DE69737754T2 - Substanzen für die präsymptomatische erkennung und zielgerichtete therapie der alzheimer-krankheit beim menschen. - Google Patents

Substanzen für die präsymptomatische erkennung und zielgerichtete therapie der alzheimer-krankheit beim menschen. Download PDF

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG:
  • Die Erfindung bezieht sich auf hochspezifische Marker für diagnostische Zwecke, welche zudem hochspezifische Ziele für therapeutische Reagenzien sind, die zur Erkennung, der Prävention und der Behandlung der Alzheimer Krankheit verwendet werden können. Im Speziellen bezieht sich die Erfindung auf zwei einzigartige Proteine, die auf Chromosom 21 kodiert werden und sich innerhalb des Locus befinden, der von dem human ATP Gen besetzt wird; im Weiteren auf Analoge und Derivate dieser Moleküle, sowie auf Nukleinsäuremoleküle, die solche Moleküle kodieren oder deren Expression beeinflussen. Die Erfindung bezieht sich zudem auf therapeutische Methoden, die diese Moleküle involvieren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
  • Die Alzheimer Krankheit ("AD") ist eine progressive Krankheit des menschlichen zentralen Nervensystems. Sie manifestiert sich durch Demenz bei älteren Menschen, durch Desorientierung, Gedächtnisverlust, Schwierigkeiten bei Sprache, Kalkulation oder räumlichvisuellen Fähigkeiten sowie durch psychiatrische Veränderungen. Sie ist assoziiert mit degenerierenden Neuronen in verschiedenen Regionen des Gehirns. Alle von AD betroffenen Menschen entwickeln eine gewichtige Anzahl von β-amyloiden Plaques und neurofibrilären Fasern, die aus hochphosphorylierten Formen des Mikrotubulin-assoziierten tau Proteins bestehen; die Alzheimer Krankheit wird zusammenfassend beschrieben bei Price, D.L. et al. (Clin.Neuropharm. 14:S9–S14 (1991)); Pollwein, P. et al. (Nucl. Acids Res. 20:63–68 (1992)); Regland, B. et al. (Med. Hypoth. 38:11–19 (1992)) and Johnson, S.A. (In: Review of Biological Research in Aging, Vol. 4, Rothstein, M. (Ed.), Wiley-Liss, NY, 163–170 (1990)).
  • In postmortem Gehirngewebe ist die Gegenwart von zwei Proteinen, nämlich des hyperphosphorylierten tau (PHF tau) und des β-amyloid (Aß), ein pathologisches Kennzeichen für alle Formen der Alzheimer Krankheit (AD) und gibt einigen Aufschluß auf die biologischen Vorgänge, die sich im Laufe der Krankheit abspielen. Normales tau ist ein Zytoskelettprotein, das als mikrotubulärer "Klebstoff" in Neuronen fungiert, und β-Amyloid ist ein im allgemeinen neurotoxisches Polypeptidfragment, von dem man annimmt, dass es aus dem weitverbreiteten APP Transmembranprotein herausgeschnitten wird. PHF tau findet sich in der CSF bei allen AD Patienten und Aβ ist vorhanden in der CSF sowie in den Plättchen im Blut von Menschen mit AD. Ein weiterer signifikanter Hinweis auf die physiologischen Prozesse, die zur Äthiologie von AD beitragen, ist die Gegenwart von zahlreichen Entzündungs-Proteinen in für Alzheimer charakteristischen Läsionen.
  • Gene, die für AD prädisponieren.
  • Vier Gene und ein Protein, nämlich das ATP Gen auf Chromosom 21 (St. George Hyslop, P. et al. Science 235:885–890 (1987); Goate, A.M. et al. Nature 349:704–706 (1991)); das S182 Gen auf Chromosom 14 (Sherrington, R. et al. Nature 375:754–760 (1995)); das STM 2 Gen auf Chromosom 1 (Levy-Lahad, E. et al. Science 269:973–977 (1995)) und das ApoE 4 Gen auf Chromosom 19 (Saunders, A.M. et al. Neurology 43:1467–1472 (1993)) sind definitiv in die Äthiologie der Krankheit impliziert worden. Das Neuronen-spezifische Zytoskelettprotein 'tau', das in die Spinalflüssigkeit sekretiert wird, findet man bei der AD in seiner hochphosphorylierten Form, und diese Form des Proteins kann kommt es in der Spinalflüssigkeit von AD Patienten in Mengen vor, die dem Stadium der Krankheit entsprichen. Obgleich die Funktion von tau bei der Initiierung der AD Krankheit nicht offensichtlich ist, können zum Verhalten anderer mikrotubulärer Proteine in den Epithelzellen, die auf die Transduktion von Membranrezeptoren durch ungewöhnliche Liganden reagieren, Parallelen gezogen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von enteropathogenem E.coli (EPEC) innerhalb der Membran von Epithelzellen in einem Rearrangement des Zytoskeletts resultiert sowie in der Hyperphosphorylierung von drei Zytoskelettproteinen, welche an eine Stelle unterhalb der Membran-Ligandinteraktion wandern. Diese abnorm phosphorylierten Proteine formen starre Aggregate (Rosenhine Llan, EMBO J. 11:3551–3560 (1992)), die an die Aggregate (NTFs) erinnern, welche im AD Gehirn von tau gebildet werden.
  • Mutationen (mehrere) im APP Gen verteilen sich bei einigen Familien zusammen mit einer autosomalen dominanten frühen Form von AD (Goate, A.M. et al. Nature 349:704–706 (1991); Selko, D. Scientific American 265:40–47 (1991); Hardy, J. et al. WIPO WO 92/13069 (1992)); Mutationen in S182 verteilen sich mit familiärer AD (FAD) (St.George-Hyslop, P. et al. Nature Genet. 2:330–334 (1992); Sherrington, R. et al. Nature 375:754–760 (1995)); eine Mutation in STM2 segregiert mit einer seltenen autosomalen Form von AD (Levy-Lahad, E. et al. Science 269:973–977 (1995)); und die Vererbung des ApoE4 Allels scheint ein Empfänglichkeitsfaktor bei allen oben erwähnten Formen von AD zu sein (Corder, H.L. et al. Science 261:921–924 (1993)), wohingegen Vererbung des ApoE2 Allels ein geringere Risiko zu verleihen scheint (Corder, H.L. et al. Nature Genet. 7:180–184 (1994)).
  • Nichtsdestotrotz erklären die Kombination genetischer Faktoren nur einen kleinen Anteil von AD, und trotz der Identifikation dieser Faktoren ist wenig bekannt, oder kann abgeleitet werden, über die biochemischen Grundlagen der Krankheitssymptome. Etwa 80% aller AD Fälle, die hauptsächlich bei Menschen über 80 Jahre vorkommen, scheinen nicht mit einer genetischen Prädisposition assoziiert zu sein.
  • Das Gen, das zur Empfänglichkeit für AD prädisponiert.
  • Die Genprodukte, die für AD und DS prädisponieren
  • I. Das APP Gen auf Chromosom 21
  • Das APP Gen wird hauptsächlich in den neuronalen Zellen des zentralen Nervensystems exprimiert. Das Gen kodiert für ein Transmembranprotein, das eine einzige monomere Transmembranhelix enthält (Kang, J. et al. Nature 325:733–736 (1987); Tanzi, R.E. et al. Nature 321:528–530 (1988)). Das Protein, das hauptsächlich im Gehirn exprimiert wird, kann in verschiedenen Isoformen von variierender Länge vorkommen, was durch alternatives Splicing oder durch den Einbau bzw. den Ausstoß von Exons hervorgerufen wird (Pollwein P. et al. Nucl. Acid Res. 20:63–68 (1992); Price D.L. et al. Clin. Neuropharm. 14:S9–S14 (1991)). Dies scheint eine Eigenschaft zu sein, die das Protein mit dem LDL Rezeptorprotein gemeinsam hat. Allerdings haben alle Isoformen eine gemeinsame Domäne, genannt β-Amyloiddomäne (Aß), die zum Teil in der die Membran überspannenden Region des APP-Proteins eingebettet ist. Das bei der posttranskriptionellen Spaltung von APP entstehende Hauptprodukt ist Aβ (Podlisny, M.B. et al. Science 238:669–671 (1987); Currie, J.R. et al. J. Neurosci. Res. 30:687–689 (1991); Zain S.B. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:929–933 (1988); Vitek, M.P. et al. Molec. Brain Res. 4:121–131 (1988); Johnson S.A. In: Review of Biological Research in Aging, Vol 4, Rothstein, M. (Ed), Wiley-Liss, NY, 163–170 (1990)). Die Sekretion des Aβ Proteins reflektiert entsprechend das Abspalten der Domäne vom Vorläufermolekül (siehe Roch, J.M. et al. J. Biol. Chem. 267:2214–2221 (1992)).
  • Wie oben erwähnt sind die Anwesenheit von intrazellulären Fasern sowie die extrazellulären Ablagerungen von Plaques, bestehend aus Amyloidprotein Aβ, in Neurophilen und Blutgefäßen, die pathologischen Charakteristika von AD und DS (Mann, D.M.A. Neurobiol. Aging 10:397–399 (1989); Selkoe, D.J. Neuron 6:487–498 (1991); Lampe, T.H. et al. Ann. Neurol. 36:368–378 (1994); Selkoe, D.J. Nature 375:734–735 (1995)). Der Hauptbestandteil der Amyloidprotein-Plaques beim gesunden Menschen ist das Aß, ein 38–40 Aminosäuren langes (etwa 4 kDa) hydrophobes Protein (Price, D.L. et al. J. Neuropharm. 14:S9–S14 (1991)). Aβ bildet den Kern von Fibrillen, die in amyloiden Ablagerungen konzentriert sind, welche sich im extrazellulären Raum zwischen dem Parenchym des Hirns und den vaskulären Elementen von Hirn und Pia-Arachnoid befinden (Currie, J.R. et al. J. Neurosci. Res. 30:687–689 (1991)). Jedoch wird bei der Alzheimer Krankheit eine längere Version des Aβ, nämlich Aβ-42 von APP abgetrennt, und es ist diese Version des Aß, von der man annimmt, dass sie den Hauptbestandteil der amyloiden Ablagerungen ausmacht. Es wurde außerdem angenommen, dass sie der neurotrope Faktor in der AD (Roher, A.E. et al., Proc. Nat. Aca. Sci. USA 90:10836–10840 (1993); Games, D. et al., Nature 373:523–527 (1995); Laferia, F.M. et al., Nature Genet. 9:21–30 (1995)) und beim DS (Iwatsubo, T. et al., Ann. Neurol. 37:294–299 (1995); Neuron 13:45–53 (1994)) ist. Vor kurzem wurde bei Mäusen gezeigt, dass die Anwesenheit von funktionalem APP nicht notwendig ist für die Ausbildung einer AD typischen Neuropathologie (Zengh, H. et al. Cell 81:525–531 (1995)), außerdem wurde gezeigt, dass Synapsenverlust durch Überexpression von APP ohne Plaquebildung hervorgerufen werden kann (Mucke, L. et al. Brain Res. 666:151-167 (1994)).
