP2A 유전자 발현의 농도를 나타내는 값은 하우스키퍼 유전자의 농도를 나타내는 값에 대해 정규화된다: NR = G_T/G_H. 상기식에서, NR은 정규화된 유전자 발현이고; G_T는 정규화 전의 표적 유전자 (PP2A) 발현 값이고; G_H는 하우스키퍼 유전자의 유전자 발현 값이다. 다음에, BK+ 및 BK- 세포로부터의 NG의 비는 R = NG_BK ₊/NG_BK _-에 의해 계산된다. 상기식에서, R은 +브래디키닌/-브래디키닌 (BK) 비이고; NG_BK ₊은 BK+ 세포로부터의 정규화된 PP2A 유전자 발현이고; NG_BK _-는 BK- 세포부터의 정규화된 PP2A 유전자 발현이다.

PP2A 단백질 수준 및 효소 활성을 평가하는 방법

본 발명의 또 다른 태양은, 피험자로부터 세포 샘플을 수득하고, 샘플 중의 PP2A 단백질 및/또는 PP2A 효소 활성의 수준을 검출하는 단계를 포함하여, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 이러한 태양은, 알츠하이머 질환 세포 중의 PP2A 단백질 수준 및 효소 활성이 모두 비-알츠하이머 질환 세포에 비교하여 현저히 감소된다는 본원 발명자들의 발견을 토대로 한다.

바람직한 태양에서, 세포 내에 존재하는 PP2A 단백질의 수준은 웨스턴 블롯에 의해 검출한다. PP2A의 단백질 수준은 항-PP2A 항체 (Biosource)를 사용하여 섬유아세포 내에서 측정할 수 있다. 또한, 상이한 단백질의 수준은 정규화를 위해 참조 단백질로서 동일한 샘플에서 측정하는 것이 바람직하다. 가능한 참조 단백질의 예로는 안넥신-II 또는 액틴이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 태양으로, AD 및 AC 세포에서 PP2A 활성의 수준은 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP)를 사용하여 공정 (Pierce Biotechnology)에 따라 산정한다. 효소 활성 검정은 96-웰 마이크로플레이트에서 수행한다. 약 10㎕의 각 AC 또는 AD 세포 용해물을 약 90㎕의 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 개시시키고, 약 15분 동안 약 30℃에서 항온처리하고, 420 nM의 파장에서 BioRad 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. PP2A 억제제인 오카디악산 약 10 nM이 존재하는 반응물로부터의 값을 감산한 후, PP2A의 활성을 일련의 공지된 농도의 정제된 PP2A 단백질의 의해 작성된 표준 곡선에 따라 계산한다.

일 태양으로, ELISA를 아래의 공정에 따라 수행한다: 1) 항-Erk 항체로 미리 피복한 96-웰 마이크로플레이트에 2중 또는 3중으로 처리한 후 섬유아세포 세포 용해물을 첨가한다. 2) 실온에서 약 2 시간 동안 마이크로플레이트 웰에서 샘플을 항온처리한다. 3) 샘플을 흡인하고 웰을 포스페이트 완충된 염수 (PBS)-기제 세척 완충제로 세척한다. 4) 항-포스포-Erk1/2 또는 항-정상(regular) Erk1/2 항체의 작업 희석액을 각 웰에 첨가하고, 약 1 시간 동안 실온에서 항온처리하다. 5) 흡인하고 세척 완충제로 세척한다. 6) 서양 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)가 접합된 제2 항체의 작업 희석액을 각 웰에 첨가하고, 웰을 실온에서 약 30분간 항온처리한다. 7) 흡인하고 웰을 세척 완충제로 세척한다. 8) 안정화된 크로모겐 (Chromogen), 예를 들어 디아미노벤지딘 (DAB)을 첨가하고, 약 30분 동안 실온에서 항온처리한다. 9) 정지액을 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정한다. Erk1/2의 인산화를 정규화 후 산정한다: NR = A_P/A_R. 상기식에서 NR = 정규화된 비이고; A_P는 포스포-Erk1/2에 대한 흡광도 값이고; A_R은 전체 (정상) Erk1/2에 대한 흡광도이다.

PP2A 를 억제하는 제제 및 PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제제를 사용하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방법

또 다른 태양으로, 본 발명은 피험자로부터 세포 샘플을 수득하고, 당해 세포를 PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제1 제제와, PP2A 억제제인 제2 제제의 존재하에서, 접촉하고, 접촉 단계를 개시한 후 예정 시간에 샘플 세포 중의 PP2A 기질의 인산화 수준을 측정하고, 기질 인산화 수준을 공지된 비-알츠하이머 질환 세포에서 동일한 예정 시간의 기질 인산화 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 이때 공지된 비-알츠하이머 질환 세포와 비교하여 샘플 세포에서 PP2A 억제제에 대한 반응이 결여된 것이 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 알츠하이머 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.

상기 태양은, 오카디악산과 같은 PP2A 억제제의 존재하에서 브래디키닌과 같은 기질로 비-알츠하이머 질환 세포를 처리하면, Erk1/2 인산화가 연장되며, 그렇지 않은 경우에 정상 세포에서 브래디키닌 자극 후 약 10분이 지나서 기저 수준으로 복귀된다는 본원 발명자들의 발견을 토대로 한다. 이러한 반응은 알츠하이머 질환 세포에서 부재한다. 브래디키닌-자극된 Erk1/2 인산화가 알츠하이머 질환 세포에서 정상 탈인산화 기전의 억제로 인해 지속되기 때문에, 오카디악산과 같은 PP2A 억제제의 적용은 Erk1/2 인산화의 정도에 추가적 효과를 갖지 않는다. 따라서, 비-알츠하이머 질환 세포에서 +오카디악산/-오카디악산 Erk1/2 인산화의 비가 알츠하이머 질환 세포에서 보다 현저히 더 크다.

바람직한 태양으로, 피험자로부터 세포 샘플을 수득하고; 대조군 세포 및 상기 세포 샘플을 PP2A의 기질의 인산화를 자극하는 제1 제제 (특정 태양에서, 당해 제제는 브래디키닌이고 PP2A의 기질은 Erk1/2이다)와 접촉시키는데, 이때 접촉은 PP2A의 억제제인 제2 제제 (특정 태양에서 제2 제제는 오카디악산이다)의 존재 또는 부재하에서 수행하며; 접촉 단계를 개시한 후 예정된 시간 (바람직한 태양에서, 약 5분 후, 약 10분 후, 또는 약 15분 후)에 상기 대조군 세포 및 상기 세포 샘플로부터 PP2A 기질의 인산화 수준을 측정하고; PP2A의 억제제인 상기 제2 제제의 존재 또는 부재하에서 상기 세포 샘플로부터 PP2A 기질의 인산화 수준을 비교하는 단계를 포함하고, 상기 제2 제제의 존재 또는 부재하에서 PP2A 기질 인산화의 정도에서 현저한 차이가 결여된다는 것은 세포를 채취한 피험자에게 알츠하이머 질환이 존재한다는 것을 암시하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법이 기재되어 있다. 대조군 세포는 PP2A의 억제제인 제2 제제의 존재 및 부재하에서 PP2A 기질의 인산화 수준에서 통계학적으로 유의적인 차이를 보여준다.

바람직한 태양으로, Erk1/2의 인산화는 항-포스포-Erk1/2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 산정한다. 인산화된 Erk1/2에 대한 면역활성 시그널의 수준을 밀도측정 스캔을 통해 정량한다. 포스포-Erk1/2 시그널의 평균 밀도를, 별도의 웨스턴 블롯 상에서 항-정상 Erk1/2 항체를 사용하여 동일한 세포 용해물 샘플로부터 검출한 총 Erk1/2 시그널의 평균 밀도로 정규화한다. 정규화 공식은 NR = D_P/D_R이다. 상기식에서, NR (정규화 비)은 Erk1/2 인산화 정도를 나타내고; D_P는 포스포-Erk1/2에 대한 평균 밀도이고, D_R은 동일한 샘플로부터 웨스턴 블롯 상에서 검출된 Erk1/2의 총량에 대한 평균 밀도이다. 다음으로, 오카디악산의 존재 및 부재하에서 NR의 비 (시험 비)는 다음 공식에 의해 계산된다: TR = NR_OA ₊/NR_OA _-. 상기식에서, TR은 시험 비이고, NR_OA ₊는 OA의 존재하의 정규화된 비이고, NR_OA _-는 OA의 부재하의 정규화된 비이다.

