DE69430130T2 - Polypeptide von der semaphorin-genfamilie - Google Patents

Polypeptide von der semaphorin-genfamilie

Info

Publication number
DE69430130T2
DE69430130T2 DE69430130T DE69430130T DE69430130T2 DE 69430130 T2 DE69430130 T2 DE 69430130T2 DE 69430130 T DE69430130 T DE 69430130T DE 69430130 T DE69430130 T DE 69430130T DE 69430130 T2 DE69430130 T2 DE 69430130T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
seq
semaphorin
residue
peptide
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69430130T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69430130D1 (de
Inventor
David R. Bentley
Corey S. Goodman
Alex L. Kolodkin
David Matthes
Timothy O'connor
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
University of California Berkeley
Original Assignee
University of California
University of California Berkeley
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California, University of California Berkeley filed Critical University of California
Application granted granted Critical
Publication of DE69430130D1 publication Critical patent/DE69430130D1/de
Publication of DE69430130T2 publication Critical patent/DE69430130T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/60—New or modified breeds of invertebrates
    • A01K67/61—Genetically modified invertebrates, e.g. transgenic or polyploid
    • A01K67/65—Genetically modified arthropods
    • A01K67/68—Genetically modified insects
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

    Technisches Gebiet
  • Das technische Gebiet dieser Erfindung betrifft Peptide, Polypeptide und Polynukleotide, die in das Wachstum von Nervenzellen verwickelt sind.
    • Hintergrund
  • Die Spezifität der Leitungsführung des Nervensystems -das komplexe Muster der spezifischen synaptischen Verbindungen- beginnt, sich während der Entwicklung zu entfalten, während die Wachstumsspitzen der Neuronen -die Wachstumskegel- lange Entfernungen durchqueren, um ihre richtigen Ziele zu finden. Entlang ihrer Reise werden sie konfrontiert mit und navigieren korrekt eine Reihe von ausgewählten Punkten in einer bemerkenswert unfehlbaren Weise, um schließlich ihr korrektes Ziel zu kontaktieren und zu erkennen.
  • Die Identifizierung der Orientierungshinweise für die Wachstumskegel ist zu einem großen Ausmaß der heilige Gral der Neurobiologie. Dies sind die Verbindungen, die den Neuronen sagen, wann sie wachsen sollen, wohin sie wachsen sollen und wann sie aufhören sollen, zu wachsen. Die medizinischen Anwendungen solcher Verbindungen und ihrer Antagonisten sind ungeheuer und schließen das Modulieren neuronaler Wachstums-Regenerationskapazität, das Behandeln neurodegenerativer Erkrankungen und das Kartieren (z. B. Diagnostizieren) genetisch neurologischer Defekte ein.
  • Über Jahrzehnte konzentrierter Forschung wurden verschiedene Hypothesen von Chemo-Lockstoffen und Repellents, gekennzeichneten Leitungen, Zelladhesionsmolekülen usw. heraufbeschworen, um eine Führung zu erklären. Kürzlich deuteten mehrere neuere Reihen von Experimenten darauf hin, dass Abstoßung eine wichtige Rolle in der Neuronenführung spielen könnte, und es wurde über zwei anscheinend in keinem Zusammenhang stehende Faktoren ("Neunte Growth Factor" und "Collapsin") berichtet, die fähig sind, Wachstumskegel zu hemmen oder zusammenbrechen zu lassen.
    • Relevante Literatur
  • Für einen neueren Überblick über einen großen Teil der Literatur zu diesem Gebiet siehe Goodman und Shatz (1993) Cell 72/Neuron 10, 77-98. Eine Beschreibung von Heuschrecken Fasciclin IV (jetzt G-Semaphorin I genannt) erscheint in Kolodkin et al. (1992) Neuron 9, 831-845. Neuere Berichte über Collapsin und den Neunte Growth Factor schließen Raper und Kapfhammer (1900) Neuron 4, 21-29, ein Kurzreferat, das von Raper am 26. Juli 1993 auf dem GIBCO-BRL-Symposium über "Genes and Development/Function of Brain" präsentiert wurde und Schwab und Caroni (1988) J Neurosci 8, 2381 beziehungsweise Schnell und Schwab (1990) Nature 343, 269 ein. Die Aminosäuresequenz des Vaccinia Virus-Semaphorin-Polypeptids ist in J. Biol. Chem. 266, 13712-13718, (1991) und J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991) offenbart.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine neue Klasse von Proteinen, Semaphorinen, Nukleinsäuren, die für Semaphorine codieren und Verfahren, die Semaphorine und Semaphorincodierende Nukleinsäuren verwenden, sind offenbart. Semaphorine schließen die erste bekannte Familie von menschlichen Proteinen, die als Wachstumskegel- Inhibitoren wirken und eine Familie von Proteinen, die in virale Pathogenese und Onkogenese, insbesondere in die von Pockenviren verwickelt ist, ein. Familien von Semaphorin-spezifischen Rezeptoren, einschließlich Rezeptoren, die auf Nerven-Wachstumskegeln und Immunzellen gefunden wurden, sind auch offenbart.
  • Die Erfindung stellt Agenzien, einschließlich Semaphorin-Peptiden bereit, die Semaphorinrezeptoren und Agenzien spezifisch binden, einschließlich Semaphorinrezeptor-Peptide, die Semaphorine spezifisch binden, bereit. Diese Agenzien stellen starke Modulatoren des Nervenzell-Wachstums, der Immunempfindlichkeit und der viralen Pathogenese bereit und finden Verwendung in der Behandlung und Diagnose von neurologischen Erkrankungen und Neuroregeneration, in der Immunmodulation einschließlich Hypersensitivität und Transplantat-Abstoßung und in der Diagnose und Behandlung von viralen und onkologischen Infektionen/Erkrankungen.
  • Semaphorine, Semaphorinrezeptoren, für ein Semaphorin codierende Nukleinsäuren und einzigartige Anteile davon finden auch verschiedene Verwendung im Screening chemischer Bibliotheken auf Regulatoren von Semaphorin oder Semaphorinrezeptor-vermittelter Zellaktivität, im genetischen Kartieren, als Proben für verwandte Gene, als diagnostische Reagenzien für genetisch neurologische, immunologische und onkologische Erkrankungen und in der Herstellung von spezifischen zellulären und tierischen Systemen zur Entwicklung von Behandlung von neurologischen, immunologischen, onkologischen und viralen Erkrankungen.
    • BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung offenbart neue Familien von Proteinen, die in der Nerven- und Immunzellfunktion bedeutend sind: die Semaphorine und die Semaphorinrezeptoren. Die Erfindung stellt Agenzien, einschließlich Semaphorin- Peptiden bereit, die Semaphorinrezeptoren und Agenzien spezifisch binden, einschließlich Semaphorinrezeptor-Peptide, die spezifisch Semaphorine binden. Diese Agenzien finden eine breite Vielfalt an klinischen Verwendungen, therapeutischen Verwendungen und Verwendungen in der Forschung, besonders Agenzien, die die Nerven- und/oder Immunzeilfunktion durch spezifisches Nachahmen oder Stören der Semaphorinrezeptor-Bindung modulieren. Beispielsweise sind ausgewählte Semaphorin-Peptide, von denen gezeigt wurde, dass sie als Semaphorinrezeptor-Antagonisten wirken, durch konkurrierendes Hemmen natürlicher Semaphorin-Assoziation mit zellulären Rezeptoren wirksam. Auf diese Weise können diese Agenzien, in Abhängigkeit vom angesteuerten Rezeptor, verwendet werden, um Semaphorin-vermittelte Abstoßung oder Kontaktinhibition des Nervenzell-Wachstumskegel zu blockieren. Solche Agenzien finden weite klinische Anwendung, wo ein Nervenzellwachstum erforderlich ist, z. B. einer traumatischen Verletzung an Nervenzellen, neurodegenerativen Erkrankungen usw. Eine breite Vielfalt von Semaphorin- und Semaphorinrezeptorspezifischen Bindemitteln und Verfahren zur Identifizierung, Herstellung und Verwendung derselben, sind unten beschrieben.
  • Bindemittel von besonderem Interesse sind Semaphorin-Peptide, die spezifisch an einen Semaphorinrezeptor binden und diesem entgegenwirken und Semaphorinrezeptor-Peptide, die ein Semaphorin spezifisch binden und die Bindung an einen natürlichen Rezeptor verhindern. Während in erster Linie mit Semaphorin-Peptiden veranschaulicht, wird vieles der folgenden Beschreibung entsprechend für Semaphorinrezeptor-Peptide angewendet.
  • Die Semaphorin-Peptide der Erfindung umfassen einen einzigartigen Anteil eines Semaphorins und besitzen eine Semaphorin-Bindungsspezifität. Ein "einzigartiger Anteil" eines Semaphorins besitzt eine Aminosäuresequenz, einzigartig gegenüber der offenbarten, die in keinem früher bekannten Protein zu finden ist. Somit besitzt ein einzigartiger Anteil eine Länge der Aminosäuresequenz, die mindestens lang genug ist, um ein neues Peptid zu definieren. Es wurde herausgefunden, dass einzigartige Semaphorin-Anteile von etwa 5 bis etwa 25 Resten variieren, bevorzugt von 5 bis 10 Resten in der Länge, abhängig von der einzelnen Aminosäuresequenz. Einzigartige Semaphorin-Anteile werden ohne weiteres durch Vergleichen der betreffenden Sequenzen des Semaphorin- Anteils mit bekannten Peptid/Proteinsequenz-Datenbanken identifiziert. Bevorzugte einzigartige Anteile leiten sich von den Semaphorindomänen (die die lg-ähnlichen, intrazellulären und transmembranen Domänen ebenso wie die Signalsequenzen ausschließen) der offenbarten Semaphorinsequenzen ab, besonders von Regionen, die den Semaphorinrezeptor binden, besonders von denen humaner Arten. Bevorzugte einzigartige Anteile des Semaphorinrezeptors leiten sich von den Semaphorin-Bindedomänen ab, insbesondere von Regionen mit Resten, die den Semaphorin-Liganden berühren, besonders die der humanen Arten. Besonders bevorzugte Peptide sind hierin weiter beschrieben.
  • Die betreffenden Peptide können frei oder mit anderen Atomen oder Molekülen verbunden sein. Oft liegen die Peptide als ein Anteil eines größeren Polypetids vor, das das betreffende Peptid umfasst, wobei der Rest des Polypeptids nicht von Semaphorin oder vom Semaphorinrezeptor hergeleitet sein muss. Alternativ kann das betreffende Peptid als ein Anteil einer "im Wesentlichen in voller Länge vorliegenden" Semaphorindomäne- oder Semaphorinrezeptor-Sequenz vorliegen, der mindestens etwa 200, bevorzugt mindestens etwa 250, mehr bevorzugt mindestens etwa 300 Aminosäuren einer offenbarten Semaphorin/Rezeptorsequenz umfasst oder dafür codiert. Somit stellt die Erfindung auch Polypeptide bereit, die eine Sequenz umfassen, die im Wesentlichen der einer im Wesentlichen in voller Länge vorliegenden Semaphorindomäne oder der eines Semaphorinrezeptors ähnlich ist. "Im Wesentlichen ähnliche" Sequenzen teilen mindestens etwa 40%, mehr bevorzugt mindestens etwa 60%, und am meisten bevorzugt mindestens etwa 80% Sequenzidentität. Wo die Sequenzen voneinander abweichen, sind die Unterschiede normalerweise Punktinsertionen/Deletionen oder konservative Substitutionen, z. B. eine Cystein/Threonin oder Serin-Substitution, ein Aminosäureaustausch zwischen sauerer/sauerer oder hydrophober/hydrophober Aminosäure usw.
  • Die betreffenden Semaphorinpeptide/Polypeptide sind "isoliert", das bedeutet, nicht begleitet von zumindest einem Teil des Materials, mit dem sie in ihrem natürlichen Zustand assoziiert sind. Im Allgemeinen besteht ein isoliertes Peptid/Polypeptid aus mindestens etwa 1%, bevorzugt mindestens etwa 10%, und mehr bevorzugt mindestens etwa 50 Gewichtsprozent des gesamten Peptids/Proteins in einer gegebenen Probe. Mit reinem Peptid/Polypeptid ist mindestens etwa 90%, bevorzugt mindestens 95%, und mehr bevorzugt mindestens 99 Gewichtsprozent des gesamten Peptids/Proteins gemeint. Eingeschlossen in das betreffende Peptid/Polypeptidgewicht sind jegliche Atome, Moleküle, Gruppen oder Polymere, die kovalent an das betreffende Semaphorin/Rezeptor, Peptid/Polypeptid gekoppelt sind, besonders Peptide, Proteine, nachweisbare Markierungen, Glykosylierungen, Phosphorylierungen usw.
  • Die betreffenden Peptide/Polypeptide können durch eine Vielzahl von Wegen, die den Fachleuten bekannt sind, isoliert oder gereinigt werden, abhängig davon, welche anderen Komponenten in der Probe vorhanden sind und woran das Peptid/Polypeptid kovalent gebunden ist, wenn es gebunden ist. Reinigungsverfahren schließen elektrophoretische, molekulare, immunologische und chromatographische Verfahren ein, besonders Affinitätschromatographie und im Fall von Peptiden RP-HPLC. Für eine allgemeine Anleitung in geeigneten Reinigungsverfahren siehe Scopes, R., "Protein Purification", Springer Verlag, NY (1982).
  • Die betreffenden Peptide/Polypeptide umfassen im Allgemeinen natürlich vorkommende Aminosäuren, aber D-Aminosäuren oder Aminosäure- Nachahmungen, gekoppelt durch Peptidbindungen oder Peptidbindungs-Nachahmungen können auch verwendet werden. Aminosäure-Nachahmungen sind andere als die natürlich vorkommenden Aminosäuren, die die Aminosäure bezüglich der Konformation nachahmen, zum Zweck der notwendigen Semaphorin/Rezeptor-Bindungsspezifität. Geeignete Nachahmungen sind gewöhnlichen Fachleuten bekannt und schließen β-γ-δ-Aminosäuren und Iminosäuren, Cyclohexylalanin, Adamantylessigsäure usw., Modifikationen des Amidstickstoffs, des α-Kohlenstoffs, Amidcarbonyl, Modifikationen des Grundgerüsts usw. ein. Siehe, im Allgemeinen, Morgan und Gainor (1989) Ann. Repts. Med. Chem 24, 243-252; Spatola (1983) "Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins", Vol VII (Weinstein) und Cho et al. (1993) Science 261, 1303-1305 zur Synthese und zum Screening von Oligocarbamaten.
  • Die betreffenden Semaphorinpeptide/Polypeptide besitzen eine "Semaphorin-Bindungsspezifität", das bedeutet, dass die betreffenden Peptide/- Polypeptide eine molekulare Konformation, die für einen oder mehrere offenbarte Semaphorine spezifisch ist, beibehalten und durch einen Semaphorinspezifischen Rezeptor, Antikörper usw. spezifisch erkennbar sind. So kann eine Semaphorin-Bindungsspezifität durch ein Semaphorin-spezifisches immunologisches Epitop, eine Lektin-Bindungsstelle usw. und bevorzugt eine Rezeptor-Bindungsstelle bereitgestellt werden. Entsprechend besitzen die Semaphorinrezeptor-Peptide/Polypeptide eine "Semaphorinrezeptor-Bindungsspezifität", das bedeutet, dass diese Peptide/Polypeptide eine molekulare Konformation beinhalten, die für einen oder mehrere der offenbarten Semaphorinrezeptoren spezifisch ist, und durch ein Semaphorin, einen Rezeptorspezifischen Antikörper usw. spezifisch erkennbar sind.
  • Eine "Spezifische Bindung" wird empirisch bestimmt durch in Kontakt bringen, beispielsweise eines von Semaphorin abgeleiteten Peptids mit einem Gemisch aus Bestandteilen und Identifizieren jener Bestandteile, die das Semaphorin bevorzugt binden. Spezifische Bindung wird am bequemsten durch Konkurrenz mit markierten Liganden unter Verwendung rekombinanter Semaphorinpeptide entweder in vitro oder in zellulären Expressionssystemen gezeigt, wie hierin offenbart. Im Allgemeinen besitzt eine spezifische Bindung des betreffenden Semaphorins unter in vitro-Bedingungen, wie unten veranschaulicht, eine Bindungsaffinität von 10&supmin;&sup6; M, bevorzugt 10&supmin;&sup8; M, mehr bevorzugt 10&supmin;¹&sup0; M.
  • Die Peptide/Polypeptide können unter Verwendung physikalischer, chemischer und molekularer Techniken, die hierin offenbart oder zitiert sind oder andernfalls den Fachleuten der betreffenden Fachgebiete bekannt sind, modifiziert werden oder mit anderen Verbindungen verbunden werden, um ihre Semaphorin-Bindungsspezifität oder andere Eigenschaften so wie Löslichkeit, Membran-Transportierbarkeit, Stabilität, Bindungsspezifität und Affinität, chemische Reaktivität, Toxizität, Bioverfügbarkeit, Lokalisierung, Detektierbarkeit, in vitro-Halbwertszeit usw. zu beeinflussen, wie durch Verfahren, die hierin offenbart sind oder den Fachleuten anderweitig bekannt sind, untersucht wurde. Zum Beispiel werden Punktmutationen durch ortsgerichtete Mutagenese von Nukleotiden in der DNA, die für die offenbarten Semaphorin-Polypeptide codiert, oder im Ablauf der in vitro-Peptidsynthese eingeführt.
  • Andere Modifikationen, um die Bindungsspezifität/Affinität weiter zu modulieren, schließen chemische/enzymatische Interventionen (z. B. Fettsäure- Acylierung, Proteolyse, Glykosylierung) und besonders dort, wo das Peptid/Polypeptid in ein größeres Polypeptid integriert ist, die Auswahl eines besonderen Expressionswirts, usw. ein. Im Besonderen enthalten viele der offenbarten Semaphorinpeptide Serin- und Threoninreste, die phosphoryliert oder dephosphoryliert sind. Siehe z. B. Verfahren, die in Roberts et al. (1991) Science 253, 1022-1026 und in Wegner et al. (1992) Science 256, 370-373 offenbart sind. Amino- und/oder Carboxyltermini können funktionalisiert werden, z. B. die Aminogruppe durch Acylierung oder Alkylierung und die Carboxylgruppe durch Veresterung oder Amidifizierung oder dergleichen. Viele der offenbarten Semaphorinpeptide/Polypeptide enthalten auch Glykosylierungsstellen und Muster, die z. B. durch Enzyme wie Glykosidasen zerbrochen oder modifiziert werden können oder verwendet werden können, um den Rezeptor z. B. mit Lektinen zu reinigen/identifizieren. Zum Beispiel können N- oder O-verbundene Glykosylierungsstellen der offenbarten Semaphorinpeptide gelöscht oder durch eine andere basische Aminosäure so wie Lys oder His für N-verbundene Änderungen substituiert werden, oder Deletionen oder polare Substitutionen werden an Ser- und Thr-Resten eingeführt, um eine O-verbundene Glykosylierung zu modulieren. Glykosylierungsvarianten werden auch durch das selektieren geeigneter Wirtszellen, z. B. Hefe-, Insekten- oder verschiedene Säugerzellen, oder durch in vitro-Verfahren so wie Neuraminidaseverdau erzeugt. Brauchbare Expressionssysteme schließen als Beispiele COS-7, 293, BHK, CHO, TM4, CV1, VERO-76, HELA, MDCK, BRL3A, W138, Hep G2, MMT 060562, TRI-Zellen, Baculovirus-Systeme ein. Andere kovalente Modifikationen der offenbarten Semaphorinpeptide/Polypeptide können durch Reagieren der angesteuerten Aminosäurereste mit einem organischen derivatisierenden (z. B. Methyl-3-[(p-Azido-Phenyl)Dithio]Propioimidat) oder einem vernetzenden Agens (z. B. 1,1-Bis(Diazoacetyl)-2-Phenylethan), das fähig ist,- mit den ausgewählten Seitenketten oder Termini zu reagieren, eingeführt werden. Für therapeutische und diagnostische Lokalisierung können Semaphorine und Peptide davon direkt markiert werden (Radioisotope, Fluoreszenzstoffe usw.) oder indirekt markiert werden mit einem Agens, das fähig ist, ein detektierbares Signal bereitzustellen, zum Beispiel eine Herzmuskelkinase-Markierungsstelle.
  • Im Folgenden sind 14 Klassen von Semaphorinpeptiden dargestellt, worin die Positionen in Klammern durch jeden der in den Klammern enthaltenen Reste besetzt werden können, und worin "Xaa" bedeutet, dass die Position durch jeden der 20 natürlich codierten Aminosäuren besetzt werden kann. Diese aufgezählten Peptide halten hochkonservierte Strukturen, die wichtige Semaphorinbindungs-Spezifitäten bereitstellen;
  • (a) [AspGlu]Cys[GlnLysArgAlaAsn]Asn[TyrPheVal]Ile (SEQ IN NO: 1)
  • Cys[GlnLysArgAlaAsn]Asn[TyrPheVal]Ile[ArgLysGlnThr] (SEQ ID NO: 2)
  • (b) CysGlyThr[AsnGly][AlaSerAsn][TyrPheHisGly][LysArgHisAsnGln] (SEQ ID NO: 3)
  • CysGlyThr[AsnGly][AlaSerAsn]XaaXaaPro (SEQ ID NO: 4)
  • CysGlyThr[AsnGly]XaaXaaXaaProXaa[CysAsp] (SEQ ID NO: 5)
  • CysGlyThrXaaXaaXaaXaaProXaa[CysAsp]XaaXaa[TyrIle] (SEQ ID NO: 6)
  • (c)[ArgfleGlnVal][GlyAla][LeuValLys][CysSer]Pro[PheTyr][AspAsn] (SEQ ID NO: 7)
  • [CysSer]Pro[PheTyr][AspAsn]Pro[AspGluArgLys][HisLeuAsp](SEQ IN NO: 8)
  • GlyXaa[GlyAla]Xaa[CysSer]ProTyr[AspAsn]Pro (SEQ ID NO: 9)
  • (d) Leu[PheTyr]Ser[GlyAla]Thr[ValAsnAla]Ala (SEQ ID NO: 10)
  • Leu[PheTyr]SerXaaThrXaaAla[AspGlu][PheTyr] (SEQ ID NO: 11)
  • [PheTyr]Ser[GlyAla]Thr[ValAsnAla]Ala[AspGlu][PheTyr] (SEQ ID NO: 12)
  • (e) Leu[AsnAsp][AlaLys]ProAsnPheVal (SEQ ID NO: 13)
  • (f) PhePhePheArgGlu (SEQ ID NO: 14)
  • PhePhe[PheTyr]ArgGlu[ThrAsn] (SEQ ID NO: 15)
  • PhePheArgGlu[ThrAsn]Ala (SEQ ID NO: 16)
  • Phe[PheTyr]ArgGlu[ThrAsn]Ala(SEQ ID NO: 17)
  • TyrPhePhe[PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 18)
  • [PheTyr]PhePhe[PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 19)
  • [PheTyr][PheTyr][PheTyr]ArgGlu[ThrAsn]Ala (SEQ ID NO: 20)
  • [IleVal][PheTyr]Phe[PheTyr][PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 21)
  • Asp[LysPheTyr]Val[PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr] (SEQ ID NO: 22)
  • [ValIle][PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu]Phe[ArgThr]Xaa[ThrAsn](SEQID NO: 23)
  • [ValIle][PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr][ArgThr][GluAspVal][ThrAsn] (SEQ ID NO: 24)
  • (g) Glu[PheTyr]IleAsn[CysSer]GlyLys (SEQ ID NO: 25)
  • [PheTyr]IleAsnCysGlyLys[AlaValIle](SEQ ID NO: 26)
  • (h) Arg[ValIle][AlaGly][ArgGln][ValIle]CysLys (SEQ ID NO: 27)
  • Arg[ValIle]Xaa[ArgGln][ValIle]CysXaaXaaAsp (SEQ ID NO: 28)
  • GlyLys[ValAlaIle]XaaXaaXaaArg[ValAlaIle]XaaXaaXaaCysLys (SEQ ED NO: 29)
  • (i)[ArgLysAsn]Trp[ThrAlaSer][ThrAlaSer][PheTyrLeu]Leu[LysArg] (SEQ ID NO: 30)
  • [PheTyr]Leu[LysArg][AlaSer]ArgLeu[Asn][Ile]Cys (SEQ ID NO: 31)
  • [AsnIle]CysSer[IleVal][ProSer]Gly (SEQ ID NO: 32)
  • Trp[ThrAlaSer][ThrAlaSer][PheTyrLeu]LeuLys[AlaSerValIleLeu]XaaLeu (SEQ ID NO: 33)
  • Trp[ThrAlaSer][ThrAlaSer]XaaLeuLysXaaXaaLeuXaaCys (SEQ ID NO: 34)
  • TrpXaa[ThrSer]XaaLeuLysXaaXaaLeuXaaCys (SEQ ID NO: 35)