  • Einige der oben genannten experimentellen Ergebnisse scheinen gegen eine Rolle von Aβ in der Neuropathologie von AD zu argumentieren, dennoch sprechen ein frühes Auftreten von Aβ bei allen AD-Formen (Querfurth, H.W. et al., Molec. Brain Res. 28:319–337 (1995); Levy-Lahad, E. et al., Science 269:973–977 (1995)), ebenso wie die mit der Krankheit segregierenden Mutationen im APP Gen, für eine zentrale Rolle von APP in der AD (Hardy, J., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2095–2097 (1997)).
  • Die Anhäufung von Aβ-42 bei der Alzheimer Krankheit ist vermutlich ein Ergebnis von falsch verlaufendem Processing einer oder mehrer APP Isoformen (Currie, J.R. et al., J. Neurosci. Res. 30:687–689 (1991)), (s.a. Johnson, S.A. In: Review of Biological Research in Aging, Vol. 4., Rothstein, M. (Ed.), Wiley-Liss, NY, 163–170 (1990); Roch, J.M. et al., J. Biol. Chem. 267:2214–2221 (1992)). Ein solches Processing involviert vermutlich zwei oder mehrere Proteasen (Azuma, T. et al., J. Biol. Chem. 267:1609–1613 (1992); Nakanishi N. et al., Exp. Neurol 121:125 (1993)). Zur Zeit gibt es konzertierte Aktionen unter Forschern, diese im Moment hypothetischen Proteasen ('Sekretasen') zu finden; der Mechanismus der Aβ-Überproduktion in AD bleibt weiterhin unbekannt.
  • II. Das Apolipoprotein E auf Chromosom 19
  • Die E4 Allele des Apolipoproteins "ApoE4", die ursprünglich mit dem späten Auftreten von familiärer und sporadischer Alzheimer Krankheit assoziiert wurde (Saunders, A.M. et al., Neurology 43:1467–1472 (1993); Namba, Y. et al., Brain Res. 514:163–166 (1991)) scheint aber mit allen Formen von ererbter HD und DS assoziiert zu sein. Das Gen wird fast überall exprimiert, jedoch findet die höchste Expression im Gehirn statt. ApoE4 ist Mitglied einer Genfamilie, zu der auch ApoE2 und ApoE3 gehören (Utermann, G. et al., J. lipid Res. 25:378–382 (1984); Utermann, G., J. Inher. Metab. Dis. 11:74–86 (1988); Ghiselli, G. et al., Lancet 2:405–407 (1982)). Diese Genfamilie ist mit anderen schweren Krankheiten beim Menschen, einschließlich falsch verlaufenden Lipidmetabolismuses, z.B. kardiovaskulären Krankheiten, in Zusammenhang gebracht. ApoE-Proteine binden auf Zellmembranen an spezifische Stellen im LDL-Rezeptors sowie im verwandten LRD-Rezeptor und dienen als Anker für bestimmte Lipoproteine, die dann über die Plasmamembran in "bedeckte Einbuchtungen" ("coated pits") transferiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass APP an den ApoE4 LDL-Rezeptor binden kann (Kounnas, M.Z. et al., Cell 82:331–340 (1995)) und daher möglicherweise einen ähnlichen metabolischen Weg hat; jedoch gibt das wenig Einblick, in welcher Weise ApoE4 die Anfälligkeit für AD beeinflußt. ApoE-Proteine, so wie alle löslichen Membranproteine, aggregiert in Lösung, und ApoE4 ist assoziiert mit der Aβ-Immunreaktivität in β-amyloiden Plaques. Letzteres könnte vermuten lassen, dass intramolekulare Proteinaggregation bei der Pathogenese von AD eine Rolle spielt. Der Befund, der zeigt, dass ApoE2, welches im Gegensatz zu ApoE4 eine cis-Aminosäure an Position 112 hat, ein geringeres Risiko für AD bei Menschen mit beiden Allelen bedingt, legt nahe, dass eine cis-Aminosäure den ApoE2-Effekt bedingt, und lassen vermuten, dass eine cis-Aminosäure in die für AD relevanten Aggregationsprozesse bei AD involviert ist (Shi Du Yan et al., Nature 382:685–691 (1997): Tabatin, M. et al., Neurobiology of Aging 17 (48):5130 (1997)).
  • III. Das S182 auf Chromosom 14
  • Obgleich die Zahl von Menschen, die eine genetische Prädisposition für AD haben, relativ gering ist, wird S182 als einer der Haupt-AD-Ort angesehen, weil eine große Mehrzahl von familiären AD (FAD)-Patienten Mutationen in dieser Region aufweisen. Das S182 Gen kodiert für ein Transmembran-(TM-)Protein namens "AD3", das sieben Transmembranhelices beinhaltet. Fünf Punktmutationen, die bei Aminsäureresten innerhalb oder in der Nähe dieser verschieden TM-Helices vorkommen, segregiert mit AD. Weil diese Mutationen nicht bei gesunden Menschen gefunden wurden, scheinen sie für den AD-Phenotyp beim Menschen pathogen zu sein. Die Funktion von AD3 ist nicht bekannt, aber eine mögliche funktionelle Homologie zu SPE-4, einem in C.elegans exprimierten Transmembranprotein, lassen vermuten, dass AD3 beim zytoplasmischen Aufteilen der Proteine eine Funktion haben kann (Sherrington, R. et al., Nature 375:754–760 (1995); Hardy, John, Proc. Natl. Aca. Sci 94:2095–2097 (1997)).
  • IV. Das STM2 auf Chromosom 1
  • Ebenso wie S182 kodiert auch STM2 ein TM Protein, das sieben Transmembranhelices beinhaltet. Das STM2 Protein ist stark homolog zu S182, insbesondere zu Sequenzen innerhalb der TM-Helices. Eine einzelne Punktmutation in Aminosäure (aa) 141 innerhalb der zweiten TM-Helix, die zu 84% homolog zu AD3 TM-II ist, wird für AD bei einer großen Verwandtschaftsfamilie verantwortlich gemacht. Im Vergleich zu FAD mit Mutationen in S182, scheint durch Mutation in STM2 141 hervorgerufene FAD auf nur eine Verwandtschaft, "der deutschen Wolga Familie", beschränkt zu sein. Die strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den AD3 und STM2 Proteinen deutet an, dass sie eine ähnliche, zurzeit noch unbekannte biochemische Funktion gemeinsam haben (Levy-Lahad, E. et al., Science 269:973–977 (1995)). Jedoch ähnelt die Sekundärstruktur von S182 und von STM2 sehr der Struktkur der adrenergen und muscarinen Rezeptoren. Bei den letzteren werden mehrere Transmembrandomänen für die Determinierung der Bindeselektivität gegenüber Antagonisten und Agonisten benötigt (Wess, J. et al., Mol. Pharmacol. 256:872–877 (1991)).
  • Dies könnte erklären, warum jede der in S182 auftretenden fünf Mutationen zu AD führen kann.
  • Ohne irgendeine effektive Behandlung wird AD wahrscheinlich einen von zehn heute lebenden Menschen betreffen.
  • Es gibt keine effektive Behandlung von AD in irgendeinem Stadium der klinischen Progression, und es gibt auch keine verlässliche Diagnosemethode, um die Krankheit im Anfangsstadium festzustellen, selbst nicht bei der relativ kleinen Anzahl genetisch prädisponierter Personen.
  • Im Hinblick auf die Bedeutung einer Diagnose, der Vorhersage und der Behandlung von AD und DS ist es dringend erforderlich, effektive Mittel zum Erreichen dieser Ziele zu entwickeln. Die vorliegende Erfindung liefert solche Mittel.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung bestand darin, hoch spezifische Moleküle beim Menschen, die hoch zuverlässige Marker für AD beim Menschen sind, zu liefern. Diese Moleküle waren, außer dass sie akkurate, die Krankheit vorhersagende Reagenzien waren, auch Zeitmoleküle für in situ Modifikation oder Destruktion durch therapeutische Substanzen, welche die Progression der Krankheit beim Menschen ohne unerwünschte Nebenwirkungen verhindern und anhalten würden.
  • Lt. dieser Erfindung wurden die hoch spezifischen Moleküle geliefert, die Marker für AD und auch Zielmoleküle für therapeutische Intervention sind.
  • Diese Erfindung beschäftigt sich mit Mitteln und der Anwendung dieser Mittel als Marker zur Frühdiagnose und als Zielmoleküle in therapeutischen Ansätzen für die Alzheimer Krankheit. Diese Mittel schließen drei neuartige, mit der Alzheimer Krankheit in Verbindung gebrachte Neuropeptide ein, und ein neuartiges, mit Down Syndrom in Zusammenhang gebrachtes Neuropeptid, wie auch Analoga und Derivate dieser Moleküle, und Nukleinsäuremoleküle, die für solche Moleküle kodieren oder ihre Expression beeinflussen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN:
  • 1G. Nukleotidsequenz von alzas
  • 1H.
    • (i) Aminosäuresequenz von ALZASp
    • (ii) Aminosäuresequenz von ALZASp3
    • (iii) Aminosäuresequenz von ALZASp4
  • 1I. Nukleinsäuresequenz der alzas1 cDNS
  • 1J. Aminosäuresequenz von ALZASp1
  • 1K. Nukleinsäuresequenz der 5'-aufwärtsliegenden Regulationsregion des alzas Gens
  • 1L. Nukleinsäuresequenz der alzas2 cDNS
  • 1M.
    • (i) Aminosäuresequenz von ALZASp2
    • (ii) Aminosäuresequenz von ALZASp5
  • 1N. Nukleinsäuresequenz der 5' Regulationsregion des alzas2 Gens
  • 2A. Die Organisation des alzas Gens, ein Vergleich mit der Organisation des APP Gens: die Produkte, die bei der konstitutiven Spaltung von ALZASp und von Mutationen in Regionen auf Chromosom 21, die für APP kodieren, erwartet werden.
  • 2B. Die Organisation des alzas1 Gens, ein Vergleich mit der Organisation des APP Gens: die Produkte, die bei der konstitutiven Spaltung von ALZASp1 und von Mutationen in Regionen auf Chromosom 21, die für APP kodieren, erwartet werden.
  • 2C. Die Organisation des alzas2 Gens, ein Vergleich mit der Organisation des APP Gens: die Produkte, die bei der konstitutiven Spaltung von ALZASp1 und von Mutationen in Regionen auf Chromosom 21, die für APP kodieren, erwartet werden.
  • 3A, 3B & 3C. A Expression von AD-bezogener mRNS in menschlichem Gehirn: (A) Amplifikation mit primer Paar "alz289" – Bahn 1 = DS Gehirn, Bahnen 2 & 3 = normales Gehirn, Bahn 4 = Hippocampus, Bahn 5 = AD Cortex (nur eine kleine Menge des PCR Produktes wurde auf das Gel aufgetragen), Bahnen 6 & 7 = DNA Größenmarker, Bahn 2 = AD Gehirn, Bahn 3 = normales Gehirn, 5 & 6 = normale Lymphozyten, 7 & 11–14 = normales Gehirn, 15 = DNA Größenmarker.
