KR100803996B1 - 아밀로이드 전구체 단백질 프로세싱 저해제 - Google Patents

아밀로이드 전구체 단백질 프로세싱 저해제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 β-세크레타제, 및/또는 γ-세크레타제 절단 자리에 결합하며, 아밀로이드 전구체 단백질 프로세싱의 저해제에 관한 것이다.
세크레타제, 전구체, 아밀로이드, 단백질 프로세싱, 저해제

Description

아밀로이드 전구체 단백질 프로세싱 저해제{INHIBITORS OF AMYLOID PRECURSOR PROTEIN PROCESSING}
본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein, APP) 프로세싱 저해제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 아밀로이드 전구체 단백질을 이를 필요로 하는 대상에게 적용하여 알츠하이머를 치료하는 것에 대한 것이다.
알츠하이머 질병(Alzheimer's disease, AD)는 노인성 치매의 가장 잘 알려진 원인중 하나이며, 인지력의 점진적 상실이 임상적인 특징인 중추신경계의 복합 질병이다. 알츠하이머 질병의 병리학적 특징은 세포외 노인반점, 비정상적인 타우(tau) 짝을 이룬 헬릭스 형태의 필라멘트로 구성된 신경섬유의 다발성 병변, 뉴런 상실, 대뇌 아밀로이드 백관병증, 뇌의 특정영역에서의 심혈관의 퇴행 등이다.(Marti et al., Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95(26):15809-15814; Yamada M., Neuropathology 2000; 20(1): 8-22; Yankner BA, Neuron 1996;16(5):921-932).
베타-아밀로이드(β-amyloid, Aβ)는 노인반점의 주요성분이고, 아밀로이드 전구체 단백질의 단백질 분해에 의해 생성된다.(Vassar et al., Neuron 2000; 27(3): 419-422) 베타-아밀로이드가 알츠하이머 질병의 가장 주요한 원인이라는 것을 제시할만한 증거가 비록 축적되어 있기는 하지만(Calhoun et al., Nature 1998;395(6704):755-756; Hardy et al., Science 1992;256(5054):184-185; Hsiao et al., Science 1996;274(5284):99-102; Lewis et al., Science 2001;293(5534):1487-1491; Schenk et al., Nature 1999;400(6740):173-177; Sommer B., Curr Opin Pharmacol 2002;2(1):87-92; Thomas et al., Nature 1996;380(6570):168-171), 알츠하이머 질병에서 뉴런 퇴행에 대한 정확한 기작은 명확히 밝혀져 있지 않다. 그러나, 여러 가지 인자가 알츠하이머 질병에 관련되어 있을 것이다.
알츠하이머 질병은 65세 이상의 인구중 1%을 차지하는 진행성 뉴런퇴행 치매이다. 그러나, 주요한 병리학적 특징은 뇌의 연합중추 및 변연 영역에서 노인반점의 과다한 확산과 밀집에 있다. 이들 노인반점이 여러 가지 단백질을 포함하고 있지만, 이들의 코어는 베타-아밀로이드가 주로 포함되며, 베타-아밀로이드는 아밀로이드 전구체 단백질로부터 유래되는, 40-42개 아미노산의 단백질 분해성 단편이다(Selkoe DJ. Cellular and molecular biology of b-amyloid precursor and Alzheimer's disease. In: Prusiner SB, Rosenberg RN, Mauro SD, et al, eds. The molecular and genetic basis of neurological disease. Boston: Butterworth Heinemann Press, 1997:601-602).
아밀로이드 전구체 단백질은 단일 막관통 단백질로서 590-680 아미노산으로 이루어진 세포외 아미노말단 도메인과, 세포내 전달 신호서열을 포함하는 약 55 아미노산으로 구성된 세포질 테일을 가진다. 염색체 21상에 위치하는 아밀로이드 전구체 단백질 유전자의 mRNA는 선택적 스플라이싱을 통해 가능한 8개 동소 체(isoform)을 생산하며, 그중 3개 동소체(695, 751 및 770 아미노산 동소체)가 뇌에 우세하게 존재한다. APP695는 세개 중에서 가장 짧은 것으로서 뉴런에서 주로 생산한다. KPI 도메인 및 MRC-OX2 항원 도메인을 모두 포함하는 APP770는 비-뉴런 신경 아교세포는 주로 존재한다. 세 가지 동소체 모두 동일한 베타-아밀로이드, 막관통 및 세포내 도메인을 포함하고, 모두 잠재적인 아밀로이드를 생산가능하다. 아밀로이드 전구체 단백질의 정상적인 기능은 현재 알려져 있지 않으며, 신경세포 돌기신장(neurite extension) 및 기억에 주요한 역할을 수행할 수 있는 시냅스에 위치하는 것으로 설명되고 있다.
아밀로이드 전구체 단백질을 두 가지 경로를 거쳐서 단백질 분해 프로세싱(processing)을 거칠 수 있다. 베타-아밀로이드 도메인내에서 α-세크레타제 (α-secretase)에 의한 절단이 일어나 큰 수용성 N-말단 APPa 과 비-아밀로이드성 C-말단 단편을 생성한다. 이들 단편이 γ-세크레타제 (γ-secretase)에 의해 추가적인 분해로 다른 비-아밀로이드 생성형 펩타이드 p3을 생산한다. 혹은, b-세크레타제(b-secretase)에 의한 APP의 절단은 베타-아밀로이드 도메인의 초기에서 일어나서 더 짧은 수용성 N-말단, APPb 이외에, 아밀로이드 생성형 C-말단 단편(C99)생성한다. 또한, γ-세크레타제에 의해 상기 C-말단 단편을 추가로 절단함으로써 베타-아밀로이드를 생성시킨다. γ-세크레타제 또는 다중 γ-세크레타제에 의한 절단으로 C-말단이 다른 베타-아밀로이드인 Aβ40 과 Aβ42를 생성한다.
더욱 상세하게는, APP는 구성적 분비 경로를 통해 전달되고, 여기서 다양한 단백질 분해성 절단을 포함하는 번역후 프로세싱을 거친다. APP는 세 가지 효소, α-, β-, 및 γ-세크레타제에 의해 절단될 수 있다(도 1). α-세크레타제는 베타-아밀로이드 도메인의 17번째 아미노산을 절단하여 분비를 위한 큰 아미노-말단 단편 sAPPα을 생성한다. α-세크레타제가 Ab도메인내에서 절단을 하기 때문에, 이러한 절단이 Ab 형성을 시작하게 된다. 또한, α-세크레타제에 의해서 생성된, APP의 세포내 카르복시-말단 도메인은 이어서 예측된 막관통 도메인에서 γ-세크레타제에 의해 절단되어, p3 말단을 갖는 비-아밀로이드성 22-24 잔기(~3KD) 단편을 생산한다. 또는, APP는 β-세크레타제에 의해서 절단되어 Ab형의 아미노-말단을 형성하고 수용성 아미노말단 단편인 APPb 를 생성한다. γ-세크레타제에 의한 연이은 APP의 세포내 카르복시 말단의 절단으로 완전한 길이의 Aβ를 얻게 된다. g-세크레타제에 의한 Aβ의 카르복시 말단 절단으로 여러 가지 펩타이드가 생성되며, 이중 가장 흔한 두 가지 펩타이드인 40-아미노산 Aβ(Aβ40)과 42-아미노산 Aβ(Aβ42)이다. Aβ40은 90-95%의 분비된 Aβ를 구성하며 뇌척수액에서 회수된 우세한 종이다(Seubert et al., Nature; 359:325-7 (1992)). Aβ42 생산은 상대적으로 부족할지라도, Aβ42는 노인반점에서는 우세하게 발견되며 초기에 침착되는 것이며 (Iwatsubo et al., Neuron; 13:45-53 (1993)), 이는 아마도 불용성 아밀로이드 집합체가 Aβ40보다 더욱 빠르게 형성되는 이의 능력때문일 것이다(Jarrett et al., Biochemistry; 32:4693-7 (1993); Jarret et al., Cell; 73:1055-8 9 (1993)).
Aβ는 알츠하이머 질병의 원인인자로서 추정되었다. Aβ 함유 아밀로이드 반점의 존재가 알츠하이머 질병의 신경병리학적 기전의 진단에 있어서 필수적이며, 이는 Aβ가 알츠하이머질병의 원인에 관련됨을 제시한다. Aβ가 알츠하이머 질병의 원인 인자임을 뒷받침 하는 증거는 종종 40세 이후에 알츠하이머-유사 증후 및 병리현상을 나타내는 다운증후군 환자에서 발견될 수 있다 (Wisniewski et al., Neuron; 35:957-61(1985)). 다운 증후군 환자는 아마도 염색제 21이 추가로 사본이 존재하기 때문에 APP 가 증가되고 다른 알츠하이머 증후군의 개시에 앞서 현저한 알츠하이머-유사 아밀로이드 반점을 나타내며, 이는 아밀로이드 침착이 초기 현상이다 (Giaccone et al., Neurosci Lett; 97:232-8 (1989)).
또한, APP 프로세싱이 변화는 APP상의 상염색체 우세 변이를 갖는 가족유전성 알츠하이머 질병(familial AD, FAD)을 갖는 환자의 발생과 연관이 있다 (Goate et al., Nature; 349:704-6 (1991); Citron et al., Nature; 360:672-4 (1992)), presenilin 1 (PS1; 14) and presenilin 2 (PS2; 15).
Aβ생산 변화가 알츠하이머 진행의 초기 현상일 수 있음을 나타내는 증거가 있은 이후로, 많은 연구가 APP가 가공되어 Aβ을 생성하는 기전을 이해하는 데 촛점이 맞추어져 왔다. 주요 절단 겨로는 뉴런세포 및 비-뉴런세포 모두에서 보존되는 것으로 보이나, 생산이 우세한 세포내 위치 및 구체적인 산물은 세포-유형 의존적이다. 비-뉴런세포는 α-세크레타제 및 γ-세크레타제 절단을 통해 우선적으로 APP가 가공되어 APPα 및 비-아밀로이드성 단편 p3를 생성한다. 따라서, 비-뉴런 세포는 정상적인 조건하에서는 Aβ의 주요한 원천이 되지 않는다. 그러나, 비-뉴런 세포는 우세하게 α-세크레타제를 이용할지라도, 뉴런은 상기 경로에 주로 의존하지 않으며 매우 낮은 수준의 p3을 생성한다 (Chyung et al., J Cell Bio; 138:671- 80 (1997)). 세포 유형에 상관없이, α-세크레타제는 APP를 구성적으로 절단하고 (Sisodia et al., Science; 248:492-5 (1990)), APPα가 세포내에서 탐지되지 않기 때문에, 주로 세포표면에 나타하는 것으로 생각되며(Chyumg et al., J Cell Bio; 138:671-80 (1997); Forman et al., J Biol Chem; 272:32247-53(1997)), 세포 표면에 표지된 APP는 배지에서 APPα가 회수될 수 있다(Sisodia, Proc Natl Acad Sci USA; 89:6075-9 (1992)). β-세크레타제, 및 γ-세크레타제에 의한 절단으로 A β를 생성시키며, 또한 A β가 피코몰 내지 나노몰 농도로 정상적인 뇌에서 탐지되기 때문에, 상기 현상은 구성적인 현상이다(Haass et al., Nature; 359:322-5 (1992); Seubert et al., Nature; 361:260-3 (1993)).
베타-아밀로이드 축적을 방지하는 한 가지 방법은 β-세크레타제, 및/또는 γ-세크레타제가 APP 의 절단 및 프로세싱을 저해하는 방법이다. 그러나, 세크레타제는 생명체에서 많은 여러 가지 단백질의 프로세싱에 관련하기 때문에, 세크레타제 활성을 저해하는 것은 바람직하지 못한 부작용이 야기될 수 있다. 따라서, β-세크레타제, 및/또는 γ-세크레타제를 원천적으로 불활성화시키는 것은 APP 프레세싱을 막는 좋은 방법이 될 수 없다.
