DE69321893T2

DE69321893T2 - Verfahren zum Nachweis von Alzheimer-Krankheit

Info

Publication number: DE69321893T2
Application number: DE69321893T
Authority: DE
Inventors: Ralph A Nixon; Ken-Ichi Saito
Original assignee: Mclean Hospital Corp
Current assignee: Mclean Hospital Corp
Priority date: 1992-07-22
Filing date: 1993-07-22
Publication date: 1999-05-12
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: CA2101117A1; JPH07225231A; EP0582143B1; EP0582143A1; DE69321893D1; ATE173088T1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der medizinischen Diagnose unter Verwendung von Antikörpern, um Patienten auf die Alzheimer-Krankheit zu screenen.

Hintergrund der Erfindung

Synaptischer Verlust und Zelltod von Neuronen korreliert eng mit dem Grad der kognitiven Schädigung bei der Alzheimer- Krankheit (Terry et al., Ann. Neurol. 30 : 572-580, 1991, Hamos et al., Ann. Neurol. 39 : 355, 1991, Dekosky & Scheff, Ann. Neurol. 27 : 457-464, 1990). Diese pathologischen Ereignisse sind bis jetzt nicht auf der biochemischen Stufe definiert worden, obgleich viele mutmaßliche ätiologische Faktoren bei der Alzheimer-Krankheit das Potential zur Schädigung der zellulären Calcium-Homöostase teilen (Khachaturian, Z. S., Aging 1(1):17-34, 1989) und mancher Nachweis über eine solche Zerstörung in Alzheimer-Geweben besteht (Colvin, R. A. et al., Brain Res. 543 : 139-147, 1991, Peterson, C. et al., N. Engl. J. Med. 312, 16 : 1063-1064, 1985; Peterson & Goldman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2758-2762, 1986, Rizopoulos, E. et al., Brain Res. Bull. 21 : 825-828, 1988, Peterson, C. et al., Neurosci. Lett. 121 : 239-243, 1991, Iacopino & Christakos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 4087-4082, 1990, Gibson, G. E. et al., Biol. Psychiatry 22 : 1079-1086, 1987).
Calcium-aktivierte neutrale Proteinasen (CANP) sind eine Familie von Proteasen, die in Regulationsaspekten der Signaltransformation verwickelt sind (Pontremoli, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 3705-3707, 1990, Piggot, M. A. et al., Brain Res. 565 : 42-47, 1991, Adunsky, A. et al., J. Neuroimmunology 33 : 167-172, 1991, Suzuki & Ohno, Cell Struct. Funct. 15 : 1-6, 1990, Murachi, T., Biochem. Internatl. 18(2):263-294, 1989). Eingeschränkte Proteolyse durch CANP ist an der Regulation wichtiger Enzyme, einschließlich Calcium-abhängiger Proteinkinasen und Proteinphosphatasen und Neurotransmitterenzymen, und an der Modifizierung der Wirkung von Strukturproteinen auf der Membran und dem Membranskelett beteiligt (Togari, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 134(2):749-754, 1968, Kishimoto, A. et al., J. Biol. Chem. 258 : 1156-1164, 1983, Tallant, E. A. et al., Biochem. 27 : 2205- 2211, 1988, Nixon, R. A., Ann. N. Y. Acad. Sci. 568 : 198-208, 1989). Starke Aktivierung von CANP, wie es in angeregter Toxizität und Ischemie auftritt, induziert die schnelle irreversible Neuronenschädigung (Siman, R., et al., J. Neurosci. 9 : 1579-1590 (1989); Siman, R. in Neurotoxicity of Excitatory Amino Acids, A. Guidotti, Hrsg., Raven Press, New York, S. 145-161, 1990, Lee, K. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7233-7347, 1991). Frühere Berichte weisen jedoch darauf hin, daß die CANP Gesamtaktivität nicht bedeutend im Alzheimer-Gehirn verändert ist (Kawashima, S. et al., Biomed. Res. 10(1):17-23, 1989, Mantle & Perry, J. Neurol. Sci. 102 : 220-224, 1991, Nilsson, E. et al., Neurobiol. Aging 11 : 425-431, 1990).
CANP kommt in Zellen hauptsächlich als inaktive Vorläufer- Isoform vor (Suzuki & Ohno, Cell Struct. Funct. 15 : 1-6, 1990, Suzuki, K. et al., FEBS Lett. 220 : 271, 1987), die durch autoproteolytische Spaltung einer aminoterminalen Sequenz in der Gegenwart von Calcium aktiviert wird (Suzuki, K. et al.,J. Biochem. 90 : 1787-1793, 1981, Inomata, M. et al., J. Biochem. 98 : 407-416, 1985, Zimmerman & Schlaepfer, Biochim. Biophys. Acta 1078 : 192-198, 1991, Suzuki, K. et al., FEBS Lett. 220 : 271, 1987). Es ist schwierig gewesen, die Wirkung von CANP in vivo durch ein in vitro-Enzymassay aufzuzeichnen, da die Vorläuferform auch durch das Assayverfahren aktiviert wird, und als Folge davon die Aktivitäten durch die Instabilität der Enzyme sowie durch verschiedene cytosolische Hemmungs- und Aktivierungsfaktoren beeinflußt sind (Mellgren & Murachi, Hrsg., Intracellular Calcium-dependent Proteolysis, CRC Press, Boston, MA, S. 1-276, 1990.