세포에서 인산화된 Erk1 /2의 분포를 측정하는 방법

인산화된 Erk1/2의 분포를 정량하는 많은 방법이 고려되었으며, 본 발명의 범위 내에 속한다. 두 가지 바람직한 방법이 아래에 기재되어있다. 바람직한 방법 1)에서, BK 자극 후 Erk1/2의 인산화를 면역세포화학으로 검출하고, 시그널을 형광 현미경으로 획득한다. 핵 및 시토졸에서 포스포-Erk1/2 시그널을 나타내는 형광 밀도를 Metamorph 또는 NIH Image와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 별개로 정량한다. 시토졸 중의 포스포 Erk1/2에 대한 핵 중의 포스포 Erk1/2의 비를 DR = PN/PC에 의해 계산한다. 상기식에서, DR은 인산화된 Erk1/2의 분포 비이고; PN은 핵 중의 포스포-Erk1/2이고; PC는 시토졸 중의 포스포-Erk1/2이다. 바람직한 방법 2)에서, BK 자극 후, 세포를 각각 핵 분획 및 시토졸 분획으로서 세부분획화한다. 이들 분획물로부터의 Erk1/2의 인산화 정도를 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA를 통해 산정한다. 시토졸로부터의 p-Erk1/2에 대한 핵으로부터의 p-Erk1/2의 비를 DR = D_PN/D_PC로 계산한다. 상기식에서, DR은 분포비이고, D_PN은 핵으로부터의 포스포-Erk1/2의 평균 밀도측정 값이고; D_PC는 시토졸로부터의 포스포-Erk1/2의 평균 밀도측정 값이다.

또 다른 태양으로, 본 발명은 비-알츠하이머 질환 및 알츠하이머 질환 세포에서 인산화된 Erk1/2의 아세포 분포 (또는 전위)에서의 차이를 측정하는 방법을 제공한다. 이러한 태양은, 대조군 세포에서 인산화된 Erk1/2가 핵에 농축되지만, 알츠하이머 질환 세포에서는 인산화된 Erk1/2가 세포의 핵외 공간(즉, 세포질)에 분포된다는 본원의 발명자들의 발견을 토대로 한다. 본 발명에 따르면, Erk1/2의 핵 전위는 세포를 Erk1/2의 인산화를 자극하는 제제로 자극하여 시험하고, 활성화된 (즉, 인산화된) Erk1/2의 핵 분포는 바람직하게는 세포면역화학, 또는 핵과 시토졸 간의 인산화된 Erk1/2의 시험비에 의해 평가한다. 인산화된 Erk1/2의 핵 전위는 또한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA에 의해 평가된다. 인산화된 Erk1/2를 검출하는 모든 다른 방법이 고려되었으며, 이에는 유세포분석(flow cytometry), 단백질 키나제 검정, 방사선표지된 포스페이트를 사용한 면역침전, 질량 분석, 형광표지된 항체를 이용하는 형광 공명 에너지 전달, 자기 비이드에 부착된 항체를 이용하는 면역침전, MAP 키나제 기질을 이용하는 친화성-이용 검정, 노던 블롯, 1 또는 2-차원 겔 크로마토그래피, 임의로 인단백질 염색 또는 검출이 따르는 효소 활성 검정이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 면역검정은 면역형광 검정, 방사성면역검정, 웨스턴 블롯 검정, 효소 면역검정, 면역-침전, 화학발광 검정, 면역조직화학 검정, 돗트(dot) 또는 슬롯(slot) 블롯(blot) 검정 등일 수 있다 [참조 문헌: In "Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Press, New York, New York, Ausubel et al. (eds ) (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, New York, New York]. 검출은 색측정 또는 방사성 방법, 또는 당업자에게 공지된 임의의 기타 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다. ELISA에 관한 당업계에 공지된 표준 기법은 문헌[Methods in Immunodiagnosis, 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, New York 1980 및 Campbell et al., Methods of Immunology, W. A. Benjamin, Inc., 1964; 두 문헌 모두 참조로 본원에 인용된다]에 기재되어 있다. 이러한 검정은 당업계에 공지된 바와 같은 직접적, 간접적, 경쟁적 또는 비경쟁적 면역검정일 수 있다 [참조 문헌: In "Principles and Practice of Immunoassay" (1991) Christopher P. Price and David J. Neoman (eds), Stockton Pres, NY, NY; Oellirich, M. 1984. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904 Ausubel, et al. (eds) 1987 in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, New York].

앞서 언급한 바와 같이, 진단하고자하는 하는 환자로부터 채취한 세포는 임의의 세포일 수 있다. 사용될 수 있는 세포의 예로는 섬유아세포, 협측 점막 세포, 혈액 세포, 예컨대 적혈구, 림프구 및 림프아형 세포, 및 신경 세포 및 Erk1/2 단백질을 발현하는 임의의 기타 세포가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 부검 샘플 및 병변 샘플이 또한 사용될 수 있다. 이들 세포를 포함하는 조직이 또한 사용될 수 있다. 상기 세포들은 새로운 것이거나, 배양되거나 동결될 수 있다. 세포 또는 조직으로부터 분리된 단백질 샘플은 진단 검정에서 즉시 사용될 수 있거나, 또는 후에 사용하기 위해 동결될 수 있다. 바람직한 태양으로, 섬유아세포가 사용된다. 섬유아세포는 피부 펀치 생검에 의해 수득될 수 있다.

단백질은 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 세포로부터 분리될 수 있다. 바람직한 방법에서, 환자로부터 분리된 세포를 세척하고 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에서 펠릿화한다. 이어서, 펠릿을, 50 nM NaF, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 ㎍/ml 류펩틴(leupeptin), 50 ㎍/ml 펩스타틴, 10 mM TRIS-HCl (pH= 7.4)을 포함하는 "균질화 완충제"로 세척하고, 원심분리로 펠릿화한다. 상청액을 폐기하고, "균질화 완충제"를 펠릿에 첨가한 후, 펠릿을 초음파처리한다. 단백질 추출물을 보존 가공하지 않고 사용하거나, 또는 추후 분석을 위해 -80℃에서 보관할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 기재된 면역검정에서 사용된 항체들은 기원이 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 상기 항체들을 생성시키는데 사용되는 인산화된 및 비-인산화된 Erk1/2 단백질 또는 이의 부분은 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 수득될 수 있으며, 화학적 분석에 의해 생성될 수 있다. 천연 Erk1/2 단백질은 통상의 방법에 의해 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. Erk1/2 단백질을 분리하는데 사용될 수 있는 생물학적 샘플의 예로는 피부 세포, 예를 들어 섬유아세포, 섬유아세포주, 예를 들어 판매원[Coriell Cell Repositories, (Camden, NJ.)]에서 시판되며 문헌 [National Institute of Aging 1991 Catalog of Cell Lines, National Institute of General Medical Sciences 1992/1993 Catalog of Cell Lines (NIH Publication 92-2011 (1992))]에 기재되어있는 대조군 섬유아세포주 및 알츠하이머 질환 섬유아세포주가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명이 상기한 모든 진단 시험을 수행하는데 이용될 수 있는 키트에 관한 것이라는 것이 또한 고려된다. 앞서 언급한 바와 같이, 키트는 단일 진단 시험물 또는 본원에 기재된 시험의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 이러한 키트는 PP2A 또는 인산화된 PP2A 기질을 인식하는 항체뿐 아니라, PP2A 기질의 인산화를 자극하는 임의의 화합물 (예를 들어, 브래디키닌) 및/또는 PP2A 기능의 억제제 (예를 들어, 오카디악산)를 포함한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 키트는 진단 시험 중의 항체 또는 다른 구성물의 사용에 관한 지침서를 함유할 수 있다. 또한, 당해 키트는 PP2A를 암호화하는 유전자 및 예를 들어 GAPDH와 같은 "하우스키퍼 유전자"를 암호화하는 유전자에 특이적인 PCR 또는 RT-PCR에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 같이, 진단 시험을 수행하기 위한 다른 시약을 함유할 수 있다. 당해 키트는 또한 완충제, 2차 항체, 대조군 세포 등을 포함할 수 있다.