  • 4A–B. ELISA Methoden
    • A. Beschreibung der zur Erkennung von ALIAS und DSAS und PAC in menschlichen Körperflüssigkeiten und Gewebe verwendeten ELISA Methode.
    • B. Beschreibung der zur Erkennung von endogenen, im Blut und Serum von Patienten mit AD produzierten Immunglobulinen verwendeten ELISA Methode.
    • C–E. Nachweis der Expression der mit AD in Zusammenhang gebrachten Proteine ALZASp (ALIAS) mittels Immunchemilumineszenz-Detektion auf Dotblots. Für die Dotblots wurden Proteine von Gehirn und Lymphozyten mittels Ammoniumsulfatpräzipitation extrahiert, dialysiert und für 5 Minuten in 5% SDS gekocht. 2 μl der SDS-behandelten Proteine wurden auf Nylonmembranen gespottet, mit dem geeigneten Antikörper behandelt und mit Hilfe eines Immunochemilumineszenzsystems entwickelt: (A) Sonde = Antikörper ALZab2.
    • (C) Dots wurden mit Antikörper ALZab1 getestet; dots 1 = normale Lymphozyten, 3 = DS Lymphozyten, 6 = normales Gehirn, 7 = AD Cortex, 8 & 9 = AD Lymphozyten, 10 = normale Fibroblasten;
    • (D) 1.5 μl Serum von zehn gesunden, zufällig ausgewählten Frauen über 35 Jahren wurden mit ALZab1 getestet.
    • (F) Dotblots mit Serum von 28 durch Autopsie bestätigten AD-Opfern wurden mit ALZab2 getestet (mindestens 50% dieser Patienten waren vor ihrem Tod inkorrekt mit einer anderen Krankheit als AD diagnostiziert worden);
    • (G) Nachweis unterschiedlicher ALIAS-Mengen im Serum von Patienten mit vermuteter AD im frühen Stadium, Patienten mit Depression und durch Autopsie bestätigten AD Opfern.
    • (H) Nachweis von endogenem anti-ALIAS IgG in Blut, Serum und Speichel von Patienten.
    • (I) Western Blots; 1. Mit Ammoniumsulfat gefällte Proteine wurden auf 17.5 % Acrylamidgelen elektrophoretisiert, auf Nylonfilter geblottet, mit geeignetem Antikörper reagiert und mittels Immunchemilumineszenzsystems entwickelt. 2. Proteine wurden aus AD Hippocampus isoliert und mit Antikörper ALZab2 behandelt; 3. Proteine wurden aus AD Hippocampus isoliert und mit ALZab3 behandelt.
  • 5A–D
    • (A) Isolierung von ALIAS aus Serum eines durch Autopsie bestätigten AD Patienten. Das Protein wurde mittels Affinitätsreinigungsmethoden unter Verwendung von an CNBr-Sepharose gebundem affinitätsgereingtem anti-ALZab2 Antikörper isoliert. Die Gele wurden mit Silberfärbung entwickelt und dem Westernblotting-Transfer unterworfen. Human-IgG-Fragmente wurden mit Maus-anti-human mAbs nachgewiesen.
    • (B) Silberfärbung des SDS Gels: nach Affinitätsreinigung von ALIAS aus Serum von AD-Patienten im Spätstadium erhalte Proteine.
    • (C) Nachweis von ALIAS-IgG Komplexen im unter 5(B) beschriebenen Gel mittels anti-Human-IgG (Fe-Fragment).
    • (D) Western Blot von kationischer nicht-SDS (nativer) Polyacrylamid Gelelektrophorese mit Seren (a) eines Patienten mit sporadischer AD, und (b) eines Patienten mit Schwedischer Mutations-AD.
  • 6 Ausrichtungen (Alignments):
    • (A) Ausrichtung von S182 tm-II mit ALZASpTM (App-TM) und STM2 TM-2.
    • (B) Ausrichtung des C-terminus von ApoE4 mit dem C-terminus von ALZASp1
    • (C) Ausrichtung der Rezeptor/Heparin-Bindungsstelle des ApoE Proteins mit dem C-terminus von ALZASp1.
  • EINZELHEITEN DER ERFINDUNG
  • Im Einzelnen liefert die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das substantiell frei von natürlichen Verunreinigungen ist und das für ein Protein kodiert, welches aus einer aus alzas, alzas1 und alzas2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Im Speziellen liefert die Erfindung das oben beschriebene Nukleotidsäuremolekül, wobei die Sequenz SEQ ID NO:11 ist: SEQ ID NO:11
    Figure 00080001
  • Die Erfindung liefert auch ein Protein, das substanziell frei von natürlichen Verunreinigungen ist, und das aus einer Gruppe bestehend aus ALZASp, ALZASp1, ALZASp2 ausgewählt wurde. Im Speziellen liefert die Erfindung das oben beschriebene Protein, welches die Sequenz SEQ ID NO:12 hat. Die Erfindung liefert zudem drei hypothetische Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 und SEQ ID NO:26.
    • SEQ ID NO:12 M D A E F R H D S G Y E V H H Q K L V F F A E D V G S N K G AI I G L M V G G V V I A T V I V I T L V M L K K K Q Y T S I HH G V V E V G K L D C M F P S G N
  • Die Erfindung liefert außerdem ein Reagenz, das in der Lage ist, das Vorkommen eines Moleküls zu diagnostizieren, das aus der Gruppe, bestehend aus alzas, einem für ALIAS kodierenden Nukleinsäuremoleküls, alzas1, einem für ALZAS1 kodierenden Molekül, alzas2 und einem für ALZAS2 kodierenden Molekül, ausgewählt ist.
  • Die Erfindung betrifft speziell die Ausführungen, worin das Reagenz ein Nukleinsäuremolekül ist, das von Nukleinsäuremolekülen produziert wird, die eine zu SEQ ID NO:11 (Nukleotide 191–240) oder zu SEQ ID NO:24 (Nukleotise 96–170) komplementäre Sequenz besitzen, oder auch ein Nukleinsäuremolekül, das durch Mutation eines Nukleinsäuremoleküls erhältlich ist, das die Sequenz SEQ ID NO:11 (Nukleotide 191–240) oder SEQ ID NO:24 (Nukleotide 96–170) hat, oder ein Protein (speziell einen Antikörper oder das Fragment eines Antikörpers), das in der Lage ist, an ALZASp (Aminosäuren 68–79) oder ALZASp1 (Aminosäuren) zu binden.
  • Die Erfindung liefert zudem eine Methode zur Behandlung der Alzheimer Krankheit, indem Personen, die eine solche Behandlung benötigen, eine effektive Menge an Antikörper oder Peptidsubstanz gegen ALZASp, oder ein Reagenz, das die Aktivität von Promotoren sowie auch anderer regulatorischer Elemente, die die Transkription von alzas programmieren, blockiert, oder auch heat shock Elemente, die die Aktivität solcher Promotorn innerhalb der wie folgt identifizierten Sequenzen beeinflussen können, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:27,

    SEQ ID NO:17
    5' TTGATAATTAAATGTTATAGCATGGACACTGACATTTACATTTTTTACTTATGTTTTTGGTTTTTAAATGACTCTGCAT 3'

    SEQ ID NO:18
    5' ATTATTATTTGAATAATGAAATTCATCAGAACAATTA 3'

    SEQ ID NO:19
    5' GCAATTTATAGAAAAGGAAGAGTTCGTAGGTTATAAATTCTGTTAGTTGCTAAGAAGCATTTTTAAAA 3'

    SEQ ID NO:20
    5' ATGCTCATTTTTAAAGGCTTTTATTATTATTTCTGAAGTAATGAGTGCACATGGAAAAA 3'

    SEQ ID NO:2!
    5' TATTCCAGGAACAAATCCTTGCCAACCTCTCAACCAGG 3'

    SEQ ID NO:22
    5' TAGCATGTATTTAAATGCAGCAGAAG 3'

    SEQ ID NO:23
    5' GAAGGTTTAAATATAGGGTATCATTTTTCTTTAAGAGTCATTTATCAATTTTCTTC 3'
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN WEGE ZUR UMSETZUNG
  • Der Konsens aller experimenteller Beweise deutet an: (1) das APP-Protein (der β-Amyloid-Vorläufer) spielt eine wichtige Rolle in der Expression des AD phenoltypischen Krankeitsbildes, unabhängig vom Ursprung des Originalauslösers der Krankheit; die Beteiligung von APP manifestiert sich durch die anormalen Ablagerungen einer Vielzahl von Aβ-Molekülen in wichtigen Regionen des Hirns, (2) Aβ ist ein 38–42, 4.6 kDa-Polypeptid, das von post-translationaler Verarbeitung des APP Proteins herrührt, d.h. es ist ein Fragment des β-Amyloid-Vorläuferproteins (siehe Selkoe, D.J. Neuron 6:487–498 (1991), Nature 375:734–735 (1995); Masters, C.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245–4249 (1985)). (3) die Gegenwart von Aβ im Gehirn und in zerebralen Arterien signalisiert den Beginn von AD, obgleich Aβ nicht die für AD charakteristischen neurodegenerativen Symptome hervorruft, (4) das APP Gen wird nicht überexprimiert in AD; allerdings ist es beim Down Syndrom aufgrund der zusätzlichen Gendosis überexprimiert, aber das gleiche könnte auf andere Chromosm 21-assoziierte Gene zutreffen, die nicht in DS involviert sind, (5) die Gewichtung der Suche nach den biochemischen Gründen für AD hat sich auf die Suche nach den Proteasen verlagert, welche für die fehlerhafte Verarbeitung von APP verantwortlich sind, und (hoffentlich) darauf, diese als diagnostische und therapeutische Angriffspunkte zu wählen, und schließlich (6) gibt es derzeit weder eine verlässliche nicht-invasive Methode zum Nachweis der AD im Frühstadium noch eine effektive Methode zur Behandlung der Krankheit.
  • Der Erfolg der vorliegenden Erfindung rührte hauptsächlich daher, dass wir realisierten, dass es andere Gene innerhalb des APP-Locus geben muss, die mit AD im Zusammenhang stehen, und dass zumindest eines dieser Gene auch eine Komponente mit Bezug zum β-Amyloid haben muss. Wir haben daher eine Vorgehensweise angewendet, die wir bereits erfolgreich bei der Suche nach alternativen Genen benutzt hatten, welche putative kausative Faktoren für andere "Genkrankheiten" sind; um innerhalb des das gesamte APP-Gen codierenden Ortes auf Chromosom 21, und den dieses Gen flankierenden Regionen, nach solchen Genen zu suchen, die möglicherweise mit AD segregieren.