  • (j) [PheTyr][PheTyr][AsnAsp]GluIleGlnSer (SEQ ID NO: 36)
  • [PheTyr]Pro[PheTyr][PheTyr][PheTyr][AsnAsp]Glu (SEQ ID NO: 37)
  • (k) GlySerAla[ValIleLeu]CysXaa[PheTyr] (SEQ ID NO: 38)
  • SerAla[ValIleLeu]CysXaa[PheTyr]XaaMet (SEQ ID NO: 39)
  • (l) AsnSer[AsnAla]TrpLeu[ProAla]Val (SEQ ID NO: 40)
  • (m) [ValLeuIle]Pro[GluAspTyrSerPhe]ProArgProGly (SEQ ID NO: 41)
  • [ValLeuIle]ProXaaPro[ArgAla]ProGlyXaaCys (SEQ ID NO: 42)
  • Pro[GluAsplyrSerPhe]ProArgProGly[ThrGlnSer]Cys (SEQ ID NO: 43)
  • (n) AspPro[HisPheTyr]Cys[AlaGly]Trp (SEQ ID NO: 44)
  • Pro[HisPheTyr]Cys[AlaGly]TrpAsp (SEQ ID NO: 45)
  • AspProXaaCys[AlaGly]TrpAsp (SEQ ID NO: 46)
  • CysXaaXaaXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 47)
  • CysXaaXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 48)
  • CysXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 49)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaXaaXaaAspXaaXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 50)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaXaaAspXaaXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 51)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaAspXaaXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 52)
  • Die folgenden Peptide stellen Angehörige von jeder Klasse dar:
  • (a) AspCysGlnAsnTyrIle (SEQ ID NO: 67)
  • (b) CysGlyThr[AsnGly][AlaSer]XaaXaaPro (SEQ ID NO: 68)
  • (c) GlyXaa[SerCys]ProTyrAspPro (SEQ ID NO: 69)
  • (d) LeuTyrSerGlyThr[ValAsnAla]Ala (SEQ ID NO: 70)
  • (e) LeuAsnAlaProAsnPheVal (SEQ ID NO: 71)
  • (f) [PheTyr]PhePhe[PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 19)
  • (g) Glu[PheTyr]IleAsn[CysSer]GlyLys (SEQ ID NO: 25)
  • (h) Arg[ValIle]AlaArgValCysLys (SEQ ID NO: 72)
  • (i) Trp[ThrAla][ThrSer][PheTyr]LeuLys[AlaSer]ArgLeu (SEQ ID NO: 73)
  • (j) ProPheTyrPhe[AsnAsp]GluIleGlnSer (SEQ ID NO: 74)
  • (k) GlySerAlaValCysXaa[PheTyr] (SEQ ID NO: 75)
  • (l) AsnSerAsnTrpLeu[ProAla]Val (SEQ ID NO: 76)
  • (m) Pro[GluAsp]ProArgProGly[ThrGlnSer]Cys (SEQ ID NO: 77)
  • (n) AspProTyrCys[AlaGly]TrpAsp (SEQ ID NO: 78)
  • Die folgenden 14 Klassen sind bevorzugte Peptide, die Semaphorinpeptide ausschließen, die in offenen Leserahmen von Variola major- oder Vaccinia-Viren codiert sind.
  • (a) [AspGlu]Cys[GlnLysArgAlaAsn]Asn[TyrPheVal]Ile (SEQ ID NO: 01)
  • Cys[GlnLysArgAlaAsn]Asn[TyrPheVal]Ile[ArgLysGlnThr] (SEQ ID NO: 02)
  • (b) CysGlyThr[AsnGly][AlaSer][TyrPheHisGly][LysArgHisAsnGln] (SEQ ID NO: 79)
  • CysGlyThr[AsnGly][AlaSerAsn][TyrPheHis][LysArgHisAsnGln] (SEQ ID NO: 80)
  • CysGlyThr[AsnGly][AlaSer]XaaXaaPro (SEQ ID NO: 81)
  • (c) [ArgIleGlnVal][GlyAla][LeuValLys][CysSer]Pro[PheTyr][AspAsn] (SEQ ID NO: 07)
  • [CysSer]Pro[PheTyr][AspAsn]Pro[AspGluArgLys][HisLeuAsp](SEQaNO: 08)
  • GlyXaa[GlyAla]Xaa[CysSer]ProTyr[AspAsn]Pro (SEQ ID NO: 09)
  • (d) Leu[PheTyr]Ser[GlyAla]Thr[ValAsnAla]Ala (SEQ ID NO: 10)
  • Leu[PheTyr]SerXaaThrXaaAla[AspGlu][PheTyr] (SEQ ID NO: 11)
  • [PheTyr]Ser[GlyAla]Thr[ValAsnAla]Ala[AspGlu][PheTyr] (SEQ ID NO: 12)
  • (e) Leu[AsnAsp][AlaLys]ProAsnPheVal (SEQ ID NO: 13)
  • (f) PhePhePheArgGlu (SEQ ID NO: 14)
  • PhePhe[PheTyr]ArgGlu[ThrAsn] (SEQ ID NO: 15)
  • PhePheArgGlu[ThrAsn]Ala (SEQ ID NO: 16)
  • Phe[PheTyr]ArgGlu[ThrAsn]Ala (SEQ ID NO: 17)
  • TyrPhePhe[PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 18)
  • [PheTyr]PhePhe[PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 19)
  • [PheTyr][PheTyr][PheTyr]ArgGlu[ThrAsn]Ala (SEQ ID NO: 20)
  • [IleVal][PheTyr]Phe[PheTyr][PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 21)
  • Asp[LysPheTyr]Vat[PheTyr][PheTyrLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr] (SEQ ID NO: 22)
  • Asp[LysPheTyr]Val[PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIle][PheTyr] (SEQ ID NO: 82)
  • [ValIle][PheTyr][PheTyrLeu][PheTyrIleLeu]Phe[ArgThr]Xaa[ThrAsn] (SEQ ID NO: 83)
  • [ValIle][PheTyr][PheTyrIleLeu]LPheTyrIle]Phe[ArgThr]Xaa[ThrAsn] (SEQ ID NO: 84)
  • [ValIle][PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu]PheArgXaa[ThrAsn] (SEQ ID NO: 85)
  • [ValIle][PheTyr][PheTyrLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr][ArgThr][GluAspVal][ThrAsn] (SEQ ID NO: 86)
  • (g) Glu[PheTyr]IleAsn[CysSer]GlyLys (SEQ ID NO: 25)
  • [PheTyr]IleAsnCysGlyLys[AlaValIle](SEQ ID NO: 26)
  • (h) Arg[ValIle][AlaGly][ArgGln][ValIle]CysLys (SEQ ID NO: 27)
  • Arg[ValIle]Xaa[ArgGln][ValIle]CysXaaXaaAsp (SEQ ID NO: 28)
  • GlyLys[ValAlaIle]XaaXaaXaaArg[ValAlaIle]XaaXaaXaaCysLys (SEQ ID NO: 29)
  • (i) [ArgLysAsn]Trp[ThrAla][ThrAlaSer][PheTyrLeu]Leu[LysArg] (SEQ ID NO: 87)
  • [PheTyr]Leu[LysArg][AlaSer]ArgLeu[AsnIle]Cys (SEQ ID NO: 31)
  • [AsniIe]CysSer[IleVal][ProSer]Gly (SEQ ID NO: 32)
  • Trp[ThrAla][ThrAlaSer][PheTyrLeu]LeuLys[AlaSerValIleLeu]XaaLeu(SEQ ID NO: 88)
  • Trp [IhrAlaSer][ThrAlaSer][PheTyrLeu]LeuLys[AlaSerIleLeu]XaaLeu (SEQ ID NO: 89)
  • Trp[ThrAla][ThrAlaSer]XaaLeuLysXaaXaaLeuXaaCys (SEQ ID NO: 90)
  • (j) [PheTyr][PheTyr][AsnAsp]GluIleGinSer (SEQ ID NO: 36)
  • [PheTyr]Pro[PheTyr][PheTyr][PheTyr][AsnAsp]Glu (SEQ ID NO: 37)
  • (k) GlySerAla[ValIleLeu]CysXaa[PheTyr] (SEQ ID NO: 38)
  • SerAla[ValIle]CysXaa[PheTyr]XaaMet (SEQ ID NO: 39)
  • (l) AsnSer[AsnAla]TrpLeu[ProAla]Val (SEQ ID NO: 40)
  • (m) [ValLeuIle]Pro[GluAspTyrSerPhe]ProArgProGly (SEQ ID NO: 41)
  • [ValLeuIle]ProXaaProArgProGlyXaaCys (SEQ ID NO: 91)
  • Pro[GluAspTyrSerPhe]ProArgProGly[ThrGlnSer]Cys (SEQ ID NO: 43)
  • (n) AspPro[HisPheTyr]Cys[AlaGly]Trp (SEQ ID NO: 44)
  • Pro[HisPhelyr]Cys[AlaGly]TrpAsp (SEQ ID NO: 45)
  • AspProXaaCys[AlaGly]TrpAsp (SEQ ID NO: 46)
  • CysXaaXaaXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 47)
  • CysXaaXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 48)
  • CysXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 49)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaXaaXaaAspXaaXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 50)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaXaaAspXaaXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 51)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaAspXaaXaaCysXaalrpAsp (SEQ ID NO: 52)
  • Die folgenden 2 Klassen sind bevorzugte Peptide, die Semaphorinpeptide ausschließen, die in offenen Leserahmen von Variola major- oder Vaccinia-Viren- Grashüpfer-Semaphorin I codiert sind.
  • (f) TyrPhePhe[PheTyr]ArgGlu (SEQ ID NO: 18)
  • Asp[LysTyr]Val[PheTyr][PheTyrLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr] (SEQ ID NO: 92)
  • Asp[LysTyr]Val[PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIle][PheTyr] (SEQ ID NO: 93)
  • [ValIle]Tyr[PheTyrLeu][PheTyrIleLeu]Phe[ArgThr]Xaa[ThxAsn] (SEQ ID NO: 94)
  • [ValIle]Tyr[PheTyrIleLeu][PheTyrile]Phe[ArgThr]Xaa[ThrAsn] (SEQ ID NO: 95)
  • [ValIle]Tyr[PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu]PheArgxaa[ThrAsn] (SEQ ID NO: 96)
  • Val[PheTyr][PheTyrLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr][ArgThr][GluAspVal][ThrAsn] (SEQ ID NO: 97)
  • Val[Phelyr][PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIle][PheTyr][ArgThr][GluAspVal][ThrAsn] (SEQ ID NO: 98)
  • Val[PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr]Arg[GluAspVal][ThrAsn] (SEQ ID NO: 99)
  • (n) CysXaaXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 48)
  • CysXaaXaaAspProXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 49)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaXaaAspXaaXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 51)
  • CysXaaXaaCysXaaXaaAspXaaXaaCysXaaTrpAsp (SEQ ID NO: 52)
  • Die folgenden 5 Klassen schließen Peptide ein, die Peptide umgeben, die in offenen Leserahmen von Variola major-Viren oder Vaccinia-Viren codiert sind. Entsprechend offenbart die vorliegende Erfindung für den Fall, dass diese viralen Peptide an sich nicht neu sind, einen bis jetzt unvorhergesehenen und unvorhersehbaren Nutzen für diese Peptide als Immunsuppressoren und Ziele der antiviralen Therapie.
  • (b) CysGlyThr[AsnGly][AlaSerAsn][TyrPheHisGly][LysArgHisAsnGln] (SEQ ID NO: 03)
  • CysGlyThr[AsnGly][AlaSerAsn]XaaXaaPro (SEQ ID NO: 04)
  • CysGlyThr[AsnGly]XaaXaaXaaProXaa[CysAsp] (SEQ ID NO: 05)
  • CysGlyThrXaaXaaXaaXaaProXaa[CysAsp]XaaXaa[TyrIle] (SEQ ID NO: 06)
  • (f)Asp[LysPheTyr]Val[PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu][PheTyr] (SEQ ID NO: 22)
  • [ValIle][PheTyr][PheTyrIleLeu][PheTyrIleLeu]Phe[ArgThr]Xaa[ThrAsn] (SEQ ID NO: 23)
  • Val[PheTyr]PheTyrIleLeu]PheTyrIleLeu]PheTyr]ArgThr][GluAspVal][ThrAsn] (SEQ ID NO: 100)
  • (i) [ArgLysAsn]Trp[ThrAlaSer][ThrAlaSer][PheTyrLeu]Leu[LysArg] (SEQ ID NO: 30)
  • Trp[ThrAlaSerl][IhrAlaSer][PheTyrLeu]LeuLys[AlaSerValIleLeu]XaaLeu(SEQ ID NO: 33)
  • Trp[ThrAlaSer][ThrAlaSer]XaaLeuLysXaaXaaLeuXaaCys (SEQ ID NO: 34)
  • TrpXaa[ThrSer]XaaLeuLysXaaXaaLeuXaaCys (SEQ ID NO: 35)
  • (k) SerAla[ValIleLeu]CysXaa[PheTyr]XaaMet (SEQ ID NO: 39)
  • (m) [ValLeuIle]ProXaaPro[ArgAla]ProGlyXaaCys (SEQ ID NO: 42)
  • Die offenbarten Semaphorin-Sequenzdaten werden verwendet, um eine breite Vielfalt an anderen Semaphorin- und Semaphorinrezeptorspezifischen Bindungsagenzien unter Verwendung immunologischer, chromatographischer oder synthetischer Verfahren, die Fachleuten zugänglich sind, zu definieren.
  • Von besonderer Bedeutung sind Peptide, die einzigartige Anteile von Semaphorin-spezifischen Rezeptoren und Polypeptiden umfassen, die eine Sequenz umfassen, die im Wesentlichen ähnlich zu der eines im Wesentlichen in voller Länge vorliegenden Semaphorinrezeptors ist. Unter Verwendung von Semaphorinpeptiden werden diese Rezeptoren durch eine Vielzahl von Fachleuten bekannten Verfahren identifiziert, worin ein Ligand zu dem Zielrezeptor bekannt »ist, einschließlich Expressionsklonierung, wie in der Veranschaulichung unten ausführlich dargelegt. Zu anderen Beispielen von Rezeptorisolierung mit bekannten Liganden unter Verwendung von Expressionsklonierung siehe Staunton et al. (1989) Nature 339, 61; Davis et al. (1991) Science 253, 59; Lin et al. (1992) Cell 68, 775; Gearing et al. (1989) EMBO 8, 3667; Aruffo und Seed (1987) PNAS 84, 8573 und Literaturangaben darin. Im Allgemeinen werden COS-Zellen transfiziert, um eine cDNA-Bibliothek oder ein PCR-Produkt zu exprimieren und Zellen werden isoliert, die Peptide/Polypeptide produzieren, die an Semaphorin/Rezeptor Peptide/Polypeptide binden. Für Neurosemaphorin-Rezeptoren sind fötale Gehirn cDNA-Bibliotheken bevorzugt; für Immunsemaphorin-Rezeptoren sind Bibliotheken bevorzugt, die von aktivierten lymphoiden oder myeloiden Zelllinien abgeleitet sind oder von Gewebe, das von Entzündungsstellen oder von Stellen T-Zell vermittelter Überempfindlichkeitsreaktionen abgeleitet ist; und für Semaphorin- und Semaphorinrezeptor-Varianten, die von Tumorzellen verwendet werden, um die Immunüberwachung zu umgehen oder eine Immunantwort zu supprimieren (Onkosemaphorine), sind Bibliotheken bevorzugt, die von kanzerösem Gewebe oder von Tumorzelllinien, die gegenüber dem Wirts-Immunsystem resistent sind, abgeleitet sind. Alternativ werden PCR-Primer, die auf bekannten Semaphorin/Rezeptor-Sequenzen basieren, so wie diese, die hierin offenbart sind, verwendet, um ein PCR-Produkt von solchen Geweben/Zellen zu amplifizieren. Andere Rezeptor/Ligand-Isolierungsverfahren, die immobilisierten Liganden oder Antikörper verwenden, sind Fachleuten bekannt.
  • Semaphorinrezeptor-Peptide mit Rezeptor-Bindungsspezifität werden durch eine Vielzahl von Wegen identifiziert, einschließlich des Besitzens von konservierten übereinstimmenden Sequenzen mit anderen Semaphorinrezeptoren, durch Vernetzen mit Ligand- oder Rezeptorspezifischen Antikörpern, oder bevorzugt durch Screening solcher Peptide zur Semaphorin-Bindung oder zur Zerstörung der Semaphorinrezeptor-Bindung. Verfahren zum Identifizieren von Semaphorinrezeptor-Peptiden mit der erforderlichen Bindungsaktivität werden hierin beschreiben oder sind Fachleuten anderweitig bekannt. Durch analoge Verfahren werden Semaphorinrezeptor-Peptide verwendet, um zusätzliche Semaphorinpeptide mit Semaphorin-Bindungsspezifität, insbesondere Rezeptorspezifität, zu definieren.
  • Die verschiedenen Semaphorin- und Semaphorinrezeptor-Peptide werden verwendet, um funktionelle Domänen von Semaphorinen zu definieren, um Verbindungen zu identifizieren, die mit Semaphorinen assoziieren, um Verbindungen zu entwerfen, die fähig sind, Semaphorin-vermittelte Nerven- und Immunzellfunktion zu modulieren und um zusätzliche Semaphorin- und Semaphorin-Rezeptorspezifische Bindungsagenzien zu definieren. Zum Beispiel werden Semaphorinmutanten, einschließlich Deletionsmutanten aus den offenbarten Semaphorinsequenzen gebildet und verwendet, um Regionen zu identifizieren, die für spezifische Protein-Ligand- oder Protein-Protein-Interaktionen wichtig sind, zum Beispiel durch Untersuchen auf die Fähigkeit, eine Abstoßung zu vermitteln oder eine Aggregation in auf Zellen basierenden Tests, wie hierin beschrieben, auszuschließen. Weiter werden Röntgenkristall-Strukturdaten der offenbarten Proteine verwendet, um Bindungsmoleküle einer bestimmten Struktur oder Komplementarität für das Modulieren von Wachstum und Führung eines Wachstumskegels vernünftig zu entwerfen.
  • Zusätzliche Semaphorin- und Semaphorinrezeptor-spezifische Agenzien schließen spezifische Antikörper ein, die in eine monovalente Form modifiziert werden können, so wie Fab, Fab' oder Fv, spezifisch bindende Oligopeptide oder Oligonukleotide und am meisten bevorzugt organische Rezeptorantagonisten mit kleinem Molekulargewicht. Zum Beispiel werden die offenbarten Semaphorin- und Rezeptorpeptide als Immunogene verwendet, um Semaphorin- und Semaphorinrezeptor-spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper zu bilden. Siehe Harlow und Lane (1988) "Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory", für allgemeine Verfahren. Anti-idiotypische Antikörper, insbesondere anti-ids innerer Abbildung werden auch unter Verwendung der Offenbarungen hierin hergestellt.
  • Zusätzlich zu von Semaphorin und Semaphorinrezeptor abgeleiteten Polypeptiden und Peptiden werden andere vorraussichtliche Agenzien aus großen Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen herausgefiltert. Zum Beispiel sind zahlreiche Mittel für die zufällige und gerichtete Synthese von Verbindungen, die auf Sacchariden, Peptiden und Nukleinsäuren basieren, erhältlich. Alternativ sind Bibliotheken von natürlichen Verbindungen in Form von bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen und tierischen Auszügen erhältlich oder ohne weiteres herstellbar. Zusätzlich sind natürliche und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen ohne weiteres durch konventionelle chemische, physikalische oder biochemische Mittel modifizierbar. Siehe z. B. Houghten et al. und Lam et al. (1991) Nature 354, 84 beziehungsweise 81 und Blake und Litzi- Davis (1992), Bioconjugate Chem 3, 510.
  • Nützliche Agenzien werden unter Anwendung einer Verbindung, die die betreffenden Peptide oder codierten Nukleinsäuren umfasst, im Rahmen von Assays identifiziert. Eine breite Vielfalt von in vitro-, zellfreien Bindungsassays, insbesondere Assays für die spezifische Bindung an immobilisierte Verbindungen umfassend ein Semaphorin- oder Semaphorinrezeptor-Peptid, finden passende Verwendung. Obwohl weniger bevorzugt, können auf Zellen basierende Assays verwendet werden, um spezifische Effekte von voraussichtlichen Agenzien für eine Semaphorinrezeptor-Bindung zu bestimmen, können untersucht werden, siehe z. B. Schnell und Schwab (1990) oben. Optional wird die intrazelluläre C-terminale Domäne mit einer Sequenz substituiert, die für ein Oligopeptid- oder eine Polypeptiddomäne kodiert, die ein detektierbares intrazelluläres Signal durch die Ligandenbindung bereitstellt, das sich von dem des natürlichen Rezeptors unterscheidet. Nützliche intrazelluläre Domänen schließen diejenigen des humanen Insulinrezeptors und des TCR ein, insbesondere Domänen mit Kinase-Aktivität und Domänen, die fähig sind, einen Calzium-Zustrom auszulösen, der durch Fluorimetrie durch Vorbelasten der Wirtszelle mit Fura-2 bequem detektiert werden kann. Mehr bevorzugte Assays betreffen einfache zellfreie in vitro-Bindung von Test-Agenzien an immobilisiertes Semaphorin oder an Rezeptorpeptide, oder umgekehrt. Siehe z. B. Fodor et al (1991) Science 251, 767 für Licht-gerichtete parallele Syntheseverfahren. Solche Assays sind zugänglich für Scale-up, für Hochdurchsatz-Verwendung, geeignet für Volumen-Arzneimittel-Screening.
  • Brauchbare Agenzien sind typischerweise diejenigen, die an ein Semaphorin binden oder die Assoziation eines Semaphorins mit seinem Rezeptor zerstören. Bevorzugte Agenzien sind Semaphorin spezifisch und kreuzreagieren nicht mit anderen neuralen oder Iymphoiden Zellmembran-Proteinen. Brauchbare Agenzien können innerhalb zahlreicher chemischer Klassen gefunden werden, obwohl sie typischerweise organische Verbindungen; bevorzugt kleine organische Verbindungen sind. Kleine organische Verbindungen besitzen ein Molekulargewicht von mehr als 150 aber geringer als etwa 4500, bevorzugt weniger als etwa 1500, mehr bevorzugt weniger als etwa 500. Beispielhafte Klassen schließen Peptide, Saccharide, Steroide, Heterozyklen, Polyzyklen, substituierte aromatische Verbindungen und dergleichen ein.
  • Ausgewählte Agenzien können modifiziert werden, um die Effizienz, Stabilität, pharmazeutische Verträglichkeit und dergleichen zu verbessern. Eine Strukturelle Erkennung eines Agens kann verwendet werden, um zusätzliche Agenzien zu identifizieren, herzustellen oder zu screenen. Wo Peptidagenzien identifiziert werden, können sie zum Beispiel in einer Vielzahl von Wegen wie oben beschrieben modifiziert werden, z. B., um ihre proteolytische Stabilität zu verbessern. Andere Verfahren zur Stabilisierung können Einkapselung, zum Beispiel in Liposomen usw., einschließen.
  • Die betreffenden Bindungsagenzien können auf eine Vielzahl von Wegen, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel können Peptide mit weniger als etwa 60 Aminosäuren heutzutage ohne weiteres unter Verwendung konventioneller kommerziell erhältlicher automatischer Synthesemaschinen synthetisiert werden. Alternativ können DNA-Sequenzen hergestellt werden, die für die gewünschten Peptide kodieren und in einen geeigneten Expressionsvektor für die Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt, insertiert werden. Eine breite Vielfalt von Expressionsvektoren ist heutzutage erhältlich und kann in konventionellen Verfahren zur Transformation eines kompetenten Wirts zur Expression und Isolierung verwendet werden. Wenn gewünscht, kann der offene Leserahmen, der für das gewünschte Peptid kodiert, mit einer Signalsequenz zur Sekretion verbunden werden, so dass eine Isolierung aus dem Kulturmedium erlaubt wird. Verfahren zur Herstellung der gewünschten Sequenz, zur Insertion der Sequenz in einen Expressionsvektor, zur Transformation eines kompetenten Wirts und zum Wachstum des Wirts in einer Kultur zur Produktion des Produkts können in U.S. Patenten Nr. 4 710 473, 4 711 843 und 4 713 339 gefunden werden.
  • Für therapeutische Verwendungen können die hierin offenbarten Zusammensetzungen und Agenzien durch jedes geeignete Verfahren verabreicht werden. Kleine organische Verbindungen werden bevorzugt oral verabreicht, Zusammensetzungen mit großem Molekulargewicht (z. B. größer als 1 kD, im Allgemeinen größer als 3 kD, mehr allgemein größer als 10 kD) werden bevorzugt parenteral verabreicht, passenderweise in einem pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Träger, z. B. in phosphatgepufferter Salzlösung, in Salzlösung, in deionisiertem Wasser oder dergleichen. Typischerweise werden die Zusammensetzungen zu einer behaltenen physiologischen Flüssigkeit so wie Blut oder Synovialflüssigkeit zugegeben. Zur Verabreichung ins ZNS ist eine Vielzahl von Verfahren verfügbar, um den Transfer des Therapeutikums über die Blut-Hirn- Schranke zu fördern, einschließlich Zerreißung durch Chirurgie oder Injektion, Arzneimittel, die vorübergehend den Adhäsionskontakt zwischen ZNS- Gefäßsystem-Endothelialzellen öffnen und Verbindungen, die die Translokation durch solche Zellen vereinfachen.
  • Als Beispiele sind viele der offenbarten Therapeutika direkter Injektions- oder Infusions-, topischer, intratrachealer/nasaler Applikation zugänglich, z. B. durch Aerosole, intraokulare osmotischen Pumpen oder osmotische Pumpen in/auf Implantaten, z. B. Fasern (z. B. Kollagen), Transplantaten umfassend geeignet transformierte Zellen usw. Eine besonders bevorzugte Anwendung schließt Beschichtung, Einbetten oder Derivatisieren von Fasern so wie Kollagenfasern, Proteinpolymere usw. mit therapeutischen Peptiden ein. Andere brauchbare Zugänge sind in Otto et al. (1989) J Neuroscience Research 22, 83-91 und Otto und Unsicker (1990) J Neuroscience 10, 1912-1921 beschrieben. Im Allgemeinen wird die zu verabreichende Menge empirisch bestimmt werden, typischerweise im Bereich von etwa 10 bis 1000 ug/kg des Empfängers. Für Peptid-Agenzien wird die Konzentration der verabreichten Dosis im Allgemeinen im Bereich von etwa 50 bis 500 ug/ml liegen. Andere Additive, so wie Stabilisatoren, Bakterizide usw. können eingeschlossen werden. Diese Additive werden in üblichen Mengen vorhanden sein.