치료 물질을 동정하기 위한 스크리닝 방법

또 다른 태양으로, 본원에 기재된 진단 시험은 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 스크리닝하고 동정하는데 사용될 수 있다. 이러한 태양에 따르면, 본원에 기재된 알츠하이머 질환-관련 차이를 역전시키거나 개선시키는 (즉, 정상 세포에서 발견되는 수준으로 되돌리는) 물질이 알츠하이머 질환의 치료에 잠재적으로 유용한 물질로서 동정되고 선택될 것이다.

예로써, 치료 물질을 스크리닝하는 이러한 방법은, 알츠하이머 질환 환자로부터의 샘플 세포를 스크리닝하고자 하는 물질과 접촉시키고, 샘플 중의 PP2A 유전자 발현의 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 이때 알츠하이머 질환 세포와 관련된 PP2A 유전자 발현의 비정상적으로 상승된 수준이 감소하는 것은 당해 물질이 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 잠재적으로 유용하다는 것을 암시한다. AD 세포에서 PP2A 유전자 발현의 상승은 감소된 PP2A 단백질 수준 및 손상된 PP2A 활성에 대한 세포 보상이다. PP2A 단백질 수준을 증가시키거나 또는 PP2A 활성을 증강시키는 물질은 연장된 Erk1/2 인산화를 감소시킬 것이므로, 잠재적으로 AD의 치료에 유용하다. PP2A 단백질 및 활성이 증가하면, 상승된 PP2A 유전자 발현은 정상 수준으로 복귀될 수 있다.

본원에 기재된 화합물 스크리닝 방법의 또 다른 바람직한 태양으로, 알츠하이머 질환-관련된 비정상은, Erk1/2의 인산화를 자극하는 제제를 접촉시킨 세포에서 PP2A 발현 증가가 결여된다는 것이다. 이러한 태양에서, Erk1/2의 인산화를 자극하는 브래디키닌과 같은 제제를 접촉시킨 세포에서 증가된 PP2A 발현을 복귀시키는 화합물은 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 잠재적으로 동정할 것이다.

본원에 기재된 화합물 스크리닝 방법의 또 다른 바람직한 태양으로, 알츠하이머 질환-관련 비정상은, 비-알츠하이머 대조군 세포에 비해 감소된 PP2A 단백질 또는 PP2A 효소 활성이다. 이러한 태양에서, 알츠하이머 질환을 가진 피험자로부터 분리된 세포의 PP2A 단백질 또는 PP2A 효소 활성의 정상 수준을 복귀시키는 화합물은 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 잠재적으로 동정할 것이다.

본원에 기재된 화합물 스크리닝 방법의 또 다른 바람직한 태양으로, 알츠하이머 질환-관련된 비정상은, 시험 세포를 오카디악산의 존재하에서 브래디키닌으로 처리했을 때 정상 반응이 결여된다는 것이다. 이러한 태양에서, 알츠하이머 질환을 가진 피험자로부터 분리된 세포에서 정상 반응을 복귀시키는 화합물은 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 잠재적으로 동정할 것이다.

본원에 기재된 화합물 스크리닝 방법의 또 다른 바람직한 태양에서, 알츠하이머 질환-관련된 비정상은 핵외 영역에 인산화된 Erk1/2가 분포한다는 것이다. 이러한 태양에서, 알츠하이머 질환을 가진 피험자로부터 분리된 세포의 핵 중의 인산화된 Erk1/2의 정상 분포를 복귀시키는 화합물은 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 잠재적으로 동정할 것이다.

당업자는 본원에 기재된 알츠하이머 질환-관련된 차이점을 적용하여, 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방용 치료 물질의 동정을 위한 스크리닝 방법 또는 검정의 기반을 형성할 수 있다는 것을 쉽게 인지할 것이다. 또한, 이러한 방법은 당업계에 익히 공지되고/되거나 본원 및 실시예에 이미 기재된 모든 기법 또는 재료를 이용할 것이다.

본원의 발명자들은 세린/트레오닌 포스파타제 2A가 AD 환자로부터의 섬유아세포에서 손상된다는 것을 발견하였다. 이러한 손상은 유전자 및 단백질 수준에서의 PP2A의 비정상적 발현 및 이의 포스파타제 활성의 손상을 포함한다. AD 및 AC 세포에서 PP2A 유전자 발현을, mRNA 수준을 비교하는데 매우 민감한 방법인 RTQ-PCR로 측정한다 [참조 문헌: Heid et al., 1996; Winer et al., 1999; Livak and Schmittgen, 2001]. cDNA 복사체의 출발량이 차이날 수 있음으로 인한 샘플에 따른 변동을 최소화하기 위하여, GAPDH mRNA의 수준을 PP2A 유전자 발현의 정규화에 사용한다. 게놈 DAN가 역전사된 샘플 중에 함유되지 않기 때문에, 모든 증폭된 cDNA 복사체는 AD 및 AC 세포로부터 수득된 mRNA에 기인한 것이어야 한다. PCR 산물은, 이들의 특징적인 융점 곡선 (TM)뿐 아니라, 예상된 서열 크기를 갖는 TBE 겔 상에서 분석된 PP2A 또는 GAPDH의 단일 PCR 산물에 의해 입증되는 바와 같이, PP2A 및 GAPDH에 대해 특이적이다 (도 1).

PP2A 유전자 발현의 기저 수준이 현저히 높게 AD 세포에 존재한다. 그러나, PP2A mRAN 기저 수준이 높다고, 반드시 단백질 발현이 높은 것도 아니고, 반드시 정상 PP2A 기능을 나타내는 것도 아니다. 실제로, AD 세포에서, PP2A의 양은 대조군 세포에 비해 현저히 낮고, PP2A 효소 활성도 마찬가지이다. AD는 병인학적으로 이질적인 질환이기 때문에, 다중 인자가 AD 세포에서 PP2A의 비정상적 발현 및 활성을 일으키는 상류 분자 기전에 관련되어 있을 수 있다. AD 세포에서 PP2A의 단백질 수준의 감소는, 단백질 합성의 전사후 프로세싱이 손상되고/되거나 비정상적으로 증가된 단백질분해 또는 부정확한 단백질 폴딩으로 인한 PP2A 단백질 안정성이 약화되어, PP2A 단백질의 분해를 촉진함으로 인한 결과이다. AD 세포에서 PP2A 단백질이 감소하면, PP2A 활성을 손상시킬 것이다. 추가로, 변형된 효소 특성, 예를 들어 조절 도메인의 기질-결합 친화성 및/또는 촉매 아단위의 활성이 또한 PP2A 기능을 손상시키는 인자이다.

상류 분자 현상 중에서 기타 비정상, 예를 들어 AD에서 칼슘 항상성의 교란이 알려졌다. 두 개의 Ca² ⁺-결합 EF-핸드 모티프가, PP2A 활성의 조절에 관여하는 PP2A의 B/PR72 조절 아단위에서 확인되었다 (Janssens et al., 2003). 시험관내 시스템에서, 상기 저자들은 낮은 Ca² ⁺ 농도가 PP2A 활성을 증가시키지만, 높은 Ca² ⁺ 농도가 이를 억제한다는 것을 밝혀내었다 (Janssens et al., 2003). 비정상적으로 증가된 세포내 칼슘 시그널 전달이 AD 세포로부터의 상이한 유형의 세포, 예를 들어 푸레세닐린-1(presenilin-1) 돌연변이에 의한 것들에서 발견되었다 (Sheehan et al., 1997; Etcheberrigaray et al., 1998; Putney, 2000; Yoo et al., 2000; Mattson et al., 2001). 산화적 스트레스와 함께 세포내 Ca² ⁺ 수준의 증가가, PP2A 기능 결함, 및 MAP 키나제 활성의 증가 및 연장을 유도하는 MEK, PKC 및 PP60-src와 같은 상류 단백질 키나제의 활성 증가에 기여하는 주요 인자들일 수 있다. 예를 들어, 비정상적으로 증가된 pp60-src 활성은 MAP 키나제 인산화를 촉진할뿐 아니라 (Zhao et al., 2002), PP2A 활성을 억제하며, (McMahon et al., 2001), 이러한 현상은 모두 AD 세포에서 MAP 키나제 경로의 조절곤란을 일으킨다.