  • Wir nennen diese alternativen Gene "Huckepack-Gene" ("piggy-back Gene") und bezeichnen diese Technologie als "disease gene discovery by positional searching" (DGDPS). Piggy-back Gene werden in jedweder Richtung innerhalb des von einem anderen Gen besetzten Chromosomenortes transkribiert.
  • DGDPS Vorgehensweise.
  • Diese Methode hat deshalb Vorteile gegenüber der Genisolierung mittels Klonen aus einer genomischen oder cDNS Library, weil sie drei wichtige Nachteile überwindet, (1) die Möglichkeit, dass manche DNS Sequenzen mit konventionellen Methoden nicht geklont werden können, (2) dass manche mRNS-Sequenzen in solch geringer Menge vorkommen, dass sie in einer cDNS-Bibliothek nicht repräsentiert sind, und (3) das Überwinden der Tatsche, dass die Produkte einiger geklonter Sequenzen höchst toxisch für bakterielle und andere Wirte sind.
  • Im allgemeinen haben wir zunächst Gene identifiziert, die in engem Bezug stehen zu einem Gen, das bereits genetisch korreliert wurde mit einer bestimmten Krankheit, haben die mRNS, die von diesem Gen transkribiert wird, isoliert aus Gewebe oder Patientenblut, danach aus der isolierten mRNS die cDNS mittels reverser Transkriptase synthetisiert und anschließend neue cDNS mit spezifischen Primern amplifiziert, die die gesamte Kodierungsregion der cDNS flankierten. Danach haben wir die cDNS nach Elektrophorese im Agarosegel aufgrund ihrer Größe identifiziert, und haben schließlich die einzigartige cDNA aus dem Agarosegel isoliert. Dies ermöglichte es uns, das gewünschte Molekül, sofern es exprimiert wurde, zu selektieren, ohne mehrere Millionen cDNS-Klone testen zu müssen.
  • Die Tatsache, dass Aß, das bei allen AD vorkommt, Teil des APP Proteins ist, und unterstützt durch Ergebnisse von unseren Arbeiten mit anderen neurodegenerativen Krankheiten, schlussfolgerten wir, dass die biochemische Verbindung zwischen allen Formen von AD das APP Protein ist. Wir stellten die Hypothese auf, dass Aβ nicht direkt von in der Membran eingebettetem APP generiert wird, sondern vielmehr von einer "löslichen", d.h. im Transport befindlichen Form des APP stammt, oder von einem anderen Protein, das wahrscheinlich in signifikanten Menge krankheitsspezifisch exprimiert wird. Wir nannten dieses Protein "ALIAS" (Alzheimer Krankheit assoziiert) und sagten voraus, dass ALIAS strukturell mit APP eng verwandt sein, und von der gleichen Stelle innerhalb des Chromosoms wie APP transkribiert würde. Weiterhin sagten wir voraus, dass ALIAS die Phosphorylierung von tau beeinflussen würde und die immunologischen Reaktionen initiieren würde, die zu Komplementbildung in Neuronen führt, und dass ALZASp sich in Körperflüssigkeiten (Serum, Speichel, Urin) von Menschen mit AD finden würde. Das Ziel des Projekts war, ALIAS in Patienten mit AD zu finden.
  • Die vorliegende Erfindung ist zum Teil Folge der Entdeckung und des Klonens eines neuartigen Gens alzas mit Hilfe der oben genannten Vorgehensweise. Es folgt eine detaillierte Beschreibung des positionellen Suchens (positional searching), so wie es für die vorliegende Erfindung zutrifft:
    • (1) Wir haben Sequenzregionen innerhalb des APP Locus auf Chromosom 21 untersucht und potentielle vollständige orf's ausgesucht, d.h. solche mit akzeptablen, geeignet platzierten Translations-Initiationssequenzen (siehe Kozak, M. Nucleic Acid Res. 12:857–872 (1984) sowie Translationsterminations-Stopkodons (TAA, TAG oder TGA),
    • (2) anschließend haben wir die Methode von Sucher et al., J. Mol. Biol. 212:563–578 (1990) angewendet, um putative Promoterregionen zu identifizieren, die mit dem orf assoziiert sind und sich zwischen 100–1000 bp 5' sequenz-aufwärts von der Translations-Initiations-Region befinden, und haben innerhalb einer Region von –1000 bp 3'sequenz-abwärts des Translations-Stopkodons des potentiellen orf potentielle Poly-A-Additionssignale identifiziert (die Konsens-PolyA-Additionssequenz ist AATAAA).
    • (3) orf's, die die obigen zwei Charakteristika erfüllten, wurden in putative Proteinsequenzen unter Verwendung des Universalkodes übersetzt,
    • (4) danach haben wir das putative Protein mittels unserer eigenen Komputer-assistierten Protein-Fingerprinting Technologie (proprietary computer assisted Protein finger printing technology) analysiert und Informationen zu potentiellen biochemischen Charakteristika der deduzierten Proteine erhalten,
    • (5) als nächstes wurden die biochemischen Eigenschaften der deduzierten Proteine mit bekannten klinischen Symptomen von AD (Mann, D.M.A. Neurobiol. Ageing 10:397–399 (1989)), sowie mit beschriebenen biochemischen, die Krankheit charakterisierenden Eigenschaften (Selkoe, D.J. Neuron. 6:487–498 (1991)) korreliert,
    • (6) die für Proteine mit Eigenschaften, die mit den Krankheitscharakteristika korrelierten, kodierenden RNSs wurden als potentielle krankheitsbezogene Kandidaten ausgewählt,
    • (7) der Gegenwartsnachweis für transkribierte mRNS-Sequenzen, die für das Protein in einer Zelle kodieren erfolgte durch PCR (Mullis, K.B., Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 51:263–273 (1986); Saiki, R.K. et al, Bio/Technology 3:1008–1012 (1985); Mullis, K. et al., U.S. Patent 4,683,202 ; Erlich, H., U.S. Patent 4,582,788 ; Saiki, R. et al., U.S. Patent 4,684,194 und Mullis, K.B. et al., Meth Enzymol. 155:335–350 (1987); im einzelnen erfolgte die Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) unter Verwendung des Stratagene RAP-PCR TR-PCR Kits entsprechend den Angaben des Herstellers und unmarkierten Primern, um in RNS, die aus gefrorenem menschlichen Hirn sowie aus Lymphozyten isoliert worden war, diejenigen cDNSs zu finden, welche für die deduzierten Proteine kodieren. RNS wurde aus gefrorenem Gehirn extrahiert, indem gefrorenes postmortem Hirn in einem Gewebehomogenisator in Anwesenheit von Diäthylpyrokarbonat (DEPC) zerrieben wurde. Gesamt-RNS wurde mit Hilfe des Stratagene Mikro RNS Isolation Kits isoliert, und poly(A)+ wurde mit Hilfe des Stratagene Poly(A)+ Quick mRNS Isolation Kits entsprechend der Anwesiungen des Herstellers isoliert. Isolierte RNS wurde mit 10 Einheiten (units) RNAse-freier DNAse für 15 Minuten bei 37° C behandelt. DNAse wurde bei 100° C für 2 Minuten inaktiviert. cDNS Synthese erfolgte an mRNS als Templat und unter Verwendung des Erststrang-Protokols nach dem dem Kit beiliegenden Protokoll, und RT-PCR wurde unter den vom Hersteller empfohlenen Zyklisierungs-Bedingungen durchgeführt. Vorwärts- und rückwärts-PCR-Primer wurden zu den Regionen hergestellt, die die gesamte das Protein kodierende Region des orf's eines ausgewählten Proteins flankieren (siehe Tabelle 1 für die Sequenzen der Primer und für die Größe des erwarteten Amplifikationsprodukts). Die amplifizierte cDNS wurde der Elektrophorese in Agarosegelen unterworfen, und die Größe des Produktes wurde durch Vergleich mit DNS-Größenmarkern, die in demselben Gel elektrophoretisiert wurden, ermittelt. Um die cDNS-Sequenz zu verifizieren, wurden die Regionen in der Agarose, die cDNS der erwünschten Größe enthielten, in H2O extrahiert, mit Äthanol präzipitiert, und ein Teil wurde mit den Primern in "12" und der Perkin Elmer ampli-Taq mit dem Perkin Elmer 376 A DNS Sequenzer zyklisch sequenziert, wobei eine nicht-radioaktive Methode, wie bei Liu, C. et al. Nucl. Acid. Res. 21:333–334 (1993) beschrieben, benutzt wurde.
    • (8) Um festzustellen, ob die Proteine tatsächlich exprimiert waren, wurden Epitope innerhalb der Aminsäuresequenz des Proteins identifiziert, wobei die Methode von Hopp, T.P. and Woods, K.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824–3828 (1981) verwendet wurde. Die Epitopsequenzen wurden mit Sequenzen in Datenbanken verglichen; Epitope (siehe Tabelle 2), die keine Homologie zu Sequenzen in den öffentlich zugänglichen Datenbanken hatten, wurden ausgewählt, und monospezifische Antikörper gegen diese Epitope wurden in Kaninchen hergestellt, gereinigt durch Affinitätschromatographie auf Pharmacia LKB, CNBr-aktivierter Sepharose 4B entsprechend der Empfehlung des Herstellers (s. Sektion #11 über Immunologie, in Current Protocols in Molecular Biology (Vol 1) Ausubel, F.M. et al. (Herausg.) John Wiley & Sons NY. NY. 1991).
    • (9) Um die Expression der deduzierten Proteine in menschlichem Material zu zeigen, wurden Proteine aus Gewebe von AD-Patienten sowie von Normalgewebe mittels Präzipitation des homogenisierten Gewebes mit > 80% Ammoniumsulfat und anschließender Dialyse gegen SDS-PAGE Puffer (die Pufferbedingungen wie beschrieben bei Laemmli, U.K. Nature 227:680–685 (1970)) isoliert, (16) die dialysierten Proteine wurden in SDS-PAGE Puffer gekocht und entweder in einem 17.5% Acrylamidgel elektrophoretisiert, gefolgt von Western blotting der Proteine auf Nylonmembranen sowie Behandlung mit dem affinitätsgereinigten Antikörper, oder aber auf positiv geladene Membranen gespottet und genauso behandelt wie oben beschrieben. Die Wechselwirkung zwischen Antikörper und membrangebundenen Protein wurde visualisiert durch ein Chemilumineszenz Kit, das von BioRad Inc. gekauft und entsprechend der Herstellerbeschreibung verwendet wurde (siehe auch Blake, M.S. et al. Anal. Biochem. 136:175–179 (1984)).