Zusammenfassung der Erfindung

Zur Überwindung dieser Probleme haben wir unterschiedliche uCANP-Isoformen in postmortalem Menschengehirn identifiziert, die der autolytisch aktivierten Isoform und dem zuvor in Erythrozyten gezeigten ungeschnittenen Vorläufer entsprechen. Die Erfindung betrifft die Entdeckung, daß das Verhältnis der Vorläufer zu aktivierten Isoformen von uCANP in Geweben ein Index der CANP-Wirkung in vivo bereitstellt.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, umfassend
(a) Erhalten einer Gewebeprobe von einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, und
(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDA Isoform in der Gewebeprobe, wobei ein erhöhtes 76-kDa/80-kDA Verhältnis im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Individuen, die nicht die Alzheimer- Krankheit haben, bestätigt, daß das Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, die Alzheimer-Krankheit hat.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweisen der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, umfassend
(a) Erhalten einer Gewebeprobe von einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, und
(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu den Gesamtmengen der 76-kDa, 78-kDa und 80- kDA Isoformen, wobei ein erhöhtes Verhältnis von 76-kDa/76- kDa+78-kDa+80-kDA im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Individuen, die nicht die Alzheimer-Krankheit haben, bestätigt, daß das Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, die Alzheimer-Krankheit hat.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit, das zur Feststellung der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, nützlich ist, umfassend eine Trägereinrichtung, die eine oder mehrere Behältereinrichtungen mit enger Begrenzung hat, worin der erste Behälter einen nachweisbaren Antikörper enthält, der mit der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDa uCANP- Isoform immunoreaktiv ist. Weitere Behältereinrichtungen können einen nachweisbar markierten Antikörper enthalten, der mit dem nachweisbaren Antikörper immunoreaktiv ist, der mit der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDa uCANP-Isoform immunoreaktiv ist. Zusätzlich können weitere Behältereinrichtungen ein Mittel zum Trennen der 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDa uCANP-Isoform enthalten.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit, das zur Feststellung der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, nützlich ist, umfassend eine Trägereinrichtung, die zwei oder mehrere Behältereinrichtungen mit enger Begrenzung hat, worin der erste Behälter einen ersten nachweisbaren Antikörper enthält, der mit der 80-kDa uCANP-Isoform und nicht mit den 76-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen immunoreaktiv ist, und der zweite Behälter einen zweiten nachweisbaren Antikörper enthält, der mit den 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen immunoreaktiv ist. Bevorzugt sind der erste und zweite nachweisbare Antikörper mit verschiedenen Markierungen, die beim Nachweis unterschieden werden können, nachweisbar markiert.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Screenen eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit, umfassend
(a) Erhalten einer ersten Tierhirnprobe,
(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der ersten Tierhirnprobe,
(c) Inkubieren einer zweiten Tierhirnprobe mit einer wäßrigen Lösung aus Ca++ und einem Medikament, von dem angenommen wird, daß es beim Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist;
(d) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der in Schritt (c) erhaltenen Gewebeprobe,
wobei bestätigt wird, daß das Medikament zum Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, wenn sich das 76-kDa/80-kDA Verhältnis der Tierhirnprobe, die mit dem Medikament kontaktiert wird, wie in Schritt (d) bestimmt, im Vergleich zu dem in Schritt (b) erhaltenen 76-kDa/80-kDA Verhältnis verringert.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Screenen bei der Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit, umfassend
(a) Erhalten einer ersten Fibroblastenprobe von einem Tier,
(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der ersten Fibroblastenprobe,
(c) Inkubieren einer zweiten Fibroblastenprobe mit einer wäßrigen Lösung aus Ca++, einem Calciumionophor und einem Medikament, von dem angenommen wird, daß es beim Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist;
(d) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der in Schritt (c) erhaltenen Fibroblastenprobe,
wobei bestätigt wird, daß das Medikament zum Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, wenn sich das 76-kDa/80-kDA Verhältnis der Fibroblastenprobe, die mit dem Medikament kontaktiert wird, wie in Schritt (d) bestimmt, im Vergleich zu dem in Schritt (b) erhaltenen 76-kDa/80-kDA Verhältnis verringert.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1(A) stellt eine Immunoblot-Analyse von uCANP in der präfrontalen Kortex von zwei Kontrollen (CONT) und zwei Alzheimer (AD)-Patienten dar.
Fig. 1(B) stellt eine Gelelektrophorese dar, die die Autolyse von uCANP von menschlichen Erythrozyten in vitro zeigt.
Fig. 2 stellt eine graphische Darstellung dar, die die Beziehung zwischen der Enzymaktivität und dem uCANP-Gehalt zeigt.
Fig. 3 stellt eine Immunoblot-Analyse der uCANP-Autolyse in menschlichen Gehirnabschnitten (präfrontaler Kortex) dar.
Fig. 4 stellt eine graphische Darstellung dar, die das Verhältnis der 76-kDa/80-kDa uCANP-Isoform in der präfrontalen Kortex von Kontrollindividuen (O) und AD-Patienten ( ) aufgetragen gegen das postmortale Intervall (PMI) zeigt.
Fig. 5 stellt Säulendiagramme dar (Felder A, B und C), die das Verhältnis der uCANP-Isoform (76-kDa/80- kDa) in Gehirnbereichen von Kontroll-, Alzheimer- und Huntington-Krankheit (HD)-Gehirnen zeigt. (A) präfrontale Kortex. (B) Putamen. (C) Cerebellum.
Fig. 6 (Felder A und B) stellt eine Immunoblot-Analyse von Fibroblasten von Kontrollen und mit Individuen, die von der kanadischen FAD-Kohorte betroffen sind, dar. Die Figur zeigt, daß das Verhältnis der aktivierten Calpain-Isoform (76 kDa) zu der latenten Isoform (84 kDa) in Fibroblasten von phenotypisch-betroffenen Individuen der FAD -Kohorte (C = Kontrolle) erhöht ist.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Calcium-aktivierte neutrale Proteinasen (CANP) sind Schlüsselenzyme in den intrazellulären Signalkaskaden und sind potentielle Mediatoren der Calcium-induzierten Zellschädigung. Die Enzymform, die micromolare Calciumwerte (uCANP) erfordert, die in Neuronen angereichert ist, wurde am häufigsten damit verbunden. Als ein Index der Änderung der in vivo Aktivität von uCANP wurden die Verhältnisse der aktivierten uCANP-Isoform zu den Vorläuferisoformen immunochemisch in Bereichen des postmortalen menschlichen Gehirns gemessen. Dieses Verhältnis war in der präfrontalen Kortex von Patienten mit Alzheimer-Krankheit dreifach erhöht, aber nicht von solchen mit Huntington-Krankheit. Andere Bereiche des Alzheimer-Gehirns (Putamen und Cerebellum), in denen die Neuronendegeneration bei der Alzheimer-Krankheit am minimalsten angesehen wird, entfalteten außerdem bedeutend erhöhte uCANP-Aktivierung.
Folglich betrifft die Erfindung die Entdeckung, daß erhöhte Gehalte der aktiven uCANP-Isoform mit der Alzheimer-Krankheit in Beziehung stehen. In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Feststellen der Alzheimer- Krankheit in einem Individuum, umfassend
(a) Erhalten einer Gewebeprobe von einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, und
(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDA Isoform in der Gewebeprobe, wobei ein erhöhtes 76-kDa/80-kDA Verhältnis im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Individuen, die nicht die Alzheimer- Krankheit haben, bestätigt, daß das Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, die Alzheimer-Krankheit hat.
Die Gewebeprobe kann eine Gehirnbiopsie oder bevorzugt eine Fibroplastenprobe sein. Wenn eine Gehirnbiopsieprobe erhalten wird, wird sie bevorzugt von der frontalen Kortex, dem Putamen oder Cerebellum erhalten. Wenn sie von der frontalen Kortex erhalten wird, ist es möglich, zwischen der Alzheimer und der Huntington-Krankheit zu unterscheiden. Wenn das Gewebe des Nervensystems erfindungsgemäß analysiert wird, werden ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,5 g Gewebe benötigt, um die Analyse durchzuführen.
Am meisten bevorzugt wird eine Fibroblastenproben von einem Individuum erhalten, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat. Fibroblasten können gemäß der von Willers, I. et al., Pathobiology 59 : 357-360, 1991 beschriebenen Verfahren erhalten werden. Siehe auch Ham und McKeehan, In Vitro 14 : 11-22, 1978, die Verfahren zum Wachstum von Fibroblasten in Zellkultur lehren. Ungefähr 0,5 bis 0,1 g Fibroblasten werden zum Durchführen der Analyse benötigt.
Nach dem Erhalt der Gewebeprobe wird sie in einem physiologischen Puffer homogenisiert, zentrifugiert, und der Überstand wird auf die 76-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen untersucht. Bevorzugt wird der Überstand zunächst einer Fraktionierung unterworfen, um potentiell interferierende Substanzen zu entfernen. Dies kann durch Auftragen des Überstands auf eine DEAE-Zellulosesäule und Eluieren der Säule mit einem Puffer, der zunehmende Mengen eines Salzes, wie Kaliumchlorid enthält, durchgeführt werden.
Die von der Säule eluierten Fraktionen können einer Elektrophorese unterworfen werden, um die 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa Isoformen zu trennen, gefolgt von einem Elektrotransfer auf eine Membran (z. B. Nitrozellulose) und einer Immunoblot-Analyse mit nachweisbaren Antikörpern, die mit einem oder mehreren der 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa Isoformen immunoreaktiv sind. Der nachweisbare Antikörper kann, wie hier beschrieben, nachweisbar markiert werden, oder kann durch Kontaktieren mit einem zweiten Antikörper, der damit immunoreaktiv ist, nachgewiesen werden, z. B. wenn der erste Antikörper von einer ersten Tierart und der zweite Antikörper von einer zweiten Tierart, der mit den Antikörpern der ersten Tierart immunoreaktiv ist, stammt. Antikörper, die mit den 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa Isoformen immunoreaktiv sind, werden zum Beispiel von Samis, J. A. et al., Biochem. J. 246 : 481-488, 1987 und Elce, J. S. et al., Biochem. J. 261 : 1039-1042, 1989 beschrieben. Es ist außerdem möglich, Antikörper zu verwenden, die nur für die 76-kDa Isoform selektiv sind. Siehe Saido, T. C. et al., J. Biochem. 111 : 81- 86, 1992.
Besonders bevorzugt wird das Verhältnis der 76-kDa und 80-kDa Isoformen mit nachweisbar markierten Antikörpern bestimmt, die zwischen der 80-kDa Isoform und den 76-kDa und 78-kDa Isoformen unterscheiden. Wenn die 80-kDa Isoform durch Proteolyse in die 76-kDa und 78-kDa Isoformen umgewandelt wird, geht der Endterminus der 80-kDa Isoform verloren.