따라서, 알츠하이머 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 특히 베타-아밀로이드 생성 및 집합을 저해하는 방법을 제공할 필요가 있다. 추가로, 다른 세포내 작용에는 영향을 미치지 않으면서 APP 프로세싱만을 선택적으로 저해하는 화합물을 개발하는 것이 바람직하다. 더욱이, APP에서 β-세크레타제, 및/또는 γ-세크레타제 자리에 결합할 수 있는 APP-특이적 저해제를 고안하는 것은 상기 세크레타제의 다 른 중요한 기질의 프로세싱을 방지하면서 상기 세크레타제의 접근을 차단할 수 있는 바람직한 방법이다.
본 발명을 상기 문제점에 대한 해결수단을 제공한다. 본 발명은 APP내에 존재하는 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제 절단 자리에 결합하는 몇 가지 폴리펩타이드의 발견에 기초한 것이다. 구체저인 예로 제공되는 것은 다양한 데카머(decamer)들이며 본 발명은 이들 데카머에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 APP내에 존재하는 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제 절단 자리에 결합하는 어떠한 폴리펩타이드, 펩타이드 유사 작용체(mimetic) 화합물에 관한 것이며, 이들은 약 4 내지 20개 아미노산, 특히 약 4 내지 15개 아미노산, 더욱 바람직하게는 4 내지 11 아미노산, 가장 구체적으로는 4 내지 7개 아미노산으로 구성되는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 유사 작용체를 포함한다. 또한, 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 가로지르는 작용 유사체(mimetics)도 고려된다. 더욱이, 약물로서 사용될 화합물은 APP에 대한 높은 친화성과 특이성을 구비하여야만 하며, 안정하고 작으며, 적절한 용해도와 소수성을 가지고 세포막을 관통하여 수송될 수 있어야 한다.
본 발명의 일예에서, 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질의 β-세크레타제 절단 자리에 결합하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 작용유사체 화합물에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드 또는 펩타이드 작용유사체 화합물은 약 4 내지 20개 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 약 4 내지 15개 아미노산 또는 약 4 내지 10개 아미노산을 포함할 수 있다.
아밀로이드 전구체 단백질의 β-세크레타제 절단 자리는 야생형의 경우에 SEVKMDAEFR (SEQ ID NO:1)내에 위치할 수 있다. 그러나, 본 발명은 비-야생형 β-세크레타제 절단 자리, 예컨대 SEVNLDAEFR (SEQ ID NO:2)을 포함할 수 있으나 이는 변이 서열의 일예로 제시되는 것이다. 상기 SEVKMDAEFR (SEQ ID NO:1) 또는 SEVNLDAEFR (SEQ ID NO:2)을 갖는 아밀로이드 전구체 단백질의 절단 산물은 각각 SEVKM (SEQ ID NO:3), DAEFR (SEQ ID NO:4), SEVNL (SEQ ID NO:5), 또는 DAEFR (SEQ ID NO:4). 일 수 있다.
본 발명의 일예에서, 아밀로이드 전구체 단백질의 야생형 β-세크레타제 절단자리에 결합하는 폴리펩타이드는 여러가지 단편, 즉 SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6) 또는 SEFCIQIHFR (SEQ ID NO:7)을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 폴리펩타이드 및 이들의 펩타이드 작용유사체 화합물을 알려진 펩타이드 상보성 및 화학적 합성 방법에 기초하여 야생형 및 비-야생형 β-세크레타제 절단자리에 대해서 합성할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일예에서, 상기 폴리펩타이드는 β-세크레타제 절단 자리를 암호화하는 상보적인 핵산서열로부터 번역될 수 있다. 또한 펩타이드 서열에 기초한 생-작용유사체(biomimetic) 화합물의 배열을 합성하거나 변이를 제조함에 기초하여 다른 펩타이드 유사작용체 화합물을 본 발명에서 고려할 수 있다.
또한, 본 발명은 APP와 β-세크레타제 간의 상호작용을 저해하는 화합물, 예컨대 상술한 폴리펩타이드 또는 펩타이드 작용유사체 화합물을 제공하는 것을 포함하는, APP와 β-세크레타제의 결합을 저해하는 방법에 관한 것이다. 그러나, 상기 화합물은 APP와 β-세크레타제의 결합을 저해할 수 있다면, 어떠한 부류의 화합물일 수도 있다. 본 발명에 따른 저해방법에 있어서, 상기 화합물은 아밀로이드 반점 형성에 의해 표시되는 질병을 갖는 포유동물에게 제공될 수 있다.
본 발명은 APP와 β-세크레타제 결합을 저해하는 화하물을 스크리닝 하는 방법으로서,
(a) β-세크레타제 결합 자리를 함유하는 APP 또는 이의 단편, 그리고 β-세크레타제를 포함하는 시료와 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 APP 또는 이의 단편과 β-세크레타제가 서로 정상적으로 특이적으로 결합하는 조건하에서, β-세크레타제와 상기 APP 또는 이의 단편의 결합 수준을 결정하는 단계;
(c) 상기 화합물이 존재하에서, 상기 APP 또는 이의 단편과 β-세크레타제의 결합 수준을 결정하는 단계; 및
(d) (b) 및 (c)단계에서 기재한, 상기 APP 또는 이의 단편과 β-세크레타제의 결합 수준을 비교하는 단계로서, (b) 단계의 결합수준보다 (c) 단계의 결합수준이 더 낮은 경우, 상기 화합물은 상기 APP와 β-세크레타제 결합 저해제인 것인, 아밀로이드 전구체 단백질과 β-세크레타제의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질과 β-세크레타제의 결합을 저해하는 화합물을 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 알츠하이머 질병의 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질내에 존재하는 β-세크레타제 절단 자리에 특이적으로 결합하며 APP와 β-세크레타제간의 결합을 효과적으로 저해할 수 있는 폴리펩타이드의 활성을 모방하는 펩타이드 작용유사체 화합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 β-세크레타제에 결합하는 상기 폴리펩타이드로서 혈액-뇌 장벽과 같은 세포막을 통한 상기 폴리펩타이드의 수송을 돕는 아미노산 잔기가 공유결합되어 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 바람직한 일예에서, 상기 아미노산 잔기는 아르기닌을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일예에서, 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질내에 존재하는 γ-세크레타제 절단자리에 결합하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드는 약 4 내지 20개 아미노산으로 이루어지며, 또한 약 4 내지 15 아미노산으로 이루어지며, 더욱 자세하게는 약 4 내지 10개 아미노산으로 이루어진다.
상기 아밀로이드 전구체 단백질의 γ-세크레타제 절단자리는 야생형인 GVVIATVIVI (SEQ ID NO:8)일 수 있다. 그러나, 본 발명은 비-야생형γ-세크레타제 절단자리를 포함할 수 있다.
아밀로이드 전구체 단백질의 γ-세크레타제 절단자리에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 PQQYRCHRQR (SEQ ID NO:9) 를 포함할 수 있다. 그러나, 알려진 펩타이드 상보성 및 화학적 합성 방법에 기초하여 야생형 및 비-야생형 γ-세크레타제 절단 자리에 대한 다른 폴리펩타이드 및 펩타이드 작용유사체 화합물을 합성할 수도 있다. 또한 펩타이드 서열에 기초한 생-작용유사체(biomimetic) 화합물의 배열을 합성하거나 변이를 제조함에 기초하여 다른 펩타이드 유사작용체 화합물을 본 발명에서 고려할 수 있다.
또한, 본 발명은 APP와 γ-세크레타제 간의 상호작용을 저해하는 화합물, 예컨대 상술한 폴리펩타이드 또는 펩타이드 작용유사체 화합물을 제공하는 것을 포함하는, APP와 γ-세크레타제의 결합을 저해하는 방법에 관한 것이다. 그러나, 상기 화합물은 APP와 γ-세크레타제의 결합을 저해할 수 있다면, 어떠한 부류의 화합물일 수도 있다. 본 발명에 따른 저해방법에 있어서, 상기 화합물은 아밀로이드 반점 형성에 의해 표시되는 질병을 갖는 포유동물에게 제공될 수 있다.
본 발명은 APP와 γ-세크레타제 결합을 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) γ-세크레타제 결합 자리를 함유하는 APP 또는 이의 단편, 그리고 γ-세크레타제를 포함하는 시료와 화합물을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 APP 또는 이의 단편과 γ-세크레타제가 서로 정상적으로 특이적으로 결합하는 조건하에서, γ-세크레타제와 상기 APP 또는 이의 단편의 결합 수준을 결정하는 단계;
(c) 상기 화합물이 존재하에서, 상기 APP 또는 이의 단편과 γ-세크레타제의 결합 수준을 결정하는 단계; 및
(d) (b) 및 (c)단계에서 기재한, 상기 APP 또는 이의 단편과 γ-세크레타제의 결합 수준을 비교하는 단계로서, (b) 단계의 결합수준보다 (c) 단계의 결합수준이 더 낮은 경우, 상기 화합물은 상기 APP와 γ-세크레타제 결합 저해제인 것인, 아밀로이드 전구체 단백질과 γ-세크레타제의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질과 γ-세크레타제의 결합을 저해하는 화합물을 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 알츠하이머 질병의 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 아밀로이드 전구체 단백질내에 존재하는 γ-세크레타제 절단 자리에 특이적으로 결합하며 APP와 γ-세크레타제간의 결합을 효과적으로 저해할 수 있는 폴리펩타이드의 활성을 모방하는 펩타이드 작용유사체 화합물을 포함한다.
또한, 본 발명은 γ-세크레타제에 결합하는 상기 폴리펩타이드로서 혈액-뇌 장벽과 같은 세포막을 통한 상기 폴리펩타이드의 수송을 돕는 아미노산 잔기가 공유결합되어 있는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 바람직한 일예에서, 상기 아미노산 잔기는 아르기닌을 포함한다.
본 발명의 목적은 이후 상세한 설명, 도면, 및 청구범위에 의해서 충분히 이해될 것이다.
본 발명은 하기 발명이 상세한 설명 및 비제한적이며 예시적인 목적으로 제공되는 첨부 도면에 의해서 충분히 이해될 것이다.
도 1은 APP 프로세싱 반응식이다.
도 2A 및 2B는 스웨덴 변이형 APP (도 2A) 및 야생형 APP(도 2B)에 대한 상보적인 펩타이드를 얻는 방법을 보여준다. 도 2A에서, APPsw의 ㅠ-세크레타제 절단 자리이 mRNA 서열을 5'-ucugaagugaaucuggaugcagaauuccga -3'(SEQ ID NO:10)으로 기재하고 있으며 이는 번역되어 폴리펩타이드 서열 SEFCIQIHFR(SEQ ID NO:7)(c-Sub M)이 되고, APPsw의 ㅠ-세크레타제 절단자리의 안티센스 mRNA 서열은 3'-agacuucacuuagaccuacgucuuaaggcu-5' (SEQ ID NO:11)으로 나타내며, 이는 번역되어 폴리펩타이드 RLHLDLRLKA (SEQ ID NO:12) (Sub M-c)이다. 도 2B에서, APP의 ㅠ-세크레타제 절단자리의 mRNA 서열은 5'-ucugaagugaagauggaugcagaauuccga-3'(SEQ ID NO:13)이고, 이는 번역되어 폴리펩타이드 SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6) (c-Sub W)가 된다. APP의 β-세크레타제 절단자리의 안티센스 mRNA 서열은 3'-agacuucacuuagaccuacgucuuaaggcu-5' (SEQ ID NO:43)으로 나타내고, 이는 번역되어 폴리펩타이드 RLHFYLRLKA (SEQ ID NO:14) (Sub W-c)이다.