  • Die Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuresequenzen bereit, die für die offenbarten Semaphorin- und Semaphorinrezeptor-Peptide und Polypeptide kodieren, einschließlich Sequenzen, die im Wesentlichen mit Sequenzen, die für solche Polypeptide codieren, identisch sind. Eine "isolierte" Nukleinsäuresequenz ist anders als ein natürlich vorkommendes Chromosom oder Transkript in seinem natürlichen Zustand vorhanden, und ist typischerweise von mindestens einigen der Nukleotidsequenzen entfernt, mit welchen sie normalerweise auf einem natürlichen Chromosom assoziiert ist. Eine komplementäre Sequenz hybridisiert an einen einzigartigen Anteil der offenbarten Semaphorinsequenz unter Bedingungen geringer Strenge, zum Beispiel bei 50ºC und SSC (0,9 M Salzlösung/0,09 M Natriumcitrat), und sie bleibt gebunden, wenn sie einem Waschen bei 55ºC mit SSC unterzogen wird. Regionen der komplementären Nukleinsäuren, die nicht identisch sind, oder im Fall von homologen Nukleinsäuren ein Nukleotidaustausch, der ein überflüssiges Codon bereitstellt, sind bevorzugt. Eine partiell reine Nukleotidsequenz besteht aus mindestens etwa 5%, bevorzugt mindestens etwa 30% und mehr bevorzugt mindestens etwa 90 Gewichtsprozent der gesamten Nukleinsäuren, die in einer gegebenen Fraktion vorhanden sind.
  • Einzigartige Anteile der offenbarten Nukleinsäuresequenz sind von einer Länge, die ausreichend ist, um zuvor bekannte Nukleinsäuresequenzen davon zu unterscheiden. Somit besitzt ein einzigartiger Anteil eine Nukleotidsequenz, die zumindest lang genug ist, um ein neues Oligonukleotid zu definieren. Bevorzugte Nukleinsäureanteile codieren für ein einzigartiges Semaphorinpeptid. Die Nukleinsäuren der Erfindung und Anteile davon, andere als diese, die als PCR-Primer verwendet werden, sind normalerweise mindestens etwa 60 bp und normalerweise weniger als etwa 60 kb lang. PCR-Primer sind normalerweise zwischen etwa 15 und 100 Nukleotide lang.
  • Die Erfindung stellt auch die offenbarten Sequenzen bereit, die, durch Transitionen, Transversionen, Deletionen, Insertionen oder anderen Modifikationen so wie alternativem Spleißen modifiziert sind und stellt auch genomische Semaphorinsequenzen und Gen-flankierende Sequenzen, einschließlich regulatorischen Sequenzen bereit; eingeschlossen sind DNA- und RNA-Sequenzen, Sense und Antisense. Bevorzugte DNA-Sequenzanteile schließen Anteile ein, die für die oben offenbarten bevorzugten Aminosäuresequenz-Anteile kodieren. Für Antisense-Anwendungen, worin die Inhibition der Semaphorin-Expression indiziert ist, sind besonders nützliche Oligonukleotide die, die zwischen etwa 10 und 30 Nukleotide lang sind und Sequenzen, die die offenbarte ATG-Startstelle umgeben, insbesondere die Oligonukleotide, die durch die offenbarte Sequenz definiert sind, die etwa 5 Nukleotide vor der Startstelle beginnt und etwa 10 Nukleotide nach der offenbarten Startstelle endet, einschließen. Andere speziell nützliche Semaphorinmutanten betreffen Deletions- oder Substitutionsmodifikationen der offenbarten zytoplasmischen C-Termini der transmebranen Semaphorine. Entsprechend werden Semaphorinmutanten mit Semaphorin-Bindungsaffinitäten, aber mit veränderten intrazellulären Signaltransduktions-Kapazitäten hergestellt.
  • Für modifizierte Semaphorin-codierende Sequenzen oder verwandte Sequenzen, die für Proteine mit Semaphorin-ähnlichen Funktionen kodieren, wird es im Allgemeinen eine wesentliche Sequenzidentität zwischen mindestens einem Segment davon und einem Segment geben, das für wenigstens einen Anteil der offenbarten Semaphorinsequenz kodiert, bevorzugt mindestens etwa 60%, mehr bevorzugt mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90% Identität. Homologe Segmente befinden sich insbesondere zwischen für Semaphorindomänen kodierenden Regionen und Regionen, die für Proteindomänen kodieren, die in Protein-Protein-, besonders in Semaphorinrezeptor- Wechselwirkungen verwickelt sind, und Unterschiede innerhalb solcher Segmenten sind insbesondere konservative Substitutionen.
  • Typischerweise kodieren die Semaphorinpeptide der Erfindung für Polynukleotide, die mit heterologen Sequenzen assoziiert sind. Beispiele für solche heterologe Sequenzen schließen regulatorische Sequenzen so wie Promotoren, Enhancer, Response-Elemente, Signalsequenzen, Polyadenylierungs-Sequenzen usw. Introns, 5'- und 3' nichtkodierende Regionen usw. ein. Andere nützliche heterologe Sequenzen sind Fachleuten bekannt und anderenfalls in den hierin zitierten Literaturangaben offenbart. Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden Anteile der für Semaphorin kodierenden Sequenz mit heterologen Sequenzen gespleißt, um lösliche, sekretierte Fusionsproteine herzustellen, unter Verwendung geeigneter Signalsequenzen und optional einem Fusionpartner so wie β-Gal.
  • Die offenbarten Sequenzen werden auch verwendet, um andere natürliche Semaphorine und Analoge zu identifizieren und zu isolieren. Insbesondere werden die offenbarten Nukleinsäuresequenzen als Hybridisierungsproben unter geringer Strenge oder als PCR-Primer verwendet, z. B. werden Oligonukleotide, die für funktionelle Semaphorindomänen kodieren, mit ³²P markiert und verwendet, um cDNA-Bibliotheken unter geringer Strenge zu screenen, um ähnliche cDNAs zu identifizieren, die für Proteine mit verwandten funktionellen Domänen kodieren. Zusätzlich werden Nukleinsäuren, die für mindestens einen Anteil des offenbarten Semaphorins codieren, verwendet, um sowohl gewebespezifische Expression von Semaphorin als auch Änderungen der Expression über die Zeit, besonders während der Entwicklung des Organismus oder zellulärer Differenzierung zu charakterisieren.
  • Die für Semaphorin kodierenden Nukleinsäuren können Gegenstand von alternativer Reinigung, Synthese, Modifizierung, Sequenzierung, Expression, Transfektion, Applikation oder anderer Verwendung sein, durch Verfahren, die in Standardhandbüchern so wie "Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor)", "Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith and Stuhl, Greene Publ. Assoc.; Wiley-Interscience, NY, NY, 1992)", offenbart sind oder die anderweitig im Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel können die Nukleinsäuren modifiziert werden, um die Stabilität, Löslichkeit, Bindungsaffinität und Spezifität usw. zu verändern, für Semaphorin kodierende Sequenzen können selektiv methyliert werden usw. Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können auch mit einer Markierung modifiziert werden, die fähig ist, ein detektierbares Signal bereitzustellen, entweder direkt oder indirekt. Beispielhafte Markierungen schließen Radioisotope, Fluoreszenzstoffe, Biotinylierung usw. ein.
  • Die Erfindung stellt auch Vektoren bereit, die Nukleinsäuren umfassen, die für Semaphorinpeptide, Polypeptide oder Analoge kodieren. Eine große Anzahl von Vektoren, einschließlich Plasmid- und viralen Vektoren, wurden für die Expression in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten beschrieben. Vorteilhafterweise können Vektoren auch einen Promotor einschließen, der auf funktionsfähige Weise mit dem für Semaphorin kodierenden Anteil verbunden ist. Vektoren werden oft ein oder mehrere Replikationssysteme für die Klonierung oder Expression, einen oder mehrere Marker für die Selektion im Wirt, z. B. Antibiotikaresistenz, einschließen. Die insertierten, für Semaphorin kodierenden Sequenzen, können synthetisiert, aus natürlichen Quellen isoliert, als Hybride hergestellt werden usw. Geeignete Wirtszellen können durch jegliches geeignete Verfahren einschließlich Elektroporation, CaCl&sub2;-vermittelter DNA-Aufnahme, viraler Infektion, Mikroinjektion, Mikroprojektil- oder anderen Verfahren transformiert/transfiziert/infiziert sein.
  • Geeignete Wirtszellen schließen Bakterien, Archebakterien, Pilze, besonders Hefen, und Pflanzen- und Tierzellen, besonders Säugetierzellen ein. Von besonderem Interesse sind E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, SF9- Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora- und CHO-, COS-, HeLa-Zellen, immortalisierte myeloide und lymphoide Säugetier-Zelllinien und pluripotente Zellen, insbesondere Säugetier-Es-Zellen und Zygoten. Bevorzugte Replikationssysteme schließen M13, ColE1, SV40, Baculoviren, Lambda, Adenovirus, AAV, BPV usw. ein. Eine große Anzahl von Transkriptions-Initiations- und Terminations-Regulations-Regionen wurden isoliert und es wurde gezeigt, dass sie in der Transkription und Translation von heterologen Proteinen in den verschiedenen Wirten effektiv sind. Beispiele für diese Regionen, Verfahren zur Isolierung, Arten der Manipulation usw. sind im Fachgebiet bekannt. Unter geeigneten Expressionsbedingungen können Wirtszellen als eine Quelle für rekombinant hergestellte Semaphorine oder Analoge verwendet werden.
  • Zur Herstellung von stabil transformierten Zellen und transgenen, nicht humanen Tieren können Nukleinsäuren, die für die offenbarten Semaphorine kodieren, durch Rekombinations-Ereignisse in ein Wirtsgenom integriert werden. Zum Beispiel kann eine solche Sequenz in eine Zelle mikroinjiziert werden und dabei eine homologe Rekombination an der Stelle eines endogenen Gens bewirken, an einem analogen Gen oder Pseudogen davon, oder an einer Sequenz mit wesentlicher Identität mit einem für Semaphorin kodierenden Gen. Andere auf Rekombination basierende Verfahren, so wie nicht homologe Rekombinationen, Deletion eines endogenen Gens durch homologe Rekombination, besonders in pluripotenten Zellen usw., stellen zusätzliche Anwendungen bereit. Bevorzugte Transgene und stabile Transformanten überexprimieren das offenbarte Rezeptorgen und finden Verwendung in der Arzneimittel-Entwicklung und als ein Krankheitsmodell. Alternativ finden Knockout-Zellen und -Tiere Verwendung in der Entwicklung und in funktionellen Studien. Verfahren zur Herstellung transgener, nicht humaner Tiere, normalerweise Nagetiere, aus Es-Zellen oder Zygoten sind Fachleuten bekannt.
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren, die hierin offenbart sind, können verwendet werden, um Gentherapie auszuführen. Siehe z. B. Zhu et al. (1993) Science 261, 209-211; Gutierrez et al. (1992) Lancet 339, 715-721. Zum Beispiel werden Zellen mit Semaphorinsequenzen transfiziert, die auf funktionsfähige Weise an Gen-Regulatorsequenzen gebunden sind, die fähig sind, eine veränderte Semaphorin-Expression oder -Regulation zu bewirken. Um eine Semaphorin-Translation zu modulieren, können Zellen mit komplementären antisense-Polynukleotiden transfiziert werden. Für eine Gentherapie, die die Transfusion von mit Semaphorin transfizierten Zellen betrifft, wird die Applikation von einer Vielzahl von Variablen abhängen, die empirisch bestimmt werden. Zum Beispiel wird die Anzahl der Zellen in Abhängigkeit von der Stabilität der transfundierten Zellen variieren. Das Transfusionsmedium ist typischerweise eine gepufferte Salzlösung oder andere pharmakologisch akzeptable Lösungen. Ähnlich wird die Menge an anderen verabreichten Zusammensetzungen, z. B. transfizierten Nukleinsäuren, Protein usw. von der Art der Applikation, vom Zweck der Therapie und dergleichen abhängen.
  • Die folgenden Beispiele werden als Veranschaulichungen und nicht als Limitierung angeboten.
    • BEISPIELE I. Isolierung und Charakterisierung von Heuschrecken-Semaphorin I (SEQ ID NO 57 und 58) (früher als Fasciclin IV bezeichnet) (nur zur Veranschaulichung, nicht Teil der Erfindung)
  • Um Oberflächenmoleküle zu identifizieren, die bei selektiver Faszikelbildung wirken, wurde eine Reihe von Screenings von monoklonalen Antikörpern (MAb) durchgeführt. Das verwendete Immunogen für die meisten dieser Screenings waren Membranen von den longitudinalen Bindungen (der Ansammlung von longitudinalen Axonen) zwischen benachbarten segmentierten Ganglien des Nervensystems der Heuschreckenlarve. Von diesen Screenings wurden MAb 3B11 und 8C6 verwendet, um zwei Oberflächenglykoproteine, Fasciclin I und Fasciclin II, zu reinigen und zu charakterisieren, siehe Bastiani et al. 1987; die kodierenden Gene wurden beide nacheinander kloniert, siehe Snow et al. 1989, Zinn et al. 1988 und Harrelson und Goodman, 1988.
  • Ein anderer MAb, der während dieser Screenings isoliert wurde, MAb 6F8, wurde für die vorliegende Untersuchung gewählt, weil das Antigen, das durch diesen MAb erkannt wird, genau wie bei Fasciclin I und Fasciclin II, auf einer verschiedenen, aber überlappenden Untergruppe von Axonbahnen in dem sich entwickelnden ZNS exprimiert wird. Das 6F8-Antigen scheint auf der Außenseite von Zelloberflächen lokalisiert zu sein, wie durch MAb-Bindung angezeigt, wenn beide in lebenden Präparationen und in fixierten Präparationen, in denen keine Detergenzien zugegeben wurden, inkubiert werden. Weil das 6F8-Antigen ein Oberflächengykoprotein ist, das auf einer Untergruppe von Axonfaszikeln exprimiert wird (siehe unten), nennen wir es Fasciclin IV.
  • Die Fasciclin IV-Expression beginnt früh in der embryonalen Entwicklung vor der Axonogenese. Bei 29% der Entwicklung wird eine Expression auf der Oberfläche der mesektodermalen Mittelllinie-Zellen gesehen, und etwa 5-7 Neuroblasten und assoziierte ektodermale Zellen werden pro Hemisegment gesehen. Diese Expression erinnert an die mesektodermale und Neuroblastenassoziierte Expression, die sowohl bei Fasciclin I als auch bei Fasciclin II beobachtet wird; aber in jedem Fall spaltet sich das Muster in eine verschiedene Untergruppe von Neuroblasten und assoziierten ektodermalen Zellen.
  • Bei 32% der Entwicklung, kurz nach dem Beginn der Axonogenese im ZNS, kann eine Fasciclin IV-Expression an der Oberfläche der Axone und Zellkörper der drei Paare von MP4-, MP5- und MP6-Mittelllinie-Nachkommen, der drei U-Motoneuronen und auf mehreren nicht identifizierten Neuronen in dichter Nähe zu den U's gesehen werden. Dies steht im Gegensatz zu Fasciclin II, welches in diesem Stadium auf den MP1- und dMP2-Neuronen exprimiert wird, und zu Fasciclin I, welches auf den U-Neuronen, aber nicht auf irgendwelchen Mittellinie-Vorläufer-Nachkommen exprimiert wird.
  • Die Expression von Fasciclin IV auf einer Untergruppe von Axonbahnen wird am besten bei 40% der Entwicklung beobachtet, nach der Anlage der ersten longitudinalen und kommisuralen Axonbahnen. In diesem Stadium wird das Protein auf zwei longitudinalen Axonfaszikeln, auf einer Untergruppe von kommisuralen Axonfaszikeln, auf einer Fläche, die sich früher entlang der Mitelllinie ausstreckt, und auf einer Untergruppe von Faszikeln in den segmentierten Nerven- (SN) und zwischensegmentierten Nerven- (ISN) Wurzeln exprimiert.
  • Speziell Fasciclin IV wird auf den U-Faszikeln exprimiert, einer longitudinalen Bahn (zwischen benachbarten segmentierten Neuromeren), der der Weg teilweise durch die U-Neuronen gebahnt wurde, und auf den A/P longitudinalen Faszikeln (teilweise einer Erweiterung der U-Faszikel innerhalb jedes segmentierten Neuromers). Zusätzlich wird Fasciclin IV auch auf einer zweiten, engeren, medialen und mehr ventralen longitudinalen Bahn exprimiert. Die U- Axone drehen und verlassen das ZNS, wenn sie ihren Weg durch die ISN bahnen; die U's und viele andere Axone innerhalb der ISN exprimieren Fasciclin IV. Die Weiterführung der U-Faszikel posterior zur ISN-Verbindung ist ebenso Fasciclin IV- positiv. Die Spezifität von Fasciclin IV für deutliche Untergruppen von longitudinalen Bahnen kann durch Vergleichen der Fasciclin IV- und Fasciclin II- Expression im selben Embryo gesehen werden; Fasciclin IV wird auf den U- und A/P-Bahnen exprimiert, wohingegen Fasciclin II auf der MP1-Bahn exprimiert wird.
  • Die Axone in dem medianen Fasertrakt (MFT) exprimieren auch Fasciclin IV. Der MFT bahnt sich den Weg durch drei Paare von Nachkommen der Mittelllinie-Vorläufer MP4, MP5 und MP6. Der MFT beeinhaltet tatsächlich drei separate Faszikel. Die Axone der zwei MP4-Nachkommen bahnen sich den Weg durch die dorsalen MFT-Faszikel und verzweigen sich dann am posterioren Ende der anterioren Kommisur; wohingegen die Axone der zwei MP6-Nachkommen sich den Weg durch das ventrale MFT-Faszikel bahnen und sich dann am anterioren Ende der posterioren Kommisur verzweigen. Fasciclin IV wird auf den Zellkörpern der sechs MP4-, MP5- und MP6-Neuronen und an ihren Wachstumskegeln und Axonen exprimiert, wenn sie sich anterior im MFT ausdehnen und sich an einer der zwei Kommisuren verzweigen. Aber diese Expression ist dahingehend regional, dass, wenn sich diese Axone verzweigen und beginnen, sich lateral entlang der longitudinalen Bahnen und entgegen den peripheren Nervenwurzeln zu erstrecken, ihre Fasciclin IV-Expression sehr zurückgeht. Somit ist Fasciclin IV eine Markierung für die Axone im MFT und deren initialen Verzweigungen sowohl an den anterioren als auch den posterioren Kommisuren. Es scheint auch auf anderen kommisuralen Faszikeln exprimiert zu werden. Aber die kommisurale Expression von Fasciclin IV ist unterscheidet sich von der transienten Expression von Fasciclin II entlang des posterioren Rands der posterioren Kommisur oder der Expression von Fasciclin I auf mehreren verschiedenen kommisuralen Axon-Faszikeln sowohl in der anterioren als auch in der posterioren Kommisur (Bastiani et al., 1987, Harrelson und Goodman, 1988).
  • Fasciclin IV wird auch auf einer Untergruppe von Muskelaxonen exprimiert, die das ZNS in den SN verlassen. Die SN teilen sich in zwei Hauptzweige, einen Anterioren und den anderen Posterioren, wenn sie das ZNS verlassen. Zwei große Bündel von Motoneuronen-Axonen in der anterioren Verzweigung exprimieren Fasciclin IV mit hohem Level, ein enges Bündel von Motoneuronen-Axonen in der posterioren Verzweigung exprimiert das Protein mit viel geringeren Leveln. Fasciclin IV wird auch auf vielen der Axonen in den ISN exprimiert.
  • Das ZNS und das Nervenwurzel-Muster von Fasciclin IV, Fasciclin I und Fasciclin II bei etwa 40% der embryonalen Entwicklung zeigen auf, dass, obwohl es einige Überlappung in ihren Mustern gibt (z. B. sowohl Fasciclin IV als auch Fasciclin I markieren die U-Axone), diese drei Oberflächen-Glykoproteine verschiedene Untergruppen von Axonbahnen in dem sich entwickelnden ZNS markieren.
    • Fasciclin IV wird auf epithelialen Banden in der sich entwickelnden Extremitätenknospe exprimiert.
  • Fasciclin IV wird auf dem sich entwickelnden Epithel der Extremitätenknospen in peripheren Banden exprimiert; bei 34,5% der Entwicklung können diese Banden in Hinblick auf Verengungen im Epithel lokalisiert werden, die wahrscheinliche Segmentgrenzen markieren. Zusätzlich zu einer Bande, die genau distal zu der Trochanter/Coxa-Segmentgrenze ist, werden auch Banden in der Tibia, dem Femur, der Coxa gefunden und später in der Entwicklung wird eine fünfte Bande im Tarsus gefunden. Fasciclin IV wird auch in dem naszierenden chordotonalen Organ in der dorsalen Seite des Femur gefunden. Die Banden in der Tibia, im Trochanter und der Coxa umfassen die Extremität. Aber die femorale Bande ist nicht vollständig, sie enthält eine Lücke auf dem anterioren Epithel dieses Segments.
  • Die Position der Ti1-Axonbahn im Hinblick auf diese Banden der Fasciclin IV-positiven Epithelien deutet auf eine potentielle Rolle von Fasciclin IV in der Führung der Ti1-Wachstumskegel hin. Erstens ist die Bande der Fasciclin IV- Expression im Trochanter, die ungefähr den Durchrmesser von drei Epithelzellen in der Breite beträgt, wenn sie auf die Ti1-Wachstumskegel trifft, der axiale Ort, an dem die Wachstumskegel sich von der proximalen Migration zu der peripheren Verzweigungs-Verlängerung umorientieren. Die Tr1-Zelle, die die Stelle dieser Wendung markiert, befindet sich innerhalb dieses Bandes, normalerweise über der zentralen oder der proximalen Zelllage. Zweitens existiert eine Lücke in diesem Band, obwohl es ein mehr distal gelegenes Fasciclin IV-exprimierendes Band im Femur gibt, in dem ein Wechsel im Ti1-Wachstum nicht beobachtet wird, so dass Fasciclin IV-exprimierende Zellen nicht von den Ti1-Wachstumskegeln durchkreuzt werden. Die Ti1-Axone können auch auf eine Fasciclin IV exprimierende Region innerhalb der Coxa treffen, wobei Interaktionen zwischen den Wachstumskegeln, den Epithelzellen und den Cx1-Wegweiser-Zellen bisher noch nicht untersucht wurden.
  • Zusätzlich zu seiner Expression auf der Oberfläche von Epithelzell-Banden wird das Fasciclin IV-Protein, wie durch MAb 6F8 sichtbar gemacht, auch auf der basalen Oberfläche dieser Zellen in einem punktförmigen Muster gefunden. Diese punktförmige Färbung ist kein Artefakt der HRP-Immunzytochemie, da die fluoreszente Sichtbarmachung von MAb 6F8 auch punktförmig ist. Die nicht neuronale Expression von Fasciclin IV ist nicht auf Extremitätenknospen beschränkt. Periphere Epithelbanden der Fasciclin IV-Expression werden auch auf subösophagialen Mandibelstrukturen und auf den sich entwickelnden Antennen gefunden.