Folglich ist es möglich, einen Antikörper gegen den Nterminalen Bereich der 80-kDa Isoform herzustellen, um einen Antikörper zu erhalten, der nur mit der 80-kDa Isoform immunochemisch reaktiv ist. Ein zweiter Antikörper, der mit den 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa Isoformen reaktiv ist, kann zum Quantifizieren der Gesamt-uCANP verwendet werden. Da die Menge der 78-kDa Isoform sich nicht bedeutend in Alzheimererkrankten Gehirnen verändert, entspricht das Verhältnis des zweiten Antikörpers zum ersten Antikörper dem Verhältnis der 76-kDa zu 80-kDa Isoformen.
Bevorzugt wird der erste Antikörper gegen einen Bereich der ersten 21 N-terminalen Aminosäuren von uCANP hergestellt. Die Aminosäuresequenz von uCANP wird von Imajoh, S. et al., Biochem. 27 : 8122-8128, 1988 gelehrt. Durch die Aminosäureseguenz von uCANP ist es möglich, die N-terminalen Fragmente von uCANP zu erhalten und monoklonale oder polyklonale Antikörper davon herzustellen. Zum Beispiel können Peptidsegmente von 8 Aminosäuren oder mehr durch Festphasensynthese, Konjugieren der Peptidsegmente an einen immunogenen Träger und Immunisieren eines Tieres damit hergestellt werden. Größere Peptidfragmente können per se eine Immunantwort induzieren. Da jedoch viele kleine Moleküle keine aktive Immunität durch sich selbst induzieren, kann es notwendig sein, die Peptide an einen immunogenen Träger zu konjugieren, um die Herstellung von Antikörpern dagegen zu induzieren. Solche immunogenen Träger umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Proteine, wie Rinderserumalbumin, Diphthematoxoid, Tetanustoxoid, Edestin, Keyhole-Limpethemocyanin, Pseudomonaltoxin A, Choleragenoid, Choleratoxin, Pertussistoxin, virale Proteine und eukaryontische Proteine, wie Interferone, Interleukine oder Tumornekrosefaktor. Solche Proteine können von natürlichen oder rekombinanten Quellen gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren erhalten werden. Wenn von rekombinanten Quellen erhalten, kann der immunogene Träger ein Proteinfragment umfassen, das mindestens den immunogenen Teil des Moleküls umfaßt. Andere bekannte immunogene Makromoleküle, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Polysaccharide, tRNA, nichtmetabolisierbare synthetische Polymere, wie Polyvinylamin, Polymethacrylinsäure, Polyvinylpyrrolidon, gemischte Polykondensate (mit verhältnismäßig hohem Molekulargewicht) von 4147 -Diaminodiphenylmethan-3,3'-dicarbonsäure und 4- Nitro-2-Aminobenzolsäure (siehe Sela, M. Science 166 : 1365- 1374, 1969) oder Glycolipide, Lipide oder Kohlenhydrate. Bevorzugt ist der immunogene Träger ein Protein.
Von dem mit dem N-terminalen uCANP-Segment (entweder allein oder als Teil eines Immunogenkonjugats) immunisierten Tier kann anschließend Blut entnommen und das polyklonale Serum isoliert werden. Siehe Vitto und Nixon, J. Neurochem. 47 : 1039-1051, 1986. Alternativ können monoklonale Antikörper gemäß der bekannten Verfahren von Köhler und Milstein, Nature 256 : 495-497, 1975 hergestellt werden, wobei die Milz des immunisierten Tiers entfernt wird, und die Zellen zum Erhalt von Hybridomzellen mit einer unsterblichen Zell-Linie verbunden werden. Hybridome, die den gewünschten Antikörper absondern, können durch Subklonieren der Hybridome in HAT Auswahlmedium und Screenen der resultierenden Klone auf die immunogene Aktivität mit der 80-kDa Isoform und dem Fehlen der Immunoreaktivität mit den 76-kDa und 78-kDa Isoformen erhalten werden.
Am meisten bevorzugt besteht das N-terminale uCANP-Segment aus den ersten 21 Aminosäuren mit der folgenden Aminosäuresequenz [SEQ ID NR. 1]
Die erfindungsgemäß verwendeten Antikörper können auf eine per se bekannte Weise nachweisbar markiert werden. Es gibt viele verschiedene Markierungen und Markierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele der Markierungstypen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen - sind aber nicht darauf beschränkt - Enzyme, radioaktive Isotope, Farbstoffe, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, biolumineszierende Verbindungen und Metallchelate. Der Fachmann weiß von anderen Markierungen zur Bindung an die Antikörper oder wird diese durch die Verwendung von Routineversuchen feststellen. Die Bindung dieser Markierungen an die Antikörper kann unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, erreicht werden.
Eine der Methoden, durch die die Antikörper markiert werden können, ist das Binden desselben an ein Enzym. Dieses Enzym wird, wenn es später seinem Substrat ausgesetzt wird, dann mit dem Substrat auf eine solche Weise reagieren, daß eine chemische Komponente hergestellt wird, die zum Beispiel durch spektrophotometrische, fluormetrische oder durch sichtbar machende Mittel nachgewiesen werden kann. Enzyme, die verwendet werden können, um Antikörper nachweisbar zu markieren, umfassen - aber sind nicht darauf beschränkt - Malatdehydrogenase, Staphylococconuclease, Delta-V- Steroidisomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, Alpha- Glycerophosphatdehydrogenase, Triose-Phosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, Beta-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Catalase, Glucose-VI-Phosphatdehydrogenase, Glucoamylase und Acetylcholinesterase.
Die Antikörper können mit einem radioaktiven Isotop markiert werden, das durch Mittel, wie die Verwendung eines Gammazählers oder eines Scintillationszählers, oder Autoradiographie bestimmt werden kann. Isotope, die erfindungsgemäß besonders nützlich sind umfassen: ³H, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³²p, ³&sup5;S, ¹&sup4;C oder Blei-, Quecksilber-, Thallium-, Technetium- oder Indium-Radioisotope (²&sup0;³Pb, ¹&sup9;&sup8;Hg, ²&sup0;¹Tl, 99mTc, ¹¹¹In)
Es ist außerdem möglich, die Antikörper mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Wenn fluoreszierend-markiertes Annexin Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, kann deren Gegenwart wegen der Fluoreszenz des Farbstoffes nachgewiesen werden. Unter den am meisten verwendeten fluoreszierend-markierten Verbindungen sind Fluorescein Isothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Die Antikörper können außerdem unter Verwendung von Fluoreszenz-ausstrahlenden Metallen, wie ¹&sup5;²Eu oder anderen der Lanthanidreihe nachweisbar markiert werden. Diese Metalle können unter Verwendung solcher metallchelatierender Gruppen, wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), an dem Antikörper befestigt werden.
Das Markieren ist außerdem durch ein paramagnetisches Kontrastmittel, das in einem MRI (Magnetischen Resonanz Abbildungs)System nachweisbar ist, möglich. Es ist möglich, Gadolinium, Kobalt, Nickel, Mangan oder Eisenkomplexe zu verwenden, durch die Konjugate als diagnostische Mittel bereitgestellt werden, die in einem MRI-System nachweisbar sind. Ein starkes magnetisches Feld wird in solchen Systemen verwendet, um die Kernspinvektoren der Atome in dem Organismus einzustellen. Anschließend wird das Feld zerstört, wodurch die Kerne zu ihrem Ausgangszustand zurückkehren. Dieser Vorgang wird beobachtet und aufgezeichnet.
Die Antikörper können außerdem nachweisbar markiert werden, indem sie an eine chemilumineszierende Verbindung gekoppelt werden. Die Gegenwart des chemilumineszierend-markierten Antikörpers wird anschließend durch Nachweisen der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt, die beim Verlauf der chemischen Reaktion entsteht. Beispiele besonders nützlicher chemilumineszierend-markierter Verbindungen sind Luminol, Isoluminol, theromatischer Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
Gleichermaßen kann eine biolumineszierende Verbindung verwendet werden, um die Antikörper zu markieren. Biolumineszenz ist eine Art von Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen festgestellt wurde, in denen ein katalytisches Protein die Wirksamkeit der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Die Gegenwart eines biolumineszierenden Proteins kann durch Nachweisen der Gegenwart von Lumineszenz bestimmt werden. Wichtige biolumineszierende Verbindungen zur Markierung sind Luciferin, Luciferase und Aequorin.
Ein anderes Verfahren, das, wenn es in Verbindung mit dieser Erfindung verwendet wird, außerdem zu einer hohen Sensitivität führt, besteht aus Koppeln des Antikörpers an niedermolekulare Haptene. Diese Haptene können anschließend durch eine Reaktion spezifisch nachgewiesen werden. Zum Beispiel werden im allgemeinen solche Haptene, wie Biotin (das mit Avidin reagiert) oder Dinitrophenyl, Pyridoxal und Fluorescamin (die mit spezifischen Anti-Hapten Antikörpern reagieren) auf diese Weise verwendet. Amplifizierungsstrategien können leicht auf diese und andere Markierungen angewendet werden.
Die nachweisbaren Antikörper eignen sich hervorragend für die Herstellung eines Kits. Ein solches Kit kann eine unterteilte Trägereinrichtung umfassen, um eine oder mehrere Behältereinrichtungen, wie Ampullen, Röhrchen und dergleichen, mit enger Begrenzung aufzunehmen, wobei diese Behältereinrichtung die getrennten Elemente des Assays umfaßt. Zum Beispiel gibt es eine Behältereinrichtung, enthaltend einen nachweisbaren Antikörper, der für alle uCANP-Isoformen spezifisch ist und außerdem zum Beispiel eine Behältereinrichtung, enthaltend Standardserienverdünnungen der 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen in Lösung. Der nachweisbare Antikörper kann nachweisbar markiert sein. Eine weitere Behältereinrichtung kann eine Einrichtung umfassen, um eine elektrophoretische Trennung der 76-kfla, 78-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen durchzuführen. Die uCANP- Standardlösungen können als Standarde zur elektrophoretischen Trennung der uCANP-Isoformen einer Gewebeprobe und zum Herstellen von Standardkurven, wobei die Konzentration der 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen auf der Abscisse und das Nachweissignal auf der Ordinate aufgetragen werden, verwendet werden. Die von dem Überstand einer Gewebeprobe, wie Gehirnzellen oder Fibroblasten, erhaltenen Ergebnisse, können von einem solchen Diagramm interpoliert werden, um die Konzentration der 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen zu erhalten und folglich einen Hinweis darüber zu ergeben, ob das Individuum die Alzheimer-Krankheit hat. Weitere Behältereinrichtungen können einen nachweisbar markierten Antikörper enthalten, der mit dem nachweisbaren Antikörper immunoreaktiv ist, der für die aktive 76-kDa und die 80-kDa uCANP-Isoform spezifisch ist.
Alternativ kann das Kit eine unterteilte Trägereinrichtung umfassen, um eine oder mehrere Behältereinrichtungen mit enger Begrenzung einzufügen, die einen ersten nachweisbaren Antikörper, der nur für die 80-kDa uCANP-Isoform spezifisch ist, und einen zweiten nachweisbaren Antikörper, der für alle uCANP-Isoformen spezifisch ist, enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform sind der erste und zweite nachweisbare Antikörper mit unterschiedlichen Markierungen markiert, die durch unterschiedliche Nachweisverfahren unterschieden werden können. Weitere Behältereinrichtungen können Standardserienverdünnungen der 76-kDa, 78-kDa und 80- kDa uCANP-Isoformen in Lösung enthalten.