  • ALIAS hat strukturelle Ähnlichkeiten mit kleinen porenbildenden Proteinen. Porenbildende Proteine, die in einer ganzen Reihe von Organismen gefunden worden sind, penetrieren Zellmembranen und führen zu Membranschädigungen, meistens in einem sehr kleinen Verhältnis von Effektor zur Zielzelle. Damit ein porenbildendes Protein effektive sein kann, müssen zwei interkonvertible Konfigurationen des Proteins in der Zelle vorhanden sein: (i) um in die Membran eingebaut zu werden, muss das Protein eine hydrophobe Domäne auf seiner Oberfläche präsentieren, die aber nicht dominant sein darf, (ii) andererseits muss ein Protein eine lösliche Einheit bilden, um das Zytoplasma zu durchqueren und die Membran zu Erreichen. Die interkonvertiblen Konfigurationen können auf verschiede Weisen erreicht werden, z.B. durch Oligomerisierung oder durch Wechselwirkung hydrophober Stellen mit einem Chaperon. Um in die Membran einzudringen, findet beim Kontakt mit dieser eine Dissoziation des Oligomers statt, was die hydrophobe Domäne des Proteins wieder exponiert und die Membraneinlagerung fördert. ALIAS besitzt das APP-Transmembransignal; deshalb kann ALIAS ebenso wie APP durch die Membran des endoplasmischen Retikulums (ER) und das Zytoplasma hindurch translociert werden und in die gleichen Plasmamembranstellen eingefügt werden wie APP.
  • Das alzas Gen und das Protein, das von diesem Gen kodiert wird, sind in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Unsere Entdeckung, dass diese Moleküle: (i) zu 100% in Gehirnen, Lymphozyten und Blut von Menschen mit AD exprimiert wurden, (ii) eine Antikörperantwort in Menschen hervorrufen, bevor klinische Symptome der Krankheit gesehen werden, (iii) nicht in normalen (gesunden) Menschen (normal = Individuen unter 30 Jahre und Individuen über 60 Jahre ohne Vergangenheit einer neurodegenerativen Krankheit) auftraten, und (iv) im Einklang mit der bekannten Inzidenzrate von AD in einer Population bei 2 von 5 klinisch normalen (gesunden) Menschen über 65 Jahre mit einem gewissen Verdacht auf AD, nachgewiesen wurden, unterstützte stark die These, dass diese Moleküle in die Äthiologie von AD und DS involviert sind. Zudem war es ein starker Hinweis darauf, dass diese Moleküle zur präsymptomatischen Diagnose von AD verwendet werden können, und auch, dass sie Ziele für eine aktive und/oder passive Impfstoff-Therapie sein können, um AD zu Verhindern und zum Einhalt zu bringen.
  • MOLEKÜLE DER ERFINDUNG
  • Beispiel 1
  • Beispiel 2
  • Das ALIAS Transmembranprotein
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Gen, das wir Alzheimer's assoziiertes Gen ("alzas") nennen. alzas wird innerhalb des APP Locus auf Chromosom 21 kodiert. Die positionelle Beziehung zu APP-kodierenden Sequenzen ist in 2Ai gezeigt. Das Gen beinhaltet zwei Exons, die durch ein Intron von 5.6 kb getrennt werden. Die Nukleotidsequenz der regulatorischen Transkriptionsregion von alzas, welche innerhalb von Intron 15 des APP Gens liegt, ist in 1K gezeigt. Die Transkription von alzas kann durch einen von acht Promotern programmiert werden, (PALZ1") + ("PALZ2") SEQ ID NO:17; ("PALZ3") SEQ ID NO:18; ("PALZ4") SEQ ID NO:19; ("PALZ5") SEQ ID NO:20; ("PALZ6") SEQ ID NO:21; ("PALZ7") SEQ ID NO:22; ("PALZ8") SEQ ID NO:23, die innerhalb der regulatorischen Region liegen. PALZ3/4/5/6/7/8 sind mit Cap-Stellen korreliert. Heatshockelemente, die die Aktivität aller alzas Promotoren verändern können, überlappen PAL3 (Heatshock-Proteine wurden von Gething, M.J. und Sambrock, J. Nature 355;33–45 (1992) umfassend beschrieben); zwei putative Östrogen-responsive Elemente (Savouret et al., Recent Progress in Hormone Res. 45:69–120 (1989); Beato M., Cell 56:355–361 (1989), liegen vor und zwischen PALZ 7/8. Eine potentielle Poly-A-Additionsstelle befindet sich in der 3 sequenzabwärts liegenden, untranslatierten Region des Gens.
  • Die alzas cDNS ist in 1G, SEQ ID:NO 11, gezeigt. Sie schließt Sequenzen ein, die zu APP Exon 16, Exon 17 und einen Teil von Intron17 identisch sind, und kodiert für ein 79 Aminosäure langes Protein ALZASp, SEQ ID:NO 12, wie in 1Hi gezeigt wird. Das Protein schließt ein die gesamte Aβ-Proteinsequenz, die APP-Transmembranhelixsequenz (die ein konstitutives, hormonkontrolliertes sekretorisches Signal zwischen aa 42/43 hat) und eine einzigartige C-terminale Sequenz, welche zu den APP Aminosäuresequenzen in keinem Bezug steht, jedoch eine signifikante Homologie zu einer Domäne in einem Pflanzen-Chloroplasten-Membranprotein sowie zu der C-terminalen Sequenz des ApoE4 Proteins aufweist (siehe 6b), wie die Anwendung der Methode von Feng, D.F. et al. J. Mol. Evol. 21:112–125 (1985) aufgezeigt hat.
  • Wie ALZASp beim Menschen AD initiieren oder hervorrufen kann.
  • Die Gegenwart einer Transmembranhelix (TM), die mit der APP TM identisch ist, bedeutet, dass ALZASp (von dem man annimmt, dass es aufgrund der Größe eine weitaus weniger komplexe Sekundärstruktur hat als APP) erfolgreich mit APP um die Membran-Ankerstellen konkurrieren kann und womöglich verhindert, dass APP in die Membran eingelagert wird. Wenn das der Fall ist, dann wird das APP Protein für abbauende lysosomale Proteaseaktivität angreifbar. Letztere könnte erhöhte Werte und größere Fragmentstücke von Aβ hervorrufen, ohne dass der aktuelle Wert an APP verändert wird, könnte aber auch, unbeabsichtigt, die Aβ- und die Transmembransequenz vom APP-Protein angreifen. Gemeinsamer proteolytischer Angriff auf APP und ALIAS könnte alle Formen von AD erklären und könnte des Weiteren erklären, wie Aβ aus einem Teil von APP herausgeschnitten wird, der innerhalb der TM Helix liegt. Dies macht eine funktionelle Signifikanz eines spezifischen Verdaus des APP vor durch einzigartige Proteasen unnötig. Daher erscheint es wahrscheinlich, dass die Beschaffenheit der menschlichen Immunantwort eine signifikante Rolle dabei spielt, wer AD entwickelt, und es macht die Rolle von Entzündungsreaktionen bei der Äthiologie selbsterklärend. Es ist möglich, dass eine Zerstörung der Zytoskelettstruktur, die zu einer abnormalen Phosphorylierung von tau durch aktivierte Tyrosinkinasen führt, ein direktes Resultat der Interaktion von ALIAS mit der Neuronenplasmamembran ist (siehe Knulton, J. et al. Infec. And Immuno., 57:1290–1298 (1989), Rosenshine, et al. EMBO J. 11:3551–3560 (1992)), ebenso wie die Produktion verschiedener Formen von Aβ auf den durch kompetitive Bindung von ALIAS erwirkten Ausschluß des APP aus der Membran mit darauf folgender Verdauung durch proteolytische Enzyme zurückzuführen ist.
  • Aufgrund der oben genannten Anhaltspunkte ergibt es sich, dass DS und AD nicht so eng verwandt sind wie man allgemein annimmt. Der die beiden Krankheiten verbindende Faktor, d.h. die Anwesenheit von Aβ, das womöglich von geringer physiologischer Bedeutung bei AD und DS ist, wird wahrscheinlich durch zwei entgegengesetzte Mechanismen hervorgerufen, die beide zur Produktion von Aβ aus freiem (d.h. mit der Membran assoziiertem) APP führen. Bei DS ist die Akkumulation von Aβ auf die Überproduktion von APP zurückzuführen, was die Membranstellen übersättigt und zum Ausschluß und zytoplasmatischem Verdau einer signifikanten Menge von APP Molekülen führt; bei AD wird APP durch ALIAS kompetitiv an der Membranbindung gehindert und bleibt im Zyoplasma, wo es verdaut wird.
  • Amplifikation von alzas aus gefrorenem Gehirn und Lymphozyten
  • RNS wurde aus 13 normalen Gehirnen und aus Lymphozyten isoliert, sowie aus gefrorenem AD Hirngewebe und Lymphozyten. cDNS Synthese aus mRNS erfolgte wie bereits beschrieben und cDNA Amplifikation wurde mit pp alz287 (siehe Tabelle 1a) und mit pp alz 393 (Daten nicht gezeigt) ausgeführt, wobei ein Amplifikationsfragment von 287 bp erwartet wurde.
  • Das amplifizierte Fragment wurde durch Vergleich mit DNS Größenmarkern ermittelt, welche unter den gleichen Bedingungen elektrophoretisiert wurden (3A). Bahn 1 DS Gehirn, Bahnen 2 & 3 normales Gehrin, Bahn 4 AD Hippocampus, Bahn 5 AD Cortex, Bahnen 6 & 9 DNA Größenmarker (Böhringer Marker #5), Bahn 7 normale Lymphozyten, Bahn 8 AD Lymphozyten. Das amplifizierte 287 bp Fragment wurde aus dem Agarosegel isoliert und der Zyklischen DNS-Sequenzierung unterworfen, in dem die nichtradioaktive Methode wie bereits für pp287 beschrieben verwendet wurde. Die Resultate (nicht gezeigt) stimmten exakt mit der vorhergesagten Nukleinsäuresequenz in 1G überein.
  • Detektion von ALZASp in gefrorenem menschlichem Gehirn und in Lymphozyten
  • Aliquote der oben beschriebenen isolierten Proteine aus Humanhirngewebe, gefrorenem AD Hirngewebe, normalen Lymphozyten und AD Lymphozyten wurden auf eine Nylonmembran gespottet oder der Western Blot Methode, wie bereits beschrieben, unterworfen und mit Antikörper ALZ ab2 getestet.
  • ALZ ab2 erkennt nur die letzten 12 Aminosäuren im C-terminus von ALZASp. Die Ergebnisse in 4E & F zeigen die Anwesenheit von ALZASp im AD Cortex sowie in Lymphozyten.
  • Western Blot, 4D, Spur 2, getestet mit ALZ ab2, zeigt eine einzelne immunreaktive Bande von 8.5 kd, was der erwarteten Größe von ALZASp entspricht.
  • Die Gegenwart von multiplen Promotoren, Heatshock-Eelementen und putativen Östrogenrezeptor-Elementen in der regulatorischen Region von alzas ist ein Hinweis darauf, dass die Transkription von alzas mRNS durch eine Reihe von verschiedenen Faktoren getriggert werden könnte, einschließlich externer Umweltfaktoren, die nicht mit Mutationen, wie Stress-induzierende Faktoren, Metalle etc., in Zusammenhang stehen. Bestimmte Faktoren mögen allerdings einen suppressiven Effekt auf die Aktivierung der Promotoren haben (z.B. Östrogene und Nikotinsäure-verwandte Moleküle) und daher die AD bei einigen Menschen verzögern oder sogar verhindern. Deshalb sind lt dieser Erfingung diese Promotoren ideale Ziele für Therapeutika, die die Aktivierung blockieren und die Transkription von alzas im Menschen verhindern können.