도 3A 및 3B는 상보적 펩타이드에 대한 서브스트레이트 A (도 3A) 및 서브스트레이트 B (도 3B)의 결합을 보여준다. 도 3A에서, 다양한 양의 상보적인 펩타이드를 플라스틱 웰에 고정시키고 바이오틴-표지된 서브스트레이트 M을 상기 웰에 첨가하였다. 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제와의 반응으로 결합된 서브스트레이트 M을 결정하였다. 대조 펩타이드는 무관한 서열을 갖는 데카펩타이드(decapeptide)을 의미한다. 도 3B에서, 상보적인 펩타이드를 플라스틱 웰에 고정시키고, 서브스트레이트 M을 상기 웰에 첨가하였다. 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제와의 반응으로 결합된 서브스트레이트 M을 결정하였다.
도 4는 β-세크레타제의 서브스트레이트 M 절단이 상보적인 펩타이드에 의해서 저해됨을 보여준다. c-SubM C△1은 C-SubM의 C-말단으로부터 아미노산 결실이 있는 것을 말한다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 사용된 APPsw 저해제의 결실 변이를 보여준다. c-SubM(SEFCIQIHFR) (SEQ ID NO:7), c-SubM △N1 (EFCIQIHFR) (SEQ ID NO:15), c-SubM △N2 (FCIQIHFR) (SEQ ID NO:16), c-SubM △N3 (CIQIHFR) (SEQ ID NO:17), c-SubM △N4 (IQIHFR) (SEQ ID NO:18), c-SubM △N5 (QIHFR) (SEQ ID NO:19), c-SubM △C1 (SEFCIQIHF) (SEQ ID NO:20), c-SubM △C2 (SEFCIQIH) (SEQ ID NO:21), c-SubM △C3 (SEFCIQI) (SEQ ID NO:22), c-SubM △C4 (SEFCIQ) (SEQ ID NO:23), c-SubM △C5 (SEFCI) (SEQ ID NO:24), c-SubM △C6 (SEFC) (SEQ ID NO:25), c-SubM △C7 (SEF).
도 6은 서브스트레이트 절단에 대한 다양한 결실 펩타이드의 효과를 나타낸다.
도 7은 β-세크레타제 절단에 대한, 말단 결실된 추가 펩타이드의 저해 활성을 보여준다.
도 8은 실시예에서 사용한 다양한 펩타이드의 농도의존성 저해 활성을 보여준다. c-SubM △N2C1 (FCIQIHF) (SEQ ID NO:26), c-SubM △N1C1 (EFCIQIHF) (SEQ ID NO:27), c-SubM △C3 (SEFCIQI) (SEQ ID NO:22), c-SubM △C5 (SEFCI) (SEQ ID NO:24), c-SubW (SEFCIHLHFR) (SEQ ID NO:6), c-SubM △N3C3 (CIQI) (SEQ ID NO:28), c-SubM △C1 (SEFCIQIHF) (SEQ ID NO:20), c-SubM △N3C1 (CIQIHF) (SEQ ID NO:29), c-SubM (SEFCIQIHFR) (SEQ ID NO:7).
도 9A 및 9B는 상보적 펩타이드와 SubM 간의 결합, 그리고 상보적인 펩타이 드와 SubW간의 결합을 각각 나타낸다.
도 10은 상보적 펩타이드의 저해활성을 결정하기 위해 사용된 세포에 기반한 분석시스템을 설명하는 것이다.
도 11은 HEK293-APP세포에 대한 APP 저해제 펩타이드의 영향을 보여준다. 전세포 추출물을 로딩하고, 16E10 항체가 Aβ의 N-말단을 참지한다. 레인 1: 대조 세포, 레인 2:c-SubM; 레인 3;c-Sub M △C6; 레인 4 c-Sub M △N1C1; 레인 5 대조 세포; 레인 6 β-세크레타제 저해제(판매제품, 펩타이드).
도 12는 HEK293-APPsw 세포에 대한 APP 저해제 펩타이드의 영향을 나타낸다. 레인 1:무처리, 레인 2:c-Sub M △C1; 레인 3;c-Sub M △C5; 레인 4 c-Sub M △N2C1; 레인 5 c-Sub M △N3C3; 레인 6 β-세크레타제 저해제.
도 13은 rhBACE1 및 fluo-Sub M 시스템에 대한 APP 저해제-R9의 활성을 나타낸다.
도 14는 올리고아르기닌-커플링 APP 저해제의 세포내 수송을 나타내는, APP 저해제-R9 수송 분석의 결과를 나타낸다.
도 15는 293-APP 세포에 대한, APP 저해제-R9의 활성을 나타낸다.
도 16은 APPsw 저해제에 대한 특이도 분석 개략도이다.
도 17은 여러 가지 농도의 ㅠ-세크레타제에서 B-세크레타제 기질의 절단율을 보여준다.
도 18은 각각의 β-세크레타제 기질에 대한, APPsw 저해제의 저해 활성을 나타낸다.
도 19는 APP γ-세크레타제 절단 자리에 대한 상보적 펩타이드를 얻는 방법을 보여준다. γ-세크레타제 절단 자리는 GVVIATVIVI (SEQ ID NO:8)이다. γ-세크레타제 절단 자리에 대한 mRNA 서열은 5'-ggu guu guc aua gcg aca gug auc guc auc-3' (SEQ ID NO:30)이고, 이는 번역되어 폴리펩타이드 DDDHCRYDNT (SEQ ID NO:31) (gCh1)이다. γ-세크레타제 절단 자리에 대한 안티센스 mRNA 서열은 3'-cca caa cag uau cgc ugu cac uag cag uag-5'(SEQ ID NO:32)이고, 이는 번역되어 폴리펩타이드PQQYRCHRQR (SEQ ID NO:9) (gCh2)이다.
도 20A 및 20B는 여러 가지 세포주에서 γ-세크레타제 절단 활성을 보여준다. 도 20A는 불멸화 마우스 hippocampal 뉴런-HT22(5.55 mg/ml) 및 래트 아드레날 pheochromocytoma-PC12(7.61 mg/ml)에서 활성을 나타낸다. 도 20B는 마우스 hippocampal 뉴런 + neuroblastoma-HN33(5.95 mg/ml) 및 마우스 neuroblastoma- N2a(3.65 mg/ml)에서 활성을 나타낸다.
도 21A 및 21B는 상보적 펩타이드 존재하에서 γ-세크레타제의 활성을 나타낸다. 기질: 12.5 μM, 상보적 펩타이드 200 μM; γCh1 (5'→3') DDDHCRYDNT (SEQ ID NO:31); γCh1 △N1 : DDHCRYDNT (SEQ ID NO: 33); γCh2(3'→5'): PQQYRCHRQR (SEQ ID NO:9);γCh2-2: PQQYHCHYQ (SEQ ID NO:34). 전배양 기간은 1시간이고, 사용된 γ-세크레타제 (세포막 분획)는 3mg/ml이었다.
도 22는 세포에서 상보적 펩타이드의 저해활성을 보여주며, 이는 실험 대상 펩타이드가 세포막을 가로질러 세포내로 들어갈 수 없음을 나타낸다.
도 23A 및 23B는 c-SubM △C1N3에 대한 알라닌 스캐닝 자료를 보여준다. 도 23A는 다양한 알라닌 변이를 나타낸다. 도 23B는 BACE 저해 활성을 나타낸다. C-SubM △C1N3(CIQIHF) (SEQ ID NO:29), C-SubM △C1N3.A1(AIQIHF)(SEQ ID NO:35), C-SubM △C1N3.A2(CAQIHF)(SEQ ID NO:36), C-SubM △C1N3.A3 (CIAIHF) (SEQ ID NO:37), C-SubM △C1N3.A4(CIQAHF) (SEQ ID NO:38), C-SubM △C1N3.A5 (CIQIAF) (SEQ ID NO:39), C-SubM △C1N3.A6 (CIQIHA) (SEQ ID NO:40).
본 명세서에서, "하나(a)" 또는 "하나(an)"는 단수 및 복수를 모두 의미한다.
본 명세서에서, "약(about)" 또는 "실질적으로 (substantially)"이란 일반적으로 정확한 숫자로 제한되는 것을 방지(leeway)하고자 제공된다. 예를 들면, 폴리펩타이드 길이를 언급하는 문맥에서, "약(about)" 또는 "실질적으로 (substantially)"란 용어는 폴리펩타이드가 언급된 아미노산 숫자에 한정되는 않는의도이다. N-말단 또는 C-말단에서 몇몇 아미노산이 첨가되거나 결실되는 것은 그이 결합 활성이 존재하는 등이 기능적 활성이 유지되는 한, 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 사용하는 바와 같이, "아미노산 (amino aicd)" 또는 "아미노산들 (amino acids)"는 일반적으로 자연에 존재하는 모든 L-알파-아미노산들을 말한다. 그러나, 펩타이드 작용유사체 화합물은 본 발명에 포함되기 때문에, 자연에 존재하지 않는 아미노산들도 본 발명에 포함된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 "아미노산 서열 변이체(amino acid sequence variant)"는 기준(예, 천연서열) 폴리펩타이드와 비교할 때 이들의 아미노산 서열상이 몇몇 차이을 갖는 분자를 말한다. 아미노산 변형은 천연 아미노산 서열에서 치환, 삽입, 결실 또는 어떠한 바람직한 이들 변형이 조합일 수 있다.
치환 변이체는 천연 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삭제되고 동일한 위치에 다른 아미노산이 삽입된 것을 말한다. 치환은 분자내에 하나의 아미노산만이 치환된 단일치환, 또는 분자내에 2 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수있다.
서열내에서 아미노산 치환은 상기 아미노산이 속하는 부류의 다른 일원중에서 선택될 수있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라진 및 글루타민을 포함한다. 양전하 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 동일하거나 유사한 생물학적활성을 나타내는 단백질, 이들의 단편 또는 유도체, 그리고 상기 유도체는 번역과정 또는 번역후에 분화변형되거나 (예, 당화, 분해적 절단), 항체 분자 또는 다른 세포유래 리간드에 결합하는 것이며, 이들은 모두 본 발명의 범위에 속한다.
삽입 변이체는 천연 아미노산 서열에서 특정 위치의 아미노산 바로 옆에 하나 이상이 아미노산이 삽입된 것이다. 아미노산 바로 옆이라 함은 아미노산의 α-카르복시, 또는 α-아미노기에 연결된 것을 말한다.
결실 변이체는 천연 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것을 말한다. 일반적으로, 결실 변이체는 하나 또는 두 아미노산이 분자내 특정 위체에서 삭제된 것이다.
본 명세서에서 기재한 바와 같이, "APP 결합 폴리펩타이드(APP binding polypeptide)" 또는 "ABP"라 함은 APP의 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제의 절단 자리에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 말한다. 본 발명자들은 최초로 APP에 존재하는 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제의 절단 자리에 결합하는 다양한 폴리펩타이드를 발명하였으며, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 APP에 대한 결합능을 유지한 채 서열의 다양한 변형을 할 수 있다.