Alternativ kann das Kit eine unterteilte Trägereinrichtung umfassen, um eine Behältereinrichtung mit enger Begrenzung einzufügen, die einen ersten nachweisbaren Antikörper, der nur für die 80-kDa uCANP-Isoform spezifisch ist, und einen zweiten nachweisbaren Antikörper, der für die mit den 76-kDa uCANP-Isoform spezifisch ist, enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform sind der erste und zweite nachweisbare Antikörper mit unterschiedlichen Markierungen markiert, die durch verschiedene Nachweisverfahren unterschieden werden können. Weitere Behältereinrichtungen können Standardserienverdünnungen der 76-kDa, 78-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen in Lösung enthalten.
Die Einrichtung zum Trennen/Identifizieren der uCANP- Isoformen kann Slab-Gele umfassen, die zum elektrophoretischen Trennen der uCANP-Isoformen verwendet werden können. Bevorzugt sind solche Slab-Gele wie Natriumdodecylsulfat-(SDS)-Polyacrylamidgele.
Beim Durchführen des Verfahrens zum Nachweisen der uCANP- Isoformen können die spezifischen Konzentrationen der Isoformen, die Temperatur und die Inkubationszeit sowie andere Assaybedingungen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Konzentration der uCANP- Isoformen, der Beschaffenheit der Probe und dergleichen variiert werden. Der Fachmann kann komparative und optimale Assaybedingungen durch Verwenden von Routineversuchen bestimmen.
Der Nachweis von nachweisbaren Antikörpern und folglich der uCANP-Isoformen kann mit einem Scintillationszähler, wenn zum Beispiel die nachweisbaren Antikörper mit einem radioaktiven Gamma-Emitter markiert sind oder durch ein Fluormeter, wenn die nachweisbare Markierung ein fluoreszierender Emitter ist, erreicht werden. Im Fall einer Enzymmarkierung kann der Nachweis durch colorimetrische Verfahren, die ein Substrat für das Enzym verwenden, erreicht werden. Der Nachweis kann durch Vergleich mit Standardisoformen erreicht werden.
Bei der Verwendung des ersten und zweiten Antikörper, um das relative Verhältnis der 76-kDa/80-kDa Isoformen zu bestimmen, wie hier beschrieben, können die beiden Antikörper mit verschiedenen Markierungen markiert sein, die getrennt nachgewiesen werden können. In dieser Ausführungsform kann das Verhältnis durch eine einzige Inkubation mit beiden Antikörpern erhalten werden. Die die uCANP-Isoformen enthaltende Probe kann auf einem Festphasenträger, wie Nitrozellulose oder einer Polyvinylidendifluoridmembran (Immobilon-P), immobilisiert und mit dem ersten und zweiten nachweisbar markierten Antikörper kontaktiert werden, und die Menge der gebundenen Markierung wird bestimmt. Andere Schritte, wie Waschen, Rühren, Schütteln, Filtrieren und dergleichen können zu dem Assay hinzugefügt werden, da es für eine bestimmte Situation üblich oder notwendig ist.
Wie hiernach detaillierter beschrieben, gibt es Beweise, daß die uCANP-Aktivierung zu der Entwicklung von neurofibrillärer Pathologie und β-Amyloidbildung führt, die Zeichen der Alzheimer-Krankheit sind. Folglich sind Mittel, die die uCANP-Aktivierung hemmen, bei der Behandlung oder Vorbeugung der neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit nützlich. Die Erfindung betrifft folglich außerdem ein Verfahren zum Screenen eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit, umfassend
(a) Erhalten einer ersten Tiergehirnprobe, bevorzugt einer kortikalen Gehirnscheibe,
(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der ersten Tiergehirnprobe,
(c) Inkubieren einer zweiten Tiergehirnprobe mit einer wäßrigen Ca&spplus;&spplus;-Lösung und einem Medikament, von dem angenommen wird, daß es beim Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer- Krankheit nützlich ist,
(d) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der in Schritt (c) erhaltenen Tiergehirnprobe,
wobei bestätigt wird, daß das Medikament zum Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, wenn sich das 76-kDa/80-kDA Verhältnis der Tiergehirnprobe, die mit dem Medikament kontaktiert wird, wie in Schritt (d) bestimmt, im Vergleich zu dem in Schritt (b) erhaltenen 76-kDa/80-kDA Verhältnis verringert.
Bevorzugt werden die erste und zweite Gewebeprobe prämortal von dem Gehirn eines Tiers oder postmortal von einem Individuum mit Alzheimer-Krankheit erhalten.
Alternativ betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screenen eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit, umfassend
(a) Erhalten einer ersten Fibroblastenprobe von einem Tier,
(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der ersten Fibroblastenprobe,
(c) Inkubieren einer zweiten Fibroblastenprobe mit einer wäßrigen Ca&spplus;&spplus;-Lösung, einem Calciumionophor und einem Medikament, von dem angenommen wird, daß es beim Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, (d) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der in Schritt (c) erhaltenen Fibroblastenprobe,
wobei bestätigt wird, daß das Medikament zum Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, wenn sich das 76-kDa/80-kDA Verhältnis der Fibroblastenprobe, die mit dem Medikament kontaktiert wird, wie in Schritt (d) bestimmt, im Vergleich zu dem in Schritt (b) erhaltenen 76-kDa/80-kDA Verhältnis verringert.
In Schritt (b) beider Verfahren kann die Gewebeprobe unter Erhalt eines Überstandes zunächst in einem Puffer homogenisiert und zentrifugiert werden und anschließend wird das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in dem Überstand bestimmt. Das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform kann bestimmt werden durch
(e) Trennen der uCANP-Isoformen in dem Überstand durch Gelelektrophorese,
(f) Kontaktieren der getrennten 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDA uCANP-Isoform mit mindestens einem nachweisbaren Antikörper, der mit diesen immunoreaktiv ist,
(g) Feststellen der Menge des nachweisbaren Antikörpers, der an die 76-kDa und die 80-kDA uCANP-Isoformen gebunden ist, unter Erhalt eines relativen Signals für jede Isoform, und
(h) Dividieren des relativen Signals entsprechend der 76-kDa Isoform durch das relative Signal entsprechend der 80-kDA Isoform, um das Verhältnis zu erhalten.
Alternativ kann das Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP- Isoform zu der 80-kDa Isoform bestimmt werden durch (e) Kontaktieren des Überstandes mit einem ersten und einem zweiten nachweisbaren Antikörper, wobei der erste nachweisbare Antikörper nur mit der 80-kDA uCANP-Isoform und der zweite nachweisbare Antikörper mit den 76-kDA, 78-kDA und 80-kDA uCANP-Isoformen immunoreaktiv ist,
(f) Feststellen der Menge des nachweisbaren ersten und zweiten Antikörpers, der an die jeweiligen uCANP-Isoformen gebunden ist, um ein relatives Signal zu erhalten, und
(g) Dividieren des relativen Signals entsprechend den 76- kDA, 78-kDA und 80-kDA Isoformen durch das relative Signal entsprechend der 80-kDA Isoform, um das Verhältnis zu erhalten.
Die Umwandlung der 80-kDA Isoform zu der 76-kDA Isoform ist calciumabhängig. Folglich wird in Schritt (c) die Gewebeprobe zunächst mit Calcium und dem Medikament für einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, um das 76-kDA/80-kDA Verhältnis zu ändern. Gewöhnlich werden das Medikament und Calcium mit der Gewebeprobe ungefähr 5 bis 60 Minuten kontaktiert. Die Calciumkonzentration kann von 0 bis 5 mM reichen. Die Konzentration des Medikaments kann von 0,001 bis ungefähr 1000 uM reichen. Bevorzugt wird die Gewebeprobe zuerst mit dem Medikament bei ungefähr 4ºC inkubiert und anschließend bei ungefähr 30ºC mit Calcium und dem Medikament inkubiert. Wenn Fibroblasten verwendet werden, wird ein Calciumionophor, wie A23187, in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 100 uM verwendet. Die Gewebeprobe wird anschließend unter Erhalt eines Überstandes in einem Puffer homogenisiert und zentrifugiert und dann wird das relative Verhältnis der aktiven 76-kDA uCANP-Isoform zu der 80-kDA Isoform in dem besagtem Überstand bestimmt.
Erfindungsgemäß kann ein monoklonaler Antikörper, der gegen menschliches uCANP hergestellt wurde (Samis, J. A. et al., Biochem. J. 246 : 481-488, 1987 und Elce, J. S. et al., Biochem. J. 261 : 1039-1042, 1989), verwendet werden, um durch Western-Blot-Analyse die drei Isoformen der katalytischen uCANP-Untereinheit in menschlichen Gehirnextrakten nachzuweisen. Diese Isoenzyme entfalten auf SDS- Polyacrylamidgelen Molekulargewichte von 80-kDa, 78-kDa und 76-kDa, die identisch mit denen von menschlichen Erythrozyten sind (Samis, J. A. et al., Biochem. J. 246 : 481-488, 1987 und Elce, J. S. et al., Biochem. J. 261 : 1039-1042, 1989 und Samis, J. A. et al., Biochem. J. 246 : 481-488, 1987 (Fig. 1a). Wenn menschliche Erythrozyten uCANP durch Zugabe von Calcium in vitro aktiviert wurde, war die Hydrolyse von gereinigtem Spectrin durch das Enzym von der N-terminalen Spaltung der 80-kDA Isoform an der GLY&sub2;&sub6;-LEU&sub2;&sub7;-Peptidbindung und der Bildung der 76-kDA Isoform begleitet (die 76-kDA uCANP- Isoform, die durch Autolyse hergestellt, durch SDS-PAGE getrennt und auf DF-Immobilonmembranen übertragen worden war, wurde der N-terminalen Analyse durch das Edman-Abbauverfahren an der Harvard Universität, Mikrochemie-Fakultät, Gefälligkeit von William Lane, unterworfen.) (Fig. 1B). Die Umwandlung der 80-kDA uCANP-Isoform in die 78-kDA und 76-kDA Isoformen war innerhalb von 30 Sekunden fast abgeschlossen. Die Enzymaktivität wurde in Abwesenheit der 80-kDA uCANP beibehalten und blieb mit der Menge der 76-kDA Isoform proportional, wodurch andere neuere Daten bestätigt wurden, daß die 76-kDA Isoform enzymatisch aktiv ist (Pontremoli, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 123(1):331-337, 1984, Inomata, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 138(2):638-643, 1986) (Fig. 2). Obwohl menschliche Gehirn- uCANP in zellfreien Extrakten instabil ist, konnte die Umwandlung der 80-kDA uCANP-Isoform in die 76-kDA Isoform in Scheiben der mit Calcium inkubierten menschlichen Neo-Kortex gezeigt werden (Fig. 3). Die Autolyse von uCANP wurde dadurch bestätigt, daß der Verlust des äußersten N-Terminus der 80-kDA Isoform unter Verwendung eines gegen die ersten 21 Aminosäuren des Polypeptids hergestellten monoklonalen Antikörpers gezeigt wurde (ein 34-mer synthetisches Peptid, das der äußersten N-terminalen Aminosäuresequenz von uCANP entspricht und von einer menschlichen Leber-cDNA abgeleitet wurde (Imajoh et al., Biochem. 27 : 8122, 1988), wurde unkonjugiert verwendet, um zwei Monate alte New Zealand Kaninchen, wie zuvor beschrieben, zu immunisieren (Vitto und Nixon, J. Neurochem. 47 : 1039-1051, 1986)). Die Aminosäuresequenz des 34-mer ist wie folgt [SEQ ID NR. 2]:
Antiserum, das gegen dieses 34-mer hergestellt wurde, crossreagierte spezifisch mit der 80-kDA uCANP-Isoform auf Western-Blot-Analysen von einem 30000 · g Überstandsextrakt des menschlichen Gehirns.
Zur Beurteilung des relativen Grades der uCANP-Aktivierung im Gehirn bei der Alzheimer-Krankheit wurden durch ein Immunoassay drei uCANP-Isoformen quantifiziert, indem Extrakte von Gehirngeweben von 22 Individuen, die prämortal mit Demenz diagnostiziert worden waren und die neuropathologischen Kriterien der Alzheimer-Krankheit aufwiesen, und von 17 Individuen, die keine klinisch neurologische Krankheit (Khachaturian, Z. S., Arch. Neurol: 42 : 1097-1105, 1985) und keine neuropathologische Anzeichen (Mirra, S. S. et al., Neurology 41 : 479-486, 1991) der Alzheimer-Krankheit hatten, verwendet. Die Alzheimer- und Kontrollgruppen wurden hinsichtlich des Alters des Individuums (jeweils 75,8 ± 2,0 Jahre gegenüber 68,9 ± 2,6 Jahre) und postmortalem Abstands für die Gehirnproben (jeweils 12 2 ± 1,3 Stunden gegenüber 12,0 ± 1,8 Stunden) angepaßt.
Der Gehalt von cytosolischem 80-kDA uCANP war wesentlich geringer in der Alzheimer-Gruppe, als in den Kontrollen (22,7 ± 1,5% gegenüber 37,2 ± 2, 2%, p < 0,001, ungepaarter t- Test). Im Gegensatz dazu war autolytisch aktiviertes (76 kDa) uCANP im Alzheimer-Gehirn (41,2 ± 1,6%) im Vergleich mit den Kontrollen (26,6 ± 2, 2%) (p < 0,001) fast zweifach erhöht. Die 78-kDA uCANP-Isoform war unverändert. Das Verhältnis von 76-kDA zu 80-kDA uCANP für einzelne Gehirnproben war in der Alzheimer-Gruppe fast dreifach höher (2,20 ± 0,39 gegenüber 0,81 ± 0,10). Die Summe der drei uCANP-Isoformen war unverändert (Tabelle 1).
Tabelle 1: Der uCANP-Gehalt in Gehirnbereichen von Kontrollindividuen und Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD) und Huntington-Krankheit, gemessen durch das zuvor beschriebene Immunoassay (Takeuchi, K. S. et al., J. Neurochem. 92 : 526-532, 1992). uCANP wurde teilweise durch DEAE-Zellulosechromatographie von 0,5 g Gehirnproben, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Der Gesamt-uCANP-Gehalt wurde densitometrisch nach der SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese und der Immunoblot-Analyse quantifiziert. Das uCANP-Gewicht auf dem Immunoblot wurde mit Hilfe von Standardkurven berechnet, die durch Messen der Immunofarbintensität verschiedener bekannter Mengen von menschlicher Erythrocyten-uCANP auf Immunoblots bereitgestellt wurden. Die Standard-uCANP-Mengen wurden auf jedem Immunoblot, der Gehirnproben enthielt, untersucht, um mögliche geringfügige Abweichungen in den Immunofarbverfahren zu kontrollieren. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± S. E. M. der in den Klammern gezeigten Zahlen.
Das abnormale Verhältnis der uCANP-Isoformen in der cytosolischen Fraktion konnte kein Licht auf die Veränderung in ihrer zellulären Verteilung werfen (Tabelle 2). Ungefähr 30% der Gesamt-uCANP war mit der bestimmten Fraktion sowohl in der Kontroll- als auch in der Alzheimer-Gruppe assoziiert (Tabelle 2). Der höhere Anteil der 76-kDA uCANP, der in dieser Fraktion beobachtet wurde, stimmt mit der Hypothese überein, daß uCANP hauptsächlich auf der Membran aktiviert wird (Inomata, M. et al., J. Biol. Chem. 264(31): 18838-18843, 1969, Pontremoli, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 128(1): 331-338, 1985). Interessant ist, daß die Verhältnisse der 76-kDA zu der 80-kDA Isoform in den cytosolischen Fraktionen der Kontrollgehirne bedeutend mit denen korrelierten, die bestimmten Fraktionen der Kontrollgehirne entsprachen (r = 0,839, p < 0,005), aber diese Beziehung war im Alzheimer-Gehirn gestört (r = 0,077).
Tabelle 2 Subzelluläre Verteilung der uCANP-Isoformen in der präfrontalen Kortex von Kontrollen und Alzheimer- Patienten. Homogenate des Gehirngewebes wurden 30 Minuten mit 15000 · g bei 4ºC zentrifugiert, um eine cytosolische (Überstands-)Fraktion und eine Membran (Pellet-) Fraktion zu erhalten. Der uCANP-Gehalt in diesen Fraktionen wurde durch ein Immunoassay, wie oben in der Legende von Tabelle 1 beschrieben, quantifiziert. Die Daten sind als Mittelwerte ± S. E. M. angegeben. Die Zahlen in den Klammern sind prozentuale Mittelwerte von dem Gesamten (cytosolische + Membran-Fraktion) (uCANP-Gehalt ± S. E. M., *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,005 gegenüber der cytosolischen uCANP-Isoform in Kontrollen, ****p < 0,005 gegenüber cytosolischem AD- uCANP.
Der Grad der abnormalen uCANP-Aktivierung war in Alzheimer- Gehirnen nach allen postmortalen Abständen vergleichbar. Das Verhältnis der 76-kDA zu 80-kDA Isoformen nahm gegenüber den postmortalen Abständen ab, was eine unbedeutende Korrelierung in der Kontroll- (r = 0,355), Alzheimer- (r = 0,155) oder kombinierten Gruppe (r = 0,148) (Fig. 4) ergab. Die Möglichkeit kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß die Verhältnisse der Isoform sich bedeutend in den ersten Stunden nach dem Tod ändern. Der Grad der uCANP-Aktivierung korrelierte auch nicht bedeutend mit dem Alter innerhalb des Bereiches, der für jede Gruppe untersucht wurde.
Da einige Neuronen in der Alzheimer-Neokortex degenerieren, wurde der Grad der uCANP-Aktivierung in zwei Gehirnbereichen untersucht, von denen berichtet wurde, daß neuronale Degeneration minimal oder abwesend ist (Pro, J. D. et al. Neurology 30 : 820-825 (1980), Katzmann & Terry, in The Neurobiology of Aging, Katzmann & Terry Hrsg., F. A. Davis Co., New York, S. 51-84, 1983). Das Verhältnis der Verhältnis der 76-kDA zu der 80-kDA Isoform war bedeutend erhöht, sowohl im Putamen (46%, p < 0,005) als auch im Cerebellum (58%, p < 0,005) bei den Alzheimer-Fällen (Fig. 5b, c). Im Gegensatz dazu waren die Anteile der uCANP- Isoformen in der präfrontalen Kortex und dem Cerebellum von Patienten mit Huntington-Krankheit im Stadium 3 normal (Fig. 5 A und C). Übereinstimmend mit dem Nachweis, daß fortlaufende neuronale Degeneration mit der CANP-Aktivierung in Verbindung steht (Dure, L. S. et al., Ann. Neurol. 30 : 785 - 793, 1991), war die uCANP-Aktivierung 50% (p < 0,05) in Putamen-Proben von Huntington-Patienten (HD) erhöht (Vonsattel, J.-P. et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 44 : 559-577, 1985, Roos, R. A. C. et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 48 : 422-425, 1985), bei denen der neuronale Zellverlust beträchtlich ist (Fig. 5 B).
Die im Huntington-Putamen beobachtete, mäßig erhöhte uCANP- Aktivierung kann möglicherweise durch den Calciumzufluß erklärt werden, der entweder mit in diesem Bereich auftretendem Zelltod im Endstadium oder der NMDA- Rezeptorstimulierung, von der angenommen wird, daß sie ein grundlegender Mechanismus des neuronalen Zelltods bei der Huntington-Krankheit (Dure, L. S. et al., Ann. Neurol. 30 : 785- 793, 1991) ist, assoziiert ist. Der wesentlich höhere Anteil der uCANP-Aktivierung in der Alzheimer-Neokortex und der ähnlichen Abnormalitäten in Gehirnbereichen, die minimale neuronale Degeneration entfalten, weisen darauf hin, daß uCANP-Aktivierung nicht nur eine Konsequenz der neuronalen Degeneration im Endstadium ist, sondern eine weitläufigere metabolische Veränderung reflektiert, die der neuronalen Degeneration vorhergeht und möglicherweise dazu beiträgt. In dieser Hinsicht ist der extensive Verlust von Synapsen in der Neokortex, die mit der Demenz korreliert (Terry et al., Ann. Neurol. 30 : 572-580, 1991, Hamos et al., Ann. Neurol. 39 : 355, 1991, Dekosky & Scheff, Ann. Neurol. 27 : 457-464, 1990), relevant, da uCANP an den Synapsen angereichert ist (Peterson, C. et al., Neurosci. Lett. 121 : 239-243, 1991) und die CANP-Aktivierung an den Nervenenden mit der terminalen Degeneration assoziiert ist (Swanson & Vrbóva, Devel. Brain Res. 33 : 199-203, 1987, O'Brien, R. A. D. et al., Neuroscience 12 : 637-646, 1984).
Weitverbreitete uCANP-Aktivierung im Gehirn stimmt mit dem Nachweis überein, daß in Fibroblasten von Alzheimer-Patienten der Spektrinabbau erhöht ist (Peterson, C. et al., Neurosci. Lett. 121: 239-243, 1991) während der Proteinkinase C-Gehalt verringert ist (Saitoh, T. et al., Lab. Invest. 64 : 596-616, 1991), wobei beide bevorzugte Substrate von CANP sind. Der Spektrinabbau im Gehirn ist außerdem in der Kortex und dem Hippocampus des Alzheimer-Gehirns erhöht (Masliah, E. et al., Brain Res. 531 : 36-44, 1990). Frühere Berichte, daß die CANP- Gesamtaktivität im Alzheimer-Gehirn nicht bedeutend anders ist (Kawashima, S. et al., Biomed. Res. 10(1):17-23, 1989, Mantle & Perry, J. Neurol. Sci. 102 : 220-224, 1991, Nilsson, E. et al., Neurobiol. Aging 11 : 425-431, 1990), stimmt mit unseren Ergebnissen überein und deutet darauf hin, daß Messungen des Gesamt-CANP-Pools die funktionelle Aktivität des CANP-Systems nicht sensitiv reflektieren.
Abgesehen von dem Beitrag in Bezug auf den synaptischen Verlust und Zelltod kann die abnormale uCANP-Aktivierung zu weiteren Konsequenzen in Neuronen führen, die auf die Entwicklung der neurofibrillären Pathologie und β-Amyloid- Bildung einwirken. Diese umfassen die abnormale Weiterverarbeitung von Cytoskelettproteinen und anderen sensitiven CANP-Substraten, einschließlich das Amyloid- Vorläuferprotein (APP) (Siman, R. in Neurotoxicity of Excitatory Amino Acids, A. Guidotti, Hrsg., Raven Press, New York, S. 145-161, 1990, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7233-7347, 1991) und die Änderung der Aktivitäten von Calcium-abhängigen Protein-Kinasen und Phosphatasen (Togari, A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 134(2):749-754, 1968, Kishimoto, A. et al., J. Biol. Chem. 258 : 1156-1164, 1983, Tallant, E. A. et al., Biochem. 27 : 2205-2211, 1988, Nixon, R. A., Ann. N. Y. Acad. Sci. 568 : 198-208, 1989), die außerdem die APP-Weiterverarbeitung oder Absonderung beeinflussen können. In dieser Hinsicht wurden verringerte Gehalte von löslichen (abgesonderten) Formen von APP in der cerebrospinalen Flüssigkeit der Alzheimer-Patienten festgestellt. In Vorversuchen entfaltete der Grad der uCANP- Aktivierung in der Neokortex der Alzheimer-Patienten eine hoch signifikante entgegengesetzte Korrelierung mit dem Gehalt von löslichem APP im menschlichen Gehirn. Diese Ergebnisse sind mit der Hypothese vereinbar, daß β-Amyloid oder APP-Fragmente eine primäre Rolle in der Alzheimerbetreffenden Neurodegeneration haben. Die Toxizität von β- Amyloid oder APP-Fragmenten kann zum Teil durch Veränderungen in der Calciumhämostase vermittelt werden, wobei angenommen wird, daß dies zu einer CANP-Aktivierung führt.
In vivo wirksame pharmakologische Modulation des CANP-Systems zur Beschränkung der neuralen Schädigung in Ischemie und Vasospasmus (Siman, R. in Neurotoxicity of Excitatory Amino Acids, A. Guidotti, Hrsg., Raven Press, New York, S. 145-161, 1990, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 7233-7347, 1991, Minami, N. et al., J. Neurosurg. 76 : 111-118, 1992) verdient weitere Überlegungen als potentielle therapeutische Strategie bei der Alzheimer-Krankheit.