  • Beispiel 1: Nachweis des ALIAS Proteins im Serum von Personen mit der Schwedischen Mutation unter Verwendung der in 4A gezeigten ELISA Methode. In 5a haben die Personen 1–5 keine Mutation, die Person 6 hat die Mutation und zeigt klinische Symptome von AD, die Personen 7–10 haben die Mutation, zeigen aber keine klinischen Symptome von AD. Wie erkennbar ist, haben die Patienten Nr. 6 und Nr. 9 hohe Werte an ALIAS.
  • In Beispiel 2, 5b, wurden die Seren von einem Patienten mit sporadischer, postmortem bestätigter AD, und von Patient 6 aus Beispiel 1 der kationischen SDS-freien Polyacrylamidelektrophorese, Western Blot Analyse und nachfolgend Immunreaktion mit anti-ALIAS b unterworfen. Positiv reagierende Banden wurden durch anschließende Behandlung mittels eines Chemilumineszenz-anti-Kaninchen IgG Systems sichtbar gemacht. Wie ersichtlich ist, reagiert anti-ALIAS mit Proteinbanden in beiden Fällen, dem Serum der sporadischen AD sowie der AD mit der Schwedischen Mutante. Es ist auch erkennbar, dass der Antikörper mit einem Komplex in Wechselwirkung tritt, was, wie wir in anderen Experimenten ermittelt haben, der ein Komplex aus ALIAS und endogenem human-anti-ALZAS IgG ist.
  • Zusammenfassend kann ALZAS2p, wenn es exprimiert ist, einige der biochemischen Aktivitäten des in AD involvierten ALSASp nachahmen.
  • Der Einfluß von Mutationen in den APP Exons 16 & 17 auf die Expression der ALIAS Proteine
  • Es besteht eine entfernte Möglichkeit, dass die Region auf Chromosom 21, wo alzas, alzas1 und alzas 2 lokalisiert sind, ein Duplikat von einer kleinen Region von Chromosom 21 ist. In diesem Falle wären diese Gene nicht obligatorisch betroffen von Mutationen im vollständigen Chromosom. Jedoch ist es wahrscheinlicher, dass die Gene von innerhalb des APP Gens transkribiert werden, entweder in bestimmten Zellgruppen oder nur, wenn die Promotoren durch toxische intra- oder interzelluläre Faktoren, die in neuronalen Zellen produziert werden, oder durch toxische Substanzen, die in solche Zellen aus der äußeren Umgebung gelangen, sporadisch aktiviert werden. Andere Mutationen auf Chromosom 21, die die Konfiguration der DNS-Sequenzen in den Exons 16 und 17 beeinflussen und die mit früh auftretender AD in Zusammenhang gebracht worden sind (Mullan, M. und Crawford, F. Trends Neurosci. 16:398–403 (1993), können auch in den alzas Genen auftreten. Die Hardy VI und VG Mutation, die VF Mutation und die in Exon 17 vorkommende Holland-EQ Mutation (Selkoe, D.J. Rev. Neurosci. 17:489–517 (1994); Hardy, J. Clin. Geriatr. Med. 10:239–247 (1994)) haben eine einzige Aminosäureänderung in ALZASp/p1/p2 zur Folge. Jedoch eliminiert die DM zu QL Mutation in Exon 16 (Cai, X.D. et al. Science 259:514–516 (1993)) den normalen orf für ALZASp und ALIAS1p, was zur Nutzung anderer Leserahmen und zur Translation und Expression alternativer Proteine führen kann. Zwei hypothetische Neuropeptide ("[hyp]ALZASp"), gezeigt in 1Hii, und ("[hyp1]ALZASp"), gezeigt in 1Hiii, können von der alzas cDNS übersetzt werden. Aminsäuren 23–40 in [hyp1]ALZASp sind mit der Sequenz von [hyp]ALZAS2p identisch. Wenn sie exprimiert sind, können diese hypothetischen Proteine eine Rolle in der Ätiologie der AD spielen und auch zu Variationen des Krankheitsphänotyps führen, z.B. können die Mutation im Kodon #713, die Schizophrenie verursacht (Jones, C.T. et al., Nature Genet. 1:306–309 (1992)), und die Mutation im Kodon #702, die zum Hollandtyp der erblichen zerebralen Hämorrhage führt (Levy, E. et al, Science 248:1124–1126 (1990)), zu Veränderungen der biochemischen Eigenschaften zumindest eines der hypothetischen Proteine führen.
  • Die folgenden, die AD betreffenden, durch Daten unterstützten Ableitungen wurden gemacht:
    ALZASp hat strukturelle Ähnlichkeiten zu kleinen porenformenden Proteinen. Porenformende Proteine findet man in verschiedenen Organismen. Sie penetrieren Zellmembranen und bedingen Membranschädigung, zumeist in einem sehr kleinen Effektor/Zielzellen Verhältnis. Damit ein Porenformendes Protein effektiv sein kann, müssen zwei interkonvertible Konfigurationen in der Zelle vorhanden sein: (i) um in die Membran eingelagert zu werden, muss das Protein eine hydrophobe Oberflächendomäne besitzen, die aber nicht dominant sein darf, (ii) wohingegen das Protein eine lösliche Einheit sein muss, um das Zytoplasma zur Membran hin zu durchqueren. Die interkonvertiblen Konfigurationen können auf verschiedenen Wegen erlangt werden einschließlich Oligomerisierung oder Wechselwirkung von hydrophoben Stellen mit einem Chaperon. Um in die Membran einzudringen, erfolgt beim Kontakt mit der Membran die Dissoziation des Oligomers, was die hydrophobe Domäne des Proteins wieder exponiert und damit die Einlagerung in die Membran antreibt. ALZASp besitzt das APP Transmembransignal; daher kann ALIAS genau wie APP zwischen der Membran des endoplasmischen Retikulums (ER) und dem Zytoplasma umgelagert werden und in die gleichen Stellen wie APP in die Plasmamembranen eingelagert werden.
  • Innerhalb der Zelle werden als Antwort auf das Anheften bestimmteR infektiöser Agenzien sowie sekretorischer Produkte solcher Agenzien an lokalisierte Regionen von Zellmembranen spezifische Zytoskelettproteine durch Tyrosin Phosphatasen hochgradig phosphoryliert und bilden organisierte Zytoskelettstrukturen. Letztere interagiert mit der Zellmembran direkt unterhalb des Kontaktpunktes auf der Oberflächenmembran, was das Eindringen des Agens in das Zytoplasma erleichtert. Tau könnte speziell als Antwort auf die Wechselwirkung zwischen ALIAS und Membranen einer spezifischen Gruppe von Neuronen mobilisiert und hyperphosphoryliert werden. Außerhalb der Zelle bedingt der Eintritt von ALIAS in die neuronale Plasmamembran die Freisetzung von IgG, IgM und anderen immunologischen Faktoren sowie deren Bindung an das membrangebundene Protein, speziell an die einzigartige C-terminale Sequenz. Dies wirkt als Signal für den Aufbau der Komplementkaskade, die ALIAS-tragende Zellen zum Zweck der Zerstörung und im Bemühen um Beseitigung angreift.
  • Zusammenfassend werden die klinischen Symptome von AD durch eine Kombination aus den durch ALZASp verursachten Verlust von APP von neuronalem ER und Plasmamembran, sowie der langsamen Auflösung der betroffenen neuronalen Membran durch gegen ALZASp auf den Membranoberfläche gerichtetes Komplement hervorgerufen. Letzteres führt zu einer autoimmunähnlichen Situation in den von der Krankheit betroffenen Regionen des Gehirns.
  • Die Anwendungen der in dieser Erfindung beschriebenen Moleküle
  • A. Diagnostische Anwendungen
  • ALZASp ist bei allen klinisch positiv diagnostizierten AD Patienten exprimiert. ALIAS wird auch exprimiert in 2 von 5 Menschen, die 65 Jahre alt oder älter und bezüglich AD klinisch unauffällig sind (einige von ihnen haben andere neurodegenerative Krankheiten), wohingegen ALIAS nicht bei Menschen gefunden wird, die mit Bestimmtheit normal sind, d.h. Menschen < 50 Jahre ohne sichtbare Symptome oder solchen in der Vorgeschichte. Allerdings wurde ALIAS im Speichel von Frauen in der Menopause, die an von Depression begleiteter Osteoporose litten, gefunden. Die der Nachweis dieser Moleküle kann mit einer beliebigen von vielen immunologischen Methoden erfolgen (Yolken, R.H., Rev. Infect. Dis. 4:35 (1982); Collins, W.P., In: Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons, NY (1985); Ngo, T.T. et al., In: Enzyme Mediated Immunoassay, Plenum Press, NY (1985)); hierin durch Referenz eingeschlossen.
  • In einer Ausführung kann der von uns hergestellte, auf den Sequenzen in Tabelle 1b basierende, affintätsgereinigte monospezifische Antikörper ALZab2 in irgendeinem Immunassay zum Nachweis von ALZASp verwendet werden, mit Dotblot-Methoden oder quantitativen Methoden wie den Sandwich-ELISA- oder Einfang-ELISA-Techniken wie in 5A + B beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführung kann die Gegenwart von alzas und mRNS in einer Zelle oder in einer Flüssigkeit, wie hierin beschrieben, mit jeder Methode nachgewiesen werden, die in der Lage ist, die für diese Proteine kodierende mRNS zu detektieren.
  • Solche Nukleinsäure-basierten Tests können entweder DNS oder RNS nutzen, um dsas, alzas, alzas1 und alzas2 mRNS nachzuweisen. In einer Ausführung kann der Test mit RNS ausgeführt werden, die aus Blutzellen extrahiert wurde, wie in den Spezifikationen hierin beschrieben. Die Assays können an einer Gewebebiopsie durchgeführt werden unter Verwendung z.B. der PCR (Mullis, K.F., Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 51:263–273 (1986); Saiki, R.K. et al., Bio/Rechnology 3:1008–1012 (1985); Mullis, K. et al., U.S. Patent 4,683,202 ; Erlich, H., U.S. Patent 4,582,788 ; Saiki, R. et al., U.S. Patent 4,683,194 und Mullis, K.B. et al., Meth. Enzymol. 155:335–350 (1987), transcriptionsbasierten Amplifikationssystemen (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86;1173 (1989); Gingeras, T.R. et al., PCT Anmeldung WC 88/10315; Davey, C. et al., Europäische Patentveröffentlichung Nr. 329,822 ), u.s.w.
  • B. Prognostische Anwendungen
  • Die vorliegende Erfindung liefert zudem die Möglichkeit, sehr früh vorherzusagen, ob ein asymptomatisches Individuum die Alzheimer Krankheit hat. Somit kann jeder der beschriebenen Assays an asymptomatischen Individuen durchgeführt werden, um das Stadium der Krankheit festzustellen.