    • Gegen MAb gerichtetes Fasciclin IV kann die Bildung der Ti1-Axonbahn in den Extremitätenknospen verändern
  • Die Expression von Fasciclin IV auf einem Epithelband an einen Schlüssel- Auswahlpunkt in der Bildung der Ti1-Axonbahn führte uns zu der Frage, ob dieses Protein in die Führung der Wachstumskegel an dieser Stelle verwickelt ist. Um diese Frage zu beantworten, kultivierten wir Embryonen oder epitheliale Streifen (z. B. O'Connor et al., 1990) während der 5% der Entwicklung, die für normale Leitungsbildung notwendig sind, entweder in der Gegenwart oder der Abwesenheit von MAb 6F8 oder 6F8 Fab-Fragmenten. Unter den für diese Experimente verwendeten Kulturbedingungen werden fehlerhafte Ti1-Bahnen in 14% der Extremitäten beobachtet (Chang et al. 1992); dies definiert die Basis für Anormalitäten, die unter Verwendung dieser Bedingungen beobachtet werden. Als Kontrollen verwendeten wir andere MAbs und deren Fab-Fragmente, die entweder an die Oberfläche dieser Neuronen und Epithelzellen binden (MAb 3B11 gegen das Oberflächenprotein Fasciclin I) oder nicht binden (MAb 4D9 gegen das ausgezackte Kernprotein; Patel et al. 1989). Um den Einfluss von MAb 6F8 auf die Ti1-Leitungsbildung einzuschätzen, verglichen wir den Prozentanteil abweichender Bahnen, die nach Behandlung mit MAb 6F8 beobachtet wurden, mit dem der mit den MAbs 3B11 und 4D9 beobachtet wurde. Unsere Kulturen begannen bei 32% der Entwicklung, wenn die Ti1-Wachstumskegel das Epithel, das sich genau distal bezüglich der Trochanter/Coxa-Grenze befand, noch nicht erreicht hatten und deshalb nicht auf die Fasciclin IV-exprimierenden Epithelzellen trafen. Nach ungefähr 30 Stunden in Kultur (~4% bei der Entwicklung) wurden Embryonen fixiert und mit Antikörpern gegen HRP immungefärbt, um die Ti1- Axone und andere Neuronen in der Extremitätenknospe sichtbar zu machen. Kriterien für die Punkte der Ti1-Bahn und die Definition für "abweichend" werden ausführlich unten in den experimentellen Verfahren beschrieben.
  • Obwohl MAb 6F8 die Leitungsbildung nicht hindert, werden mehrere Arten von charakteristischen anormalen Bahnen beobachtet. Diese Fehler beginnen im Allgemeinen, wo Wachstumskegel zuerst mit den Fasciclin IV-exprimierenden Zellen im Trochanter in Kontakt kommen. Normalerweise besitzen die Ti1- Neuronen jeweils ein einzelnes Axon, und die Axone der zwei Zellen sind in diesem Anteil der Bahn innerhalb des Trochanters faszikulär. Nach Behandlung mit MAb 6F8 werden vielfache lange Axon-Verzweigungen innerhalb des und proximal zum Trochanter beobachtet. Zwei Hauptklassen von Bahnen werden von diesen Verzweigungen eingeschlagen; in 36% der abweichenden Extremitäten erstrecken sich vielfache lange Axon-Verweigungen ventral in die Region, die distal bezüglich der Cx1-Zellen liegt, die das Band aus Fasciclin IV-exprimierenden Epithelzellen beinhaltet. In der ventralen Region des Trochanters wenden diese Verzweigungen oft unabhängig auf proximale Weise, um mit den Cx1-Zellen in Kontakt zu kommen und so die Bahn in diese Region zu vervollständigen.
  • In einer zweiten Klasse von Leitungsfehlern, gesehen bei 47% der abweichenden Extremitäten, verlassen Axon-Verzweigungenen den Trochanter an anormalen, dorsalen Stellen und erstrecken sich proximal durch die Trochanter/Coxa-Grenze. Diese Axone drehen sich dann ventral und kommen oft mit den Cx1-Neuronen in Kontakt. Die restlichen 17% der Fehler schließen Defaszikulation distal zum Trochanter, Axon-Verzweigungen, die darin scheitern, proximal in den ventralen Trochanter zu wenden und in das posteriore Kompartiment der Extremität weiterführen und Axon-Verzweigungen, die die Trochanter/Coxa-Grenze überqueren und fortfahren, sich ohne ventrale Wendung proximal zu erstrecken, ein.
  • Wenn sie in der Gegenwart von MAb 6F8 kultiviert wurden, zeigten 43% der Extremitäten mißgebildete Ti1-Bahnen (n = 381) verglichen mit 11 % mit MAb 3B11 (n = 230) und 5% mit MAb 4D9 (n = 20). Diese Prozentangaben sind vereint aus Behandlungen mit Mabs, die aus aus Hybridoma-Überstand konzentriert wurden, IgGs wurden aus diesen Überständen isoliert und Fab-Fragmente wurden aus diesen IgG-Präparationen isoliert (siehe experimentelle Verfahren). Die Häufigkeit der missgebildeten Ti1-Bahnen und die Arten der beobachteten Fehler zeigten keine signifikante Variation ungeachtet des Verfahrens der Antikörper- Präparation oder der Art der verwendeten Antikörper. Da Fabs ähnliche Ergebnisse zeigen wie lgGs, sind die Effekte von MAb 6F8 nicht auf die Vernetzung durch die bivalenten IgG zurückzuführen.
  • Zusammenfassend zeigt die Ti1-Bahn typischerweise nach Behandlung mit MAb 6F8 einen anormalen morphologischen Beginn gleich distal des Trochanters und an der Stelle der Fasciclin IV-Expression. Die zwei allgemeinsten Arten der oben beschriebenen Ti1-Leitungsfehler kommen bei 36% der experimentellen Extremitäten vor (behandelt mit MAb 6F8), werden aber bei nur 4% der Kontrollextremitäten (behandelt mit MAbs 3B11 und 4D9) gesehen.
    • Fasciclin IV cDNAs codieren für ein neues integrales Membranprotein
  • Heuschrecken-Fasciclin IV wurde durch Durchfließen von embryonalem Heuschrecken-Rohlysaten durch eine MAb 6F8-Säule gereinigt. Nach der Affinitätsreinigung wurde das Protein eluiert, präzipitiert, denaturiert, an den Cysteinen modifiziert und entweder mit Trypsin oder Lys-C verdaut. Einzelne Peptide wurden mittels HPLC aufgetrennt und unter Verwendung von Standardverfahren mikrosequenziert.
  • Die Aminosäuresequenzen, die von diesen proteolytischen Fragmenten abgeleitet sind, wurden verwendet, um Oligonukleotid-Proben für PCR- Experimente herzustellen, was in Produkten resultierte, die verwendet wurden, um cDNA-Klone aus der embryonalen Zinn-Heuschrecken-Bibliothek zu isolieren (Snow et al. 1988). Eine Sequenzanalyse dieser cDNAs enthüllt einen einzigen offenen Leserahmen (ORF), der für ein Protein mit zwei potentiellen hydrophoben Ausdehnungen von Aminosäuren kodiert: einer aminoterminalen Signalsequenz aus 20 Resten und (beginnend bei Aminosäure 627) einer potentiellen transmembranen Domäne aus 25 Aminosäuren. Somit besitzt das abgeleitete Protein eine extrazelluläre Domäne aus 605 Aminosäuren, eine transmembrane Domäne und eine zytoplasmatische Domäne aus 78 Aminosäuren. Die berechnete Molekülmasse des reifen Fasciclin IV-Proteins ist 80 kd und wird durch Western Blotting-Analyse des mittels Affinität gereinigten und endogenen Proteins bestätigt, wie unten beschrieben. Die extrazelluläre Domäne des Proteins schließt 16 Cysteinreste ein, die in drei lose Cluster fallen, aber keine wiederholte Domäne beinhalten und anderen bekannten Motiven mit Cystein-Wiederholungen nicht ähneln. Es gibt auch sechs potentielle Stellen für eine N-verbundene Glykosylierung in der extrazellulären Domäne. Eine Behandlung des mittels Affinität gereinigten Fasciclins IV mit N-Glykanase zeigt, dass Fasciclin IV in der Tat N-gebundene Oligosaccharide beinhaltet. Fasciclin IV zeigt keine Sequenzähnlichkeit, wenn es mit anderen Proteinen in der PIR-Datenbank unter Verwendung von BLASTP (Altschul et al. 1990) verglichen wird und stellt deshalb ein neues integrales Membranprotein des Typs I dar.
  • Ein polyklonales Antiserum, das gegen die zytoplasmatische Domäne des Proteins gerichtet ist, das von der Fasciclin IV-cDNA kodiert wird, wurde verwendet, um Heuschrecken-Embryonen bei 40% der Entwicklung zu färben. Das beobachtete Färbungsmuster war identisch mit dem, das mit MAb 6F8 gesehen wurde. Auf Western Blots erkennt dieses Antiserum das Protein, das wir mittels Affinität unter Verwendung von MAb 6F8 reinigten und dann einer Mikrosequenz- Analyse unterzogen. Zusätzlich erkennt das polyklonale Serum ein Protein mit ähnlicher Molekülmasse aus embryonalen Heuschrecken-Membranen. Zusammengenommen zeigen diese Daten an, dass die Sequenz, die wir erhalten haben, in der Tat Fasciclin IV ist.
  • Vier andere Zelloberflächen-Proteine, die Untergruppen von Axonbahnen im Nervensystem von Insekten markieren (Fasciclin I, Fasciclin II, Fasciclin III und Neuroglian) sind fähig, homophile Zelladhäsion zu vermitteln, wenn sie in S2-Zellen in vitro transfiziert werden (Snow et al. 1989; Elkins et al. 1990b; Grenningloh et al., 1990). Um zu fragen, ob Fasciclin IV als homophiles Zelladhäsionsmolekül wirken kann, wurde die Fasciclin IV-cDNA mit dem gesamten offenen Leserahmen unter die Kontrolle des induzierbaren Metallothionin-Promoters (Bunch et al. 1988) gestellt, in S2-Zellen transfiziert und bezüglich der Fähigkeit, Adhäsion in normalen nicht adhesiven S2-Zellen zu fördern, untersucht. Nach Induktion mit Kupfer wurde Fasciclin IV in diesen S2-Zellen synthetisiert, wie durch Western Blotting- Analysen und Zelloberflächen-Färbung von induzierten S2-Zellen mit dem polyklonalen Antiserum, das oben beschrieben ist, gezeigt.
  • Wir beobachteten kein Anzeichen für die Aggregation während der Induktion der Fasciclin IV-Expression, womit nahegelegt ist, dass Fasciclin IV im Gegensatz zu den anderen vier Proteinen nicht als homophiles Zelladhäsionsmolekül fungiert. Alternativ kann die Fasciclin IV-vermittelte Aggregation einige weitere posttranslationale Modifikationen oder Cofaktoren erfordern, die von den S2-Zellen nicht bereitgestellt werden, aber dieses Protein agiert klar anders im S2- Zellassay als die anderen vier, früher getesteten axonalen Glykoproteine. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Muster der Fasciclin IV-Expression in der embryonalen Extremität, da nur die Epithelzellen und nicht die Ti1- Wachstumskegel Fasciclin IV exprimieren und Antikörper-Blockierungs- Experimente doch anzeigen, dass Fasciclin IV in der epithelialen Führung dieser Wachstumskegel wirken. Solche Ergebnisse legen nahe, dass Fasciclin IV in einer heterophilen Adhäsion oder einem Signalsystem wirkt.
    • Diskussion
  • Fasciclin IV wird auf Gruppen von Axonen exprimiert, die in das ZNS faszikulieren, was darauf hindeutet, dass es, wie andere axonale Glykoproteine von Insekten, als ein homophiles Zelladhäsionsmolekül fungiert, indem es diese Axone aneinander bindet. Schon in der Extremitätenknospe wird Fasciclin IV auf einem Band des Epithels exprimiert, aber nicht auf den Wachstumskegeln, die sich entlang dieses Bandes umorientieren, was eine heterophile Funktion nahelegt. Dass Fasciclin IV eher in einer heterophilen als in einer homophilen Art wirkt, wird durch den Mangel an homophiler Adhäsion in S2-Zellaggregations-Assays unterstützt. Im Gegensatz dazu können Fasciclin I, Fasciclin II, Fasciclin III und Neuroglian alle als homophile Zelladhäsionsmoleküle wirken (Snow et al., 1989; Elkins et al., 1990b; Grenningloh et al., 1990).
  • Die cDNA-Sequenzanalyse zeigt an, dass Fasciclin IV ein integrales Membranprotein mit einer neuen Sequenz ist, das mit keinem Protein der gegenwärtigen Datenbank verwandt ist. Somit stellt Fasciclin IV eine neue Art von Protein dar, das in der epithelialen Führung von Wachstumskegeln, die sich den Weg in die sich entwickelnden Extremitätenknospen bahnen, wirkt. Fasciclin IV wirkt auch in der Führung von ZNS-Wachstumskegeln, was durch seine Expression auf einer Untergruppe von Axonbahnen in dem sich entwickelnden ZNS gegeben ist.
  • Die Ergebnisse der MAb-Blockierungs-Experimente klären mehrere Streitpunkte in der Ti1-Wachstumskegel-Führung und Axon-Morphogenese in der Extremität. Erstens ist der am meisten auffallende Wechsel im Verhalten der Wachstumszonen in der Extremität der Stillstand des proximalen Wachstums und die Einleitung der peripheren Ausdehnung von Prozessen während des Zusammentreffens der Trochanter/Coxa-Grenzregion (Bentley und Caudy, 1983, Caudy und Bentley, 1987). Dies könnte aufgrund der Tatsache sein, dass das Band aus Epithelzellen innerhalb des Trochanters peripheres Wachstum fördert oder dass die Zellen, die die Trochanter/Coxa-Genzregion und die Region, die sich gleich proximal daran befindet, umfassen, nicht permissiv oder aversiv für die Wachstumskegel-Migration oder beides sind. Die Ausdehnung von manchen Axon- Verzweigungen über die Trochanter/Coxa-Grenze nach Behandlung mit MAb 6F8 deuten darauf hin, dass die Zellen der Trochanter/Coxa-Grenze, die Fasciclin IV nicht exprimieren, nicht aversiv oder nicht permissiv sind. Somit scheint der Wechsel im Verhalten an der Grenze aufgrund der Fähigkeit der Fasciclin IV- exprimierenden Zellen aufzutreten, periphere Ausdehnung von Prozessen der Ti1- Wachstumskegel zu fördern.
  • Zweitens ergibt eine Behandlung mit MAb 6F8 eine häufige Defaszikulierung der Axone der zwei Ti1-Neuronen und auch eine Bildung von anormalen mehrfachen Axon-Verzweigungen innerhalb des Trochanters über die Fasciclin IV-exprimierenden Zellen hinweg. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass eine Behandlung mit Antikörpern gegen Liganden, die auf nicht neuralen Substraten exprimiert werden (Landmesser et al., 1988) oder gegen vermeintliche kompetitive Inhibitoren von Substratliganden (Wang und Denburg, 1992) eine Defaszikulierung und vermehrte Axon-Verzweigung fördern kann. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ti1-Axon : Axon-Faszikulierung und Axon- Verzweigung auch stark durch Interaktionen mit Substratliganden beeinflusst sind und dass Fasciclin IV eine Komponente dieser Interaktion innerhalb des Trochanters zu sein scheint.
  • Drittens bleibt trotz der Effekte von MAb 6F8 auf die Axon-Verzweigung und auf die Überquerung der Trochanter/Coxa-Grenze eine ausgeprägte Tendenz der Verzweigungen, sowohl innerhalb des Trochanters als auch innerhalb der distalen Region der Coxa ventral zu wachsen. Daher wurden alle Signale, die eine ventrale Migration der Wachstumskegel fördern können, durch eine MAb 6F8- Behandlung nicht blockiert. Eine Antikörper-Behandlung kann einen Schwelleneffekt besitzen, worin auf ventrales Wachstum gerichtete Eigenschaften von Fasciclin IV unempfindlicher sind und durch eine Behandlung weniger untauglich gemacht werden als andere Merkmale; alternativ kann eine Führungs- Information, die eine ventrale Migration fördert, unabhängig sein von Fasciclin IV. Zeitverlaufs-Video-Experimente zur Bestimmung, wie sich die anormalen Bahnen, die wir beobachten, tatsächlich bilden, können diese Streitfragen auflösen.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass Fasciclin IV als eine Führungslinie für die Ti1-Wachstumskegel wirkt, die sich gleich distal zu der Trochanter/Coxa-Grenze befinden und für diese Wachstumskegel erforderlich sind, um proximales Wachstum zu stoppen und sich peripher ausbreiten, und dass die Wirkung von Fasciclin IV in der Ti1-Leitungsbildung aus Interaktionen zwischen einem Rezeptor/Ligand auf den Ti1-Wachstumskegeln resultiert und Fasciclin IV auf der Oberfläche des Bands der Epithelzellen in Veränderungen der Wachstumskegel- Morphologie und nachfolgender Umorientierung resultiert. Fasciclin IV scheint diese Veränderung in der Wachstumskegel-Morphologie und der Orientierung durch Adhäsions-Regulierung, durch eine Signaltransduktions-Funktion oder durch eine Kombination aus den beiden ans Licht zu bringen.
    • Experimentelle Verfahren Immunhistochemie
  • Heuschrecken-Embryonen wurden aus einer Kolonie erhalten, die an der U. C. Berkeley geführt wird und bezüglich des Prozentanteils bezogen auf die gesamte Embryonalentwicklung in Stadien unterteilt (Bentley et al., 1979). Die Embryonen wurden in PBS präpariert, für 40 Min in PEM-FA [0,1 M PIPES (pH 6,95), 2,0 mM EGTA, 1,0 mM MgSO&sub4;, 3,7% Formaldehyd] gewaschen, für 1 Stunde mit dreimaligem Wechsel in PBT gewaschen (1 · PBS, 0,5% Triton X-100, 0,2% BSA), für 30 Min in PBT mit 5% normalem Ziegenserum geblockt und über Nacht bei 4ºC in primärem Antikörper inkubiert. PBSap (1 · PBS, 0,1% Saponin, 0,2% BSA) wurde anstelle von PBT mit MAb 8G7 verwendet. Antkörper- Verdünnungen waren wie folgt: MAb 6F8 1 : 1, polyklonale Antiseren, gerichtet gegen ein bakterielles Fasciclin IV-Fusionsprotein (#98-3) 1 : 400; MAb 8G7 1 : 4; MAb 8C6 1 : 1. Die Embryonen wurden für eine Stunde in PBT mit dreimaligem Wechsel gewaschen, für 30 Min blockiert und in sekundärem Antikörper für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die sekundären Antikörper waren HRP-konjugierte Ziege-Anti-Maus- und Anti-Ratte-IgGs (Jackson Immunoresearch Lab) und waren 1 : 300 verdünnt. Embryonen wurden für eine Stunde in PBT mit dreimaligem Wechsel gewaschen und dann in 0,5% Diaminobenzidin (DAB) in PBT zur Reaktion gebracht. Die Reaktion wurde mittels mehrmaligen Waschens in PBS gestoppt und die Embryonen wurden in einer Gycerol-Reihe (50%, 70%, 90%) gereinigt, fixiert und unter Nomarski- oder mittels Hellfeld-Optik betrachtet. Für doppelt markierte Präparationen wurde die erste HPR-Reaktion in PBT durchgeführt, das 0,06% NiCl enthielt, gefolgt von Waschen, Blocken und Inkubation über Nacht in dem zweiten primären Antikörper. Der zweite Antikörper wurde mittels einer DAB-Reaktion wie oben beschrieben sichtbar gemacht. Embryonen, die in Gegenwart von monoklonalen Antikörpern kultiviert wurden, wurden fixiert und über Nacht in Ziege-Anti-HRP (Jackson Immunoresearch Labs), konjugiert an RITC (Molecular Probes), inkubiert, für eine Stunde in PBT mit dreimaligem Wechsel gewaschen, in 90% Glycerol, 2,5% DABCO (Polysciences) fixiert und unter Fluoreszenz-Auflicht betrachtet. S2-Zellen wurden mit polyklonalen 1 : 400 verdünnten Seren #98-3 gefärbt und wie zuvor beschrieben weiterverarbeitet (Snow et al., 1989)
    • Monoklonale Antikörper-Blockierungs-Experimente
  • Um sie bezüglich funktionellen Blockierens zu untersuchen, wurden monoklonale Antikörper-Reagenzien wie folgt hergestellt. Hybridoma-Überstand wurde mit H&sub2;O-gesättigtem NH&sub4;SO&sub4; auf 20% gebracht, eine Stunde in Eis inkubiert und bei 15000 g bei 4ºC für 20 Min rotiert. Der Überstand wurde mit H&sub2;O-gesättigtem NH&sub4;SO&sub4; auf 56% gebracht, über Nacht bei 4ºC inkubiert und wie oben rotiert. Der Niederschlag wurde in PBS resuspendiert unter Verwendung von annähernd 1/40 Volumen des originalen Hybridoma-Überstandes (der oft als Brei übrig bleibt) und gegen 1 · PBS über Nacht bei 4ºC mit zwei Wechseln dialysiert. Dieses Reagenz wird als "konzentrierter Hybridoma-Überstand" erwähnt. Gereinigtes IgG wurde erhalten unter Verwendung eines "Immunopure Plus Immobilized Protein A IgG Purification Kit" (Pierce), um IgG aus dem konzentrierten Hybridom-Überstand zu isolieren. Fab-Fragmente wurden unter Verwendung des "ImmunoPure Fab Preparation Kit" (Pierce) aus den zuvor isolierten IgGs erhalten. Für Blockierungs-Experimente wurde jedes Reagenz in frisch angesetztem, ergänztem RPMI-Kulturmedium (O'Connor et al., 1990) verdünnt, und über Nacht bei 4ºC gegen 10 Volumina desselben Kulturmediums dialysiert. Verdünnungen waren wie folgt: konzentrierter Hybridoma-Überstand 1 : 4; gereinigtes IgG 150 mg/ml; Fab 75mg/ml.
  • Embryonen für Kultur-Experimente wurden sorgfältig in Stadien zwischen 31 und 32% der Entwicklung gebracht. Da Embryonen in jeder Brut typischerweise weniger als 1% der embryonalen Entwicklung voneinander abweichen, wurden die Wachstumskegel der Ti1-Neuronen zu Beginn der Kulturperiode ungefähr im mittleren Femur lokalisiert, weit distal zu der Trochanter/Coxa-Segmentgrenze. Von jeder Brut wurden mindestens zwei Extremitäten in Streifen geschnitten und die Ti1-Neuronen wurden mit dem lipophilen Farbstoff Di I (Molecular Probes), wie beschrieben (O'Connor et al., 1990) markiert, um die genaue Stelle der Ti1-Wachstumskegel zu bestätigen. Vor der Kultivierung wurden die Embryonen sterilisiert und präpariert (Chang et al., 1992). Die gesamte Amniom- und dorsale Membran wurde von dem Embryo entfernt, um den Zugang der Reagenzien während der Kultivierung sicherzustellen. Die Embryonen wurden zufällig in Gruppen unterteilt und in einem der oben beschriebenen Blocking-Reagenzien kultiviert. Die Kulturen wurden mit gelegentlichem Schütteln bei 30ºC für 30 Stunden inkubiert. Am Ende der Kulturperiode wurden die Embryonen fixiert und für die Analyse, wie oben in der lmmunhistochemie beschrieben, weiterverarbeitet.
  • Für jedes Kulturexperiment wurden die Einschnitte der Ti1-Bahn in jeder Extremität unabhängig durch einen zweiten Beobachter bestätigt. Es gab keine statistisch signifikante Abweichung zwischen den beiden Beobachtern. Extremitäten aus MAb kultivierten Embryonen wurden mit repräsentativen normalen Extremitäten von ohne MAb kultivierten Embryonen verglichen und wurden als anormal gewertet, wenn irgendeine wichtige Abweichung von der normalen Ti1-Bahn beobachtet wurde. Die Ti1-Bahn wurde als anormal gewertet nach einem oder mehreren der folgenden beobachteten Kennzeichen: (1) Defaszikulation über eine Mindestdistanz von annähernd 25 mm irgendwo entlang der Bahn, (2) mehrfache Axon-Verzweigungen, die sich ventral innerhalb des Trochanter erstreckten, (3) Vorhandensein von einer oder mehrerer Axon- Verzweigungen, die die Trochanter/Coxa-Grenze dorsal zu den Cx1-Zellen überquerten, dann aber ventral in die Coxa wendeten und in Kontakt mit den Cx1- Zellen kamen, (4) Anwesenheit von Axon-Verzweigungen, die die Trochanter/Coxa-Segmentgrenze überquerten, nicht ventral wendeten, aber proximal auf das ZNS zuführten und (5) Störung der sich ventral erstreckenden Axone innerhalb des Trochanters, um mit den Cx1-Zellen in Kontakt zu kommen und sich proximal zu den Cx1-Zellen umzuorientieren. Für jeden untersuchten MAb sind die Daten als Prozentangabe der beobachteten anormalen Ti1-Bahnen dargestellt.