본 명세서에서, "담체(carrier)"는 사용량 및 농도에서 대상 포유동물 도는 세포에 독성이 없는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 수용성 pH 완충액일 수 있다. 약제학적으로 허영되는 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산을 포함하는 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량 폴리펩타이드 (약 10 개 아미노산 잔기 미만); 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐필롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린등을 포함하느 ㄴ단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알콜; 소디움과 같은 염형성 짝이온; 및/또는 TWEEN(상표명), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 및 PLURONICS (상표명)을 포함하는 비이온성 계면활성제을 포함하는 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "상보적(conplementary)"란 용어는 사용되는 문맥에 따른 의미이다. 예를 들면, 상보적 염기 또는 뉴클레오타이드라 함은 특징적인 수소결합(G-C, A-T, A-U)을 형성하는 것, 상보적 코돈 핵산 또는 이전에 정의된 이중나선 과 같은 핵산 이중사슬이 수소결합된 폴리뉴클레오타이드 성분을 의미하며, 친수도 상보성(hydrophatic complementary)을 갖는 상보적 아미노산은 상보적 코돈쌍을 갖는 일원을 의미한다.
상보적 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 및 이들의 관련 기원 펩타이드 또는 단백질은 상보적 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 의한 한쌍의 펩타이드이고, 한쌍의 펩타이드 간에는 특징적인 결합력(binding affinity)을 갖는다. 펩타이드 결합력이 불완전한 경우에는, Kaiser 등(Science; 223:249-255 (1984)). 에 의해 설명되는 양쪽성 2차 구조의 개념으로 설명되는, 그들은 적어도 일부분에서 결합력이 있다.
상보적 폴리펩타이드 및 이들의 펩타이드 작용유사체 화합물의 아미노산 서열은 다양한 방법, 예컨대 화학적 합성, 상기 아미노산을 함유하는 단백질 또는 더 큰 폴리펩타이드로 부터 유래에 의해 얻을 수 있으며, 자연에 존재하는 아미노산 서열이 특히 적합한 경우에는 단세포 생물에 DNA 벡터를 형질전환하여 형질전환체가 상보적 폴리펩타이드를 생산하는 재조합 방법에 의해서 얻을 수 있다.
본 명세서에서, "유효량(effective amount)"이라 함은 유익하거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과를 달성하기에 충분한 양을 말한다. 유효량을 1회 이상 투여할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 저해제 화합물의 유효량은 질병상태의 경감, 개선, 안정화, 역위, 지연 또는 천천히 진행되도록 하는 양이다. 본 발명의 바람직한 일예에서, "유효량"이라 함은 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제가 APP 에 결합하는 것을 저해할 수 있는 화합물의 양으로 정의된다.
본 명세서에서, "친수도 상보성"이라 함은 아미노산의 친수성과 소수성의 상대적인 수치를 나타내는 것으로서 높은 친수도에 대응하는 높은 또는 낮은 친수도로 나타낸다. 아미노산을 포함하는 구조를 언급할 때, 상기 용어는 일반적으로 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 말하고, 이러한 순서는 예컨데 디펩타이드, 올리고펩타이드, 및 수백개 아미노산을 포함하는 단백질등 사이의 크기 증가를 가리킨다.
본 명세서에서, "저해제(inhibitor)"라 함은 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제의 APP에 대한 결합을 저해하는 분자를 말한다.
본 명세서에서, "리간드(ligand)"라 함은 폴리펩타이드와 같은 분자에 특이적으로 공유결합 또는 일시적 결합을 하는 어떠한 분자, 작용제 또는 화합물을 말한다.
본 명세서에서, 치료대상인 "포유동물(mammal)"은 포유동물로 분류되는 모든 동물을 말하며, 사람, 가정, 농장, 및 동물원, 애완용 동물등, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지등을 포함한다. 바람직하게는 상기 포유동물은 사람이다.
본 명세서에서, "정제된(purified)" 또는 "분리된 (isolated)"라 함은 그 자체의 천연 환경으로 제거되거나, 천연에 함께 존재하는 다른 성분이 없는 분리된 상태의 생물학적 또는 합성 분자를 말한다.
본 명세서에서, "특이적 결합(specifically bind)"라 함은 APP에 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제 절단자리에 결합하는 두 분자, 예를 들면 폴리펩타이드, 펩타이드 작용유사 화합물 사이의 임의 결합 반응이 아닌 것을 의미한다.
본 명세서에서, "대상 (subject)"라 함은 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 사람을 말한다.
본 명세서에서, "치료 (treatment)"라 함은 유익하거나 바람직한 임상적 결과를 얻고자 하는 접근법을 말한다. 본 발명에 있어서는, 유익하거나 바람직한 임상적 결과는 탐지되거나 탐지되지 않는 지에 상관없이, 증상의 완화, 질병정도의 축소, 질병의 안정화상태(즉 더 나빠지지 않음), 질병 진행이 지연 또는 속도감소, 질병상태의 개선 또는 경감 및 완화(부분적 또는 전체적)을 말한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 것보다 생존기간이 길어지는 것을 의미할 수도 있다. "치료"라 함은 치료적 처리와 예방적 또는 예후적 조치도 모두 포함한다. 치료가 필요한 이들이라 함은 이미 질병에 걸린 대상 뿐만 아니라 질병이 예방이 필요한 대상일 수 있다. "완화" 질병이라 함은 치료를 하지 않은 상황에 비해서, 질병상태의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상적 발현이 감소하는 것 및/또는 경과가 천천히 진행되거나 지연되는 것을 말한다.
APP β- 세크레타제 또는 γ- 세크레타제 절단자리에 결합하는 화합물의 스크 리닝
본 발명이 일예에서, 본 발명은 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 대한 APP의 결합을 저해하는, 폴리펩타이드, 펩타이드 작용유사체, 또는 화학적 화합물과 같은 화합물을 스크리닝하는 방벙에 관한 것이다. 상기 저해제 화합물은 베타-아밀로이드 침착이 적어도 일부분은 원인이 되는 질병을 앓고 있는 환자를 치료할 수 있을 것으로 예상된다.
β-세크레타제 또는 γ-세크레타제 절단자리를 포함하는 APP 단편을 이들 자리에서 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 의해 절단이 일어나는 것을 저해하는 화합물을 스크리닝하는 표적으로 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리, 또는 화학적 라이브러리 등을 포함하는 다양한 라이브러리를 사용하여 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 의해 절단이 일어나는 것을 저해하는 화합물을 스크리닝할 수 있다.
β- 세크레타제 또는 γ- 세크레타제와 APP 결합 저해제
본 발명이 일예에서, 본 발명은 APP와 상호작용하여 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제가 APP에 결합하는 것을 차단할 수 있는 저해제 화합물에 관한 것이다. 특히, 상기 화합물은 APP에 존재하는 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제 절단자리와 상호작용을 할 수 있어야 한다. 상기 저해제 화합물이 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제와 APP사이의 결합에 손상을 주고 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 의한 절단을 저해하는 한, 상기 저해제 화합물은 생화학적 또는 효소적 저해 기작, 예컨대 경쟁적, 비경쟁적 또는 무경쟁적 저해 등의 수단으로 APP와 β-세크레타제 또는 γ-세크레타제 사이의 상호작용에 손상을 준다. β-세크레타제 결합자리를 포 함하는 APP의 10개 아미노산 단편에 결합하는 예시적인 폴리펩타이드는 SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6) 및 SEFCIQIHFR (SEQ ID NO:7)이다. γ-세크레타제 결합자리를 포함하는 APP의 10개 아미노산 단편에 결합하는 예시적인 폴리펩타이드는 PQQYRCHRQR (SEQ ID NO:9)이다.
변이( mutant ) 또는 변형( varient ) 폴리펩타이드
상기 저해제 폴리펩타이드 특성을 향상 또는 변화시키기 위해서, 아미노산 가공을 이용할 수 있다. 본 기술분야에서 널리 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실, 추가, 또는 융합 단백질을 포함하는 새로운 변이 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 유사한 변이 폴리펩타이드를 또한 화학적 합성으로 특히 짧은 펩타이드의 경우에 얻을 수 있다. 상기 변형된 폴리펩타이드는 예컨대 증가/감소된 활성 또는 증가/감소된 안정성등을 나타낼 수 있다. 또한, 적어도 특정 정제 및 저장 조건하에서, 이들을 고수율로 정제할 수도 있고, 대응하는 천연 폴리펩타이드보다 더 나은 용해도를 나타낼 수도 있다.
치료 활성 조성물
한 구체예에 있어서, 본 발명은 β-아밀로이드 응집체 또는 아밀로이드 플라크가 형성되는 특징을 갖는 다양한 질병의 치료와 관련된 것이다. 이와 같이, 본 발명의 치료 활성 화합물은 β- 또는 γ-세크레타제 절단 부위에 결합하여 APP가 β-아밀로이드로 절단되는 것을 억제하는 화합물로서, 상기 질병을 앓고 있거나 걸 릴 가능성이 있는 인간 환자에게 투여할 수 있다. 특히, 상기 질병은 치매, 뇌의 만성 신경변성 장애(chronic neurodegenerative disorder), 특히 해마 및 대뇌 피질에 있어서의 신경 세포 손실, 신경전달물질 감소, 뇌혈관 퇴행(cerebrovascular degeneration), 및/또는 인지력 상실과 관련된 질환이다. 또한, 특히 본 발명은 알츠하이머 질환의 치료에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 혈뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과할 수 있는 것이다.
치료 활성 화합물의 제제화는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 'Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA' 등에 기재되어 있다. 예컨대, 본 발명의 화합물의 하루 투여량은 체중 1 kg 당 약 0.05 mg 내지약 20 mg 정도일 수 있다. 투약 계획은 최적의 치료 효과를 제공하기 위하여 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 하루에 여러 번 나누어 투약하거나, 투여량을 치료 상황의 긴급도에 따라서 비율적으로 감소시킬 수 있다. 활성 화합물은 예컨대 경구 투여, 정맥내 투여 (수용성인 경우), 근육내 투여, 피하 투여, 비강내 투여, 진피내 투여 또는 좌식 투여, 또는 이식 (예컨대, 서방성 분자의 복막내 경로를 통한 사용, 또는 생체 내 민감화되고 수령자에게 면역 전달(adoptive transfer)되는 단핵세포 또는 수상세포 등의 세포를 사용) 등과 같은 편리한 방법으로 투여할 수 있다. 투여 경로에 따라서, 펩타이드가 효소, 산 및 이를 불활성화시킬 수 있는 다른 자연 조건과 반응하는 것을 방지할 수 있는 물질로 이를 코팅하는 것이 필요할 수 있다.
예컨대, 상기 펩타이드는, 친지성이 낮기 때문에, 위장관 내에서는 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의하여, 위에서는 산의 가수분해에 의하여, 쉽게 파괴될 수 있다. 비경구 투요 이외의 경로로 펩타이드를 투여하는 경우, 펩타이드는 이를 불활성화시키는 것을 방지하는 물질로 코팅시키거나 이러한 물질과 함께 투여할 수 있다. 예컨대, 펩타이드를 보조제(adjuvant)와 함께 투여하거나, 효소 억제제 또는 리포좀과 함께 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서, 보조제는 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르와 같은 비이온성 계면 활성제, 레조시놀류(resorcinols) 등을 포함할 수 있다. 상기 효소 억제제는 췌장 트립신 억제제, 디이소프로필플루오로포스페이트 (DEP) 및 트라시롤(trasylol) 등을 포함할 수 있다. 상기 리포좀은 통산적인 리포좀 뿐 아니라 수중유중수 CGF 에멀젼 등을 포함할 수 있다.
상기 활성 화합물을 비경구 또는 복막내 투여할 수 있다. 또한, 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 내에서 분산액으로 제조할 수도 있다. 저장 및 사용의 통상의 조건하에서, 이러한 제제들은 미생물의 성정을 막기 위하여 보존제를 포함할 수 있다.