Beispiele

Beispiel 1 Immunoblot-Analyse in der präfrontalen Kortex

Fig. 1(A) stellt die Immunoblot-Analyse von uCANP in der präfrontalen Kortex von zwei Kontrollen (CONT) und zwei Alzheimer-(AD)-Patienten dar. Die präfrontale Kortex (0,5 g) von den Kontrollen oder AD-Patienten wurde mit 10 Vol. 20 mM Tris HCl, pH 7,4, enthaltend 2 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM Benzamidin, 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 0,32 M Sucrose (Puffer A) homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 15.000 · g 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert, und der Überstand wurde auf eine mit Puffer A äquilibrierte DEAE-Cellulose(DE-52, Whatman®) (1,0 · 15 cm) Säule aufgetragen. Die extensiv mit Puffer A gewaschene Säule wurde in schrittweisen KCl- Abständen von 0-3 mM eluiert. uCANP wurde von der Säule durch 0,15 M KCl in Puffer A eluiert. Diese Fraktionen wurden 7,5% SDS-PAGE, gemäß dem Verfahren von Laemmli, Nature 227: 680-685, 1970 unterworfen. Elektroblottieren wurde gemäß Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354, 1979 in einem Transferpuffer, enthaltend 15% Methanol, 25 mM Tris und 192 mM Glyzin, pH 8,3 durchgeführt. Die Proteine wurden elektrophoretisch durch Auftragen bei einem konstanten Strom von 0,5 A 2,5 Stunden bei 4ºC auf eine PVDF-Membrane (Immobilon-P, Millipore®) übertragen. Die Blots wurden mit 5% fettfreier Trockenmilchlösung, enthaltend 2 mM EGTA, 0,15 mM NaCl in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 (Blockierungspuffer) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Immunoblot-Analyse wurde mit einem monoklonalen anti-uCANP-Antikörper vom Kaninchen unter Verwendung von peroxidasekonjugiertem Antikaninchen- Immunoglobulin G von der Ziege 50 Stunden bei 4ºC durchgeführt. Die Blots wurden mehrmals mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl gewaschen und die Peroxidaseaktivität wurde mit H&sub2;O2, 4-Chlor-1-naphthol und N,N'-Dimethyl-pphenyldiamin sichtbar gemacht. Fig. 1 (A) zeigt uCANP in der präfrontalen Kortex von zwei beispielhaften Kontrollgehirnen (Bahnen 1 und 2) und zwei AD-Gehirnen (Bahnen 3 und 4).

Beispiel 2 Immunoblot-Analyse des uCANP-Autolyseproduktes

Fig. 1(B) stellt die Immunoblot-Analyse des uCANP- Autolyseproduktes von menschlichen Erythrozyten in vitro dar. Menschliche Erythrozyten uCANP wurde von dem normalen Blut von Erwachsenen wie zuvor beschrieben gereinigt (Inomata, M. et al., J. Biochem. 93 : 291-294 (1983); Fairbanks, G. et al., Biochemistry 10(13):2606, 1971) (Bahn 1), mit 5,3 mM CaCl&sub2; (freie Calcium Endkonzentration betrug 50 uM) und 2,2 ug menschlichem Erythrozytenspektrin (Bennet, V. et al., Nature 299 : 126, 1982) 30 s bei 30ºC in Gegenwart von entweder 1 mM Leupeptin (Bahn 2), 10 uM Leupeptin (Bahn 3) oder 100 uM Leupeptin (Bahn 4) inkubiert oder mit 5,3 mM CaCl&sub2; und 2,2 ug Spectrin 30 s bei 30ºC inkubiert (Bahn 5).
Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Enzymaktivität und dem uCANP-Gehalt. Nach der Präinkubierung von menschlicher Erythrozyten uCANP mit Calcium und Spektrin wurde zum Stoppen der Reaktion 1 mM EGTA zugegeben. Die Hälfte jeder Probe wurde auf SDS/PAGE aufgetragen, und die Immunoreaktivität jeder uCANP-Isoform wurde unter Verwendung eines Bio-Rad Video Densitometers Modell 620 quantifiziert. Die andere Hälfte wurde verwendet, um wie zuvor beschrieben die Enzymaktivität zu messen, (Takeuchi, K. S. et al., J. Neurochem. 92 : 526-532, 1992) durch Zugabe von [¹&sup4;C]Azocacein als Substrat und 4 mM CaCl&sub2; (freie Calcium-Endkonzentration betrug 125 uM). Es ist zu bemerken, daß die 78-kDa Isoform nach einer einminütigen Inkubierung vollständig verschwand.
O: Proteaseaktivität, : uCANP 76-kDa Gehalt.
Fig. 3 zeigt die uCANP-Autolyse in menschlichen Gehirnscheiben. Abschnitte des frischen postmortalen menschlichen Gehirns (präfrontale Kortex) (200 uM) wurden bei 37ºC 60 Minuten mit Puffer A mit oder ohne CaCl&sub2; (Endkonzentration 5 mM) inkubiert. Die Scheiben wurden anschließend mit Puffer A abgewaschen (1 ml · 2), homogenisiert und bei 15000 · g 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde wie zuvor beschrieben der Immunoblot-Analyse unterworfen. Menschliche Erythrozyten uCANP (Bahn 1), menschliche Gehirn uCANP von nichtinkubierten Scheiben (Bahn 2) oder Scheiben, die in Abwesenheit von exogenem Calcium inkubiert wurden (Bahn 3), 5 mM CaCl&sub2; (Bahn 4) oder mit 5 mM CaCl&sub2; plus 10 uM Leupeptin (Bahn 5).