  • C. Therapeutische Anwendungen
  • Signifikanterweise liefert die vorliegende Erfindung Möglichkeiten für die Behandlung von AD. Eine solche Behandlung kann entweder "prophylaktisch" sein oder "therapeutisch". Eine prophylaktische Behandlung ist eine Behandlung, die vor jeglicher klinischer Symptomatik von AD gegeben wird, um das Auftreten der Krankheit zu verhindern oder zumindest abzuschwächen. Eine therapeutische Behandlung ist eine Behandlung, die als Antwort auf den Beginn der Symptome von AD gegeben wird und dient der Abschwächung/Milderung der tatsächlichen Krankheitssymptome.
  • In einer Ausführung wird eine solche Behandlung gewährleistet, indem einem Patienten, der dieser Behandlung bedarf, eine effektive Menge eines Antikörpers gegeben wird, oder auch eines Antikörperfragments (F(ab'), F(ab')2, Einzelkette Antikörper usw., welche in der Lage sind, an ALIAS zu binden (aa67–79).
  • Die Immuntherapie kann in Form eines aktiven Impfstoffes erfolgen, z.B. mit multiplen, auf der ALIAS Sequenz basierenden Antigenepitopen, oder eines passiven Impfstoffes, z.B. mit humanisierten Antikörpern (siehe humanisierte Antikörper in den folgenden Referenzen, die durch die Auflistung hierin inkorporiert sind (Morrison, S.L., Science 229:1202–1207 (1985); Oi, V.T. et al., Bio-Techniques 4:214 (1986); Jones, U.T. et al., Nature 321:552–525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239:1534 (1988)).
  • In einer anderen Ausführung kann die erwünschte Therapie durch den Angriff auf das Nukleinsäuremolekül, speziell auf die Promotorsequenzen Palzas 1–7 der vorliegenden Erfindung, mit "Antisens"-Nukleinsäurermolekülen erlangt werden. Antisense Oligonukleotide werden in den Europäischen Patentveröffentlichungen Nummern. 263,740 ; 335,451 und 329,882 , sowie in PCT Veröffentlichung Nr. WO90/00624 beschrieben. Wie hierin verwendet, sind Antisens-Nukleotide eine DNS oder eine RNS, deren Sequenzen komplementär zu den Sequenzen 6 oder PALZ1 bis PALZ7 ist, so dass sie in der Lage ist, an einen endogenen Promotor oder eine Heatshock-Sequenz in einer Art zu binden oder mit ihnen zu hybridisieren, dass die Transkription ausreichend behindert und die Sequenz in der Zelle inaktiviert wird; oder dessen Sequenz komplementär ist zu alzas – Nukleotid 96–135, oder alzas1 – Nukleotid 55–156, oder alzas2 – Nukleotid 96–135 und dadurch die Translation zum Protein beeinträchtigt (d.h. abschwächt oder verhindert). Diese Moleküle können als eine geeignete pharmazeutische Verbindung mittels des Protein-Polycation Systems (Beug, H. et al. United States Patent 5,354,84411 /101994) in die Zelle transportiert werden, siehe auch (Oldham, R.K. In: Principles of Biotherapy, Raven Press, NA (1987) und Ledley, F.D., In: Biotechnology, A Comprehensive Treatise, Ausgabe 7B, Gene Technology, VCH Publishers, Inc. NY, Seiten 399–458 (1989)). Die Prinzipien dieser Erfindung können zur prophylaktischen Gentherapie für Individuen, die als Folge von ererbten genetischen Mutationen oder durch somatische Zellmutation für Alzheimer prädisponiert sind, verwendet werden.
  • Somit kann in einer Ausführung dieser Erfindung ein Antisens-Oligonukleotid, welches entworfen wurde, um spezifisch die Transkription und Translation des alzas-, alzas1- oder alzas2-mRNS-Transkriptes zu blockieren, verwendet werden, um die Expression von ALZASp in einer Zelle zu beeinträchtigen und somit eine Behandlung von AD zu gewährleisten.
  • In noch einer weiteren Ausführung wird eine solche Behandlung durch Gabe einer effektiven Menge von Cys-Cys-reduzierenden Agenzien an den Patienten bereitgestellt, wodurch die Oligomerisierung von ALZASp inhibiert oder reduziert wird.
  • III. Administration der Moleküle dieser Erfindung
  • Zusätzliche pharmazeutische Methoden können angewendet werden, um die Wirkdauer eines jeden der beschriebenen Reagenzien zur Behandlung von AD zu kontrollieren. Solche Techniken sind bei Remingtons's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben.
  • Rätselhafte Fragen, die durch diese Erfindung beantwortet werden
  • Die Entdeckung, dass die für Aβ kodierenden Gene von der APP-mRNS getrennt sein können, hat Einsichten darüber gebracht, wie und warum Mutationen in verschiedenen Regionen des APP Gens, einschließlich Regionen außerhalb der Aβ-Kodierungsregion, die AD hervorrufen können. Sie hat zudem eine Erklärung für die AD-ähnlichen Symptome in transgenen, die APP-mRNS exprimerenden Mäusen, sowie in Mäusen, bei denen die Transkription der APP-mRNS blockiert war, geliefert.
  • Diese Erfindung erlaubt es, ein umfassendes Modell für AD aufzustellen.
  • DAS MODELL
  • Innerhalb der Zelle werden spezifische Zytoskelettproteine als Antwort auf das Anheften bestimmter infektiöser Agenzien oder sekretorischer Produkte solcher Agenzien an lokalisierte Stellen der Zellmembranen in hohem Grade durch aktivierte Tyrosinphosphatasen phosphoryliert und bilden organisierte Zytoskelettstrukturen. Letztere interagiert mit der Zellmembran direkt unterhalb des Kontaktpunktes auf der Oberflächenmembran, was das Eindringen des Agens in das Zytoplasma erleichtert. Tau könnte speziell als Antwort auf die Wechselwirkung zwischen ALIAS und Membranen spezifischen Untergruppen von Neuronen mobilisiert und hyperphosphoryliert werden. Außerhalb der Zelle bedingt der Eintritt von ALIAS in die neuronale Plasmamembran die Freisetzung von IgG, IgM und anderen immunologischen Faktoren sowie deren Bindung an das membrangebundene Protein, speziell an die einzigartige C-terminale Sequenz. Dies wirkt als Signal für den Aufbau der Komplementkaskade, die ALIAS-tragende Zellen zum Zweck der Zerstörung und im Bemühen um Beseitigung angreift.
  • Basierend auf unseren Resultaten, sowie den Überlegungen und Ergebnissen Anderer in der Literatur, haben wir das folgende Modell für AD vorgeschlagen, welches zeigt, wie die unterschiedlichen AD-bezogenen Proteine miteinander Wechselwirken und den AD Phänotyp hervorrufen. Das Modell kann rigoros getestet werden.
  • DIE ENTSTEHUNG DER AD
    • 1. Transkription und Expression von ALIAS werden durch jeden einer Anzahl von externen und intrazellulären Faktoren aktiviert, einschließlich Stress, viröse und andere pathogene Invasionen und Umwelttoxine. Dies findet in einem spezifischen Zelltyp (vielleicht Lymphozyten) statt. ALIAS Moleküle aggregieren um löslich zu bleiben, durchqueren das Zytoplasma, wobei sie die gleiche Route wie APP benutzen, und werden ausgeschieden.
    • 2. Ausgeschiedenes ALIAS wird wegen seines einzigartigen C-Terminus, der von Intronsequenzen kodiert wird als „fremd" (d.h. ein endogenes Pathogen) angesehen. Lösliche Antikörper IgM, IgG, IgA (anti-ALIAS IgG), die als Antwort auf ALIAS produziert werden, binden an ALIAS und neutralisieren es.
    • 3. Bedingungen, die die Effizienz des Immunsytems verringern, wie z.B. bestimmte virale Infektionen, physiologisches Altern usw., erlauben einer zunehmenden Zahl von ALIAS Molekülen der Zerstörung zu entkommen. Diese Moleküle interagieren mit Zellmembranen von spezifischen Unterpopulationen von Neuronen (Zielzellen), dringen in die Membran ein und zerstören sie.
    • 4. Wechselwirkungen von ALIAS mit Membranen von Zielneuronen triggern zwei physiologische Hauptantworten. (i) Die Aktivierung von Tyrosinphosphatasen, die tau zu PHF-tau konvertieren. Letzteres geht eine Wechselwirkung mit der zytoplasmischen Seite der Membran unterhalb des Punktes der Wechselwirkung mit ALIAS ein und bildet lange neurofibrilläre Strukturen, die den Eintritt von ALIAS ins Zytoplasma erleichtern, und (ii) die Aktivierung des Komplementsystems, das um die Zerstörung von ALIAS bemüht ist. Weil spezifische Aminosäuresequenzen, die von Komplementsystemproteasen zielgerichtet angegriffen werden, in ALIAS und APP identisch sind, wird auch APP durch die gegen ALIAS gerichteten Protease/n zerschnitten und zerstört. Die Komplement-vermittelte Zerstörung des neuronalen Membran-APPs resultiert in einer lokalen akuten Entzündungsreaktion und einer autoimmunartigen entzündlichen Zerstörung der betroffenen Neuronen.
    • 5. ALIAS geht mit ApoE Proteinen auf eine Weise Wechselwirkungen ein, die die hydrophobe Domäne verbirgt und es dem Komplex erlaubt, im Zytoplasma löslich zu bleiben; auf diese Weise wird ALIAS „chaperoned" (in einer löslichen Form transportiert) zwischen dem neuronalen Zytoplasma, dem ER und der neuronalen Plasmamembran. Wenn ALIAS mit ApoE2 oligomerisiert, und, in geringerem Ausmaß, mit ApoE3, entstehen Cys-Cys Wechselwirkungen zwischen den beiden Molekülen, was ALIAS in einer löslichen Form verbleiben lässt, in der das Protein nicht das ER durchqueren kann.
    • 6. Wenn ALIAS mit ApoE4 oligomerisiert, das keinen Cys-Rest besitzt, behält ALIAS beim Kontakt mit den ER-Membranen den monomeren Status bei, in welchem das hydrophobe Membransignal exponiert ist und das Protein mit APP konkurriert, es ersetzt und verhindert, dass APP die Stellen am ER besetzt. Das normalerweise ER-gebundene APP verbleibt im Zytoplasma, wo es durch zelluläre proteolytische Aktivität in kleinere Fragmente, inklusive verschiedener Aβ-Spezies, abgebaut wird.