주사용으로 적합한 약학적 제형은 살균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 주사용 살균 용액 또는 분산액으로 즉석으로 제조하여 사용하기 위한 멸균 파우더 등일 수 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 제형은 살균된 것이어야 하고, 용이하게 주사될 수 있을 정도의 유동성을 가져야 한다. 상기 제형은 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하고, 세균류 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용이 방지된 것이어야 한다. 담체는, 예컨대, 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 레시틴 등으로 코팅하거나, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하거나, 슈퍼팩턴트(superfactants)를 사용하여 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 예컨대, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 테오머살(theomersal) 등의 다양한 항균제 및 항진균제를 사용하여 미생물의 작용을 방지할 수 있다. 많은 경우에 있어서, 예컨대, 당류 또는 염화나트륨 등의 등장제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 사용하여 상기 주사 가능한 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
필요한 양의 상기 활성 화합물을 필요에 따라서 상기한 다양한 다른 성분을 포함하는 적절한 용매와 혼합시킨 후, 여과살균시켜 살균 주사 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균된 활성 성분을 기본적인 분산 용매와 상기에 열거한 성분들 중에서 선택된 필요한 다른 성분을 포함하는 살균 비히클과 혼합하여 제조할 수 있다. 살균 주사 용액을 제조하기 위한 살균 파우더의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 살균 여과된 용액으로부터 활성 성분 파우더와 함께 필요한 모든 추가적인 성분을 얻을 수 있는 진공 건조 및 동경 건조 기술일 수 있다.
펩타이드가 상기한 바와 같이 보호된 경우, 상기 활성 화합물을 불활성 희석제 또는 동화성(assimilable) 식용 담체와 함께 경구 경로로 투여하거나, 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 포함시키거나, 정제로 타정하거나, 식이요법을 위한 식 품에 직점 첨가할 수 있다 할 수 있다. 치료적 경구 투여의 경우, 상기 활성 화합물을 부형제와 혼합하여 섭취가능한(ingestible) 정제, 구강정(buccal tablets), 구내정(troche), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현탁액, 시럽, 박판 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 1 중량% 이상의 활성 화합물을 함유할 수 있다. 물론, 조성물 및 제제의 비율은 다양할 수 있으며, 일반적으로, 단위체당 약 5 내지 약 80 중량% 범위일 수 있다. 이러한 치료적으로 유효한 조성물의 활성 화합물의 함량은 적절한 투여량을 얻을 수 있도록 하는 양이다. 본 발명에 따른 조성물 또는 제제는 하나의 경구 단위 투약 제형이 약 0.1 μg 내지 2000 mg의 활성 화합물을 함유하도록 제조하는 것이 바람직하다.
상기 정제, 환제, 캡슐 등은 추가로 다음과 같은 성분을 포함할 수 있다: 트래거캔스 고무(gum tragacanth), 아카시아(acacia), 옥수수 전분 또는 젤라틴 등의 결합제; 인산이칼슘(dicalcium phosphat) 등의 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등의 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제; 및 과당, 젖당 또는 사카린 등의 감미제 또는 페퍼민트, 동록유 (oil of wintergreen), 또는 체리향 등의 향미료. 상기 단위 투약 제형이 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 액상 담체를 함유할 수 있다. 코팅제 형태로서 사용되거나 또는 투약 단위체의 물리적 형태를 다른 형태로 변형시키기 위한 다양한 다른 종류의 물질을 사용할 수 있다. 예컨대, 정제, 환약 또는 캡슐을 셸락(shellac), 설탕 또는 이들 모두로 코팅시킬 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 설탕, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오랜지 향 향미료를 함유할 수 있다. 물론, 모든 단위 투약 제형의 제조에 사용되는 모든 물질은 사용량에서 약학적으로 순수하고 실질적으로 비독성인 것이어야 한다. 또한, 상기 활성 화합물은 서방성 제제 및 배합물에 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용된 바로서, "약학적으로 허용 하능한 담체 및/또는 희석제"는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 통상적인 매질 또는 작용제가 상기 활성 성분에 부적합한 경우를 제외하고는 모든 매질과 작용제를 본 발명이 치료용 조성물에 사용하는 것을 고려할 수 있다. 보충적 활성 성분을 또한 본 발명의 조성물에 포함시킬 수 있다.
투여 용이성과 투여량의 균일성을 위하여, 비경구 조성물을 투약 단위 제형으로 제제화하는 것이 특히 바람직하다. 본 명세서에 사용된 단위 투약 제형은 치료 대상 포유류 환자에 따른 단위 투여량으로 적절한 물리적으로 분리된 단위들로서, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 함께 목적하는 치료적 효과를 발휘하도록 계산된 활성 물질의 예정량을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 단위 투약 제형에 대한 상세 사항은 (a) 활성 물질의 특유한 성질 및 달성하고자 하는 치료적 효과, 및 (b) 신체 건강을 해치는 질병 증상을 앓고 있는 환자의 질병 치료를 위한 활성 물질의 제조 분야의 고유한 제한에 의하여 설명되거나 이에 따라 달라질 수 있다.
주요한 활성 성분은 간편하고 효과적인 투여를 위하여 단위 투약 제형 내에 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 유효량으로 혼합될 수 있다. 단위 투약 제형은, 예컨대, 주요 활성 성분을 약 0.5 μg 내지 약 2000 mg의 양으로 함유 할 수 있다. 비율로 표현하면, 상기 활성 화합물은 대체적으로 제형 내에 담체 1 ml에 대하여 약 0.5 g 존재한다. 보충적인 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투약은 상기 성분의 투여의 일반적인 투여량과 투여 방법에 따라서 결정한다.
전달 시스템
예컨대, 수용체 매개 엔도사이토시스, 미세 캡슐, 미세 입자, 리포좀 내의 인캡슐레이션 등과 같은 다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 화합물을 투여하기 위하여 사용할 수 있다. 도입 방법은 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 화합물 또는 조성물은, 예컨대, 주입 또는 일시 주사(bolus injection), 상피 또는 점막피부 내층 (예컨대, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의하는 등의 모든 간편한 경로로 투여할 수 있으며, 다른 생물학적 활성 작용제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신 또는 국부 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 화합물 또는 조성물을 뇌실내 및 수막강내 주사를 포함하는 모든 적절한 경로를 통하여 중추 신경계에 도입시킬 수 있으며, 뇌실내 주사는 예컨대 옴마야 저장소(Ommaya reservoir)와 같은 저장소에 부착되는 뇌실내 카테터를 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 또한, 예컨대 흡입기 또는 분무기 및 에어로졸화제를 포함하는 제제를 사용하여 폐투여를 수행할 수도 있다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 약학적 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 부위에 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이러한 경우, 외과적 수술 동안의 국부적 주입, 외과 수술 후의 상처 드레싱과 관련된 경우 등의 국소적 적용, 주사, 카테터의 사용, 좌약 사용, 또는 임플란트의 사용 (상기 임플란트는 다공성, 비다공성 또는 아교질 물질이며, 시알라스틱 멤브레인(sialastic membrane)과 같은 멤브레인 또는 섬유질을 포함) 등에 의할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 유사작용체(mimetics)를 포함하는 단백질을 투여하는 경우, 상기 단백질이 흡수하지 않는 물질을 사용하는데 주의를 기울여야 한다. 다른 구체예에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물은 비히클, 특히 리포좀 내에 담지하여 전달시킬 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물은 방출조절 시스템(controlled release system) 내에서 전달시킬 수 있다. 한 구체예에 있어서, 펌프를 사용할 수 있다. 다른 구체예에 있어서는, 폴리머 물질을 사용할 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 방출 조절 시스템을 치료 표적, 즉, 뇌에 근접하게 위치시켜, 전신 투여량의 분획만을 조절하게 할 수 있다.
"약리학적 또는 생리적으로 허용 가능"하다고 표현되는 조성물은 상기 조성물의 투여가 동물 수용자에게 견딜 수 있는 정도이고, 상기 동물에 투여하기 위하여 다른 방법으로 적절하게 된 경우를 의미한다. "치료적 유효량"으로 투여하는 것으로 표현되는 작용제는 투여되는 양이 생리학적으로 유의미한 경우를 의미한다. 작용제가 생리학적으로 유의미하다는 것은 그 존재가 수용 환자에게 생리학적으로 탐지가능한 변화를 야기하는 경우를 의미한다.
유사작용체( Mimetics )
약물로서의 펩타이드의 사용은 몇 가지 매우 흥미로운 이점을 갖는다. 이들은 매우 특이적으로 만들어질 수 있으며, 이들의 효능은 단순한 하나의 아미노산 치환으로 증가될 수 있으며, 다수의 펩타이드가 매우 낮은 독성을 보인다. 그러나, 본 발명은 또한 펩타이드 유사작용체와 관련된 것이다. 특히, 상기 유사작용체는 혈뇌장벽을 가로질러 통과하는 펩타이드 유사작용체를 의미하는 것일 수 있다. APP는 주로 트랜스 골지 네트워크 및 엔도좀 시스템과 같은 세포 내부의 세크레타제에 의하여 절단된다 (Huse et al., J. Biol . Chem . 275:33729-37 (2000); Walter et al., J. Biol . Chem .276:14634-41 (2001)). 따라서, 혈뇌장벽 뿐 아니라 세포막 장벽을 통과할 수 있도록 변형된 억제제 화합물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
펩타이드 유사작용체는 펩타이드 인식 부위에 의하여 인식되는 비펩타이드 리간드로서 정의된다. 이러한 유사작용체는 펩타이드와 구조적으로 상이하다. 펩타이드 유사작용체로서 잘 알려진 예로는 모르핀이 있다. 상기 천연 아편유사 알칼로이드는 인체에 존재하는 펩타이드인 β-엔도르핀이 유사작용체이다. 이러한 펩타이드 유사작용체의 정의가 유사작용체를 비펩타이드 리간드로 특징지우고 있지만, 많은 구조들이 천연 아미노산으로 구성된 본래 펩타이드와 펩타이드 유사작용체 사이의 모처에 존재한다. 상기 정의된 스펙트럼 내의 대부분의 화합물은 또한 펩타이드 유사작용체로서 간주된다. 예컨대, 비천연 요소들 만으로 구성된 트리펩타이드는 펩타이드 유사작용체로 간주될 수 있다. 몇 가지 HIV 프로테아제 억제제는, 비록 아마이드 결합과 아미노산을 포함하고 있어도, 펩타이드 유사작용체로 간 주된다. 펩타이드 유사작용체를 구성하는 것에 대한 논의는 지금도 계속 진행중이지만, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 펩타이드와 유사작용체를 구별할 수 있다. 펩타이드 유사작용체는 일반적으로 펩타이드의 개선된 형태라고 생각할 수 있다. 펩타이드 상에서의 펩타이드 결합의 환원 등과 같은 화학적 변형은 효소 안정성을 증진시킬 수 있다. 비천연 아미노산을 포함시킴으로써, 펩타이드의 활성과 선택성을 모두 증진시킬 수 있다. 펩타이드가 구조적 및/또는 화학적으로 많이 변형될수록, 진정한 펩타이드 유사작용체에 가깝게 된다.
펩타이드 유사작용체는 펩타이드류, 단백질류 및 이들의 유도체를 포함하며, 상기 유도체에는 비펩타이드 유기 모이어티를 포함하는 펩타이드, 아미노산 및/또는 펩타이드 결합을 포함하거나 포함하지 않지만 펩타이드 리간드의 구조적 및 기능적 특징을 보유하는 합성 펩타이드, 및 항개별특이형 항체(anti-idiotype antibodies)를 포함하는 항체와 'Simon et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA89:9367 (1992)'에 기재된 바와 같은 N-치환된 글리신을 포함하는 분자인 올리고펩타이드 및 펩토이드(peptoids) 등이 있다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명의 화합물은 스캐폴드, 턴 유사작용체(turn mimetics), 및 펩타이드 결합 치환(peptide-bound replacements)과 같은 다양한 최적 화합물을 합성적으로 도입함으로써 얻을 수 있다. 펩타이드 골격(backbone) 대신에 다양한 선형 및 헤테로고리형 스캐폴드를 사용하는 아미노산 합성을 사용할 수 있다. 화학적 공정 및 방법은 혈뇌간 투과성을 증진시키기 위한 천연 프로드럭으로서 하전된 펩타이드의 일시적 보호와 헤테로고리형 링, 올레핀 및 플루오로오 레핀, 및 케토메틸렌과 같은 작용기와의 펩타이드 결합의 대체를 포함한다.