Beispiel 3 Vergleich von Kontroll- mit Alzheimererkrankten Gehirnen

Fig. 4 bildet eine graphische Darstellung ab, die das Verhältnis der 76-kDa/80-kDa uCANP-Isoformen in der präfrontalen Kortex von Kontroll-Individuen (O) und AD- Patienten ( ) aufgetragen gegen den postmortalen Abstand (PMI) zeigt. Das Immunoassay der einzelnen Isoformen (Fig. 1) wurde wie in der Legende von Tabelle 1 beschrieben, durchgeführt.

Beispiel 4

Fig. 5 stellt das uCANP-Verhältnis (76-kDa/80-kDa) in Gehirnbereichen von Kontroll-, Alzheimer- und Huntington- (HD)-erkrankten Gehirnen dar, das durch das Western-Blot- Immunoassay, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemessen wurde. (A) Präfrontale Kortex: Die Mittelwerte ± S. E. M. für PMI und Alter von HD-(n = 12), Kontroll- (n = 17), AD-Fällen (n = 22) waren 10,5 ± 1,9 Std. und 54,6 ± 3, 3 Jahre. ***p < 0,005. (B) Putamen: Die Mittelwerte ± S. E. M. für PMI und Alter waren 10,6 ± 2,9 Std. und 68,5 ± 1,9 Jahre, 14,8 ± 1,4 Std. und 71,8 ± 2, 3 Jahre, oder 14,1 ± 2,0 Std. und 60,1 ± 2,6 Jahre in Kontrollen (n = 8), AD (n = 21) oder HD (n = 14) -Patienten. *p < 0,05, ***p < 0,05. (C) Cerebellum: Der Mittelwert ± S. E. M. für PMI und Alter waren jeweils 7,6 ± 1,6 Std. und 67,8 ± 4,2 Jahre, 13,1 ± 1,7 Std. und 76,0 ± 1,9 Jahre oder 10,6 ± 2,1 Std. und 54,6 ± 3,1 Jahre in Kontrollen (n = 14), AD (n = 21) oder HD (n = 16) -Patienten. ***p < 0,005.

Beispiel 5 Abnormalitäten in der Calpainregulierung bei der Alzheimer-Krankheit - - Fibroblastenuntersuchung

Verfahren

Experimente, die Fibroblasten von FAD Kohorten verwenden, wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Jesse Sisken (University of Kentucky Medical School), der Fibroblastenproben von Kontroll-(C) und AD-betroffenen Individuen bereitstellte, durchgeführt. Stocks wurden in DMEM (Gibco), das mit 15% FBS (Sigma) ergänzt worden war, gehalten. Die Zellen wurden auf Corning 100-mm Kulturplatten in mit 17% FBS (Gibco) ergänztem DMEM (Gibco) aufgesetzt. Nach ein bis zwei Tagen wurden die Kulturen als "subkonfluierend" angesehen und geerntet. Die Zellen wurden vorsichtig von der Oberflächen mit einem sterilen Gummipolizisten abgetragen, die Zellen wurden anschließend in ein Zentrifugenröhrchen übertragen, zentrifugiert, und das Zellpellet wurde in einem Medium mit SDS suspendiert, in einen Kryobecher übertragen, wieder zentrifugiert und tiefgefroren. Alternativ wurden die Zellen durch Zugabe von 0,05% Trypsin-EDTA, wobei das Medium mit FBS neutralisiert ist, geerntet. Das Immunoassay der einzelnen Isoformen wurde, wie in der Legende von Tabelle 1 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 (Felder A und B) abgebildet.

Ergebnisse

In Zusammenarbeit mit Dr. Jesse Sisken (University of Kentucky Medical School) wurden Studien des Calpainsystems mit kultivierten Fibroblasten von Individuen einer großen bekannten Alzheimer-Krankheit-Kohorte begonnen, in denen die Alzheimer-Krankheit früh zum Ausdruck kommt, und in denen der Gendefekt auf dem Chromosom 21 lokalisiert worden ist (aber der nicht der APP Locus ist)(Nee et al., Arch. Neurol. 40 : 203-208 (1984); Tanzi et al., Science 235 : 880-884, 1987, Tanzi et al., Nature 329 : 156-157, 1987, Tanzi et al., Nature 331 : 528-530, 1988). Bis heute haben Studien mit 7 Kontrollen und 6 phenotypisch-betroffenen Individuen (2 Experimente sind in Fig. 6 gezeigt) ein abnormal hohes Verhältnis der aktivierten uCalpain Isoform (76-kDa) zu der latenten (80- kDa) uCalpain Isoform in den AD-Fällen gezeigt (p < 0,02, gepaarter t-Test). Der Nachweis des gleichen Typs von uCalpain-Abnormalität in Fibroblasten, wie es in postmortalem menschlichem Gehirn beobachtet wurde, unterstützt die Ansicht, daß diese Abnormalität in AD weitverbreitet ist und nicht allein mit dem Zelltodphänomen im Endstadium in Verbindung steht. Folglich sind Fibroblastenzellen nützliche Modelle zum Untersuchen der Calpainsystemaktivierung in Bezug auf die stromabwärts gelegenen Wirkungen auf Kinasen, APP- Stoffwechsel und andere AD-verwandte Verfahren.

Claims

1. Verfahren zur Feststellung der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, umfassend

(a) Erhalten einer Gewebeprobe von einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer- Krankheit hat, und

(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDA Isoform in der Gewebeprobe, wobei ein erhöhtes 76-kDa/80-kDA Verhältnis im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Individuen, die nicht die Alzheimer-Krankheit haben, bestätigt, daß das Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, die Alzheimer- Krankheit hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Gewebeprobe von dem Gehirn des Individuums erhalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Gewebeprobe von der Stirnlappenkortex des Individuums erhalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Gewebeprobe eine von dem Individuum erhaltene Fibroblasten-Gewebeprobe ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin in Schritt (b) die Gewebeprobe zunächst unter Erhalt eines Überstandes in einem Puffer homogenisiert und zentrifugiert wird und anschließend das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDA Isoform in dem Überstand bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDA Isoform bestimmt wird durch

(c) Trennen der uCANP-Isoformen durch Gelelektrophorese,

(d) Kontaktieren der getrennten 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDA uCANP-Isoform mit mindestens einem nachweisbaren Antikörper, der mit diesen immunoreaktiv ist,

(e) Feststellen der Menge des nachweisbaren an die 76- kDa und die 80-kDA uCANP-Isoformen gebundenen Antikörpers, um ein relatives Signal für jede Isoform zu erhalten, und

(e) Dividieren des relativen Signals entsprechend der 76-kDa Isoform durch das relative Signal entsprechend der 80-kDA Isoform, um das Verhältnis zu erhalten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der nachweisbare Antikörper feststellbar markiert wird, und die Menge des nachweisbar markierten Antikörpers durch Feststellen der Markierung bestimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin der nachweisbare Antikörper durch Kontaktieren des nachweisbaren Antikörpers mit einem zweiten nachweisbar markierten Antikörper, der mit diesem nachweisbaren Antikörper immunoreaktiv ist, festgestellt wird.

9. Verfahren zur Feststellung der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, umfassend

(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu den Gesamtmengen der 76- kDA, 78-kDA und 80-kDA Isoformen, wobei ein erhöhtes Verhältnis von 76-kDa/76-kDa + 78-kDa + 80-kDA im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Individuen, die nicht die Alzheimer- Krankheit haben, bestätigt, daß das Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, die Alzheimer-Krankheit hat.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Gewebeprobe von dem Gehirn des Individuums erhalten wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Gewebeprobe von der Stirnlappenkortex des Individuums erhalten wird.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Gewebeprobe eine von dem Individuum erhaltene Fibroblasten-Gewebeprobe ist.

13. Verfahren nach Anspruch 9, worin in Schritt (b) die Gewebeprobe zunächst unter Erhalt eines Überstandes in einem Puffer homogenisiert und zentrifugiert wird und anschließend das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu den 76-kDA, 78-kDA und 80-kDA Isoformen in dem Überstand bestimmt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das relative Verhältnis der aktiven 76-kDA uCANP-Isoform zu den 76- kDA, 78-kDA und 80-kDA Isoformen bestimmt wird durch

(c) Kontaktieren des Überstandes mit einem ersten und einem zweiten nachweisbar markierten Antikörper, wobei der erste nachweisbare Antikörper nur mit der 80-kDA uCANP-Isoform und der zweite nachweisbare Antikörper mit den 76-kDA, 78-kDA und 80-kDA uCANP- Isoformen immunoreaktiv ist,

(d) Feststellen der Menge des nachweisbaren ersten und zweiten Antikörpers, der an die jeweiligen uCANP- Isoformen bindet, um ein relatives Signal zu erhalten, und

(e) Dividieren des relativen Signals entsprechend den 76-kDA, 78-kDA und 80-kDA Isoformen durch das relative Signal entsprechend der 80-kDA Isoform, um das Verhältnis zu erhalten.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin der erste und zweite nachweisbare Antikörper feststellbar markiert werden, und die Menge der nachweisbar markierten Antikörper durch Feststellen der jeweiligen Markierungen bestimmt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14, worin der erste und zweite nachweisbare Antikörper festgestellt werden durch Kontaktieren derselben mit mindestens einem nachweisbar markierten Antikörper, der mit dem ersten und zweiten nachweisbaren Antikörper immunoreaktiv ist, und Feststellen der Markierung,.

17. Kit, das zur Feststellung der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, nützlich ist, umfassend eine Trägereinrichtung, die einen oder mehrere Behältereinrichtungen mit enger Begrenzung hat, worin der erste Behälter einen nachweisbaren Antikörper enthält, der mit der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDa uCANP-Isoform immunoreaktiv ist.

18. Kit nach Anspruch 17, worin der nachweisbare Antikörper feststellbar markiert ist.

19. Kit nach Anspruch 17, außerdem umfassend einen zweiten Behälter, der einen nachweisbaren Antikörper enthält, der mit dem nachweisbaren Antikörper immunoreaktiv ist, der mit der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDa uCANP-Isoform immunoreaktiv ist.

20. Kit nach Anspruch 17, außerdem umfassend einen dritten Behälter, der ein Mittel zum Trennen der 76-kDa uCANP- Isoform und der 80-kDa uCANP-Isoform enthält.

21. Kit, das zur Feststellung der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, nützlich ist, umfassend eine Trägereinrichtung, die zwei oder mehrere Behältereinrichtungen mit enger Begrenzung hat, worin der erste Behälter einen ersten nachweisbaren Antikörper enthält, der mit der 80-kDa uCANP-Isoform und nicht mit den 76-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen immunoreaktiv ist, und ein zweiter Behälter einen zweiten nachweisbaren Antikörper enthält, der mit den 76-kDa, 78-kDa und 80- kDa uCANP-Isoformen immunoreaktiv ist.

22. Kit nach Anspruch 21, worin der erste und zweite nachweisbare Antikörper mit verschiedenen Markierungen, die beim Nachweis unterschieden werden können, nachweisbar markiert sind.

23. Kit, das zur Feststellung der Alzheimer-Krankheit in einem Individuum, von dem angenommen wird, daß es die Alzheimer-Krankheit hat, nützlich ist, umfassend eine unterteilte Trägereinrichtung, die mit enger Begrenzung eine Behältereinrichtung enthält, die einen ersten nachweisbaren Antikörper, der nur für die 80-kDa uCANP- Isoform spezifisch ist und einen zweiten nachweisbaren Antikörper, der nur für die 76-kDa uCANP-Isoform spezifisch ist, enthält.

24. Kit nach Anspruch 23, worin der erste und zweite nachweisbare Antikörper mit verschiedenen Markierungen, die beim Nachweis unterschieden werden können, nachweisbar markiert sind.

25. Kit nach Anspruch 23, außerdem umfassend einen Behälter, der Standard-Serienverdünnungen der 76-kDa und 80-kDa uCANP-Isoformen in Lösung enthält.

26. Verfahren zum Screenen eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer- Krankheit, umfassend

(a) Erhalten einer ersten Tierhirnprobe,

(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der ersten Tierhirnprobe,

(c) Inkubieren einer zweiten Tierhirnprobe mit einer wäßrigen Lösung aus Ca++ und einem Medikament, von dem angenommen wird, daß es beim Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist;

(d) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der in Schritt (c) erhaltenen Gewebeprobe,

wobei bestätigt wird, daß das Medikament zum Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, wenn sich das 76-kDa/80-kDA Verhältnis der Tierhirnprobe, die mit dem Medikament kontaktiert wird, wie in Schritt (d) bestimmt, im Vergleich zu dem in Schritt (b) erhaltenen 76-kDa/80-kDA Verhältnis verringert.

27. Verfahren nach 26, worin die erste und zweite Hirnprobe Corticohirnscheiben sind, die post-mortem von dem Tierhirn unmittelbar erhalten werden.

28. Verfahren nach 26, worin die erste und zweite Hirnprobe Corticohirnscheiben sind, die von einem Individuum mit Alzheimer-Krankheit post-mortem erhalten werden.

29. Verfahren nach Anspruch 26, worin in Schritt (b) die Hirnprobe zunächst unter Erhalt eines Überstandes in einem Puffer homogenisiert und zentrifugiert wird und anschließend das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in dem Überstand bestimmt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, worin das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80- kDa Isoform bestimmt wird durch

(e) Trennen der uCANP-Isoformen in dem Überstand durch Gelelektrophorese,

(f) Kontaktieren der getrennten 76-kDa uCANP-Isoform und der 80-kDA uCANP-Isoform mit mindestens einem nachweisbaren Antikörper, der mit diesen immunoreaktiv ist,

(g) Feststellen der Menge des nachweisbaren Antikörpers, der an die 76-kDa und die 80-kDA uCANP-Isoformen gebunden ist, um ein relatives Signal für jede Isoform zu erhalten, und

(h) Dividieren des relativen Signals entsprechend der 76-kDa Isoform durch das relative Signal entsprechend der 80-kDA Isoform, um das Verhältnis zu erhalten.

31. Verfahren nach Anspruch 30, worin der nachweisbare Antikörper feststellbar markiert wird, und die Menge des nachweisbaren Antikörpers in Schritt (g) durch Feststellen der Markierung bestimmt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 30, worin der nachweisbare Antikörper in Schritt (g) festgestellt wird durch Kontaktieren des nachweisbaren Antikörpers mit einem zweiten nachweisbar markierten Antikörper, der mit dem nachweisbaren Antikörper immunoreaktiv ist, und Feststellen der Markierung.

33. Verfahren nach Anspruch 29, worin das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80- kDa Isoform bestimmt wird durch

(e) Kontaktieren des Überstandes mit einem ersten und einem zweiten nachweisbar markierten Antikörper, wobei der erste nachweisbare Antikörper nur mit der 80-kDA uCANP-Isoform und der zweite nachweisbare Antikörper mit den 76-kDA, 78-kDA und 80-kDA uCANP- Isoformen immunoreaktiv ist,

(f) Feststellen der Menge des nachweisbaren ersten und zweiten Antikörpers, der an die jeweiligen uCANP- Isoformen bindet, um ein relatives Signal zu erhalten, und

(g) Dividieren des relativen Signals entsprechend den 76-kDA, 78-kDA und 80-kDA Isoformen durch das relative Signal entsprechend der 80-kDA Isoform, um das Verhältnis zu erhalten.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin der nachweisbare Antikörper feststellbar markiert wird, und die Menge des nachweisbaren Antikörper in Schritt (f) durch Feststellen der Markierung bestimmt wird.

35. Verfahren nach Anspruch 33, worin der erste und zweite nachweisbare Antikörper mit zwei verschiedenen Markierungen feststellbar markiert werden.

36. Verfahren zum Screenen eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer- Krankheit, umfassend

(a) Erhalten einer ersten Fibroblastenprobe von einem Tier,

(b) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der ersten Fibroblastenprobe,

(c) Inkubieren einer zweiten Fibroblastenprobe mit einer wäßrigen Lösung aus Ca++, einem

Calciumionophor und einem Medikament, von dem angenommen wird, daß es beim Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist;

(d) Bestimmen des relativen Verhältnisses der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80-kDa Isoform in der in Schritt (c) erhaltenen Fibroblastenprobe,

wobei bestätigt wird, daß das Medikament zum Behandeln oder Vorbeugen der Alzheimer-Krankheit nützlich ist, wenn sich das 76-kDa/80-kDA Verhältnis der Fibroblastenprobe, die mit dem Medikament kontaktiert wird, wie in Schritt (d) bestimmt, im Vergleich zu dem in Schritt (b) erhaltenen 76-kDa/80-kDA Verhältnis verringert.

37. Verfahren nach Anspruch 36, worin in Schritt (b) die Fibroblastenprobe zunächst unter Erhalt eines Überstandes in einem Puffer homogenisiert und zentrifugiert wird und anschließend das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80- kDa Isoform in dem Überstand bestimmt wird.

38. Verfahren nach Anspruch 37, worin das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80- kDa Isoform bestimmt wird durch

(e) Trennen der uCANP-Isoformen in dem Überstand durch Gelelektrophorese,

(g) Feststellen der Menge des nachweisbaren Antikörpers, der an die 76-kDa und 80-kDA uCANP- Isoformen gebunden ist, unter Erhalt eines relativen Signals für jede Isoform, und

39. Verfahren nach Anspruch 38, worin der nachweisbare Antikörper feststellbar markiert ist, und die Menge des nachweisbar markierten Antikörpers in Schritt (g) durch Feststellen der Markierung bestimmt wird.

40. Verfahren nach Anspruch 38, worin der nachweisbare Antikörper in Schritt (g) festgestellt wird durch Kontaktieren des nachweisbaren Antikörpers mit einem zweiten nachweisbar markierten Antikörper, der mit dem nachweisbaren Antikörper immunoreaktiv ist, und Feststellen der Markierung.

41. Verfahren nach Anspruch 37, worin das relative Verhältnis der aktiven 76-kDa uCANP-Isoform zu der 80- kDa Isoform bestimmt wird durch

(e) Kontaktieren des Überstandes mit einem ersten und einem zweiten nachweisbaren Antikörper, wobei der erste nachweisbare Antikörper nur mit der 80-kDA uCANP-Isoform und der zweite nachweisbare Antikörper mit den 76-kDA, 78-kDA und 80-kDA uCANP- Isoformen immunoreaktiv ist,

(f) Feststellen der Menge des nachweisbaren ersten und zweiten Antikörpers, der an die jeweiligen uCANP- Isoformen gebunden ist, um ein relatives Signal zu erhalten, und

42. Verfahren nach Anspruch 41, worin der nachweisbare Antikörper feststellbar markiert wird, und die Menge des nachweisbar markierten Antikörpers in Schritt (f) durch Feststellen der Markierung bestimmt wird.

43. Verfahren nach Anspruch 41, worin der erste und zweite nachweisbare Antikörper mit zwei verschiedenen Markierungen feststellbar markiert werden.