PP2A mRNA 발현은 사후 AD 뇌에서 감소된다 (Gong et al., 1995; Vogelsberg-Regaglia et al., 2001). 본원에 기재된 PP2A mRNA의 기저 수준의 증가가 AD 세포에서 PP2A 결함 단백질 발현 및 효소 활성에 대한 세포의 보상 기전을 반영하는 것일 수 있다. 이러한 보상 현상은 본원에서 밝혀진 바와 같이 살아있는 AD 세포에서 발견되었으나, 이는 AD의 말기 상태에서 완전히 감소하여, 사후 AD 뇌에서 더 낮은 PP2A mRNA 수준이 감출될 수 있다.

BK는 일련의 세포내 Ca² ⁺-의존성 시그널 전달 과정, 예를 들어 단백질 인산화, 및 유전자 발현을 유도하는 전사 인자의 활성화를 자극하는 강력한 염증 매개인자이다 (Connolly, 1998; Liebmann, 2001). 정상적 피드백 기전의 일부로서, 포스파타제가 세포 자극에 반응하여 단백질 인산화의 결과로서 활성화될 수 있고, 특정 포스파타제의 유전자 발현이 세포에 충분한 효소를 공급하도록 상향조절될 수 있다. 본 발명은 AC 세포를 약 10분 동안 BK로 자극한 경우에, PP2A 유전자 발현의 충분한 상승이 검출됨을 입증하였으며, 이는 약리학적 자극에 대한 정상 세포 반응이다. 그러나, 이러한 반응은 AD 세포에서는 나타내지 않는데, 그 이유는 PP2A mRNA 수준이 BK 자극 후 변화되지 않기 때문이다. 자극에 반응하여 PP2A 유전자 발현의 조절 능력을 상실하는 것은 AD 발병 동안 PP2A 기능의 손상의 원인이 된다.

BK는 Erk1/2 인산화의 증가를 일으킨다. AC 세포에서, 이러한 증가된 Erk 인산화는 몇 분 동안 지속되고, 자극후 약 10 분이 지나 대조군 수준으로 복귀된다. 그러나, AD 세포에서, 이는 상당히 지속된다 (Zhao et al., 2002). PP2A의 기능장애는 Erk1/2 인산화의 AD-관련 증가의 원인이 된다. 본원의 발명자들은 PP2A 억제제, 예를 들어 OA 및 PP2B 억제제 FK506가 브래디키닌 자극 후 Erk1/2 인산화에 미치는 효과를 측정하였다. OA에 의한 PP2A의 억제는 Erk1/2 인산화를 증가시킨다. AC 세포에서 이러한 증가는, AC 세포에서 +0A/-0A 비의 현저히 높은 비만큼 AD 세포에서 보다 현저히 더 크다. OA가 PP2A를 선택적으로 억제하는 용량 (약 10 nM)로 사용되기 때문에 (Nagao et al., 1995; Sheppeck et al., 1997; Fernandez et al., 2002), FK506가 Erk1/2 인산화를 억제하지 않는 결과를 초래하며, PP2A가 섬유아세포에서 BK-유도된 Erk1/2 인산화의 불활성화에 관여하지만, PP1 또는 PP2B와 같은 다른 포스파타제는 관여하지 않는다. 따라서, AD 세포에서 BK 자극에 의해 유도된 지속적 Erk1/2 인산화는 PP2A 기능의 손상으로 인한 것이다.

세포를 FK506으로 처리하는 경우에, BK에 의해 유도된 AD 세포에서 Erk1/2 인산화의 연장이 사라졌다. PP2B에 추가하여, FK506도 또한 일종의 펩티딜 프롤릴 시스/트랜스 이소머라제(PPIase)인 FK-결합 단백질 (FKBP)을 주로 표적으로 한다. 예전의 연구는 FK506이 MAP 키나제 포스파타제 1의 발현 및 활성을 촉진하여, Erk 인산화 및 하류 시그널 전달의 감소를 유도한다고 보고했다 (Winter et al., 1998; Zawadzka and Kaminska, 2003). PPIase 활성을 억제함으로써, FK506 및 다른 FKBP 리간드가 신경보호 기능을 갖는다는 것이 보고되었다 (Gold, 1999, 2000; Christner et al., 2001; Klettner et al., 2001). Erk1/2는 각종 세포 현상을 조절하는 시그널 전달 경로 중의 주요 인자이다. 미토겐 자극에 반응한 Erk의 활성화가 키나제를 시토졸로부터 핵으로 이동시키고 (Chen et al., 1992; Gonzales et al., 1993; Lenormand et al., 1993; Brunet et al., 1999; Ferrell, 1998; Lewis et al., 1998), 핵에서 키나제가 유전자 전사 과정의 조절에 관여한다는 것이 보고되었다 (Treisman, 1996). 또한, 핵은 Erk1/2를 이의 상류 활성화 키나제 MEK, 이의 세포질 활성인자, 및 특정 핵 포스파타제에 의한 이의 탈인산화로부터 분리한 핵 격리를 통해 Erk1/2를 불활성화시키는 중요한 장소이다 (Volmat et al., 2001). Erk의 핵 유입은 여러 기전, 예를 들어 Erk 단량체의 수동 확산, Erk 이량의 능동 수송, 및 Erk과 핵공 복합체와의 직접적인 상호작용을 통해 매개된다 (Khokhlatchev et al., 1998; Adachi et al., 1999; Matsubayashi et al., 2001). 본원의 발명자들은 본원에서 활성화된 Erk1/2가 AC 세포의 핵 속에 농축되는 반면에, 상당한 양의 포스포-Erk1/2가 AD 세포의 핵외 영역에 남아있다는 것을 공개하였다. 본 발명은 또한, 활성화된 Erk1/2의 핵 유입을 일으키는 기전이 AD 세포에서 손상되었음을 보여주는 인산화된 Erk1/2의 차등적인 아세포 분포에 관한 것이다.

본 발명은 PP2A 기능, 예를 들어 이의 유전자 발현 및 단백질 생산뿐 아니라 효소 활성의 손상이 AD로부터의 섬유아세포에 존재한다는 본원의 발명자들의 관찰을 활용한다. PP2A의 이러한 손상은 AD 세포에서 Erk1/2 인산화의 BK-유도된 연장의 원인이 된다. PP2A의 기능장애가 또한 AD 뇌의 뉴런에서 일어나므로, NFT 병소로 유도하는 tau 단백질의 과인산화를 효율적으로 역전시킬 수 없다. 뇌에서 손상된 PP2A는 또한 지연된 Erk 불활성화를 일으키고, 이는 추가로 더 많은 tau 인산화에 기여한다. 다른 포스파타제, 예를 들어 Erk를 불활성화시키는데 관여하는 또 다른 주요 포스파타제인 이중 티로신 포스파타제의 기능장애가 또한 Erk 시그널전달의 AD-관련 기능장애의 원인이 될 수 있다.

본원에서 언급된 모든 참조 문헌, 특허문헌 및 인쇄된 공보가 본원에 참조로서 이들의 전문이 인용된다.