아미노산 서열의 수치료 상보성 ( Hydropathic Complementarity )
아미노산의 수치료 상보성에 따르면, 안티센스 코드 ( 5'→3' 또는 3'→5' 방향)에 의하여 추론된 아미노산은 일반적으로 상호 부합하지 않는데, 즉, 소수성 아미노산 서열이 친수성 아미노산 서열에 대한 코드로부터 추론될 수 있고 그 반대의 경우도 가능하다는 것이다 (Blalock and Smith, Biochem . Biophys . Res . Commun. 121:203-207 (1984); US Patent No. 4,863,857 (1989); US Patent No. 5,077,195 (1991), 이들의 내용은 전체로서, 특히 수치료 상보성에 대한 설명 및 자료를 제공하는 것과 관련되어 본 명세서에 참조로서 포함된다). 수치료 상보성 접근으로 설계된 펩타이드는 센스 mRNA에 의하여 코딩되는 펩타이드와 역 수치료 관계를 보이며, 이와 같이 설계된 펩타이드는 표적 단백질에 특이적으로 높은 친화성을 가지고 결합한다 (Bost et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 82:1372-1375 (1985)). 이러한 접근의 성공적인 적용을 보여주는 몇 가지 예가 있다. ACTH, 리보뉴클레아제 S 펩타이드, c-Raf 단백질, 피브로넥틴, 인슐린, 및 피브리노겐의 α-사슬과 같은 다양한 단백질의 길항제들이 이러한 접근에 기초하여 개발되었다 (Bost et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:1372-1375 (1985); Shai et al. Biochemistry 26:669-675 (1987); Fassina et al. J. Biol . Chem . 264: 11252-11257 (1989): Brentani et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:364-367 (1988); Knutson J. Biol . Chem . 263:14146-14151 (1988): Pasqualini et al. J. Biol . Chem. 264:14566-14570 (1989), 이들은 전체적으로 참조로서 본 명세서에 포함된다).
본 발명은 본 명세서에 기재된 구체예들에 의하여 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 기재된 구체예 이외의 다양한 변형은 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 상기한 설명과 첨부된 도면으로부터 용이하게 알 수 있는 것임이 분명하다. 이러한 변형은 본 발명의 첨부된 청구항의 범위에 포함될 것으로 의도된다. 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예1 . APP 의 β- 세크레타제 절단 부위에 결합하는 펩타이드
APP의 절단부위를 포함하는 펩타이드 십합체 서열을 사용하였다. 상기 서열은 다음과 같다: SEVKMDAEFR (SEQ ID NO:1). 이러한 야생형 펩타이드 서열을 '기질 W'라 명명하였다. β-세크레타제는 M과 D 사이의 펩타이드 결합을 절단하여 하기와 같은 절단 산물을 방출한다: SEVKM (SEQ ID NO:3) 및 DAEFR (SEQ ID NO:4). APP의 스웨덴 변이체(APPsw)는 정상 APP보다 매우 높은 비율로 β-세크레타제에 의하여 절단된다. β-세크레타제에 의한 APPsw 절단부위를 포함하는 십합체 서열은 다음과 같다: SEVNLDAEFR (SEQ ID NO:2) (도 2). 이러한 변이체 펩타이드는 '기질 M'으로 표지하였다.
몇몇 경우, 표적 펩타이드의 안티센스 mRNA로부터 유래하는 펩타이드 (상보적 펩타이드)는 표적 펩타이드에 결합할 수 있는 것으로 보고되어 있다 (Blalock, J.E. and Smith, E.M. Biochem . Biophys . Res . Commun . 121, 203-207 (1984) Gho, Y.S. and Chae, C.-B. J. Biol . Chem . 272, 24294-24299 (1997), 본 명세서에 전체적으로 참조로서 포함됨). 이러한 보고에 기초하여, 4 개의 펩타이드를 설계하였다. 상기 두 개의 십합체 기질 펩타이드에 해당하는 mRNA 서열로부터 상기 안티센스 서열을 추론하였다. 서열을 5'→3' 또는 3'→5' 방향으로 읽어서 안티센스 RNA로부터 유전자 코드를 얻었다. 기질 W로부터 하기의 펩타이드 십합체 서열을 얻었다: SEFCIHLHFR (c-Sub W, SEQ ID NO: 6) 및 RLHFYLRLKA (Sub W-c, SEQ ID NO:1 4). 기질 M으로부터 다음의 두 개의 펩타이드를 얻었다: SEFCIQIHFR (c-Sub M, SEQ ID NO:7) 및 RLHLDLRLKA (Sub M-c, SEQ ID NO:12) (도 2). 이들 펩타이드를 집합적으로 상보적 펩타이드라 명명하였다.
두 개의 상보적 펩타이드, c-Sub W와 c-Sub M는 각각 기질 W와 M에 결합하고 (도 3), 둘 다 β-세크레타제에 의한 기질 M의 절단을 억제하였다 (도 4). Sub W-c와 Sub M-c는 기질에 결합하지 않았으며 (도 3), 기질 M의 절단을 억제하지 않았다 (도 4). 본 실시예에서, 기질 M이β-세크레타제에 의하여 용이하게 절단되기 때문에 주로 기질 M을 사용하였다.
실시예 2. 기질과 상보적 펩타이드와의 결합
상보적 펩타이드 (0.2, 2, 20, 및 200 M)를 포스페이트 버퍼 살린 (PBS) (pH 7.4)에 녹이고, 마이크로타이터 웰에 37℃에서 5시간 동안 고정시켰다. 상기 웰을 블로킹 버퍼(3% BSA/PBS)로 37℃에서 1시간동안 블로킹하였다. 블로킹 버퍼에 용해된 N-말단 바이오틴화된 기질 W 또는 M (20M) 중 어느 하나를 첨가하고, 40℃에 서 하룻밤동안 인큐베이팅하였다. 블로킹 버퍼에 용해된 스트렙타비딘-호스래디시 과산화효소 (Streptavidin-horseradish peroxidase)를 첨가하여 얻어진 결합 기질을 검출하였다. 플레이트를 상온(RT)에서 2시간동안 인큐베이팅한 후, 호스래디시 과산화수소의 발색반응용 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB)을 첨가하였다.
특히, 기질 W에 대하여, 인산 버퍼 살린 (PBS) (pH 7.4)에 용해된 상보적 펩타이드 (200 M)을 Reacti-Bind Maleic Anhydride Activated Polystyrene 웰 (Pierce Biotechnology, Inc.)에 상온에서 20 시간동안 화학적으로 결합시켰다. 남아있는 플레이트의 활성 부위를 에탄올아민 (1 M)를 첨가하여 상온에서 1시간동안 불활성화시켰다. 블로킹 버퍼 (3% BSA/PBS)로 상온에서 1시간동안 상기 웰을 블로킹시켰다. 블로킹 버퍼에 용해된 N-말단 바이오틴화된 기질 W (20 M)를 첨가하고 상온에서 3 시간동안 인큐베이팅하였다. 블로킹 버퍼에 용해된 스트렙타비딘-호스래디시 과산화효소를 첨가하여 얻어진 결합 기질을 검출하였다. 상기 플레이트를 상온에서 2시간동안 인큐베이팅한 후, 호스래디시 과산화수소의 발색반응용 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB)을 첨가하였다.
실시예 3. β- 세크레타제에 의한 기질 절단에 대한 형광 에세이(Fluorometric Assay )
본 에세이 시스템은 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 기술을 이용하였다. 두 개의 형광물질(fluorophores), 형광 공여체 및 독점적 소멸 수용체 (R&D Systems로부터 구입)를 사용하여 기질 M을 합성하 였다. 공여체 형광 에너지는 수용체에 의하여 상당히 소멸되었다. β-세크레타제에 의한 기질의 절단시에, 상기 형광물질을 소멸 그룹으로부터 분리하고, 공여체의 전체 형광 에너지 양을 회복시켰다.
형광물질로 표지된 기질을 F-기질 M (R&D Systems)으로 명명하였다. 재조합 인간 β-세크레타제를 rhBACE (재조합 인간 β-부위 APP 절단 효소) (R&D systems으로부터 구입)라 명명하였다.
F-기질 M (20 M)을 에세이 버퍼(0.1 M NaOAc, pH 4.0)에 용해된 다양한 농도의 상보적 펩타이드와 함께 상온에서 1시간동안 프리인큐베이팅하였다. 에세이 버퍼에 용해된 rhBACE (70 nM)를 첨가하였다. 방출된 형광 수준을 측정하여 rhBACE에 의한 절단을 검출하였다.
실시예 4. β- 세크라타제에 의한 기질절단에 대한 HPLC 측정
기질 M (100 M)을 에세이 버퍼(100 ml)에 용해된 상보적 펩타이드(2.6 mM)와 함께 상온에서 하룻밤동안 프리인큐베이팅하였다. 에세이 버퍼에 용해된 rhBACE (140 nM)를 첨가하여 상온에서 11시간동안 인큐베이팅하였다. rhBACE에 의한 기질 M의 절단 산물을 C-18 역상 컬럼 크로마토그래피 (GRACE VyDAC)에 의하여 분리한 후 정량하였다.
실시예 5. 상보적 펩타이드의 저해활성에 대한 결실의 효과
지금까지 우리는 c-Sub M 펩타이드(c-Sub M 펩타이드)에 대해 관심을 가져왔다. c-Sub M 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 일련의 결실이 만들어졌고(도 5), 기질 M의 절단이 결실에 미치는 효과를 조사하였다. 상기 기질의 절단을 저해 하는 적절한 펩타이드와 기질의 비는 다양한 펩타이드와 기질 비의 저해 활성을 관찰함에 의해서 결정되었다(도 4). 이어서, 상기 결실 펩타이드의 저해활성은 기질 당 저해제 10의 비와 기질 M의 농도는 50 mM인 조건에서 측정되었다. 상기 c-Sub M 펩타이드의 N-말단의 첫번째 두 아미노산의 결실과 상기 c-Sub M 펩타이드의 C-말단의 다섯 아미노산의 결실은 저해 활성을 거의 나타내지 못하였다(도 6). 나아가, 결실된 펩타이드는 상기 기질 M의 절단에 대한 저해활성에 대해 측정되어졌다(도 7). 측정된 10개의 펩타이드 중 5개의 펩타이드가 상당한 저해활성을 나타내었다. c-Sub M△N3C1(헥사 펩타이드)와 c-Sub M△N3C3 (테트라 펩타이드)가 상당한 저해활성을 나타내었다.