    • Protein Affinitäts-Reinigung und Mikrosequenzierung
  • Heuschrecken-Fasciclin IV wurde durch Durchfließen eines embryonalen Heuschrecken-Rohlysats (Bastiani et al., 1987) über eine Affi-Gel 15-Säule (Bio Rad), konjugiert mit dem monoklonalen Antikörper 6F8, gereinigt. Das Protein wurde mit 50 mM DEA (pH 11,5), 0,1% Lauryldimethylaminoxid (Cal Bio Chem) und 1 mM EDTA eluiert. Das Protein wurde dann präzipitiert, denaturiert, an den Cysteinen modifiziert und entweder mit Trypsin oder Lys-C (Boehringer-Mannheim) verdaut. Einzelne Peptide wurden durch RP-HPLC aufgelöst und mikrosequenziert (Applied Biosystems 4771 Mikrosequenzer) unter Verwendung von Standardchemie.
    • PCR-Verfahren
  • DNA, die zu poly(A) + RNA von 45% bis 50% der Heuschrecken- Embryonen komplementär ist, wurde präpariert (Sambrook et al.; 1989). Eine PCR wurde durchgeführt unter Verwendung von Perkin Eimer Taq-Polymerase (Saiki et al., 1988) und teilweise degenerierter (basiert auf Heuschrecken-Codon-Bias) Oligonukleotide in beiden Orientierungen, übereinstimmend mit einem Anteil der Proteinsequenz von mehreren Fasciclin IV-Peptiden, wie durch Mikrosequenzierung bestimmt. Diese Oligonukleotide wurden so entworfen, dass nicht die gesamte vom Peptid abgeleitete DNA-Sequenz eingeschlossen war, wobei verbleibende 9- 12 Basenpaaren übrig blieben, die verwendet werden konnten, um die richtige Identität der amplifizierten Produke zu bestätigen. Alle möglichen Kombinationen dieser Sequenzen wurden ausprobiert. 40 Zyklen wurden durchgeführt, die Parameter von jedem Zyklus sind wie folgt: 96ºC für eine Minute, eine sequenziell abnehmende Annealing-Temperatur (2ºC/Zyklus, Start bei 65ºC und Ende bei 55ºC für verbleibende 35 Zyklen) für eine Minute; und bei 72ºC für eine Minute. Reaktionsprodukte wurden in die Sma-Stelle von M13 mp10 kloniert und sequenziert. Zwei Produkte, 1074 bp und 288 bp fang, enthielten 3'-DNA der Oligonukleotid-Sequenzen, die für die zusätzliche Aminosäure-Sequenz des Fasciclin IV-Peptids kodierten, von der die Oligonukleotide abgeleitet waren. Diese zwei Fragmente besitzen ein gemeinsames Ende und die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um sie zu amplifizieren, stimmten mit den Aminosäure- Sequenzen MYVQFGEE und MDEAVPAF (Fasciclin IV-Rest 29-386) und HTLMDEA und KNYVVRMDG (Fasciclin IV-Rest 376-472) überein.
    • cDNA-Isolierung und Sequenzanalyse
  • Beide PCR-Produkte wurden verwendet, um 1 · 10&sup6; Klone von einer embryonalen cDNA-Bibliothek aus Heuschrecken (Snow et al., 1988) zu screenen. 21 Klone, die an beide Fragmente hybridisierten, wurden wiedergewonnen, und ein 2600 bp-Klon wurde unter Verwendung der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode (Sanger et al., 1977) und Sequenase (US Biochemical Corp.) sequenziert. Template wurden aus M13 mp 10-Vektoren hergestellt, die Insertionen enthielten, die durch Beschallung von Plasmid-Klonen hergestellt wurden. Eine cDNA wurde an beiden Strängen komplett sequenziert unter Verwendung von Oligonukleotiden und Doppelstrang-Sequenzierung von Plasmid-DNA (Sambrook et al., 1989), um Lücken zu füllen. Zwei zusätzliche cDNAs wurden durch Doppelstrang- Sequenzierung analysiert, um die 402 bp des 3'-Endes des Transkripts zu erhalten. Alle drei cDNAs wurden verwendet, um ein Plasmid zu konstruieren, das das gesamte Transkript enthält. Die komplette Transkript-Sequenz ist 2860 bp lang mit 452 bp am 5'-Ende und 217 bp der nicht translatierten Sequenzen am 3'-Ende, die Stop-Codons in allen Leserahmen beinhalten. Die vorausgesagte Protein-Sequenz wurde unter Verwendung der FASTDB- und BLASTP-Programme (Intelligenetics) analysiert. Der Fasciclin IV-ORF enthält unzweideutig 10 der 11 Peptidsequenzen, bestimmt durch Mikrosequenzierung der Fasciclin IV Trypsin- und Lys-C-Peptide.
    • Herstellung von polyklonalen Antikörpern aus bakteriellen Fusionsproteinen
  • Bakterielle trpE-Fusionsproteine wurden konstruiert unter Verwendung von pATH-(Koerner et al., 1991) Vektoren, von drei Restriktionsfragmenten, die für extrazelluläre Sequenzen kodieren, und von einem Fragment (770 bp HindIII/EcoR1, das Aminosäuren 476-730 einschließt), das sowohl für extrazelluläre als auch für intrazelluläre Sequenzen (bezeichnet als #98-3) kodiert. Fusionsproteine wurden durch Herstellung eines Extrakts aus gereinigten Einschlusskörpern (Spindler et al., 1984) isoliert, und Ratten wurden mit ~70 mg an Protein, das in einem RIBI-Adjuvans (Immunochem Research) emulgiert wurde, immunisiert. Die Ratten wurden in zweiwöchigen Intervallen injiziert und Serum wurde 7 Tage nach jeder Injektion gesammelt. Seren wurden histologisch an Heuschrecken-Embryonen bei 45% der Entwicklung untersucht. Das Konstrukt #98-3 zeigte eine starke Antwort und zeigte ein Färbungsmuster, das mit dem von MAb 6F8 identisch ist. Zwei der extrazellulären Konstrukte reagierten schwach, aber zeigten auch das Fasciclin IV-Färbungsmuster. Alle Präimmunseren scheiterten darin, Heuschrecken-Embryonen zu färben.
    • S2-Zelltransfektionen, Aggregations-Assays und Western-Analysen
  • Ein Restriktion-Fragment, das die Fasciclin IV-cDNA in voller Länge enthält, wurde in pRmHa-3 (Bunch et al., 1988) kloniert und in Drosophila S2-Zellen (Schneider, 1972) mit dem Plasmid pPC4 (Jokerst et al., 1989), das a- Amanitinresistenz verleiht, cotransformiert. S2-Zellen wurden unter Verwendung des Lipofectin-Reagenz und des empfohlenen Protokolls (BRL) mit kleinen Modifikationen transformiert. Alle anderen S2-Zell-Manipulationen sind im Wesentlichen wie beschrieben (Snow et al., 1989), einschließlich der Adhäsions- Assays. Fasciclin IV-Expression in transformierten Zelllinien wurde für Adhäsions- Assays und Histologie durch Zugabe von CuSO&sub4; bis 0,7 mM und Inkubation für mindestens 48 Stunden induziert. Northern-Analyse bestätigte die Transkription von Fasciclin IV und eine Oberflächenassoziierte Färbung der S2-Zellen mit polyklonalem Serum #98-3 wies stark darauf hin, dass Fasciclin IV an die Zelloberfläche transportiert wird. Die Präparation von Membranen von S2-Zellen und von Heuschrecken-Embryonen, PAGE und Western Blotting wurden wie vorhergehend beschrieben durchgeführt (Elkins et al., 1990b), mit der Ausnahme, dass das Signal unter Verwendung des "Enhanced Chemiluminescence Immunodetektion System Kit" (Amersham) detektiert wurde. Menge an Protein pro Bahn, die für jede Probe geladen wurde: Fasciclin IV-Protein, ~5 ng; S2- Zellmembranen, 40 mg; Heuschrecken-Membranen 80 mg. Die Mengen an geladenen Proteinen wurden durch Ponceau S-Färbung des Blots vor der Inkubation mit dem Antikörper überprüft.
    • Literaturangaben, die in Beispiel I zitiert sind
  • Altschul et al. (1990) I. Mol. Biol. 215: 403-410; Bastiani et al. (1992) Dev. Biol., in press.; Bastiani et al. (1986) J. Neurosci. 6: 3518-3531; Bastiani et al. (1986) I. Neurosci. 6: 3542-3551; Bastiani et al. (1987) Cell 48: 745-755; Bastiani et al. (1984) J. Neurosci. 4: 2311-2328; Bentley and Caudy (1983) Nature 304: 62-65; Bentley et al. (1979) J. Embryol. Ftp. Morph. 54: 47-74; Bentley and O'Connor (1992); Letourneau et al. (New York: Raven Press, Ltd.), pp. 265-282; Bunch et al. (1988) Nucleic Acids Bes. 16: 1043-1061; Chang et al. (1992) Development 114: 507-519; Caudy and Bentley (1987) Dev. Biol. 119: 454-465; Chou and Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245; Elkins et al. (1990a) Cell 60: 565-575; Flkins (1990b) J. Cell Biol. 110: 1825-1832; Goodman et al. (1981) J. Neurosci. 1: 94-102; Grenningloh et al. (1990) Symp. Quant. Biol. 55: 327-340; Grenningloh et al. (1991) Cell 67: 45-57; Harrelson and Goodman (1988) Science 242: 700-708; Jacobs and Goodman (1989) J. Neurosci. 7: 2402-2411; Jay and Keshishian (1990) Nature 348: 548-551; Jokerst et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 266-275; Koerner et ab (1991) Methods Enzymol. 194: 477490; Landmesser et ab (1988) Dev. Biol. 130: 645-670; Lefcort and Bentley (1987) Dev. Biol. 119: 466-480; Lefcort and Bentley (1989) J. Cell. Biol. 108: 1737-1749; O'Connor et al. (1990) J. Neurosci. 10: 3935-3946; Patel et al. (1989) Cell 58: 955-968; Patel et al. (1987) Cell 48: 975- 988; Raper et al. (1984) J. Neurosci. 4: 2329-2345; Sailci et al. (1988) Science 239: 487-494; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory); Sanger et al. (1977) Proc. Nazi. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467; Schneider (1972) J. Embryol. Ftp. Morphol. 27: 353-365; Snow et al. (1989) Cell 59: 313-323; Snow et al. (1988) Proc. NaH. Acad. Sci. USA 85: 5291-5295; Spindler et al. (1984) J. Virol. 49: 132-141; Wang and Denburg (1992) Neuron. 8: 701-714; Wang et al. (1992) J. Cell Biol. 118: 163-176; and Zinn et al. (1988) Cell 53: 577-587.
    • Genbank Zugangsnummer:
  • Die Zugangsnummer für die Sequenz, über die in dieser Veröffentlichung berichtet wird, ist L00709.
    • II. Isolierung und Charakterisierung von Tribolium- (SEQ ID NO 63 und 64) und Drosophila- (SEQ ID NO 59 und 60) Semaphorin I, Drosophila-Semaphorin II (SEQ ID NO 61 und 62) humanes Semaphorin III (SEQ ID NO 53 und 54 und Vaccinia Virus-Semaphorin IV (SEQ ID NO 55 und 56) (nicht Teil der Erfindung) und Variola major- (Pocken) Virus-Semaphorin IV (SEQ ID NO 65 und 66) (nicht Teil der Erfindung)
  • Wir verwendeten unsere G-Semaphorin I-cDNA in standardisierten Screening-Verfahren unter geringer Strenge (sowohl bei cDNA als auch bei genomischen Bibliotheken) in einem Versuch, um ein potentielles Semaphorin I- Homologes von Drosophila zu isolieren. Wir waren mit diesen Screenings erfolglos. Da die Sequenz neu war und keine Ähnlichkeit mit etwas anderem in der Datenbank teilte, versuchten wir dann, zu sehen, ob wir ein Semaphorin I- Homologes in anderen, näher verwandten Insekten identifizieren konnten. Wenn möglich, würden wir dann diese Sequenzen vergleichen, um die am meisten konservierte Regionen zu finden um dann Proben (z. B. Oligonukleotidprimer für die PCR) zu verwenden, die auf diese konservierten Regionen basieren, um ein Drosophila-Homologes zu finden.
  • Wir verwendeten in dem Verfahren G-Semaphorin I-cDNA in Screenings mit geringer Strenge, um Semaphorin I-cDNAs aus Bibliotheken zu klonieren, hergestellt aus embryonaler RNA der Heuschrecke Locusta migratoria und von einer embryonalen cDNA-Bibliothek von der Grille Acheta domestica. Wir verwendeten PCR, um genomische Fragmente von genomischer DNA des Käfers Tribolium und der Motte Manduca zu klonieren. Wir verwendeten dann das genomische DNA-Fragment aus Tribolium, um cDNA-Klone zu isolieren und sequenzierten grundlegend die gesamten ORF der Tribolium cDNA.
  • In der Zwischenzeit verwendeten wir die partiellen Tribolium- und Manduca-Sequenzen in Kombination mit der gesamten Heuschrecken-Sequenz, um konservierte Regionen zu identifizieren, die uns erlaubten, Primer für eine PCR zu entwerfen in einem Versuch, ein Drosophila-Semaphorin I-Homologes zu klonieren. Mehrere Primer-Paare erzeugten verschiedene Banden, die subkloniert und sequenziert wurden und mehrere von den Banden ergaben partielle Sequenzen des Drosophila-Semaphorin-Homologs. Eine der Banden ergab eine partielle Sequenz eines klar verschiedenen, mehr abweichenden Gens, das wir als D-Semaphorin II bezeichneten.
  • Basierend auf der Sequenz der PCR-Produkte wussten wir, dass wir zwei verschiedene Drosophilagene identifiziert hatten, wovon eines das Semaphorin 1- Homologe zu sein schien und das andere ein zweites verwandtes Gen. Die gesamte ORF-Sequenz des D-Semaphorin I-Homologen enthüllte eine Gesamtstruktur, die identisch mit G-Semaphorin I war: eine Signalsequenz, eine extrazellulläre Domäne von etwa 550 Aminosäuren, die 16 Cysteine enthält, eine transmembrane Domäne aus 25 Aminosäuren und eine zytoplasmatische Domäne aus 117 Aminosäuren. Als wir die Sequenz für D-Semaphorin II beendet hatten, waren wir in der Lage, das Durchführen von Homologierecherchen in der Datenbank zu beginnen, was einige ihrer strukturellen Merkmale, die weiter hierin geschrieben sind, enthüllte. Die Semaphorin II-Sequenz enthüllte eine unterschiedliche Struktur: eine Signalsequenz aus 16 Aminosäuren, eine Domäne aus ~525 Aminosäuren, die 16 Cysteine enthält, mit einer einzelnen Immunglobulin (Ig)-Domäne aus 66 Aminosäuren, gefolgt von einer kurzen eindeutigen Region aus 73 Aminosäuren. Es gibt keine Anzeichen für entweder eine transmembrane Domäne oder eine potentielle Phospholipid-Bindung im C- Terminus dieses Proteins. Somit scheint es, dass das D-Semaphorin II-Protein von den Zellen, die es produzieren, sekretiert wird. Die Heuschrecken-, Tribolium- und Drosophila-Semaphorin I-cDNA-Sequenzen genauso wie die Sequenz der D- Semaphorin II-cDNA werden hierin gezeigt. Zusätzlich verwendeten wir dasselbe Verfahren, um Semaphorin I-Gene in einer Motte, Manduca sexta, einer Heuschrecke, Locusta migratoria, und einer Grille, Acheta domestica, zu identifizieren.
  • Mit dieser großen Familie von Insekten-Semaphoringenen identifizierten wir eine Anzahl von guten Ausdehnungen der richtigen Aminosäuren (mit der geringsten Degeneration basierend auf deren Codons) mit starker Homolgie, um Primer für eine PCR zu entwerfen, um nach humanen Genen zu schauen. Wir entwarfen einen Satz von Oligonukleotidprimern und plattierten mehrere humane cDNA-Bibliotheken aus: eine fötale Gehirn-Bibliothek (Stratagene) und eine adulte Hippocampus-Bibliothek. Wir erhielten schließlich humane cDNA-Banden der richtigen Größe, die nicht selbst starteten und somit gute Kandidaten dafür waren, echte semaphorinähnliche cDNAs von Menschen zu sein. Diese Banden wurden gereinigt, subkloniert und sequenziert. Ganz zusammengesetzte in situ- Hybridisierungsexperimente zeigten, dass D-Semaphorin I und II durch verschiedene Untergruppen von Neuronen im embronalen ZNS exprimiert werden. D-Semaphorin I wird von bestimmten Zellen entlang der Mittellinie genauso wie von anderen Neuronen exprimiert, wohingegen D-Semaphorin II nicht an der Mittellinie exprimiert wird, aber von einer unterschiedlichen Untergruppe von Neuronen exprimiert wird. Zusätzlich wird D-Semaphorin II von einer Untergruppe von Muskeln vor und während des Zeitraums der Innervation durch spezifische Motoneuronen exprimiert. Auf den Riesenchromosomen sind die D-Semaphorin I- Gene auf (Gen-Band-Chromosom) 29E1-33L lokalisiert und die von D-Semaphorin II auf 53C9-102R. Wir haben Mutationen mit einem Funktionsverlust im D- Semaphorin II-Gen lokalisiert und ein Paar von P-Element-Transposon-Insertionen im D-Semaphorin II-Gen, die schwere Phänotypen zu verursachen scheinen.
  • Als wir die Sequenzen von G-Semaphorin I, T-Semaphorin I, D-Semaphorin I und D-Semaphorin II in eine Reihe stellten und die Sequenzen auf der Suche nach anderen Sequenzen mit signifikanten Ähnlichkeiten durch die Sequenzdatenbank laufen ließen, machten wir eine merkwürdige Entdeckung: diese Semaphorine teilten eine Sequenzähnlichkeit mit dem offenen Leserahmen (ORF) A39R von Vaccinia Virus und dem A43R ORF von Variola major- (Pocken) Virus und wir entdeckten, dass die Aminosäuren, die mit dem Virus-ORF geteilt wurden, in denselben Regionen lagen, in denen die Insektenproteine deren größte Ähnlichkeit teilten. Der virale ORF begann mit einer vermeintlichen Signalsequenz, fortgesetzt mit mehreren hundert Aminosäuren mit Sequenzähnlichkeit zu den Semaphorin- Genen und endete dann ohne jegliches Membranbindungs-Signal (was darauf hindeutet, dass das Protein, wie durch die infizierte Zelle gebildet, wahrscheinlich sekretiert wird).
  • Wir folgerten, dass die Virus-Semaphorine angeeignete Wirtsproteine sind, die zum Vorteil von den Viren ausgenutzt werden, die Gegenspieler im Wirt besitzen, die sehr wahrscheinlich im Immunsystem wirken, um eine Immunantwort zu hemmen oder zu vermindern, so wie sie im Nervensystem zu wirken scheinen durch das Hemmen der Wachstumskegelverlängerung. Analog zu Situationen, in denen Viren zugedacht wird, dass sie für eine sekretierte Form eines zellulären Rezeptors codieren, kann das Virus hier verursachen, dass die infizierte Zelle eine Menge des sekretierten Liganden herstellt, um ein inhibitorisches Signal nachzuahmen und somit zu helfen, die Immunantwort zu verringern.
    • III. Isolierung und Charakterisierung des murinen ZNS-Semaphorin III- Rezeptors unter Verwendung von Epitop-markiertem humanem Semaphorin III (hSIII)
  • mRNA von murinem fötalem Gehirngewebe wurde isoliert und verwendet, um eine cDNA-Bibliothek in einem Säugetier-Expressionsvektor, pCMX, herzustellen, im Wesentlichen wie in Davis et al. (1991) Science 253, 59.
  • Die Transfektion und das Screening-Verfahren ist von Lin et al (1992) Cell 68, 775 modifiziert. COS-Zellen, die auf Glasobjektträger-Fläschchen wuchsen, wurden mit Pools von cDNA-Klonen transfiziert, ihnen wurde ermöglicht, an radioiodinisiertes hSIII zu binden, das am C-Ende der Semaphorindomäne trunkiert war. Parallel wurde gleich behandelten COS-Zellen ermöglicht, an ein nicht markiertes humanes Semaphorin III zu binden, das am C-Terminus der Semaphorindomäne trunkiert war und dort mit einer Verlängerung von 10 Aminosäuren von dem humanen c-myc Protoonkogen-Produkt verknüpft war. Dieses modifizierte hSIII erlaubt die Identifizierung von hSIII-Rezeptoren durch die Verwendung des markierten Liganden als einer Brücke zwischen dem Rezeptor und einem murinen monoklonalen Antikörper, der für ein Epitop in der c-myc- Markierung spezifisch ist. Entsprechend werden die Zellen nach dem Binden des nicht markierten hSIII dem Monoklonalen ausgesetzt, der direkt markiert sein kann oder nachfolgend mit einem sekundären anti-Maus markierten Antikörper für eine gesteigerte Signalamplifikation dekoriert werden kann.
  • Die Zellen werden dann fixiert und unter Verwendung von Dunkelfeld- Mikroskopie gescreent, im Wesentlichen wie in Lin et al. (oben). Positive Klone werden identifiziert und Sequenzanalyse der murinen ZNS-Semaphorin III-Rezeptor- cDNA-Klone durch die Didesoxy-Kettenabbruch-Methode wird verwendet, um rezeptorcodierende Sequenzen mit voller Länge zu konstruieren.
    • IV. Protokoll für Protein-Protein H-Sema III - H-Sema III-Rezeptor Arzneimittel- Screening-Assay. A. Reagenzien
  • - Neutralit Avidin: 20 ug/ml in PBS.
  • - Blockpuffer: 5% BSA, 0,5% Tween20 in PBS; 1 h, RT.
  • - Assay-Puffer: 100 mM KCL, 20 mM HEPES pH 7,6, 0,25 mM EDTA, 1% Gylcerol, 0,5% NP-40, 50 mM BME, 1 mg/ml BSA, Proteaseinhibitor-Cocktail.
  • - ³³P H-Sema III 10x Stammlösung: 10&supmin;&sup8;-10&supmin;&sup6; M "kaltes" trunkiertes (Semaphorindomäne) H-Sema III ergänzt mit 50000-500000 cpm von markiertem und trunkiertem H-Sema III (Beckman Counter). Aufbewahrung bei 4ºC während des Screenings.
  • - Proteaseinhibitor-Cocktail (100X): 1 mg Trypsininhibitor (BMB # 109894), 1 mg Aprotinin (BMB # 236624), 2,5 mg Benzamidin (Sigma # B-6506), 2,5 mg Leupeptin (BMB # 1017128), 1 mg APMSF (BMB # 917575) und 0,2 mM NaVo&sub3; (Sigma # S-6508) in 10 ml PBS.
  • - H-Sema III-Rezeptor: 10&supmin;&sup8;-10&supmin;&sup6; M biotinyliertes H-Sema III biotinylierter Rezeptor in PBS.
    • B. Herstellung von Assay-Platten:
  • Beschichten mit 120 ul Stammlösung N-Avidin pro Well mindestens 1 h bei 25ºC oder über Nacht bei 4ºC.
  • 2X Waschen mit 200 ul PBS.
  • Blocken mit 150 ul Blockpuffer.
  • 2X Waschen mit 200 ul PBS.
    • C. Assay:
  • Zugeben von 40 ul Assay-Puffer/Well
  • Zugeben von 10 ul Test-Agens
  • Zugeben von 10 ul ³³P-H-Sema III (5000-50000 cpm/0,1-10 pmoles/Well = 10&supmin;&sup9;-10&supmin;&sup7; M Endkonzentration).
  • Mischen
  • Inkubation 1 h bei 25ºC.
  • Zugeben von 40 ul H-Sema III-Rezeptor (0,1-10 pmoles/40 ul (?) in Assay- Puffer)
  • Inkubation 1 h bei 25ºC.
  • Abstoppen der Reaktion durch 4X Waschen mit 200 ul PBS. Zugeben von 150 ul Szintillations-Cocktail.
  • Zählen im Topcount.
    • D. Assay-Kontrollen (auf jeder Platte lokalisiert)
  • a. nicht spezifische Bindung (keine Zugabe von Rezeptor)
  • b. löslich (nicht biotinylierter Rezeptor) bei 80% Inhibition.
  • Es ist aus den obigen Ergebnissen offensichtlich, dass man die hierin offenbarten Verfahren und Verbindungen verwenden kann, um diagnostische Proben und therapeutische Arzneimittel herzustellen und zu identifizieren. Es wird dem Fachmann durch das Lesen dieser Offenbarung auch klar sein, dass es ausgenutzt werden kann, um Veränderungen der Semaphorin-Ansprech- Empfindlichkeit in einem Wirt zu bewirken.
  • Obwohl die vorhergehende Erfindung ausführlich via Abbildung und Beispiel beschrieben wurde, wird es zum Zweck der Klarheit und Verständlichkeit für Fachleute im Licht der Lehren dieser Erfindung ohne weiteres offensichtlich sein, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen daran durchgeführt werden können, ohne vom Geist oder Umfang der angefügten Ansprüche abzuweichen.
    • SEQUENZPROTOKOLLE