아래의 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위한 것이지, 본 발명의 범위를 어떤식으로든 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1: AD 세포에서 PP2A mRNA 수준의 변화

PP2A 유전자 발현을 정규화를 위한 표준 유전자로서 GAPDH를 사용하여 RTQ-PCR를 사용하여 정량하였다. 도 1A 및 1B에 도시된 바와 같이, 실시간 PCR을 사용하였을 때, PP2A 및 GAPDH 프라이머는 각각, 이중으로 수행된 사람 섬유아세포 cDNA 주형의 일련의 희석액으로 증폭된 서열의 선형 표준 곡선을 생성시켰다. 특정 융점 (MT)를 PP2A, GAPDH 및 물에 대하여 별개의 해리 곡선으로 플롯팅하였으며 (도 2C), 이는 각 PCR 산물의 고도의 특이성을 입증한다. 이러한 특이성은, PP2A 및 GAPDH에 대한 최종 PCR 산물을 10% TBE 겔 상에서 수행한, 도 1D에 도시된 결과에 의해 확인되었다. 예상된 서열 크기를 갖는 단일 밴드가 각 유전자에 대하여 나타났지만 (레인 2 및 4), 시험관내 역 전사 동안 역 전사효소를 첨가하지 않은 샘플에서는 검출되지 않았다 (레인 1 및 3). 이는 PP2A 및 GAPDH에 대한 증폭된 PCR 산물이 게놈 DNA로부터 유래되지 않았음을 암시한다. PP2A 유전자 발현을 측정하기 위하여, 각각의 19 AD 및 17 AC 세포주로부터의 섬유아세포 cDNA 주형의 복제물을 PCR에 적용하였다. 각 세포주로부터의 PP2A 및 GAPDH의 발현 수준은, AD 및 AC 샘플과 동시에 수행된 각각의 표준 곡선에 대하여 자동적으로 계산되었다. PP2A 유전자 발현의 수준은 각 세포주에 대하여 GAPDH의 수준으로 정규화하였으며, 수득된 비는 t-테스트를 사용하여 비교하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, PP2A mRNA의 기저 수준은 AC 세포에 비해 AD 세포에서 통계학적으로 더 높다 (P < 0.01, t-테스트). 약 10분 동안 10 nM 브래디키닌 (BK)로 섬유아세포를 처리했을 때, AC 세포에서 PP2A mRNA 수준이 현저히 증가하였다. 그러나, 이러한 BK-자극된 PP2A 유저자 상향조절은 AD 세포에는 부존재하다 (도 2B). t-테스트 분석은 유의적인 그룹 차이를 보여주었다 (P = 0.016). 이들 결과는, PP2A mRNA의 더 높은 기저 수준에도 불구하고, BK 자극에 반응한 PP2A의 역동적인 유전자 발현이 AD 세포에서 손상된다는 것을 암시한다.

실시예 2: AD 세포에서 PP2A 단백질 수준 및 효소 활성에서의 변화

AD 세포에서 PP2A 유전자 발현의 변화가 이의 단백질 발현 및 기능에 영향을 주는지를 결정하기 위하여, PP2A 단백질 수준 및 활성을 AC 및 AD 세포 간에 비교하였다. 웨스턴 블롯팅으로 측정된 PP2A 단백질의 양은 AC 세포에서보다 모든 AD 세포에서 유의적으로 감소되었다 (P <0.01). 이러한 PP2A의 감소는 SDS-겔 상에 가해진 AD 세포 유래 단백질의 양이 더 적어서 그런 것은 아닌데, 이는 동일한 샘 플로부터의 표준 단백질인 안넥신 II의 수준이 AC 세포에서의 것들과 유의적으로 상이하지 않기 때문이다 (도 3A). PP2A-면역반응성 시그널이 SDS-겔 상에 가해진 전체 단백질에 대해 정규화되는 경우에, AD 세포에서 PP2A가 일관되게 감소되는 결과가 얻어졌다. 추가로, PP2A 활성은 또한 AC 세포에 비해 AD 세포에서 현저하게 감소되었다. (P < 0.001) (도 3B).

실시예 3: PP2A 가 BK 자극 후 Erk1 /2의 탈인산화에 관여한다

PP2A가 Erk1/2의 탈인산화에 관여하는지를 시험하기 위하여, 5개의 상이한 개체로부터의 AC 세포를, PP2A 억제제인 오카디악산으로 단지 PP2A를 억제하는 농도로 처리하였다 (Nagao et al., 1995; Sheppeck et al., 1997; Fernandez et al., 2002). Erk1/2 인산화를, 포스포- 및 정상 Erk1/2에 대한 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 측정하였다. Erk1/2 인산화는 BK 자극 후 약 5분 후에 증가하였으나, 아마도 세포 내의 정상적인 탈인산화 기전으로 인해, 약 10분이 지나 대조군 수준으로 복귀되었다 (도 4). 그러나, 약 10 nM OA의 존재하에서, 이러한 Erk1/2 탈인산화가 유의적으로 억제되었다 (도 4). 일원 변량분석(one-way ANOVA)은 유의적인 처리 효과를 나타냈다 (P < 0.001). 이들 결과들은, PP2A가 BK-자극된 인산화 후 Erk1/2의 탈인산화에 관여함을 암시한다.

실시예 4: 손상된 PP2A 기능이 AD 세포에서 연장된 Erk1 /2 인산화의 원인이 된다

PP2A의 손상이 BK 자극 후 Erk1/2 인산화의 연장의 원인이 되는지를 시험하기 위하여, 본원의 발명자들은 AC 및 AD 세포 둘다를 약 10분 동안 약 10 nM OA의 존재 또는 부재하에서 BK로 처리하였다. 생성된 Erk1/2 인산화를 상기한 바와 같이 평가하였다. 9 AD 및 AC 세포주로부터의 결과가, OA가 AC 세포에서 브래디키닌으로 자극한지 약 10분 후에 Erk1/2 탈인산화를 억제한다는 것을 명확히 보여주었다 (도 5A). AD 세포에서, 연장된 Erk1/2 인산화가 브래디키닌으로 자극한지 약 10분 후에 관측되었다. OA의 첨가가 이들 세포에서 추가로 Erk1/2 인산화를 증가시키지 않는다. AC 및 AD 세포 간에는 +OA/-OA의 비의 유의적인 차이가 있었다. 이들 결과는 BK 자극에 의해 유도된 AD 세포에서의 Erk1/2 인산화의 연장이 PP2A 기능으로 인한 것임을 암시한다.

다른 한편, PP2B 억제제인 FK506이 존재하면, AC 세포에서 BK-유도된 Erk1/2 인산화가 유의적으로 증가되지 않았다 (도 5A). AD 세포에서 BK-유도된 Erk1/2 인산화 연장이 FK506의 존재하에서 없어졌다는 것이 또한 확인되었다 (도 5A).

실시예 5: 면역세포화학

상이한 처리 하의 포스포-Erk1/2에 대한 면역반응 시그널이 도 6에 도시되어있다. 도 6A는 OA의 존재 또는 부재하에서 AC와 AD 세포 간의 BK-유도된 Erk1/2 인산화의 시간 과정을 보여주며, 이는 웨스턴 블롯팅 결과 (도 4 참조)와 일치하였다. 도 6B는 동일한 AC 또는 AD 세포 내의 정상 Erk1/2 시그널과 비교한 Erk1/2 인산화를 보여주며, 이는 도 5에 도시된 웨스턴 블롯의 결과와 또한 일치한다. 그 러나, 면역조직염색으로 관찰된 Erk1/2의 기저 인산화 수준은 AC 세포에서 보다 AD 세포에서 더 높다는 것이 확인되었으며, 이는 AD와 AC 세포 간의 Erk1/2 인산화의 기저 수준에서 명백한 차이를 나타내지 않은 웨스턴 블롯의 결과와는 달랐다. 보다 중요하게, AD와 AC 세포 간에 인산화된 Erk1/2의 아세포 분포에서 차이가 있다는 것이 확인되었다. AC 세포에서, 인산화된 Erk1/2는 세포의 핵 내에 주로 농축되는 반면에, AD 세포에서, 인산화된 Erk1/2는 핵주변 영역 및 시토졸 영역에 보다 흩어져서 분포한다는 것이 확인되었다. 이는 특히 Erk1/2가 BK에 의해 활성화될 때 사실이었다 (참조: 도 6A BK, 약 5 분). 이들 결과는, 활성화된 Erk의 핵으로의 수송이 AD 세포에서 억제되고, 이는 유전자 전사의 조절에서 MAP 키나제의 AD-관련된 기능장애 및 BK 자극 후 지연된 Erk 탈인산화를 일으킬 수 있음을 암시한다.

실시예 6: 사람 피부 섬유아세포의 시험

사람 피부 섬유아세포를 본 발명의 알츠하이머 질환에 대한 진단 시험용 재료로 사용할 수 있다. 이러한 유형의 세포는, 시험 대상자 및 연령이 일치하는 비-알츠하이머 대조군 피험자로부터 확립된 방법에 따라 수집하고, 처리하고, 배양하고, 계대시킬 수 있다. 세포를, 10% 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지 중의 작은 플라스크 (통상 25cm) 또는 작은 디쉬 (35 mm)에서, 80-99 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 배양할 수 있다. 이어서, 세포들을 처리하기 전에 무혈청 배지에서 밤새 배양하여, "아사"시킬 수 있다.

PP2A 유전자 발현의 기저 수준을 정량적 실시간 PCR로 측정한다. 이는 다음의 과정을 포함한다: 1) 섬유아세포로부터 전체 RNA를 수득하거나, 또는 여과-이용 방법과 같은 기타 방법으로 전체 RNA를 수득한다. 2) 예를 들어 DNase-I으로 전체 RNA를 처리하여 게놈 DNA를 제거한다. 3) 시험관내 역 전사 반응으로 전체 RNA로부터 일본쇄 cDNA를 합성한다. 4) 실시간 PCR을 수행한다. GAPDH와 같은 참조 유전자를 PP2A 유전자 발현의 정규화를 위해 수행한 동일한 PCR에서 PP2A 유전자로 동시에 증폭시킨다.

브래디키닌-유도된 PP2A 유전자 발현은 아래의 과정에 의해 측정한다: 혈청-결핍된 섬유아세포를 약 10분 동안 37℃에서 적당한 농도의 브래디키닌 (BK)으로 처리한다. 배양 배지를 제거하고, 세포를 미리-냉각시킨 PBS (pH 7.5)로 세정하고, 드라이아이스/에탄올 표면 상에 세포를 동결시킴으로써, 반응을 종결시킨다. 별개의 플라스크에서 배양된 동일한 세포들을 BK 용액 대신 동일한 용적의 PBS와 함께 첨가하고, 대조군으로서 사용한다. 전체 RNA의 수득, DNase-I 처리, 시험관내 역 전사, 및 실시간 PCR을 상기한 바와 같이 수행한다. BK-유도된 PP2A 유전자 발현은 +BK/-BK 비를 계산하여 산정한다.

섬유아세포 내의 PP2A의 단백질 수준을 항-PP2A 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 측정한다. 안넥신-II 또는 액틴과 같은 상이한 단백질의 수준은 동일한 샘플에서 측정될 수 있으며, 정규화를 위한 참조 단백질로서 사용될 수 있다.

BK 자극 후 오카디악산 (OA)-억제된 Erk1/2 탈인산화를 아래의 과정으로 평가하였다: 동일한 세포주로부터의 세포를 두 개의 별개의 플라스크 또는 디쉬에서 80-90% 컨플루언스에 이를 때까지 배양한다. 밤새 혈청 결핍하에 둔 후, 세포들을 다음과 같이 처리한다: 1) 약 10 분간 BK로 처리한다. 2) 약 15분 동안 약 10 nM OA로 예비처리한 후, BK 및 또 다른 용량의 OA로 약 10분간 처리한다. 반응을 종결시키고, 세포를 용해 완충제로 용해시키고, Erk1/2 인산화의 정도 및 총 Erk1/2의 수준을 웨스턴 블롯을 사용하여 측정한다. 총 Erk1/2의 시그널로 정규화한 후, OA의 존재 및 부재하에서 BK-자극된 Erk1/2 인산화의 비를 계산한다.

Erk1/2의 기저 인산화 수준을 형광 면역세포화학 염색으로 평가한다. 섬유아세포를 작고 둥근 커버슬립 상에서 배양한다. 약 70-80% 컨플루언스에 도달하고 혈청-결핍하에 밤새 둔 후, 배양 배지를 제거한다. 세포를 미리 냉각시킨 PBS (pH 7.5)로 신속히 세정하고, 약 4% 포름알데히드로 고정시킨다. 고정된 세포를 약 5분씩 3회 세척하고, 항-포스포-Erk1/2과 함께 항온처리한다. 이어서, 세포를 형광 표지된 2차 항체로 염색한다. 면역반응성 시그널을 형광 현미경으로 수득하고, 포스포-Erk1/2의 시그널 수준을 Metaphore 소프트웨어로 측정한다.

포스포-Erk1/2의 핵 전위를 면역세포화학 염색, 웨스턴 블롯팅 및 ELISA로 검사한다. 1) 세포들을 70-80% 컨플루언스에 이를 때까지 작은 커버슬립 상에서 배양한다. 세포들을 혈청-결핍하에 밤새 두고, 약 10 nM OA의 존재 및 부재하에 적당한 농도의 BK로 처리한다. 상기한 바와 같이 반응을 종료하고 세포들을 고정한 후, 세포들을 항-포스포-Erk1/2로 면역염색한 다음, 형광-표지된 2차 항체로 염색한다. 포스포-Erk1/2의 증가 및 핵 유입을 관찰하고 컴퓨터에 연결된 형광 현미경으로 기록한다. 2) 동일한 세포주로부터의 세포들을 여러 개의 별도의 플라스크 또는 디쉬에서 아래의 처리 조건 하에 배양한다: 대조군, BK 처리 및 BK+OA 처리. 반응 종료 후, 시토졸 및 핵 분획을 상업용 핵 분획 제조 키트를 사용하여 분리한다. 포스포-Erk1/2의 핵 전위를 시토졸 및 핵 분획에서 각각 Erk1/2 인산화 수준을 검출하는 방법으로 검사한다. 핵 포스포-Erk1/2 대 시토졸 포스포-Erk1/2의 비를 계산하고, 상이한 처리 조건하에서 비교한다. 달리, 동일한 결과를 ELISA로 수득할 수 있다.

실시예 7: 섬유아세포의 배양 및 처리

알츠하이머 질환 환자 및 연령이 일치하는 대조군 (AC) 유래의 뱅크드(Banked) 피부 섬유아세포를 판매원 [Coriell Institute for Medical Research]으로부터 구입하였다. 59세 내지 81세의 19명의 AD 환자로부터의 세포를 본 연구에 사용하였는데, 11개의 세포주는 가족성 AD (FAD)로부터 유래하고, 9개의 세포주는 산발성 AD (SAD) 개체로부터 유래한다. 모든 환자는 중증의 치매, 진행성 기억 상실, 및 기타 손상된 인지 기능을 보여주었다. 비정상 뇌전도 및 다양한 정도의 뇌 위축이 이들 AD 환자에게서 발견되었다. 대조군 섬유아세포는 연령이 비슷하고 성이 일치하는 17명의 정상 개체로부터 유래하였다. 실험실에 도착시, 전술한 바와 같이, 세포를 10% 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하고, 계대시켰다 (Zhao et al., 2002). 17 이하의 계대 수를 갖는 세포가 본 연구에 사용되었다.

실시예 8: 약리학적 처리

MAP 키나제 인산화를 자극하기 위하여, 섬유아세포를 약 90% 컨플루언스에 이를 때까지 배양하고, 강력한 염증 매개인자인 브래디키닌 (BK, 10nM)로 약 5분 또는 약 10분 동안 처리하였다. MAP 키나제 인산화의 조절에서 PP2A 또는 PP2B의 관련 가능성을 시험하기 위하여, 세포를 오카디악산 (OA, 약 10 nM) 또는 FK506 (약 20 nM)로 약 15 분 동안 예비처리한 다음, 또 다른 용량의 오카디악산 또는 FK506과 함께 BK (약 10 nM)로 약 10 분 동안 처리하였다. 각 세포주에 대한 세포의 플라스크를 DMSO 비히클로 처리하고 대조군으로서 사용하였다. 플라스크로부터 배양 배지를 제거하고, 세포를 미리 냉각시킨 IX PBS, pH 7.5로 신속하게 세정하고, 플라스크를 드라이아이스/에탄올 상에 방치하는 방법으로 처리를 종료시킨다. 실험의 목적에 따라, 1% 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma)을 함유하는 1 ml RNA 분리제 또는 1 ml 세포 용해 완충제를, 후속 RNA 제조 또는 효소 및 면역블롯팅 검정을 위해 각 플라스크에 첨가하였다.

실시예 9: 전체 RNA의 제조 및 제1 쇄 cDNA의 합성

전체 RNA를 제조사의 지침에 따라 RNA 분리기 (Sigma Genosys)를 사용하여 각 AD 및 AC 세포주로부터 추출하고, 37℃에서 30분 동안 DNase-I로 처리하여, 있을수 있는 게놈 DNA 오염을 제거하였다. 이어서, 전체 RNA (1.5 ㎍)를, 올리고(dT) 프라이머와 함께 제1 쇄 cDNA 합성 키트를 사용하여 일본쇄 cDNA로 역전사시켰다.

실시예 10: 실시간 PCR

상기한 바와 같이 시험관내 역 전사 (RTQ-PCR) 후, ABI 7900 플랫폼 (Applied Biosystems)을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄 반응에 의해 mRNA 수준을 정량하였다. PP2A의 표적 절편을, 정방향, 5 '-GTTGGGAGGTGGCAGTGAG-3' 서열번호 1 및 역방향, 5'-AAACACTGGCCTCTGGTGTC-3 ' 서열번호 2의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰는데, PCR을 10 ㎕의 SYBR 그린-I MaterMix (Applied Biosystems), 10 pmol의 각각의 정방향 및 역방향 프라이머, 및 1 ㎍의 역전사된 cDNA 주형을 함유하는 20 ㎕ 혼합물을 사용하여 수행하였다. 샘플에 따른 cDNA 농도의 다양성으로 인한 오차를 교정하기 위하여, 참조 유전자인 글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제 (GAPDH)의 절편을, 정방향, 5'CAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3 ' 서열번호 3 및 역방향, 5'AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC-3' 서열번호 4의 프라이머 쌍을 사용하여 수행하는 동일한 PCR에서 동시에 증폭시켰다. PP2A 및 GAPDH의 실시간 증폭은, 10⁵ 내지 10¹² 복사체 범위의 cDNA 주형의 일련의 희석물을 사용하여 생성된 각 유전자에 대하여 수행된 동일한 PCR 동안에 표준 곡선에 따라, PCR 기계에 의해 자동적으로 계산되었다. PCR의 말기에, PP2A mRNA 수준을 GAPDH mRNA 수준으로 정규화시켰다. 수득된 비 (PP2A/GADPH)를 각 개체 세포주의 PP2A 유전자 발현 수준의 기준으로서 사용하였다. PP2A 및 GAPDH PCR 산물의 특이성을 이들의 융점 (MT)에 의해 나타내었고, 10% TUBE 겔 상의 최종 PCR 산물을 분석하여 확인하였다.

실시예 11: 포스파타제 활성 분석

AD 및 AC 세포에서의 PP2A 활성을, 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트 (PNPP, 14.4 mM)를 사용하여 일정 절차 (Pierce Biotechnology)에 따라 검정하였다. 효소 활성 검정을 96-웰 마이크로플레이트에서 수행하였다. 각각의 AC 또는 AD 세포 용해물 10 ㎕를 90 ㎕의 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 개시시키고, 30℃에서 15 분간 항온처리하고, 420 nm 파장하에서 BioRad 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 10 nM PP2A 억제제 오카디악산이 존재하는 경우의 반응물로부터의 값을 감산한 후, PP2A의 활성을 정제된 PP2A 단백질의 일련의 공지된 농도에 의해 생성된 표준 곡선에 따라 계산하였다.

실시예 12: PP2A 단백질 수준의 결정

섬유아세포에서 PP2A의 수준을 산정하기 위하여, 세포 용해물 중의 전체 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 시약 (Pierce Biotechnology)을 사용하여 결정하였다. 각각의 AC 및 AD 세포주로부터의 전체 단백질의 유사한 양을 4-20% SDS-PAGE 상에서 용해시켰다. PP2A 단백질을, 항-PP2A 폴리클로날 항체 (Biosource International)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다. 섬유아세포에서 풍부하게 발현되는 인지질-결합 단백질인 안넥신 II를 또한 동일한 블롯 상에서 항-안넥신 II 항체 (Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 측정하고, 이의 면역반응성 시그널을 단백질 충전 변동의 정규화로서 사용하였다.

실시예 13: Erk1 /2 인산화의 측정

상이한 처리하의 Erk1/2 인산화를 항-포스포-Erk1/2 항체 (Cell Signaling Technology)를 사용하여 웨스턴 블롯 상에서 측정하고, SDS 겔 상에 충전된 Erk1/2 단백질의 총량을 항-정상 Erk1/2 항체 (Upstate Biotechnology)에 의해 측정하고, 이를 사용하여 검출된 포스포-Erk1/2 시그널을 정규화하였다.

실시예 14: 면역조직화학 염색

섬유아세포를, 0.02 mg의 폴리리신을 피복한 2.5 cm 직경의 유리 커버슬립의 표면 상에서 성장시켰다. OA의 존재 또는 부재하에서 브래디키닌을 처리한 후, 세포를 15분 동안 4% 포름알데히드로 신속히 고정한 다음, 30분 동안 0.1% Triton X-1OO를 침투시켰다. 10% 정상 말 혈청과 함께 30분간 항온처리한 후, 세포를 4℃에서 밤새 항-포스포-Erk1/2 항체로 처리하였다. 세포를 세척하고 플루오레세인 (flourscein) (녹색)으로 표지된 항-래빗 IgG 항체로 60분 동안 처리하였다. 세척하고, Vectashield 봉입제(mounting medium) (Vector Laboratories)로 밀봉한 후, 포스포-Erk1/2 면역염색 시그널을 Nikon 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 다른 경우에는, 마우스 항-포스포-Erk1/2 항체 및 래빗 항-정상 Erk1/2 항체와 동시에 세포를 항온처리함으로써, 동일한 박편 상에서 포스포- 및 정상 Erk1/2를 관찰하기 위하여, 이중 면역염색을 수행하였다. 이어서, 플루오레세인 (녹색) 및 텍사스 레드 (적색)로 표지된 항-마우스 및 항-래빗 IgG의 2차 항체와 함께 항온처리하였다. 면역반응성 시그널을 상기한 바와 같이 수득하였다.

실시예 15: 데이터 분석

(1) 19 AC 및 19 AD 세포주의 각 샘플 중의 PP2A mRNA에 대한 정량적 PCR 값을 동일한 샘플 중의 GADH의 값으로 정규화시켰다. (2) PP2A 단백질 발현을 위하여, 면역반응성 시그널을 밀도측정 스캔으로 측정하였다. PP2A에 대한 밀도측정 값을 안넥신 II의 값으로 정규화하고, UN-SCAN-IT 소프트웨어 (Silk Scientific, Inc.)로 정량하였다. (3) Erk1/2 인산화를 산정하기 위하여, 전체 Erk1/2에 대한 포스포-Erk1/2의 비를 계산하였다. 이어서, 포스파타제 2A 활성 검정으로부터의 상기 모든 비 및 데이터를, t-테스트 또는 일원 변량분석(one-way ANOVA)을 사용하여 AD 세포와 AC 세포 간에 통계학적으로 비교하였다.

참조 문헌

Claims

a. 피험자로부터 세포 샘플을 수득하는 단계, 및

b. 상기 샘플 중의 PP2A (포스파타제 2A)유전자 발현 수준을 검출하는 단계

를 포함하고, 이때 대조군 세포와 비교하여 PP2A 유전자 발현 수준의 상승이 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
제1항에 있어서, 세포 샘플이 섬유아세포, 협측 점막 세포, 뉴런 및 혈액 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 세포 샘플이 섬유아세포인 방법.
제1항에 있어서, 검출 단계 (b)를 역 전사 정량적 중합효소 연쇄 반응 (RVQ-PCR)으로 수행하는 방법.
a. 피험자로부터 세포 샘플을 수득하는 단계,

b. 상기 세포 샘플을 PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제제에 접촉시켜 세포를 자극하는 단계, 및

c. 상기 자극된 세포 중의 PP2A 유전자 발현 수준을 상기 피험자로부터의 동 일한 유형의 자극되지 않은 세포 중의 PP2A 유전자 발현 수준과 비교하는 단계

를 포함하고, 이때 자극되지 않은 세포와 비교하여 자극된 세포에서 PP2A 유전자 발현의 증가가 결여된다는 것이 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
제5항에 있어서, 제제가 브래디키닌인 방법.
제5항에 있어서, PP2A 기질이 Erk1/2인 방법.
제5항에 있어서, 세포가 섬유아세포, 협측 점막 세포, 뉴런 및 혈액 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제5항에 있어서, 세포가 섬유아세포인 방법.
제5항에 있어서, 비교 단계 (c)를 PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제제의 존재 및 부재하에서 PP2A 유전자 발현의 비를 계산하여 수행하는 방법.
a. 피험자로부터 세포 샘플을 수득하는 단계, 및

b. 상기 세포 샘플 중의 PP2A 단백질 또는 효소 활성의 수준을 검출하는 단계

를 포함하고, 이때 비-알츠하이머 대조군 세포와 비교하여 PP2A 단백질 또는 효소 활성의 감소된 수준이 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
제11항에 있어서, 세포 샘플이 섬유아세포, 협측 점막 세포, 뉴런 및 혈액 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제11항에 있어서, 세포가 섬유아세포인 방법.
제11항에 있어서, PP2A 단백질 수준 검출을 웨스턴 블롯 또는 ELISA로 수행하는 방법.
a. 피험자로부터 세포 샘플을 수득하는 단계,

b. 상기 세포 샘플 및 대조군 세포를 PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제1 제제 및 PP2A의 억제제인 제2 제제에 접촉시키는 단계,

c. 접촉 단계를 개시한 후, 예정된 시간 후에 PP2A 기질의 인산화 수준을 측정하는 단계, 및

d. 상기 세포 샘플 중의 PP2A 기질의 인산화 수준을, 동일한 예정 시간에 대조군 세포 중의 PP2A 기질 인산화의 수준과 비교하는 단계

를 포함하고, 이때 대조군 세포와 비교하여 상기 세포 샘플 중의 PP2A 기질 인산화의 정도에 미치는 PP2A 억제제의 추가 효과가 결여된다는 것이 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
제15항에 있어서, PP2A 기질이 Erk1/2인 방법.
제15항에 있어서, PP2A의 억제제가 오카디악산(okadiac acid)인 방법.
제15항에 있어서, 세포가 섬유아세포, 협측 점막 세포, 뉴런 및 혈액 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제15항에 있어서, 세포가 섬유아세포인 방법.
제15항에 있어서, 인산화를 자극하는 제제가 브래디키닌인 방법.
제15항에 있어서, 비교 단계 (d)를 PP2A 억제제의 존재 및 부재하에서 PP2A 기질 인산화의 시험비를 계산하여 수행하고, 이때 시험비가 알츠하이머 질환 세포에서 보다 대조군 세포에서 현저히 더 큰 방법.
a. 피험자로부터 세포 샘플을 수득하는 단계,

b. 대조군 샘플 및 상기 세포 샘플을 PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제1 제 제와, PP2A의 억제제인 제2 제제의 존재 및 부재하에, 접촉시키는 단계,

c. 접촉 단계 (b)를 개시한 후, 예정된 시간 후에 상기 대조군 세포 및 상기 세포 샘플로부터 PP2A 기질의 인산화 수준을 측정하는 단계, 및

d. PP2A의 억제제인 상기 제2 제제의 존재 및 부재하에 상기 세포 샘플로부터 PP2A 기질의 인산화 수준을 비교하는 단계

를 포함하고, 이때 상기 제2 제제의 존재 및 부재하의 PP2A 기질 인산화 정도 사이에 현저한 차이가 결여된다는 것이 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
제22항에 있어서, 대조군 세포가, PP2A의 억제제인 제2 제제의 존재 및 부재하의 PP2A 기질 인산화 수준에서 현저한 차이를 보여주는 방법.
제22항에 있어서, 세포 샘플이 섬유아세포, 협측 점막 세포, 뉴런 및 혈액 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제22항에 있어서, 세포 샘플이 섬유아세포인 방법.
제22항에 있어서, PP2A 기질의 인산화를 자극하는 제1 제제가 브래디키닌인 방법.
제22항에 있어서, PP2A의 억제제인 제2 제제가 오카디악산인 방법.
제22항에 있어서, PP2A 기질이 Erk1/2인 방법.
a. 피험자로부터 세포 샘플을 수득하는 단계,

b. 상기 샘플을 Erk1/2의 인산화를 자극하는 제제와 접촉시키는 단계, 및

c. 인산화된 Erk1/2의 아세포(subcellular) 분포를 검출하는 단계

를 포함하고, 이때 인산화된 Erk1/2의 핵외 분포가 알츠하이머 질환의 존재를 암시하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
제29항에 있어서, Erk1/2의 인산화를 자극하는 화합물이 브래디키닌인 방법.
제29항에 있어서, 검출 단계 (c)를 면역세포화학에 의해 수행하거나, 또는 샘플 세포의 핵과 시토졸 사이의 인산화된 Erk1/2의 시험비를 측정하여 수행하는 방법.
제1항, 제5항, 제11항, 제15항, 제22항 및 제29항의 진단 방법의 임의의 조합을 포함하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
제1항, 제5항, 제11항, 제15항, 제22항 및 제29항의 진단 방법의 임의의 조 합을 포함하고, 추가로 세포내 칼슘 방출을 촉발하는 제제로 자극한 후 MAPK 단백질의 증가된 인산화를 측정함을 이용하여 알츠하이머 질환을 진단하는 방법과의 조합을 포함하는, 피험자에게서 알츠하이머 질환을 진단하는 방법.
a. 세포 샘플을 시험하고자 하는 물질과 접촉시키는 단계, 및

b. 상기 물질이 알츠하이머 질환-관련 PP2A 비정상을 역전시키거나 개선시키는지를 판정하는 단계

를 포함하고, 이때 상기 PP2A 비정상을 역전시키거나 개선시키는 화합물이 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 유용한 치료 물질로서 동정되는, 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 동정하기 위하여 스크리닝하는 방법.
제34항에 있어서, 알츠하이머 질환-관련된 비정상이 비-알츠하이머 대조군 세포와 비교하여 증가된 PP2A mRNA의 존재인 방법.
제34항에 있어서, 알츠하이머 질환-관련된 비정상이 Erk1/2의 인산화를 자극하는 제제와 접촉한 세포에서 PP2A 발현 증가의 결여인 방법.
제34항에 있어서, 알츠하이머 질환-관련된 비정상이 비-알츠하이머 대조군 세포와 비교하여 PP2A 단백질 또는 PP2A 효소 활성의 감소인 방법.
제34항에 있어서, 알츠하이머 질환-관련된 비정상이, 시험 세포를 오카디악산의 존재하에서 브래디키닌으로 처리한 경우에 정상 반응의 결여인 방법.
제34항에 있어서, 알츠하이머 질환-관련된 비정상이 핵외 영역 중에 인산화된 Erk1/2의 분포인 방법.
브래디키닌, 및 PP2A 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 포함하는, 알츠하이머 질환에 대한 진단 시험 키트.
항-PP2A 항체를 포함하는, 알츠하이머 질환에 대한 진단 시험 키트.
항-Erk1/2 항체 및 브래디키닌을 포함하는, 알츠하이머 질환에 대한 진단 시험 키트.
항-포스포 Erk1/2 항체 및 브래디키닌을 포함하는, 알츠하이머 질환에 대한 진단 시험 키트.
브래디키닌, 오카디악산 및 항-Erk1/2 항체를 포함하는, 알츠하이머 질환에 대한 진단 시험 키트.
제44항에 있어서, 항-포스포 Erk1/2 항체를 추가로 포함하는 진단 시험 키트.