실시예 6. 상보적인 펩타이드의 농도 의존적인 저해활성
상기한 저해활성을 갖는 펩타이드는 그들의 기질 변이체인 기질 M에 대한 저해활성을 측정하기 위해 다양한 농도에서 측정되어졌다(도 8). 일반적으로, 상기 저해활성에 근거하여, 상기 펩타이드는 세가지 집합으로 나누어질 수 있다: (1) FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27)와 SEFCIQI (SEQ ID NO:22)를 포함하는 가장 활성이 좋은 집합; (2) SEFCI (SEQ ID NO:24), 응집에 의해 변칙적인 곡선을 보일 수 있고 야생형 기질에 대해 상보적인 기질인 SEFCIHLHFR(SEQ ID NO:6)와 응집에 의해 변칙적인 곡선을 보일 수 있는 CIQI (SEQ ID NO:28)를 포함하는 중간 활성을 가진 두 번째 집합 및 (3) CIQIHF (SEQ ID NO:29)와 SEFCIQIHFR (SEQ ID NO:7)를 포함하는 가장 활성이 떨어지는 집합. 상기 결과는 상기 펩타이드의 저해활성은 상기 펩타이드의 농도비가 증가하면, 상기 저해활성도 증가하는 식 으로 상기 농도와의 관련성을 나타내었다.
실시예 7. 야생형( Sub W) 및 변이체 기질( Sub M)에 대한 상보적 펩타이드의 결합
결합력을 측정하기 위하여, 상기 상보적 펩타이드를 플레이트에 고정하고 바이오틴(biotin)으로 표시된 기질을 첨가한 후에 이를 씻어낸 후에 결합된 기질의 존재여부 및 양을 측정하였다. 도 9A에 나타난 바와 같이, 상기 상보적인 펩타이드 c-Sub M은 기질 Sub M에 결합하였으며, 도 9B에 나타난 바와 같이, 상기 상보적 펩타이드 c-Sub M은 또한 상기 야생형 기질 Sub W에 효과적으로 결합하였다. 즉, 상기 변이체 기질에 대한 상보적인 펩타이드는 야생형 기질과 변이체 기질 모두에 결합하였다.
실시예 8. 세포에서의 실험
상기 뇌의 신경세포에서, APP는 α-세크라타제 또는 β-세크라타제에 의해 처리되었다. 상기 세포에서 상기 저해제의 효과를 측정하기 위하여, 세포에서의 실험이 도 10에 나타난 바와 같이 제안되었다. 상기 세포막에 남아 있는 APP의 C-말단 단편이 웨스턴 블럿팅에 의해 측정되었다. 나아가 상기 확인된 C-말단 단편인 αCTF 또는 βCTF는 γ-세크레타제에 의해 처리되었다. 그러나, 상기 세포들이 γ-세크레타제에 의해 처리되었다면, 이 프로세싱은 차단되었을 것이다. 그 결과로써, αCTF 또는 βCTF는 세포안에 축적되었다. β-세크레타제 저해제 또는 APP 저해제가 첨가되었다면, 이 프로세싱은 차단되고, βCTF는 발견되지 않을 것이다.
실시예 9. HEK293 - APP 세포에서의 APP 저해제 활성
세포안에서의 APP 저해활성을 측정하기 위하여, 결합력 측정에서 가장 높은 흡수력을 나타낸 세 종류의 상보적인 펩타이드 ,즉 c-Sub M, c-Sub M△C6, and c-Sub M△N1C1가 HEK293-APP 세포의 전추출물(도 11의 Lanes 2, 3, 및 4)에 추가되었다. 추가로, 상기 세포의 βCTF 양을 높히기 위하여, γ-세크레타제 저해제와 콜레스테롤이 추가되었다. β-세크레타제 저해제에 기초한 상업적으로 이용가능한 펩타이드를 대조군으로 인큐베이팅하였다(Lane 6, 도 11). APP 프로세싱의 결과물인 상기 β-아밀로이드(amyloid)의 N-말단 단편을 검출하기 위하여, 6E10 항체를 이용하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, β-세크레타제 저해제에 기초한 상업적으로 이용가능한 펩타이드를 포함하여 상기 실험된 저해제 중 어떠한 것도 APP 프로세싱에 대한 저해활성을 나타내지 못하였다. 최근에, 상기 저해제에 기초한 상업적으로 이용가능한 펩타이드가 세포에 대한 저해활성을 갖기 위하여서는 올리고아르기닌 수송 펩타이드와 결합하여야 한다는 것이 보고되었다(Chang et al. J. Neurochemistry 2004; 89:1409-1416).
실시예 10. HEK293 - APPsw 세포에 대한 APP 저해제 활성
실시예 9에 나타난 결과와 비슷하게, HEK293-APPsw 세포에서 실험된 상기 펩타이드 저해제는 상기 펩타이드 저해제의 존재하에 6E10 항체에 의해서 검출된 상기와 같은 수준의 βCTF 양에서 APP 프로세싱에 대하여 어떠한 활성도 나타내지 못하였다(도 12). 상기 도 11 및 12에 나타난 상기의 결과들은 APP 저해제는 상기 세포막을 통과하지 못하기 때문에 어떠한 활성도 가지지 못한다는 것을 나타내었다.
실시예 11. rhBACE1 및 Fluo - Sub M System 에 대한 APP 저해제- R 9 활성
APP 저해제가 세포막을 투과할 수 없다는 문제점을 극복하기 위하여, APP 저해제는 수송 단백질로 알려진 올리고-아르기닌과 커플링되었다(R9는 9개의 아르기닌을 의미한다.). 커플링된 펩타이드는 상기 저해제가 세포막을 통과하는지 여부를 확인하기 위하여 AHX(aminohexanoic acid)가 연결된 FITC(Fluorescein isothiocyanate)에 의해 표지되었다. FITC-AHX-c-Sub M-R9 및 FITC-AHX-c-Sub M△N1C1-R9가 만들어졌다.
상기 올리고아르기닌-커플링 APP 저해제의 저해활성을 측정하기 위하여, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 효소 측정법을 사용하였다. 상기 도 13에서 보여진 바와 같이, c-Sub M△N1C1-R9는 그것의 대응 저해제인 c-Sub M△N1C1 lacking R9에 비하여 저해활성이 낮은 것으로 나타났다. 특히, C-Sub M-R9은 어떠한 저해활성도 없는 것으로 나타났다. 상기의 결과는 APP 저해제에 대한 올리고아르기닌-커플링은 그 저해활성을 현저하게 낮춘다는 것을 나타내었다.
실시예 12. APP 저해제- R 9 세포내 수송 및 293- APP Cell 에 대한 APP 저해제-R 9 의 활성
상기 펩타이드가 세포막을 통과할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, FITC에 의해 표지된 올리고아르기닌 커플링 APP 저해제를 HEK293-APP 세포에 첨가하였다. 도 14에 표기한 바와 같이, 상기 올리고아르기닌 커플링 APP 저해제는 상기 세포안으로 수송되었다.
상기 올리고아르기닌 커플링 APP 저해제가 상기 세포내로 수송될 수 있음을 확인한 후에, APP 프로세싱에 대한 저해활성을 측정하기 위해 APP를 과발현하는 HEK293-APP 세포에 대해 저해제로 실험하였다. 도 15는 c-Sub M-R9는 낮은 농도에서도 다소의 저해활성을 가지는 한편, 10 μM 농도에서는 어떠한 저해활성도 없을을 나타내었다(상위 패널). C-Sub M△N1C1-R9는 농도의존적으로 저해활성을 나타내었다. 상기 저해제는 0.1 μM 농도부터 상당한 저해활성을 나타내었다(하위 패널). 상기 결과는 올리고아르기닌 커플링 상보적 펩타이드가 APP 세포에서 APP 특이적 저해제로 사용될 수 있음을 나타내었다.
실시예 13. 상보적 펩타이드 APP 저해제의 특이성
본 발명에서 설명된 상기 APP 저해제의 장점 중 하나는 펩타이드 또는 유도체가 상기 APP의 β-세크레타제 절단부위와 결합하므로 다른 β-세크레타제 기질에 영향을 미치지 않는다는 것이다. 본 발명인 APP 저해제의 특이성을 확인하기 위하여,두 종류의 다른 기질과 APP Sub M 및 ST6Gal1이 사용되었다. 두 기질은 일반적인 농도하에서 β-세크레타제에 의해 절단되었고, 상기 APP 저해제의 상기 기질 절단에 대한 효과는 HPLC에 의해 측정되었으며, 도 16.의 분석 개략도가 이를 나타낸다. 상기 실험을 수행하기 위하여, 상기 두 기질을 절단하기 위해 요구되는 상기 β-세크레타제의 농도는 도 17.에서 보여준 것과 같이 결정되었다. ST6Gal1 기질의 실질적인 절단을 위해서 상기 효소는 420 nM가 요구되었다. 따라서, 420 nM의 β-세크레타제가 이하의 실험에서 사용되었다.
각각의 β-세크레타제 기질에 대한 저해제, APPsw 저해제, c-Sub M△N2C1 및 상업적으로 판매되는 β-세크레타제 저해제의 저해활성이 도 18.에 나타난 바와 같이 관찰되었다. 상기 저해제의 양을 25배 증가했을 때, 약 60 %의 Sub M 절단이 차단되었고, 단지 25%의 ST6Gal1 펩타이드 절단이 차단되었다. 그러나, 상기 상업적으로 판매되는 β-세크레타제 저해제는 두 기질 절단의 차단에 대해 동등한 효과를 나타내었다. 즉, 본 발명의 상기 APP 저해제는 APP에 대해 특이적이다.
실시예 14. 상기 APP 의 γ- 세크라타제 절단부위에 결합한 펩타이드
γ-세크라타제에 의한 APP 절단 부위를 가지고 있는 데카머 펩타이드 서열이 사용되었다. 상기 서열은 다음과 같다: GVVIATVIVI (SEQ ID NO:8). γ-세크라타제는 상기 펩타이드의 A 와 T 사이의 결합을 절단하고 다음의 절단 산물을 배출한다: GVVIA (SEQ ID NO:41) 및 TVIVI (SEQ ID NO:42)(도 19).
상기의 실시예 1에서, 상보적 접근에 기초하여 두 펩타이드를 제조하였다. 상기 안티센스 서열은 상기의 데카머 기질 서열에 대응하는 상기 mRNA 서열에 의해 제조되었다. 유전적코드는 상기 안티센스 RNA로부터 상기 서열을 5'→3' 또는 3'→5' 방향으로 서열을 번역하여 제조되었다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 다음의 데카머 펩타이드 서열이 얻어졌다: DDDHCRYDNT(γCh1(5'→3'), SEQ ID NO:31) 및 PQQYRCHRQR (γCh2 (3'→5', SEQ ID NO:9). 상기 펩타이드는 집합적으로 γ 상보적 펩타이드라고 불리운다. γCh2에 대해서는, 유전자코드와 대응하여 두개의 종결코돈이 있기 때문에, 아르기닌이 종결코돈 사이에 삽입되었다.
실시예 15. γ- 세크라타제 활성 측정
γ-세크라타제는 네가지의 요소로 구성되어 있기 때문에, γ-세크라타제 유전자의 클로닝은 불가능하다. 따라서, 세포 추출물이 γ-세크라타제의 자원으로 사용되었다. 상기 세포 추출물을 얻기 위해, 추출 완충액으로 세포를 용해한 후, 상기 용해물은 1분동안 10,000xg으로 원심분리하였다. 그 후에, 2배의 반응 완충액과 형광 기질을 섞고 상기 세포 용해물을 추가하였다. 그 후, 상기 혼합액을 37oC에서 인큐베이팅하고, γ-세크라타제 활성을 여기 파장 335 내지 355 nm 및 방출파장 495 내지 510 nm에서 측정하였다.
실시예 16. γ- 세크라타제 절단 활성
가장 γ-세크라타제 절단 활성이 높은 세포주를 선택하기 위해, 4개의 다른 세포주가 상기 실시예 15의 측정 방법에 따라 실험되었다. 도 20에서 나타낸 바와 같이, 모든 종류의 세포주는 시간 의존적인 γ-세크라타제 절단 활성을 나타내었다. 상기 세포주들 중에서, 쥐의 신경모세포종인 N2a가 가장 높은 활성을 나타내어서 γ-세크라타제의 상기 자원으로 선택되었다.