  • Die Sequenzen 53-66 zeigen die Nukleotide und abgeleiteten Aminosäure- Sequenzen von humanem Semaphorin III, Vaccinia Virus-Semaphorin IV, Heuschrecken-Semaphorin I, Drosophila-Semaphorin I, Drosophila-Semaphorin II, Tribolium-Semaphorin I und Variola major-Virus Semaphorin IV.
    • SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
  • (i) ANMELDER: Goodman, Corey S.
  • Kolodkin, Alex L.
  • Matthes, David
  • Bentley, David R.
  • O'Connor, Thimothy
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Die Semaphorin-Genfamilie
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 100
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
  • (A) ADRESSAT: SCIENCE & TECHNOLOGY LAW GROUP
  • (B) STRASSE: 268 Bush Street, Suite 3200
  • (C) ORT: San Francisco
  • (D) STAAT: CA
  • (E) LAND: USA
  • (F) POSTLEITZAHL: 94104
  • (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC compatible
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
  • (v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER:
  • (B) ANMELDETAG: 13. September 1994
  • (C) KLASSIFIZIERUNG:
  • (viii) ANWALT/AGENT-INFORMATION:
  • (A) NAME: Osman, Richard A.
  • (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 36627
  • (C) REFERENZ/LISTENNUMMER: B94-002-PCT
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
  • (A) TELEFON: (415) 343-4341
  • (B) TELEFAX: (415) 343-4342
  • (C) TELEX:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ01
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet D oder E an Rest #1; Q, K, R, A oder N an Rest #3; und Y, F oder V an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ02
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet Q, K, R, A oder N an Rest #2; und Y, F oder V an Rest #4; und R, K, Q oder T an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ03
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder G an Rest #4; A, S oder N an Rest #5; Y, F, H oder G an Rest #6 und K, R, H, N oder Q an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ04
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder G an Rest #4 und A, S oder N an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..10
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ05
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder G an Rest #4 und C oder D an Rest #10" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1.13
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ06
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet C oder D an Rest #10 und Y oder I an Rest #13" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ07
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet R, I, Q oder V an Rest #1; G oder A an Rest #2, L, V oder K an Rest #3; C oder S an Rest #4; F oder Y an Rest #6 und D oder N an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ08
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet C oder S an Rest #1; F oder Y an Rest #3; D oder N an Rest #4; D, E, R oder K an Rest #6 und H, L oder D an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ09
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet G oder A an Rest #3; C oder S an Rest #5 und D oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ10
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2; G oder A an Rest #4 und V, N oder A an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ11
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2; D oder E an Rest #8 und F oder Y an Rest #9" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ12
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #1; G oder A an Rest #3; V, N oder A an Rest #5; D oder E an Rest #7 und F oder Y an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ13
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder D an Rest #2 und A oder K an Rest #3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ15
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #3 und T oder N an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ16
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T oder N an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ17
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2 und T oder N an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ18
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #4" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ19
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #1 und F oder Y an Rest #4" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ20
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F oder Y an Rest #3 und T oder N an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ21
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet I oder V an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F oder Y an Rest #4 und F oder Y an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ22
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet K, F oder Y an Rest #2; F oder Y an Rest #4; F, Y, I oder L an Rest #5; F, Y, I oder L an Rest #6 und F oder Y an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ23
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F, Y, I oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4; R oder T an Rest #6 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23;
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ24
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F, Y, I oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4; F oder Y an Rest #5; R oder T an Rest #6; E, D oder V an Rest #7 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ25
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2 und C oder S an Rest # 5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ26
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #1 und A, V oder I an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ27
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #2; A oder G an Rest #3; R oder Q an Rest #4 und V oder I an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ28
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #2; R oder Q an Rest #4 und V oder I an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..13
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ29
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V, A oder I an Rest #3; und V, A oder I an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ30
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet R, K oder N an Rest #1; T, A oder S an Rest #3; T, A oder S an Rest #4; F, Y oder L an Rest #5 und K oder R an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ31
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #1; K oder R an Rest #3; A oder S an Rest #4 und N oder I an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEO ID NO: 31:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ32
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder I an Rest #1, 1 oder V an Rest #4 und P oder S an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ33
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T, A oder S an Rest #2; T, A oder S an Rest #3; F, Y oder L an Rest #4 und A, S, V, I oder L an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
  • (i) SEQUENZKENNZEiCHEN:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..11
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ34
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T, A oder S an Rest #2 und T, A oder S an Rest #3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..11
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ35
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T oder S an Rest #3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ36
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #1; F oder Y an Rest #2 und N oder D an Rest #3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ37
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #1; F oder Y an Rest #3; F oder Y an Rest #4; F oder Y an Rest #5 und N oder D an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ38
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V, I oder L an Rest #4 und F oder Y an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ39
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V, I oder L an Rest #3 und F oder Y an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ40
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder A an Rest #3 und P oder A an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ41
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V, L oder I an Rest #1 und E, D, Y, S oder F an Rest #3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ42
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V, L oder I an Rest #1 und R oder A an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ43
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet E, D, Y, S oder F an Rest #2 und T, Q oder S an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ44
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet H, F oder Y an Rest #3 und A oder G an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..6
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ45
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet H, F oder Y an Rest #2 und A oder G an Rest #4" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ46
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet A oder G an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 2601 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 16..2331 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 771 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 1332 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 7..1329 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 441 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 2854 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 451..2640 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 730 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 3560 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANG FORM: Doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 1..1953 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 650 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 60:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 2670 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 268..2439 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 724 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 63:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 2504 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 355..2493 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 63:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 64:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 712 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 64:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 65:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 369 Basenpaare
  • (B) ART: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelt
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
  • (B) LAGE: 1..369 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 65:
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 66:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 122 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 66:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 67:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 67:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 68:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ68
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder G an Rest #4 und A oder S an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 68:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 69:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ69
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet S oder C an Rest #3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 69:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 70:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ70
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V, N oder A" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 70:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 71:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 71:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 72:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ72
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 72:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 73:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ73
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T oder A an Rest #2; T oder S an Rest #3; F oder Y an Rest #4 und A oder S an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 73:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 74:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ74
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder D" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 74:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 75:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ75
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 75:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 76:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ76
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet P oder A an Rest #6" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 76:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 77:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ77
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet E oder D an Rest #2; T, Q oder S an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 77:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 78:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SE078
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet A oder G" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 78:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 79:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ79
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder C an Rest #4; A oder S an Rest #5; Y, F, H oder G an Rest #6 und K, R, H, N oder Q an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 79:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 80:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ80
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder G an Rest #4; A, S oder N an Rest #5; Y, F oder H an Rest #6 und K, R, H, N oder Q an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 80:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 81:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ81
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet N oder G an Rest #4 und A oder S an Rest #5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 81:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 82:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ82
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet K, F oder Y an Rest #2; F oder Y an Rest #4; F, Y, I oder L an Rest #5; F, Y oder I an Rest #6 und F oder Y an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 82:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 83:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ83
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F, Y oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4; R oder T an Rest #6 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 83:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 84:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ84
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F, Y, I oder L an Rest #3; F, Y oder I an Rest #4; R oder T an Rest #6 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 84:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 85:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANG FORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ85
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F, Y, I oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 85:
  • 2) ANGABEN ZU SEO ID NO: 86:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ86
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F oder Y an Rest #2; F, Y oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4; F oder Y an Rest #5; R oder T an Rest #6; E, D oder V an Rest #7 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEO ID NO: 86:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 87:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SE087
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet R, K oder N an Rest #1; T oder A an Rest #3; T, A oder S an Rest #4; F, Y oder L an Rest #5 und K oder R an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 87:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 88:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ88
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T oder A an Rest #2; T, A oder S an Rest #3; F, Y oder L an Rest #4; A, S. V, I oder L an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 88:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 89:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ89
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T, A oder S an Rest #2, T, A oder S an Rest #3; F, Y oder L an Rest #4; A, S. I oder L an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 89:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 90:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..11
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ90
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet T oder A an Rest #2 und T, A oder S an Rest #3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 90:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 91:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..9
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ91
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V, L oder I an Rest #1" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 91:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 92:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ92
  • Anmerkung = "Xaa bezeichnet K oder Y an Rest #2; F oder Y an Rest #4; F, Y oder L an Rest #5; F, Y, I oder L an Rest #6 und F oder Y an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 92:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 93:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..7
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ93
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet K oder Y an Rest #2; F oder Y an Rest #4; F, Y, I oder L an Rest #5; F, Y oder I an Rest #6 und F oder Y an Rest #7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 93:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 94:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ94
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F, Y oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an rest #4; R oder T an Rest #6 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 94:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 95:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ95
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F, Y, 1 oder L an Rest #3; F, Y oder I an Rest #4; R oder T an Rest #6 und T oder N a i Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 95:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 96:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ96
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet V oder I an Rest #1; F, ', I oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 96:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 97:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ97
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2; F Y oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4; F oder Y an Rest #5; R oder T an Rest #6; E, D oder V an Rest #7 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 97:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 98:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ98
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2, F, Y, I oder Lan Rest #3; F, Y oder I an Rest #4; F oder Y an Rest #5; R oder T an Rest #6; E, D oder V an Rest #7 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 98:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 99:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ99
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2; F, Y, I oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4; F oder Y an Rest #5; E, D oder V an Rest #7 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 99:
  • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 100:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANG FORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: Linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
  • (B) LAGE: 1..8
  • (D): ANDERE INFORMATIONEN: /Bezeichnung = SEQ100
  • /Anmerkung = "Xaa bezeichnet F oder Y an Rest #2, F, Y, I oder L an Rest #3; F, Y, I oder L an Rest #4; F oder Y an Rest #5; R oder T an Rest #6; E, D oder V an Rest #7 und T oder N an Rest #8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 100:

Claims (11)

1. Isoliertes Semaphorin-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 54, 60, 62 und 64; oder einen Anteil davon umfasst, wobei der Anteil ausreichend ist, um eine für Semaphorin spezifische Bindung bereitzustellen, und das eine Peptidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOS: 1-52 und 67-100 umfasst, mit der Maßgabe, daß die Peptidsequenz weder in SEQ ID NO: 56, 58 noch in SEQ ID NO: 66 beinhaltet ist.
2. Isoliertes Semaphorin-Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus SEQ ID NO: 54, 60, 62 und 64 umfasst.
3. Isolierter Antikörper, der einen Semaphorin-Polypeptidanteil nach Anspruch 1 oder 2 spezifisch bindet.
4. Isolierte Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert, wobei die Sequenz mit einem Nukleotid verbunden ist, das nicht von Natur aus mit der Sequenz verbunden ist.
5. Zelle umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 4.
6. Transgenes Nagetier umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nukleinsäure für das Nagetier xenogen ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Semaphorin-Polypeptids, umfassend die Kultivierung der Zelle nach Anspruch 5 unter Bedingungen, die für die Expression des Polypeptids geeignet sind, und die Gewinnung des Polypeptids.
8. Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, das ein Semaphorin-Polypeptid spezifisch bindet, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
In Kontakt bringen eines Panels möglicher Mittel mit einem Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2;
Messen der Bindung einer Vielzahl der möglichen Mittel an das Polypeptid;
Identifizierung eines Mittels aus der Vielzahl, das das Polypeptid spezifisch bindet; wobei das Mittel ein Semaphorin-Polypeptid spezifisch bindet.
9. Verfahren zur Diagnose von Patienten hinsichtlich einer Prädisposition für neurologische Erkrankungen, die mit einem Genlokus assoziiert sind, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
Isolierung der genomischen DNA aus isolierten somatischen Zellen;
In Kontakt bringen der genomischen DNA mit einer Probe, welche eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 kodiert unter Bedinungen, bei welchen die Probe mit der homologen DNA hybridisiert;
Identifizierung einer Region der genomischen DNA, die mit der Probe hybridisiert;
wobei die Anwesenheit, Abwesenheit oder Sequenz der Region mit einer Prädisposition für eine neurologische Erkrankung korreliert.
10. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von neurologischen Verletzungen oder Erkrankungen oder für die Behandlung viraler Infektionen.
11. In vitro-Verfahren zur Modulation einer Zellfunktion, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
In Kontakt bringen einer Zelle mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein isoliertes Semaphorin-Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst, wobei das Polypeptid eine Funktion der Zelle moduliert.
DE69430130T 1993-09-13 1994-09-13 Polypeptide von der semaphorin-genfamilie Expired - Lifetime DE69430130T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/121,713 US5639856A (en) 1993-09-13 1993-09-13 Semaphorin gene family
PCT/US1994/010151 WO1995007706A1 (en) 1993-09-13 1994-09-13 The semaphorin gene family