    • 7. PS1/PS2 sind Teil einer hochspezifischen APP-Bindestelle in neuronalen ER-Membranen. Mutationen in irgendeinem Teil des PS1/PS2 Moleküls, die auch nur den geringsten Effekt auf die Konformation haben, oder Mutationen in APP, die in der Nähe oder innerhalb des Transmembransignals erfolgen, verringern in beträchtlichem Ausmaß die Spezifität der Wechselwirkung zwischen APP und der PS1/PS2-Komponente der Bindestelle und bewirken eine noch höhere Präferenz der ALIAS-Bindung an APP Transmembranstellen. Während APP durchgeschleust wird und alle seine erforderlichen biochemischen Aktivitäten ausübt, bedingt ALIAS wahrscheinlich die Auflösung der Membran, was im Verlust der Funktion von ER Membranproteinen resultiert.
    • 8. Aβ, das der vielleicht am meisten resistente Teil von APP gegenüber Proteasen ist, und lange, klebrige, von PHF-tau gebildete Faden-bildende Neurofibrillen werden durch die „Auflösung" der Membranen in den Extrazellulären Raum entlassen
  • Nachdem nun die Erfindung unter Einbindung von Referenzen und Beispielen, die sie für jeden mit ausreichender Fachbildung leichter verständlich macht, allgemein beschrieben wurde, muss darauf hingewiesen werden, dass diese nicht für die vorliegende Erfingung beschränkend sein sollen, es sei denn, dies ist ausdrücklich so spezifiziert.
  • Zurzeit haben wir unter Verwendung von ALZab2 mit der bereits beschrieben en Immunblot-Methode ALZASp in Blutproben von einem aus fünf (5 aus 19) Menschen nachgewiesen, welche kognitiven und anderen Tests unterworfen waren, die man mit Leuten mit Anzeichen macht, von denen man annimmt, dass sie mit dem Beginn der AD assoziiert sind. Der Nachweis wurde mit 1 μl von Gesamtblutproben durchgeführt, die für andere routinemäßige Untersuchungen frisch von Patienten in Verbindung mit der AD-Testroutine des Institutes entnommen wurden. Unter Verwendung der gleichen Methode wie oben genannt, detektiert der Antikörper ALZASp in 100% aller Blutproben, die von AD-Patienten kurz nach dem Tod entnommen wurden.
  • Diese Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.
  • 4
    • (A) = Beschreibung des Antigen-Einfang ELISA Tests
    • (B) = Beschreibung des Antikörper-Einfang ELISA Tests
    • (C–E) Nachweis der Expression von ALIAS-verwandten Proteinen ALZASp (ALIAS) in 2 μl auf eine Nylonmembran gespottetem humanem Blut unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Detektionssystems. Für die Dotblots wurden aus Gehirn und Lymphozyten extrahierte Proteine mit Ammoniumsulphat gefällt, dialysiert und für 5 Minuten in 5% SDS gekocht. 2 μl der mit SDS behandelten Proteine wurden auf die Nylonmembran gespottet, mit dem geeingeten Antikörper behandelt und mit einem Chemiluminseszenzsystem detektiert.
    • (F) Dotblots mit Serum von 28 durch Autopsie bestätigte AD-Opfer wurden mit ALZab2 getestet (mind. 50% dieser Patienten waren vor ihrem Tod fälschlich für eine andere Krankheit als AD diagnostiziert worden); D 6&7 = positive Kontrolle; D 9 & 10 = negative Kontrolle
    • (G) Dotblots mit Serum von Patienten mit vermuteter früher AD, Patienten mit Depression und durch Autopsie bestätigten AD-Opfern: A 1 = physiologische Alterung; B 1 = Parkinson Krankheit; A 2-4, 6-7, B 3, 5, C 2, 3 = AD mit Depression; A 5, 8, B 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10 = vermutete AD, C 1, 6-10 = Serum von bestätigter AD; D 1-10 Serum von normalen Personen.
    • (H) Nachweis von endogenem anti-ALIAS IgG in Patientenblut, -serum und -speichel: (i) Serumproben von Japanischen Patienten, die 1995 im Krankenhaus starben; gefüllte Kreise = Serum von AD-Patienten, offene Kreise = durch Autopsie bestätigte Personen ohne AD; (ii) Serum von Patienten diagnostiziert für AD und zufällig ausgewählte, klinisch normale Personen: gefüllte Kreise = AD Patienten; leere Kreise = klinisch normale Personen; (iii) Serum von Personen mit M > L-verwandter FAD, offene Kreise = Familienmitglieder ohne die Mutation und ohne klinische Symptome von AD; gefüllte Kreise = Familienmitglieder mit der Mutation aber ohne klinische Anzeichen für AD; große Kreise mit gefülltem Inneren: Familienmitglied mit der Mutation und mit klinischer AD.
    • (I) Western Blots; Proteine in Ammoniumsulphatpräzipitaten wurden auf 17,5% Acrylamidgelen elektrophoretisiert, auf Nylonfilter gespottet, mit dem geeigneten Antikörper reagiert und mit dem Immunchemilumineszenzsystem detektiert, 2. Proteine wurden aus AD-Hippocampus isoliert und mit Antikörper ALZab2 behandelt; 3. Proteine wurden von AD-Hippocampus isoliert und mit Antikörper ALZab3 behandelt.
  • 5A–D
    • (A) Isolierung von ALIAS aus dem Cortex eines einzelnen durch Autopsie bestätigten AD-Patienten. Das Protein wurde auf an CNBR-Sepharose gebundenem anti-ALZab2 Anrikörper affinitätsgereinigt. Das Gel wurde auf eine Nylonmembran geblottet und das Protein mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem detektiert.
    • (B) Silber-gefärbtes SDS-Gel: Proteine erhalten von einem Patienten mit spät beginnender AD nach Affinitätsreinigung von ALIAS. Zusätzlich zu ALIAS wurde ALIAS gebunden an verschiedene Immunglobuline und an APOE detektiert und durch spezifische Färbung auf Duplikatgelen bestätigt.
    • (C) Nachweis von auf Gel in 5B vorhandenen ALIAS-IgG-Komplexen mit anti-Human-IgG (FC-Fragment)
    • (D) Western Blot eines Kationischen nicht-SDS (nativen) Polyacrylamidgels nach elektrophoretischer Trennung von Serum von (a) einer/m Patientin/en mit sporadischer AD und (b) einer/m Patientin/en mit AD mit der Schwedischen Mutation. Die Gele wurden zuerst mit anti-ALZASab1 und dann mit dem Chemilumineszenzsystem reagiert. ALIAS wurde in (a) nachgewiesen, und ALZAS2 in (b). Die obere Bande in (a) ist ALIAS, und in (b) ALZAS2, beide komplexiert mit humanem IgG. ALIAS und ALZAS2 haben etwas unterschiedliche isoelektrische Punkte, was auf den Gelen erkennbar ist.
  • TABELLE 1a Zum Nachweis der mRNA in post-mortem Gehirnen und Lymphozyten verwendete PCR Primer.
    Primer:
    alz287 erwartete Produktgröße = 287 bp
    vorwärts GTGGACAAATATCAACACCGAGGAG
    rückwärts ACATAGTCTTAATTCCCACTTGG
    alz393 erwartete Produktgröße = 393 bp
    vorwärts GTCCTGCATACTTTAATTATGATG
    rückwärts AGCCATCATGGAAGCACACTGATTCG
    TABELLE 1b Gegen die folgenden Epitope gerichtete Antikörper wurden zur Detektion von Proteinen von post-mortem Gehirnen und Lymphozyten verwendet
    *
    ALZab2 VGKLDCMFPSGNC
    ALZab5 EBGKLDC
    • * = zugefügter Cys-Rest zur Verbessertem Konjugation mit KLH
  • LISTE DER SEQUENZEN
    Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001

Claims (13)

  1. Ein Nukleinsäuremolekül welches frei von natürlichen Kontaminationen ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem alzas Promotor und alzas besteht, deren Sequenz SEQ ID NR:11, SEQ ID NR:17, SEQ ID NR:18, SEQ ID NR:19, SEQ ID NR:20, SEQ ID NR:21, SEQ ID NR:22, SEQ ID NR:23 ist.
  2. Ein Proteinmolekül welches frei von natürlichen Kontaminationen ist und aus ALIAS besteht, dessen Sequenz SEQ ID NR:12, insbesondere Aminosäuren 68–79 ist.
  3. Ein für ALIAS spezifischer Antikörper, wobei die Sequenz von ALIAS SEQ ID NR:12 ist und der Antikörper insbesondere gegen Aminosäuren 68–79 (ALZab2 beschrieben in Tabelle 1b) gerichtet ist.
  4. Ein Antikörper oder ein Antikörperfragment oder Einzelkettenantikörper, oder eine Kombination aus diesen, die spezifisch an Aminosäuren 68–79 der SEQ ID NR:12 (ALZab2 beschrieben in Tabelle 1b) binden können, zum Gebrauch in der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung der Alzheimer Krankheit.
  5. Der Gebrauch eines Antikörpers oder eines Antikörperfragments oder eines Einzelkettenantikörpers, oder einer Kombination aus diesen, die spezifisch an Aminosäuren 68–79 der SEQ ID NR:12 (ALZab2 beschrieben in Tabelle 1b) binden können (s. Ansprüche 2 oder 3) zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische Behandlung der Alzheimer Krankheit.
  6. Ein wie in Anspruch 4 definierter Antikörper, wobei der Antikörper ein monospezifischer polyklonaler Antikörper oder ein monoklonaler Antikörper oder ein rekombinanter Antikörper oder ein humanisierter Antikörper ist.
  7. Antisense-Nuldeotidsequenzen, die spezifisch für das Molekül sind, welches die zum alzas Promotor SEQ ID NR:17, SEQ ID NR:18, SEQ ID NR:19, SEQ ID NR:20, SEQ ID NR:21, SEQ ID NR:22, SEQ ID NR:23 komplementäre Sequenz besitzt.
  8. Der in vitro Gebrauch einer Antisense-Nukleotidsequenz von Anspruch 7.
  9. Eine Methode zur Diagnose oder präsymptomatischen Diagnose der Alzheimer Krankheit, welche den Nachweis eines Proteins definiert durch SEQ ID NR:12 (Aminosäuren 68–79) in einer Gewebeprobe oder einer Flüssigkeit, oder den Nachweis von alzas mRNA wie durch SEQ ID NR:11 definiert beinhaltet.
  10. Eine Methode zur Diagnose oder präsymptomatischen Diagnose der Alzheimer Krankheit, welche den Nachweis eines Antikörpers mit Spezifität für Aminosäuren 68–79 (SEQ ID NR:12) (s.a. Ansprüche 2 und 3) beinhaltet.
  11. Ein Antikörper wie definiert in den Ansprüchen 4 oder 6, wobei die Krankheit Alzheimer Krankheit ist.
  12. Der Gebrauch wie definiert in Anspruch 5 wobei der Antikörper wie in Anspruch 6 definiert ist.
  13. Der Gebrauch wie definiert in Anspruch 11, wobei die Krankheit wie definiert in Anspruch 11 ist.
DE69737754T 1996-08-22 1997-08-22 Substanzen für die präsymptomatische erkennung und zielgerichtete therapie der alzheimer-krankheit beim menschen. Expired - Lifetime DE69737754T2 (de)

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