실시예 17. γ- 세크라타제 활성에 대한 상보적인 펩타이드의 효과
γ-세크라타 활성 실험은 상기 여러가지 상보적 펩타이드의 존재하에 N2a 세포의 세포막 분획에서 측정되었다. 12.5 μM의 형광 기질과 각각의 상기 상보적 펩타이드 200 μM를 함께 1시간 동안 배양한 후에, 상기 혼합액에 γ-세크라타제를 추가하였다. 일정 시간이 경과한 후에, 상기 형광 기질이 γ-세크라타제에 의해 절단되었다. 도 21에 나타난 바와 같이, 상기 실험한 다른 상보적 펩타이드들이 γ-세크라타제 활성을 거의 저해하지 못한 반면, γCh2 (3'→5')가 가장 좋은 저해효과를 나타내었다(약 80%).
실시예 18. 세포에서의 γ- 세크라타제 실험
상기 펩타이드들의 γ-세크라타제의 절단에 대한 상기 저해효과를 세포 내에서 측정하기 위하여, 세포에 기초한 실험이 고안되었다. KEK293 APP 셀을 6 웰 컬처 플레이트에 90% 농도(confluency)로 배양한 후에, 상기 세포들을 9시간동안 γ-세크라타제 저해제로 알려진 N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) (Dovey HF et al, J. Neurochemistry 2001;76:173-181)와 상보적 펩타이드로 처리하였다. 각 웰에 있는 상기 세포들을 용해한 후에, 상기 용해물을 15 % tris-tricine gel을 이용 분리하였다. 제1항체로 R1 항체, 제2항체로 goat anti-rabbit-HRP를 이용하여 웨스턴블럿 방법을 수행하였다.
도 22에 나타난 바와 같이, DAPT γ-세크라타제 활성을 매우 효과적으로 ㅈ저해햐였다(lane 1). α-세크라타제 절단의 산물인 상기 α-CTF (C-말단 단편)은 γ-세크라타제에 의해서는 절단되지 아니하였으며, 대신에 상기 세포막에 축적되었다. 그러나, 상기 실험된 상보적인 펩타이드 대조군에 비하여 저해효과를 갖지 못하였다. 상기 결과들은 상기 상보적인 펩타이드는 상기 세포의 세포막을 통과하여 소송될 수 없음을 나타내었다. 상기 γ-세크라타제 억제 실험에서, 상보적인 펩타 이드인 폴리아르기닌 커플링 γCh2(3'→5')는 상기 세포를 통과하여 위치해서 세포안에서 저해활성을 가질 수 있는지 여부가 측정되었다.
실시예 19. c- Sub M△ C1N3 의 알라닌 스캐닝( CIQIHF )
펩타이드 저해활성에 대해 중요한 아미노산이 무엇인지 확인하기 위하여, CIQIHF (SEQ ID NO:29)의 각 위치는 알라닌으로 대체되었다. 알라닌으로 대체하는 것은 원형의 펩타이드 서열의 저해활성을 감소시킬 것으로 추측되었다. 원형 펩타이드의 저해활성과 각 위치가 알라닌으로 대체된 상기 펩타이드의 저해활성은 상기 실시예4에 묘사된 것과 같이 나타나졌다. 그 결과는 CIQIHF의 저해활성에 대하여 첫번째 (C), 두번째 (I), 네번째 (I) 그리고 여섯번째 (F) 위치의 아미노산이 중요한 역활을 한다는 것을 보여주었다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 전체적으로 본 명세서에 참조로써 포함된다.
* * * * *
본원 발명에 속하는 관련 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 통상적인 실험 외에 과다한 실험 없이 상기의 본원 발명을 이해하고 수행할 수 있을 것이며 특정 실시예의 많은 구체적인 동등물을 확인할 수 있을 것이다. 그러한 동등물은 본 발명의 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
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Claims (29)

  1. 삭제
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  6. 아밀로이드 전구체 단백질의 β-세크레타제 절단 자리에 결합하고, 아미노산 서열이 SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6), SEFCIQIHFR (SEQ ID NO:7), EFCIQIHFR (SEQ ID NO:15), FCIQIHFR (SEQ ID NO:16), CIQIHFR (SEQ ID NO:17), IQIHFR (SEQ ID NO:18), QIHFR (SEQ ID NO:19), SEFCIQIHF (SEQ ID NO:20), SEFCIQIH (SEQ ID NO:21), SEFCIQI (SEQ ID NO:22), SEFCIQ (SEQ ID NO:23), SEFCI (SEQ ID NO:24), SEFC (SEQ ID NO:25), SEF, FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27), CIQI (SEQ ID NO:28) 및 CIQIHF (SEQ ID NO:29)인 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열이 FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27), SEFCIQI (SEQ ID NO:22), SEFCI (SEQ ID NO:24), SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6), CIQI (SEQ ID NO:28) 또는 SEFCIQIHF (SEQ ID NO:20)인 폴리펩타이드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열이 FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27) 또는 SEFCIQI (SEQ ID NO:22)인 폴리펩타이드.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 아밀로이드 전구체 단백질과 β-세크레타제간의 상호작용을 저해하고 아미노산 서열이 SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6), SEFCIQIHFR (SEQ ID NO:7), EFCIQIHFR (SEQ ID NO:15), FCIQIHFR (SEQ ID NO:16), CIQIHFR (SEQ ID NO:17), IQIHFR (SEQ ID NO:18), QIHFR (SEQ ID NO:19), SEFCIQIHF (SEQ ID NO:20), SEFCIQIH (SEQ ID NO:21), SEFCIQI (SEQ ID NO:22), SEFCIQ (SEQ ID NO:23), SEFCI (SEQ ID NO:24), SEFC (SEQ ID NO:25), SEF, FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27), CIQI (SEQ ID NO:28) 및 CIQIHF (SEQ ID NO:29)인 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 폴리펩타이드를 제공하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 포유동물에서 아밀로이드 전구체 단백질과 β-세크레타제간의 결합을 저해하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 알츠하이머 질병을 갖는 인간을 제외한 포유동물에게 제공되는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열이 FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27), SEFCIQI (SEQ ID NO:22), SEFCI (SEQ ID NO:24), SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6), CIQI (SEQ ID NO:28) 및 SEFCIQIHF (SEQ ID NO:20)인 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드인 방법.
  15. (a) β-세크레타제 결합 자리를 함유하는 APP, 아미노산 서열이 서열번호 1(SEQ ID NO:1)인 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열이 서열번호 2(SEQ ID NO:2)인 폴리펩타이드, 그리고 β-세크레타제를 포함하는 시료와 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 APP, 아미노산 서열이 서열번호 1(SEQ ID NO:1)인 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열이 서열번호 2(SEQ ID NO:2)인 폴리펩타이드와 β-세크레타제가 서로 정상적으로 특이적으로 결합하는 조건하에서, β-세크레타제와 상기 APP, 아미노산 서열이 서열번호 1(SEQ ID NO:1)인 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열이 서열번호 2(SEQ ID NO:2)인 폴리펩타이드의 결합 수준을 결정하는 단계;
    (c) 상기 화합물의 존재하에서, 상기 APP, 아미노산 서열이 서열번호 1(SEQ ID NO:1)인 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열이 서열번호 2(SEQ ID NO:2)인 폴리펩타이드와 β-세크레타제의 결합 수준을 결정하는 단계; 및
    (d) (b) 및 (c)단계에서 기재한, 상기 APP, 아미노산 서열이 서열번호 1(SEQ ID NO:1)인 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열이 서열번호 2(SEQ ID NO:2)인 폴리펩타이드와 β-세크레타제의 결합 수준을 비교하는 단계로서, (b) 단계의 결합수준보다 (c)단계의 결합수준이 더 낮은 경우, 상기 화합물은 상기 APP와 β-세크레타제 결합 저해제인 것인, 아밀로이드 전구체 단백질과 β-세크레타제의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법.
  16. 아밀로이드 전구체 단백질과 β-세크레타제의 결합을 저해하고 아미노산 서열이 SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6), SEFCIQIHFR (SEQ ID NO:7), EFCIQIHFR (SEQ ID NO:15), FCIQIHFR (SEQ ID NO:16), CIQIHFR (SEQ ID NO:17), IQIHFR (SEQ ID NO:18), QIHFR (SEQ ID NO:19), SEFCIQIHF (SEQ ID NO:20), SEFCIQIH (SEQ ID NO:21), SEFCIQI (SEQ ID NO:22), SEFCIQ (SEQ ID NO:23), SEFCI (SEQ ID NO:24), SEFC (SEQ ID NO:25), SEF, FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27), CIQI (SEQ ID NO:28) 및 CIQIHF (SEQ ID NO:29)인 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드를 함유하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 서열이 FCIQIHF (SEQ ID NO:26), EFCIQIHF (SEQ ID NO:27), SEFCIQI (SEQ ID NO:22), SEFCI (SEQ ID NO:24), SEFCIHLHFR (SEQ ID NO:6), CIQI (SEQ ID NO:28) 및 SEFCIQIHF (SEQ ID NO:20)인 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드인 알츠하이머 질병 치료용 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 아밀로이드 전구체 단백질의 γ-세크레타제 절단 자리에 결합하고, 아미노산 서열이 PQQYRCHRQR (SEQ ID NO:9)인 폴리펩타이드.
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 아밀로이드 전구체 단백질과 γ-세크레타제간의 상호작용을 저해하고, 아미노산 서열이 PQQYRCHRQR (SEQ ID NO:9)인 폴리펩타이드를 제공하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 포유동물에서 아밀로이드 전구체 단백질과 γ-세크레타제간의 결합을 저해하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 방법은 알츠하이머 질병을 갖는 인간을 제외한 포유동물에게 제공하는 것인 방법.
  27. 삭제
  28. (a) γ-세크레타제 결합 자리를 함유하는 APP 또는 아미노산 서열이 서열번호 8(SEQ ID NO:8)인 폴리펩타이드, 그리고 γ-세크레타제을 포함하는 시료와 화합물을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 APP 또는 아미노산 서열이 서열번호 8(SEQ ID NO:8)인 폴리펩타이드와 γ-세크레타제가 서로 정상적으로 특이적으로 결합하는 조건하에서, γ-세크레타제와 상기 APP 또는 아미노산 서열이 서열번호 8(SEQ ID NO:8)인 폴리펩타이드의 결합수준을 결정하는 단계;
    (c) 상기 화합물의 존재하에서, 상기 APP 또는 아미노산 서열이 서열번호 8(SEQ ID NO:8)인 폴리펩타이드와 γ-세크레타제의 결합 수준을 결정하는 단계; 및
    (d) (b) 및 (c)단계에서 기재한, 상기 APP 또는 아미노산 서열이 서열번호 8(SEQ ID NO:8)인 폴리펩타이드와 γ-세크레타제의 결합 수준을 비교하는 단계로서, (b) 단계의 결합수준보다 (c) 단계의 결합수준이 더 낮은 경우, 상기 화합물은 상기 APP와 γ-세크레타제 결합 저해제인 것인, 아밀로이드 전구체 단백질과 γ-세크레타제의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 방법.
  29. 아밀로이드 전구체 단백질과 γ-세크레타제의 결합을 저해하고 아미노산 서열이 PQQYRCHRQR (SEQ ID NO:9)인 폴리펩타이드를 함유하는 알츠하이머 질병 치료용 조성물.
KR1020067015541A 2003-12-31 2004-12-30 아밀로이드 전구체 단백질 프로세싱 저해제 KR100803996B1 (ko)

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