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69430130D1 DE69430130D1 (de) 2002-04-18
DE69430130T2 true DE69430130T2 (de) 2002-08-22

Family

ID=22398364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69430130T Expired - Lifetime DE69430130T2 (de) 1993-09-13 1994-09-13 Polypeptide von der semaphorin-genfamilie

Country Status (11)

Country Link
US (8) US5639856A (de)
EP (1) EP0721342B1 (de)
JP (1) JP3544378B2 (de)
AT (1) ATE214286T1 (de)
AU (1) AU683494B2 (de)
CA (1) CA2171638C (de)
DE (1) DE69430130T2 (de)
DK (1) DK0721342T3 (de)
ES (1) ES2173922T3 (de)
PT (1) PT721342E (de)
WO (1) WO1995007706A1 (de)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5639856A (en) * 1993-09-13 1997-06-17 The Regents Of The University Of California Semaphorin gene family
US5654173A (en) * 1996-08-23 1997-08-05 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
DE69637846D1 (de) 1995-12-06 2009-04-09 Dainippon Sumitomo Pharma Co Neues semaphorin z und dafür kodierendes gen
DE69738302T2 (de) * 1996-09-11 2008-09-04 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Neues semaphorin-gen: semaphorin y
WO1998013493A2 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Lxr Biotechnology, Inc. A family of genes encoding apoptosis-related peptides, peptides encoded thereby and methods of use thereof
US20070299005A1 (en) * 1996-09-24 2007-12-27 Tanox, Inc. Family of genes encoding apoptosis-related peptides, peptides encoded thereby and methods of use thereof
US6902730B1 (en) 1996-10-09 2005-06-07 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Semaphorin gene: Semaphorin W
WO1998022504A1 (fr) * 1996-11-15 1998-05-28 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Nouveaux genes de semaphorine (i)
EP0892047A3 (de) * 1997-07-09 2000-03-08 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Humanes und murines Semaphorin L
US6428965B1 (en) 1997-07-17 2002-08-06 The Johns Hopkins University Screening assays for the interaction of semaphorins and neuropilins
US20030027262A1 (en) * 1997-09-18 2003-02-06 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7214497B2 (en) 1997-10-28 2007-05-08 Immunex Corporation Viral encoded semaphorin protein receptor DNA and polypeptides
US6130068A (en) * 1998-10-26 2000-10-10 Immunex Corporation Viral encoded semaphorin protein receptor DNA and polypeptides
US6562949B1 (en) 1997-10-28 2003-05-13 Immunex Corporation Antibodies to viral encoded semaphorin protein receptor polypeptides
EP1027436A1 (de) * 1997-10-28 2000-08-16 Immunex Corporation Rezeptor für viral kodiertes semaphorin protein; polypeptide und dna dafür kodierend
US6635421B1 (en) * 1997-12-09 2003-10-21 Children's Medical Center Corporation Neuropilins and use thereof in methods for diagnosis and prognosis of cancer
WO1999032511A1 (fr) 1997-12-22 1999-07-01 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides, procede de dosage du pepsinogene ii humain ou de la pepsine ii humaine et necessaire de dosage
JPH11187882A (ja) * 1997-12-26 1999-07-13 Ono Pharmaceut Co Ltd 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物
WO1999038885A2 (en) * 1998-01-30 1999-08-05 Smithkline Beecham Plc Sbsemvl polypeptides, being members of the semaphorin protein family, and polynucleotides encoding the same
EP0933425A1 (de) * 1998-01-30 1999-08-04 Smithkline Beecham Plc Der Semaphorinfamilie zugehörige Polypeptide und Polynukleotide
US20030166132A1 (en) * 1998-08-26 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
EP1135488A1 (de) * 1998-11-26 2001-09-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Menschliches semaphorin 6a-1 (sema6a-1), ein gen das beteiligt ist an die neuronal-entwicklung und regenerationsmechanismen während apoptosis, und dessen anwendung als potentielles arzneimittel-ziel
US20020049312A1 (en) * 2000-05-23 2002-04-25 Turner C. Alexander Noel human thrombospondin-like proteins and polynucleotides encoding the same
EP1210368A2 (de) * 1999-09-08 2002-06-05 Immunex Corporation Verwendung von semaphorin zur modulierung des zellausflusses
US20080213878A1 (en) * 1999-10-19 2008-09-04 Gregory Donoho Novel human membrane proteins and polynucleotides encoding the same
WO2001032707A1 (en) * 1999-11-02 2001-05-10 Zymogenetics, Inc. Human semaphorin
AU4303101A (en) * 1999-11-08 2001-06-04 General Hospital Corporation, The Novel semaphorin domains
EP1268538A2 (de) * 2000-03-20 2003-01-02 Lexicon Genetics Incorporated Menschliche sekretierte proteine und deren kodierende poloynukleinsäuren
WO2001088133A2 (en) * 2000-05-18 2001-11-22 Lexicon Genetics Incorporated Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same
WO2002009756A1 (fr) * 2000-07-28 2002-02-07 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Promoteurs de la regeneration des nerfs contenant un inhibiteur de semaphorine en tant qu'ingredient actif
CA2493718A1 (en) * 2001-07-20 2003-01-30 Paul F. Good Methods for diagnosing and treating alzheimer's disease and parkinson's disease
WO2003035100A1 (en) * 2001-09-26 2003-05-01 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Neuropilin as a novel therapeutic target for modulation of immune reponses
US7781413B2 (en) * 2001-10-31 2010-08-24 Board Of Regents, The University Of Texas System SEMA3B inhibits tumor growth and induces apoptosis in cancer cells
EP1572907A2 (de) * 2002-02-04 2005-09-14 The Johns Hopkins University Mit casl(mical)-polynukleotiden, -polypeptiden wechselwirkende moleküle sowie verfahren zu deren verwendung
EP1442749A1 (de) 2003-01-31 2004-08-04 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Verwendung von einem Antikörper gegen CD100 für die Diagnose und die Behandlung von einer entzündlichen Krankheit des Zentralnervensystems
FR2876913A1 (fr) * 2004-10-22 2006-04-28 Centre Nat Rech Scient Modulation de la transmission synaptique par les semaphorines et ses applications
WO2008100995A1 (en) 2007-02-14 2008-08-21 Vaccinex, Inc. Humanized anti-cd100 antibodies
US8496938B2 (en) 2009-05-08 2013-07-30 Vaccinex, Inc. Anti-CD100 neutralizing neutralizing antibodies and methods of using the same
EA029023B1 (ru) 2011-10-11 2018-01-31 Вэксинекс, Инк. Применение молекул, связывающих семафорин-4d, для модуляции проницаемости гематоэнцефалического барьера
US9090709B2 (en) 2012-03-28 2015-07-28 Vaccinex, Inc. Anti-SEMA4D antibodies and epitopes
US10494440B2 (en) 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
US9975933B2 (en) * 2013-05-23 2018-05-22 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Tumor tissue-penetrating peptide specific to neuropilin and fusion protein having same peptide fused therein
US9828435B2 (en) 2013-06-25 2017-11-28 Vaccinex, Inc. Use of antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically bind semaphorin-4D to increase tumor infiltrating leukocyte frequency
NZ630881A (en) 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
CN107810192A (zh) * 2015-02-23 2018-03-16 海鸥治疗简易股份公司 非天然的脑信号蛋白3及其医药用途

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE229543T1 (de) * 1991-06-24 2002-12-15 Chiron Corp Polypeptide des hepatitis c-virus (hiv)
US5639856A (en) * 1993-09-13 1997-06-17 The Regents Of The University Of California Semaphorin gene family
US5416197A (en) * 1993-10-15 1995-05-16 Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibodies which bind human collapsin
US5807806A (en) * 1997-06-12 1998-09-15 Nippon Soda Co., Ltd. Benzoylpyrazole derivatives having specific substituents and herbicide

Also Published As

Publication number Publication date
EP0721342A4 (de) 1998-07-29
DK0721342T3 (da) 2002-07-15
ES2173922T3 (es) 2002-11-01
EP0721342B1 (de) 2002-03-13
US20030166849A1 (en) 2003-09-04
AU7724094A (en) 1995-04-03
US5935865A (en) 1999-08-10
US6013781A (en) 2000-01-11
AU683494B2 (en) 1997-11-13
JPH09505725A (ja) 1997-06-10
US20070033669A1 (en) 2007-02-08
DE69430130D1 (de) 2002-04-18
WO1995007706A1 (en) 1995-03-23
ATE214286T1 (de) 2002-03-15
JP3544378B2 (ja) 2004-07-21
US5639856A (en) 1997-06-17
PT721342E (pt) 2002-09-30
CA2171638C (en) 2001-05-29
CA2171638A1 (en) 1995-03-23
US20080312158A1 (en) 2008-12-18
EP0721342A1 (de) 1996-07-17
US6344544B1 (en) 2002-02-05
US5807826A (en) 1998-09-15
US7153936B2 (en) 2006-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69430130T2 (de) Polypeptide von der semaphorin-genfamilie
DE60027135T2 (de) Inhibitoren für wachstumdifferenzierungsfaktor und ihre anwendungen
DE69129760T2 (de) T-cadherin-bindungsmolekül
DE68928491T2 (de) Erzeugnisse und verfahren zur regelung der suppression von neoplastischen phenotypen
DE69635207T2 (de) Auf Chromosom 1 lokalisiertes Gen dessen Genprodukt mit der Alzheimerschen Krankheit assoziiert ist.
Garbe et al. IMP-L2: an essential secreted immunoglobulin family member implicated in neural and ectodermal development in Drosophila
DE69736109T2 (de) Differenzierungsinhibitor
DE69934239T2 (de) Ly6h-gen
US5767252A (en) Neuronal cell growth factor, Narp
EP0613497B1 (de) Lymphoides cd30-antigen
DE69733861T2 (de) Verwendung von neuronalem apoptose-inhibitorprotein
DE69924120T2 (de) Für ataxin-2-bindende proteine kodierende nukleinsäure, damit verwandten produkten und verfahren zur deren anwendung
DE69738302T2 (de) Neues semaphorin-gen: semaphorin y
DE10004815B4 (de) Menschliche intestinale Natriumphosphat-Kotransporter
DE19617940A1 (de) Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung
DE69806107T2 (de) Methoden und reagenzien zur regulierung von apoptosis
WO1998013489A1 (en) Nucleic acid molecules coding for tumor suppressor proteins and methods for their isolation
DE69616288T2 (de) Nukleotid sequenzen und daraus abgleitete aminosäuresequenzen vom tumorgen int 6
DE69813181T2 (de) Icam-4 und dessen diagnostische verwendungen
EP1165607A2 (de) An der entwicklung des nervensystems beteiligtes protein (tp)
WO2002017947A2 (de) Verwendung von t-proteinen zur differentiellen charakterisierung und therapie von verletzungen und tumoren des nervensystems
Yuan Molecular cloning and functional characterization ofaxo, a glial-specific neurexin-like gene affecting neuronal excitability in Drosophila melanogaster
DE19929887A1 (de) cDNA-Sequenzen von zwei Interakoren FANCIP2 und FANCIP3 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A
WO2000046244A1 (de) cDNA-SEQUENZ EINES INTERAKTORS FANCIP1 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A
DE3938953A1 (de) Klonierung und expression des fuer die blut-hirn-schranke spezifischen proteins ht7

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition