DE69635207T2

DE69635207T2 - Auf Chromosom 1 lokalisiertes Gen dessen Genprodukt mit der Alzheimerschen Krankheit assoziiert ist.

Info

Publication number: DE69635207T2
Application number: DE69635207T
Authority: DE
Inventors: Ephrat Levy-Lahad; E. Rudolph TANZI; D. Gerard SCHELLENBERG; Wilma Wasco; D. Thomas BIRD; John Mulligan; J. David GALAS
Original assignee: EPHRAT LEVY-LAHAD; EPHRAT LEVY LAHAD; Ephrat Levy-Lahad Seattle; VA MEDICAL CENTER SEATTLE; VA MEDICAL CT SEATTLE; General Hospital Corp; Darwin Molecular Corp
Current assignee: General Hospital Corp; Darwin Molecular Corp
Priority date: 1995-07-07
Filing date: 1996-07-05
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2016-07-06
Also published as: US20030180880A1; WO1997003192A2; EP1637600A1; ATE305039T1; CA2226255A1; EP0846171B1; US6468791B1; EP0846171A2; DE69635207D1; WO1997003192A3; JP2008035863A; JP2008035862A; JP4073955B2; JP2001517922A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Alzheimer-Krankheit und weiter spezifisch auf Verfahren und Zusammensetzungen für die Verwendung in der Diagnose und Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
Hintergrund der Erfindung
Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine verheerende, neurodegenerative progressive Störung, die zuerst 1907 bekannt wurde (Alzheimer, Allgemeine Zeitschrift für Psychiatrie 64:146-148,1907). AD ist eine übliche Krankheit bei älteren Menschen und ist die überwiegende Ursache von Demenz in Menschen, die über 65 Jahre alt sind. Die Prävalenz von AD wird auf so hoch wie 18,7 % und 47,2% für die Altersgruppen von 75 bis 84 Jahren bzw. ≥85 Jahren geschätzt. Es gibt daher eine große betroffene Population in den meisten Ländern der Welt.
Klinische Symptome dieser Krankheit beginnen typischer Weise mit feinen Kurzzeitgedächtnis-Problemen. Wenn die Krankheit fortschreitet, verschlechtern sich die Schwierigkeiten mit dem Gedächtnis, der Sprache und Orientierung bis zu dem Punkt, wo die Fähigkeit der Person, unabhängig zu funktionieren, beeinträchtigt wird. Andere Symptome, welche variabel sind, schließen Myoklonus und Anfälle ein. Die Dauer von AD von den ersten Symptomen an Gedächtnisverlust bis zum Tod beträgt 10 Jahre im Durchschnitt, aber kann von 6-8 Jahren bis zu mehr als 20 Jahren reichen. AD führt immer zum Tod, oftmals aufgrund atemwegsähnlicher Krankheit.
Die Pathologie von AD begrenzt sich exklusiv auf das zentrale Nervensystem (ZNS). Die überwiegenden Merkmale sind Amyloid-Ablagerungen (Plaques) und neurofibrilläre Tangles (NFT). In AD wird Amyloid assoziiert mit dem vaskulären System des ZNS und als fokale Ablagerungen in den Parenchyma gefunden. Die molekulare Hauptkomponente von Amyloid ist ein stark hydrophobes Peptid, genannt das Aβ-Peptid. Dieses Peptid aggregiert in Filamente in einer anti-β-gefalteten Faltblattstruktur, was zu der doppelbrechenden Natur von AD-Amyloid führt. Während Aβ die Hauptkomponente von AD-Amyloid ist, beinhaltet eine Teilliste von anderen Proteinen, die mit dem Amyloid assoziiert sind, α-1-Antichymotypsin (Abraham, et al., Cell 52: 487-501, 1988), Cathepsin D (Cataldo, et al., Brain Res. 513:181-192, 1990), Nicht-Amyloid-Komponentenprotein (Ueda, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:11282-11286, 1993), Apolipoprotein E (ApoE) (Namba, et al., Brain Res. 541: 163-166, 1991; Wisniewski und Frangione, Neurosci. Lett. 135: 235-238, 1992; Strittmatter, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 1977-1981, 1993) Apolipoprotein J (Choi-Mura, et al., Acta Neuropathol. 83:260-264, 1992; McGeer, et al., Brain Res. 579:337-341, 1992), Hitzeschockprotein 70 (Hamos, et al., Neurology 41:345-350, 1991), Komplement-Komponenten (McGeer and Rogers, Neurology 43:447-449, 1992) α₂-Makroglobin (Strauss, et al., Lab. Invest. 66:223-230,1992), Interleukin-6 (Strauss, et al., Lab. Invest. 66:223-230, 1992), Proteoglykane (Snow, et al., Lab. Invest. 58:454-458, 1987) und Serum Amyloid P (Coria, et al., Lab. Invest. 58: 454-458, 1988). Viele Plaques werden von dystrophischen Neuriten umgeben, welches Nervenendigungen sind, die unnormale filamentöse Strukturen enthalten. Plaques werden oftmals von Astrozyten und aktivierten Mikroglia-Zellen umgeben, die immunverwandte Proteine, wie z. B. die MHC Klasse II-Glykoproteine HLA-DR, HLA-DP und HLA-DQ sowie MHC Klasse I-Glykoproteine, Interleukin-2 (IL-2)-Rezeptoren und IL-1, exprimieren. Das andere dominante Merkmal der AD-Neuropathologie ist die Anwesenheit von NFTs. Diese bestehen aus unnormalen Filamenten, die in den neuronalen Zellkörpern zusammengebündelt sind. „Geister"-NFTs werden in AD-Gehirnen beobachtet, welche vermutlich die Lage von toten Neuronen markieren. Andere neuropathologische Merkmale schließen granulovakuolare Veränderungen, neuronalen Verlust, Gliosis und die variable Anwesenheit von Lewy-Körpern ein.
Im AD-Gehirn ist der destruktive Prozess der Krankheit in einem großen Ausmaß offensichtlich. Im Spätstadium von AD können ventrikulare Vergrößerung und Schrumpfung des Gehirnes durch magnetische Resonanz-Imaging beobachtet werden. Bei der Autopsie können umfangreiche Gliosis und neuronaler Verlust beobachtet werden. Daher sind die Amyloid-Plaques-Strukturen und NFTs, die während der Autopsie beobachtet werden, sehr wahrscheinlich die Endpunkte eines langen Krankheitsprozesses, und weit entfernt von den auslösenden Ereignissen von AD. Auch sind die Zellen, die bei der Autopsie verbleiben, in starkem Maße verschieden von denjenigen eines normalen Gehirns. Neuronen, welche möglicherweise in auslösende Ereignisse involviert sind, sind abwesend und andere Zelltypen, wie die aktivierten Mikroglia-Zellen und Astrozyten, haben Genexpressionsmuster, die im normalen Gehirn nicht beobachtet werden. Daher sind Versuche, die biochemische Methoden anwenden, um Schlüsselproteine und Gene in den auslösenden Schritten der Krankheit zu identifizieren, durch den Fakt erschwert, dass es nicht möglich ist, diese kritischen auslösenden Ereignisse tatsächlich zu beobachten. Die biochemische Präparierung des AD-Gehirns bei der Autopsie ist daher eher der molekularen Archäologie ähnlich, die versucht, den pathogenen Stoffwechselweg durch Vergleich des normalen Gehirns mit dem Krankheitsgehirn des Endstadiums zu rekonstruieren.
Substantieller Beweis schlägt vor, dass vererbbare genetische Defekte an AD beteiligt sind. Zahlreiche Verwandte mit einem frühem Ausbruch wurden beschrieben. (Bird, et al., Ann. Neurol. 23:25-31, 1988; Bird, et al., Ann. Neurol. 25:12-25, 1989; Cook, et al., Neurology 29: 1402-1412, 1979; Feldman, et al., Neurology 13:811-824, 1960; Goudsmit, J. Neurol. Sci. 49:79-, 1981; Heston and White, Behavior Genet. 8: 315-331, 1978; Martin, et al., Neurology 41:62-68, 1991; Nee, et al., Arch. Neurol. 40:203-208, 1983; van Bogaeert, et al., Mschr. Psychiat. Neurol. 102:249-301, 1940; Wheelan, Ann. Hum. Genet. 23:300-309, 1959). (Als früher Ausbruch wird hierin ein Ausbruch vor dem 65. Lebensjahr bezeichnet.) Familien mit multiplen AD-Fällen mit spätem Ausbruch wurden ebenso beschrieben (Bird, et al., Ann. Neurol. 25:12-25, 1989; Heston and White, Behavior Genet. 8:315-331, 1978; Pericak-Vance, et al., Exp. Neurol. 102:271-279, 1988). Zusätzlich haben Zwillingsstudien dokumentiert, dass monozygote Zwillinge mehr Übereinstimmung in ihren AD-Phänotypen haben als dizygote Zwillinge (Nee, et al., Neurology 37:359-363, 1987; [133]). Außerdem haben Familien mit übereinstimmenden Zwillingen mehr sekundäre Fälle von AD als Familien mit uneinigen („discordant") Zwillingen (Rapoport, et al., Neurology 41:1549-1553, 1991).
Die genetische Analyse von AD wird durch die Komplexität der Krankheit und die beschränkte Genauigkeit ihrer Diagnose verkompliziert. Weil AD bei älteren Menschen üblich ist, kann die Anhäufung von Fällen in einer Familie zufällig erfolgen, was eine mögliche Verwechslung von nicht Allel-genetischer Heterogenität oder ursächlicher Heterogenität mit genetischen und nicht-genetischen Fällen, die in derselben Verwandtschaft ko-existieren, repräsentiert. Außerdem wird die klinische Diagnose von AD mit anderen Demenz-Krankheiten, die in älteren Menschen üblich sind, verwechselt.
Trotz der Probleme, die mit der Auflösung komplexer genetischer Krankheiten assoziiert sind, wurden zwei ursächliche AD-Loci und ein Risiko-modifizierendes Gen identifiziert. Mutationen im Amyloid-Vorläuferprotein (APP)-Gen auf Chromosom 21 verursachen autosomal dominante AD mit frühem Ausbruch (< 65 Jahre) (Goate, et al., Nature 349:704, 1991). Mutationen in einem kürzlich identifizierten Gen (AD3) auf Chromosom 14 resultieren ebenso in autosomal dominanter AD mit frühem Ausbruch (Schellenberg, et al., Science 258-668, 1992; Sherrington, et al., Nature 375:754-760, 1995). Für AD mit spätem Ausbruch wurde das APOE-Gen als ein genetischer modifizierender Faktor identifiziert (Strittmatter, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1977, 1993; Corder, et al, Science 261:921, 1993; Corder, et al., Nat. Genet. 7:180-184, 1994; Benjamin, et al., Lancet 344:473, 1994; Smith, et al., Lancet 344:473-474, 1994).
Die bekannten gentischen Loci für AD begründen nicht alle Fälle von AD. Zum Beispiel haben in AD mit spätem Ausbruch ungefähr die Hälfte der AD-Fälle nicht das APOE ε4-Allel (Brousseau, et al., Neurology 342, 1994; Kuusisto, et al., Brit. Med. J. 309: 636, 1994; Tsai, et al., Am. J. Hum. Genet. 54:643, 1994; Liddel, et al., J. Med. Genet. 31:197, 1994). Auch in den Wolga-Deutschen (VG) Verwandtschaften (Cook, et al., Neurology 29:1402, 1979; Bird, et al., Ann. Neurol. 23:25, 1988; Bird, et al., Ann. Neurol. 25: 12, 1989; Bird, Am. Hist. Soc. Germ. Russia J. 49:1991; Bird, et al., in Heterogeneity of Alzheimer's Disease, F. Boller, et al., Eds. (Spring-Verlag, Heidelberg, 1992) pp. 118-129) sowie in verschiedenen anderen Familien mit hoher Inzidenz an AD wurden die bekannten AD-Loci als mögliche Ursachen ausgeschlossen (Schellenberg, et al., Science 258:668, 1992; Lannfelt, et al., Nat. Genet. 4;218-219, 1993; van Duijn, et al., Am. J. Hum. Genet. 55:714-727, 1994; Schellenberg, et al., Science 241-1507, 1988; Schellenberg, et al., Am. I. Hum. Genet. 48:563, 1991; Schellenberg, et al., Am. J. Hum. Genet. 49:511-517, 1991, Kamino, et al., Am. J. Hum. Genet. 51:998, 1992; Schellenberg, et al., Am J. Hum. Genet. 53:619, 1993 [13]; Schellenberg, et al., Ann. Neurol. 31:223, 1992; Yu, et al., Am. J. Hum. Gent. 54:631, 1994). Identifizierung von neuen Genen sollte wesentlich zur Entfaltung der genetischen Determinanten beitragen und biochemische und genetische Ansätze zur Diagnose und Behandlung ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen zuvor nicht identifizierten Locus für AD, Verfahren und Zusammensetzungen für die Diagnose und Behandlung von AD zur Verfügung und stellt weiterhin andere, verwandte Vorteile zur Verfügung.
Zusammenfassung der Erfindung
Kurz gesagt, stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung, die für das AD4 (auch bekannt als STM2)-Genprodukt kodieren. In einer Ausführungsform wird ein repräsentatives Nukleinsäuremolekül in 1A und B (hiernach als 1 bezeichnet) zur Verfügung gestellt. In anderen Ausführungsformen werden Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung gestellt, welche für ein mutantes AD4-Genprodukt kodieren, welches die Wahrscheinlichkeit für die Alzheimer-Erkrankung (auf eine statistisch signifikante Weise) erhöht. Eine repräsentative Darstellung einer solchen Mutante ist eine Aminosäuresubstitution am Rest 141, wobei z. B. ein Isoleucin gegen ein Asparagin substituiert sein kann.
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung gestellt, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, wie in 1 dargestellt, oder einer komplementären Sequenz davon, (b) einem isolierten Nukleinsäuremolekül, das spezifisch an das Nukleinsäuremolekül von (a) unter Bedingungen von hoher Stringenz hybridisiert, und (c) einer isolierten Nukleinsäure, die für ein AD4-Genprodukt kodiert. Wie hierin verwendet, soll verstanden werden, dass ein Nukleinsäuremolekül „spezifisch" an ein AD4-Gen (oder eine verwandte Sequenz) hybridisiert, wenn es an eine solche Sequenz detektierbar hybridisiert, aber unter den selben Bedingungen nicht signifikant oder detektierbar an die AD3 Gensequenz hybridisiert. In anderen Aspekten werden isolierte DNA-Moleküle zur Verfügung gestellt, die genomische Sequenzen enthalten, wie z. B. die Sequenzen, die in den 13 bis 19 dargestellt sind.
In anderen Aspekten werden Expressionsvektoren zur Verfügung gestellt, umfassend einen Promotor, der operativ mit dem Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, verbunden ist. Repräsentative Beispiele von geeigneten Promotoren schließen Gewebe-spezifische Promotoren sowie Promotoren, wie den CMV I-E Promotor, frühen SV40-Promotor und MuLV LTR, ein. In verwandten Aspekten werden virale Vektoren zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, die Expression eines oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküls zu steuern. Repräsentative Beispiele von solchen viralen Vektoren schließen virale Herpes-Simplex-Vektoren, Adenovirus-assoziierte virale Vektoren und retrovirale Vektoren ein. Ebenso werden Wirtszellen (z. B. humane, Hunde-, Affen-, Ratten- oder Maus-Zellen) zur Verfügung gestellt, welche die oben beschriebenen Vektoren tragen.
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden isolierte Proteine oder Polypeptide zur Verfügung gestellt, umfassend ein AD4-Genprodukt sowie AD4 Peptide von mehr als 12, 13 oder 20 Aminosäuren. In einer Ausführungsform wird ein Protein zur Verfügung gestellt, das die Aminosäuresequenz, wie in 2 dargestellt, aufweist. In einer anderen Ausführungsform ist das Protein ein mutantes AD4-Genprodukt, das die Wahrscheinlichkeit von Alzheimer-Krankheit erhöht. Solche Mutanten schließen diejenigen mit einer Aminosäure-Substitution am Rest 141 (z. B. eine Substitution von Asparagin gegen Isoleucin) ein. In noch einer weiteren Ausführungsform werden AD4-Peptide zur Verfügung gestellt, welche aus 13 bis 20 Aminosäuren aufgebaut sind und welche von den N-terminalen, internen oder Carboxy-terminalen hydrophilen Regionen abgeleitet oder ausgewählt sind.
Weiter offenbart werden Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung der Alzheimer-Krankheit, umfassend den Schritt der Verabreichung eines Vektors, der ein Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, enthält oder exprimiert, an einen Patienten, wobei die Wahrscheinlichkeit von Alzheimer-Krankheit reduziert oder der Ausbruch von Alzheimer-Krankheit in dem Patienten verzögert wird. In einem verwandten Aspekt werden Verfahren zur Behandlung oder Vermeidung von Alzheimer-Krankheit zur Verfügung gestellt, die geeignet sind für die Verabreichung eines Proteins, wie oben beschrieben, an einen Patienten, wobei die Wahrscheinlichkeit von Alzheimer-Krankheit reduziert oder der Ausbruch von Alzheimer-Krankheit in dem Patienten verzögert wird. In noch einem weiteren verwandten Aspekt werden Verfahren zur Behandlung oder Vermeidung von Alzheimer-Krankheit zur Verfügung gestellt, die für die Verabreichung eines Antikörpers, der spezifisch für ein wie oben beschriebenes AD4-Protein ist, an einen Patienten geeignet sind, wobei die Wahrscheinlichkeit von Alzheimer-Krankheit reduziert oder der Ausbruch von Alzheimer-Krankheit in dem Patienten verzögert wird. In bestimmten Ausführungsformen können die oben genannten Verfahren durch in vivo Verabreichung ausgeführt werden.
Durch die vorliegende Erfindung werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, einen Vektor, eine Wirtszelle, ein Protein oder einen Antikörper, wie oben beschrieben, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Antikörper zur Verfügung gestellt, welche spezifisch an ein AD4-Protein oder an einzelne Peptide binden, die von den N-terminalen, internen oder Carboxy-terminalen hydrophilen Regionen abgeleitet wurden. Wie hierin verwendet, soll verstanden werden, dass ein Antikörper spezifisch für ein AD4-Protein ist, wenn er detektierbar und mit einem K_A von 10^–7M oder weniger (z. B. 10^–8M, 10^–9M, etc.) bindet, aber nicht detektierbar (oder mit einer Affinität von größer als 10^–7M (z. B. 10^–6M, 10^–5M, etc.) an das AD3 Protein bindet. Weiterhin werden Hybridoma-Zellen zur Verfügung gestellt, welche in der Lage sind, solche Antikörper zu produzieren.
In anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäure-Sonden zur Verfügung gestellt, welche in der Lage sind, an ein AD4-Gen unter Bedingungen von hoher Stringenz spezifisch zu hybridisieren (wie oben definiert). In einem verwandten Aspekt umfassen solche Sonden mindestens einen Teil der Nukleinsäuresequenz, wie in 1 gezeigt, oder ihre komplementäre Sequenz, wobei die Sonde in der Lage ist, spezifisch an ein mutantes AD4-Gen unter Bedingungen von hoher Stringenz zu hybridisieren. In einem besonders bevorzugten Aspekt werden Sonden zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, unter Bedingungen von sehr hoher Stringenz spezifisch an ein mutantes AD4-Gen zu hybridisieren, in welchem der Aminosäurerest 141 von Asparagin zu Isoleucin ausgetauscht wurde. In weiteren verwandten Aspekten werden Sonden zur Verfügung gestellt, welche fähig sind, spezifisch an mindestens einen Teil der Nukleinsäuresequenz, die in einer der 13 bis 19 gezeigt ist, zu hybridisieren. Repräsentative Sonden der vorliegenden Erfindung sind im allgemeinen mindestens 12 Nukleotidbasen lang, obwohl sie auch 14, 16, 18 Basen oder länger sein können. Weiterhin werden Primerpaare zur Verfügung gestellt, welche dazu in der Lage sind, spezifisch alle oder einen Teil von einem der hierin offenbarten Nukleinsäure-Moleküle zu amplifizieren.
In anderen Aspekten der Erfindung werden Verfahren zur Diagnose eines Patienten zur Verfügung gestellt, der eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Erkrankung an Alzheimer-Krankheit aufweist, umfassend die Schritte von (a) Inkubieren der Nukleinsäure, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einer Sonde, die in der Lage ist, spezifisch an ein mutantes AD4-Gen zu hybridisieren, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend sind, um das Auftreten einer Hybridisierung zu ermöglichen; und (b) Detektieren der Anwesenheit einer hybridisierten Probe und dadurch Nachweisen, dass der Patient eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Erkrankung an Alzheimer-Krankheit aufweist. In einem anderen Aspekt werden Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von (a) Amplifizieren einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz, die von einem Patienten erhalten wurde und mit einem mutanten AD4-Gen assoziiert ist; und (b) Detektieren der Anwesenheit einer amplifizierten Nukleinsäuresequenz und dadurch Nachweisen, dass der Patient eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Erkrankung an Alzheimer-Krankheit aufweist. In noch einem anderen Aspekt werden Verfahren zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte von (a) Inkontaktbringen einer biologischen Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit einem Antikörper, der spezifisch an ein mutantes AD4-Protein bindet, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend sind, um die Bindung des Antikörpers an das Protein zu ermöglichen; und (b) Nachweisen der Anwesenheit des gebundenen Antikörpers. Geeignete biologische Proben schließen Zellen mit Zellkernen („nucleated cells"), die von peripherem Blut, von bukkalen Abstrichen oder Hirngewebe erhalten wurden, ein.
In einem anderen Aspekt werden pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, umfassend ein Peptid, welches einen Teil eines mutanten AD4-Genproduktes, das eine Mutation enthält, umfasst, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
In noch einem anderen Aspekt werden nicht-humane transgene Tiere zur Verfügung gestellt, deren Keimzellen und somatische Zellen ein AD4-Gen enthalten, welches operativ mit einem Promotor verbunden ist, der für die Expression des Gens effektiv ist, wobei das Gen in das Tier oder einen Vorfahren des Tieres oder im embryonalen Stadium eingeführt wird. In einer Ausführungsform ist das Tier eine Maus, Ratte oder ein Hund. In anderen Ausführungsformen wird das AD4-Gen von einem Vektor, wie oben beschrieben, exprimiert. In noch einer anderen Ausführungsform kodiert das AD4-Gen für ein mutantes AD4-Genprodukt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nach Einsichtnahme der folgenden detaillierten Beschreibung und der angefügten Zeichnungen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1A und 1B stellen die Nukleotidsequenzen eines AD4-Gens dar.
2 stellt die Aminosäureseuqenz eines AD4-Genproduktes dar.
3 stellt den Sequenzabgleich eines repräsentativen AD4-Genproduktes mit dem AD3 Genprodukt dar. Vertikale Balken zwischen den Sequenzen zeigen Sequenzidentität an. Doppelpunkte zwischen den Sequenzen zeigen starke Sequenzsimilarität an. Punkte zwischen den Sequenzen zeigen mittlere Sequenzsimilarität an. Punkte, die in eine der Sequenzen eingefügt wurden, zeigen Lücken an, die in eine Sequenz eingefügt sind, um die Punktzahl des Abgleichs zu maximieren.
4 zeigt eine graphische Darstellung der Hydropathie eines AD4-Genprodukts. Die graphische Darstellung zeigt an, dass es 7 putative Transmembran-Regionen dieses Genproduktes gibt, und zeigt eine Mutation am Rest 141 (Asparagin zu Isoleucin) an.
5 stellt bestimmte Sequenzmerkmale eines repräsentativen AD4-Genproduktes dar, einschließlich einer konservierten Sequenz von 4 Aminosäuren (KPGL) in den Positionen 202-205 und 251-254, wovon jede am C-Terminus einer putativen Membran-spannenden Region liegt und in den humanen und Maus-AD3-Genprodukten konserviert ist. 5 stellt auch eine putative Gykosylierungsstelle (Asparagin 366) dar.
6 ist eine Punktdarstellung (dotplot), welche das humane AD3-Genprodukt und ein repräsentatives AD4-Genprodukt vergleicht. Die dunklen Blöcke zeigen Sequenzsimilarität zwischen den putativen Membran-spannenden Regionen an.
7 stellt einen Stammbaum dar, der die Segregation von Chromosom 1-Markern in der R-Familie zeigt. Die Balken unter jedem Subjekt repräsentieren rekombinante Minimum-Haplotypen, konstruiert unter der Verwendung der 23 Marker von D1S238 bis D1S235 (Tabelle 2). Die gezeigten Allele (von oben nach unten) sind für D1S249, D1S237, D1S479, D1S439 und D1S225, wobei A das größte publizierte Allel ist. Die ausgefüllten Balken repräsentieren die Haplotypen, die mit der Krankheit segregieren. Andere Haplotypen werden repräsentiert durch Balken mit verschiedener Schraffur oder Markierung. Ein partiell fehlender Balken zeigt an, dass die Marker nicht genotypisiert sind (Subjekt IV-15). Ein ""-Symbol zeigt Regionen an, wo die Phase nicht bestimmt werden konnte. APOE-Genotypen werden direkt über den Haplotypen mit 3 und 4 gezeigt, welches die ε3 bzw. die ε4 Allele sind. Rekombinanten wurden bei den Krankheits-Haplotypen zwischen D1S479/D1S439 und D1S225 in den Subjekten V-1 und V-3 und zwischen D1S306 und D1S310 in Subjekt IV-18 (nicht gezeigt) beobachtet. In IV-16 gibt es eine Rekombination zwischen D1S217 und D1S237. Insgesamt wurden 4 Rekombinationen (auf 3 nicht Krankheits-verwandten Chromosomen) zwischen D1S249 und D1S237 in den 27 Chromosomen der Generation IV beobachtet. Die Distanz zwischen diesen Markern ist 12 cM und die Chance, dass bis zu 4 Rekombinanten beobachtet würden, beträgt 41 %.
8 stellt die Lage der Chromosom 1-Marker dar. Entfernungen sind in centimorgans angegeben (im Durchschnitt der Geschlechter) unter der Verwendung der Kosambi-Kartenfunktion („Kosambi map function"). Die drei Kappen sind nicht unabhängig, da alle einige gemeinsame Genotypen enthalten.
9 legt die Sequenzen von Primern dar, die zur Amplifikation von polymorphen Regionen des Chromosoms 1 verwendet wurden.
10 stellt die DNA-Sequenz der Klone 788iih5, EST TO3796 und der Klone E111.1 und ELL1.2 dar.
11 stellt die DNA-Sequenzen von Primern dar, die in der PCR oder zum Sequenzieren der AD4-Gene verwendet wurden.
12 stellt ein Ethidiumbromid-gefärbtes Gel von genomischer DNA dar, die mit WWF und INTIR-Primern amplifiziert wurde. Die Spuren sind: 1, Risiko, 79 Jahre alt; 2, betroffen, Ausbruch mit 60 Jahren; 3, Risiko, 67 Jahre alt; 4, betroffen, Ausbruch mit 75 Jahren (vermutete Phänokopie); 5, DNA-Größenstandard V von Boehringer Mannheim; 6, betroffen, Ausbruch mit 52 Jahren; 7, betroffen, Ausbruch mit 46 Jahren; 8, betroffen, Ausbruch mit 49 Jahren.
13 stellt eine teilweise genomische DNA-Sequenz von AD4 dar.
14 stellt eine teilweise genomische DNA-Sequenz von AD4 dar.
15 stellt eine teilweise genomische DNA-Sequenz von AD4 dar.
16 stellt eine teilweise genomische DNA-Sequenz von AD4 dar.
17 stellt eine teilweise genomische DNA-Sequenz von AD4 dar.
18 stellt eine teilweise genomische DNA-Sequenz von AD4 dar.
19 stellt eine teilweise genomische DNA-Sequenz von AD4 dar.
20 zeigt das Expressionsmuster von STM2 in verschiedenen Geweben.
Detaillierte Beschreibung der Erindung
Definitionen
Ehe die Erfindung im Detail dargelegt wird, kann es für deren Verständnis nützlich sein, Definitionen von bestimmten Begriffen darzulegen und aufzuführen, und Abkürzungen zu definieren, welche hiernach verwendet werden.
„Genetischer Marker" ist ein beliebiges Segment auf einem Chromosom, das in dem Genom unterscheidbar einzig und polymorph in der Population ist, um somit Information über die Vererbung von verbundenen DNA-Sequenzen, Genen und/oder anderen Markern zur Verfügung zu stellen.
„Autosomal dominant" bedeutet, dass ein Merkmal auf einem der nicht-geschlechtlichen Chromosomen (Autosomen) kodiert ist und dominant für den Phänotyp ist. Es diktiert für ein Individuum, das ein heterozygotes Stadium hat.
„LOD Punktzahl" („LOD score") ist ein Standardmaß in der Genetik für die Wahrscheinlichkeit eines Merkmales, in dem Intervall lokalisiert zu sein, das bewertet wird. Es ist der Logarithmus einer kalkulierten Wahrscheinlichkeit.
„Vektor" bezieht sich auf eine Anordnung, welche in der Lage ist, die Expression eines AD4-Gens sowie zusätzlicher Sequenz(en) oder Gen(e) von Interesse zu steuern. Der Vektor muß transskriptionale Promotorelemente einschließen, welche operativ mit den Genen von Interesse verbunden sind. Der Vektor kann entweder aus Deoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA) oder einer Kombination der beiden (z. B. eine DNA-RNA-Chimäre) aufgebaut sein. Optional kann der Vektor eine Polyadenylierungssequenz, eine oder mehrere Restriktionsstellen sowie einen oder mehrere selektierbare Marker, wie z. B. Neomycin-Phosphotransferase oder Hygromycin-Phosphotransferase, enthalten. Zusätzlich können in Abhängigkeit von der gewählten Wirtszelle und dem verwendeten Vektor andere genetische Elemente, wie z. B. ein Ursprung der Replikation, zusätzliche Nukleinsäurerestriktionsstellen, Verstärker, Sequenzen, die die Induzierbarkeit der Transkription verleihen, und selektierbare Marker ebenso in die Vektoren, die hierin beschrieben sind, eingefügt sein.
Abkürzungen: AD, Alzheimer-Krankheit; APP, Amyloidvorläuferprotein-Gen; APLP1 und APLP2, Amyloidvorläufer-ähnliche Proteine; ZNS, Zentrales Nervensystem; DS, Down-Syndrom; FAD, familiäre AD; HCHWA-D, vererbbare zerebrale Hämorrhagie mit Amyloidose vom niederländischen Typ; (Z_max), maximale LOD-Punktzahl („lod score"); NFTs, neurofibrilläre Tangles; STRP, kurzer Tandem-Wiederholungs-Polymorphismus; θ, Rekombinationsfraktion; VG, Wolga-Deutsche; AD3, die Bezeichnung, die dem frühen Ausbruch FAD-Gen auf Chromosom 14gegeben wurde; YAC, Hefe-artifizielles Chromosom, EST, exprimierter Sequenz-Tag; PCR, Polymerase-Kettenreaktion; RT-PCR, PCR-Prozess, in welchem RNA zuerst in dem ersten Schritt unter der Verwendung der reversen Transkriptase (RT) in DNA transkribiert wird; cDNA, jede DNA, die durch Kopieren einer RNA-Sequenz in die DNA-Form hergestellt wird.
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen für die Detektion und Behandlung von Alzheimer-Krankheit zur Verfügung. Diese Verfahren und Zusammensetzungen basieren auf der Entdeckung eines Gens, welches auf dem Chromosom 1 lokalisiert ist, welches, wenn es mutiert ist, die Wahrscheinlichkeit von Alzheimer-Krankheit erhöht. Dieses Gen, als AD4 bezeichnet, wurde auf Chromosom 1 im Locus 1g31-42 gefunden.
Obgleich eine Ausführungsform eines AD4-Gens in 1 offenbart ist, soll verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist. Insbesondere soll in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Referenz auf das AD4-Gen so verstanden werden, dass Derivate, Analoga oder Allel-Varianten des Gens, das in 1 offenbart ist, eingeschlossen sind, die im wesentlichen gleich sind. Wie hierin verwendet, wird ein Nukleinsäuremolekül als „im wesentlichen gleich" bezeichnet, wenn: (a) die Nukleotidsequenz von der kodierenden Region des beschriebenen Gens abgeleitet ist und Teile der Sequenz und/oder Allel-Variationen der Sequenz, wie oben diskutiert, einschließt; und (b) die Nukleotidsequenz in der Lage ist, an Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung unter hoher oder sehr hoher Stringenz zu hybridisieren (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989); oder (c) die DNA-Sequenzen als ein Ergebnis des genetischen Codes der genetischen Sequenzen, die in (a) oder (b) definiert sind, degeneriert sind. Zusätzlich kann die genomische Sequenz nur Polymorphismen entweder in der kodierenden oder nicht-translatierten Region oder Insertionen, Deletionen oder ähnliches enthalten. Weiterhin schließt das AD4-Gen komplementäre und nicht-komplementäre Sequenzen unter der Voraussetzung ein, dass die Sequenzen die hierin dargestellten Kriterien erfüllen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet hohe Stringenz Standardhybridisierungsbedingungen (z. B. 5x SSPE, 0,5 % SDS bei 65°C oder das Äquivalent), so dass eine entsprechende Nukleotidsequenz in der Lage ist, selektiv an die Nukleotidsequenzen des AD-verwandten Genes oder an mutante Nukleotidsequenzen zu hybridisieren. Sehr hohe Stringenz bedeutet, dass die Nukleotidsequenz in der Lage ist, selektiv an ein einziges Allel des AD-verwandten Gens zu hybridisieren.
Das AD4-Gen kann von genomischer DNA oder cDNA isoliert werden. Genomische DNA-Bibliotheken, die in Vektoren konstruiert sind, wie z. B. YACs (artifizielle Hefe-Chromosomen), Bakteriophagen-Vektoren, wie z. B. λEMBL3, λgt10, Kosmide oder Plasmide sind für die Verwendung geeignet. cDNA-Bibliotheken, konstruiert in Bakteriophagen-Vektoren, Plasmiden oder anderen, sind für das Screening geeignet. Solche Bibliotheken können unter Verwendung von Verfahren und Techniken konstruiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989) oder von kommerziellen Quellen gekauft werden (z. B. Clontech). In einer Ausführungsform wird das AD4-Gen durch PCR, die an genomischer DNA, cDNA oder Bibliotheken durchgeführt wird, oder durch Sonden-Hybridisierung von genomischer DNA oder cDNA-Bibliotheken isoliert. Primer für PCR und Sonden für das Hybridisierungs-Screening können auf der Basis der DNA-Sequenz von AD4, wie hierin vorgestellt, entwickelt werden. Die DNA-Sequenz eines AD4-Gens wird in 1A und B dargestellt und die vorhergesagte Aminosäuresequenz wird in 2 dargestellt. Primer für PCR sollten von den Sequenzen in der 5' und 3' nicht-translatierten Region abgeleitet werden, um die Volllängen-cDNA zu isolieren. Die Primer sollten keine selbst-komplementären Sequenzen oder keine komplementären Sequenzen an ihren 3' Enden enthalten (um Primer-Dimer-Bildung zu verhindern). Bevorzugterweise haben die Primer einen GC-Gehalt von ungefähr 50 % und enthalten Restriktionsstellen. Die Primer werden an cDNA angelagert und ausreichende Zyklen von PCR werden durchgeführt, um ein Produkt zu erhalten, was leicht durch Gelelektrophorese und Färbung visualisiert werden kann. Das amplifizierte Fragment wird gereinigt und in einen Vektor eingefügt, wie z. B. λgt10 oder pBS(M13+), und vermehrt. Eine Oligonukleotid-Hybridisierungs-Sonde, die für das Screening von genomischen oder cDNA-Bibliotheken geeignet ist, kann basierend auf der Sequenz, wie hierin zur Verfügung gestellt, konstruiert werden. Bevorzugterweise ist das Nukleotid 20-30 Basen lang. Solch ein Oligonukleotid kann durch automatisierte Synthese synthetisiert werden. Das Oligonukleotid kann geeigneterweise am 5' Ende mit einem Reportermolekül, wie einem Radionuklid (z. B. ³²P) oder Biotin markiert sein. Die Bibliothek wird als Kolonie oder als Phage, in Abhängigkeit vom Vektor, ausplattiert und die rekombinante DNA wird auf Nylon oder Nitrozellulose-Membranen transferiert. Nach Denaturierung, Neutralisierung und Fixierung der DNA auf die Membran, werden die Membranen mit der markierten Sonde hybridisiert. Die Membranen werden gewaschen und das Reportermolekül detektiert. Die hybridisierenden Kolonien oder Phage werden isoliert und vermehrt. Kandidaten-Klone oder PCR-amplifizierte Fragmente können auf den Gehalt an AD4-DNA durch verschiedene Mittel verifiziert werden. Zum Beispiel können die Kandidaten-Klone mit einer zweiten, nicht überlappenden Sonde hybridisiert werden oder einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen werden. Auf diese Weise werden Klone, die das AD4-Gen enthalten, und welche für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, isoliert.
Die Struktur der Proteine, die von den hierin beschriebenen Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, können von den primären Translationsprodukten unter der Verwendung der Hydrophobizität-Plotfunktion von z. B. P/C Gene oder Intelligenetics Suite (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien) oder gemäß der Verfahren vorhergesagt werden, die von Kyte und Doolittle beschrieben wurden (J. Mol. Biol. 157:105-132, 1982). Eine solche Struktur ist in 4 dargestellt, welche eine graphische Darstellung der Hydropathie („hydropathy plot") eines AD4-Genproduktes ist. Wie aus dieser Figur offensichtlich ist, stellt die graphische Darstellung ein Protein mit einer extrazellulären Domäne, drei intrazellulären Loop-Domänen, drei intrazellulären Loop-Domänen, sieben transmembranen Regionen und einer intrazellulären Domäne dar.
AD4-Proteine der vorliegenden Erfindung können in Form von sauren oder basischen Salzen oder in neutraler Form vorliegen. Weiterhin können individuelle Aminosäurereste durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein. Weiterhin können verschiedene Substitutionen, Deletionen oder Additionen zu der Aminosäure oder Nukleinsäure-Sequenzen durchgeführt werden, wobei das Nettoergebnis davon ist, die biologische Aktivität der Mutante oder des Wildtypproteins zu erhalten oder weiter zu verstärken oder zu verringern. Weiterhin kann aufgrund der Degeneration des genetischen Codes beträchtliche Variation in den Nukleotidsequenzen, die für die selbe Aminosäuresequenz kodieren, existieren.
Andere Derivate des AD4-Proteins, die hierin offenbart sind, schließen Konjugate des Proteins zusammen mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein. Dies kann z. B. durch die Synthese von N-terminalen oder C-terminalen Fusionsproteinen erreicht werden, welche addiert werden können, um die Reinigung oder Identifizierung von AD4-Proteinen zu ermöglichen (siehe U.S. Patent Nr. 4,851,341, siehe auch Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Alternativ dazu können Fusionsproteine, wie z. B. AD4-β-Galactosidase oder AD4-Luciferase, konstruiert werden, um der Identifizierung, Expression und Analyse von AD4-Proteinen zu assistieren.
AD4-Proteine der vorliegenden Erfindung können unter der Verwendung einer großen Zahl an Techniken konstruiert werden, z. B. einschließlich derer, die in Beispiel 5 beschrieben sind. Weiterhin können Mutationen an bestimmten Loci durch die Synthese von Oligonukleotiden eingeführt werden, die eine mutante Sequenz flankiert von Restriktionsstellen enthalten, was die Ligation von Fragmenten der nativen Sequenz ermöglicht. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz für ein Derivat, das die erwünschte Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion aufweist.
Alternativ dazu können Oligonukleotid-gerichtete ortsspezifische (oder Segment-spezifische) Mutagenese-Verfahren angewendet werden, um ein verändertes Gen zur Verfügung zu stellen, welches bestimmte Codons gemäß der gewünschten Substituion, Deletion und Insertion verändert aufweist. Beispielhafte Verfahren der Alterationen, wie oben ausgeführt, werden offenbart von Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981) und Sambrook et al. (supra). Deletions- oder Stutzungsderivate von AD4-Proteinen (z. B. ein löslicher extrazellulärer Teil) können ebenso durch die Verwendung von geeigneten Restriktionsendonuklease-Stellen konstruiert werden, die benachbart zur gewünschten Deletion sind. Nach der Restriktion können Überhänge gefüllt werden und die DNA religiert werden. Beispielhafte Verfahren zur Herstellung der Veränderungen, wie oben dargestellt, werden von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ED., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) offenbart.
Mutationen, welche in den Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, erhalten bevorzugterweise den Leserahmen der kodierenden Sequenzen. Weiterhin werden Mutationen bevorzugterweise keine komplementären Regionen kreieren, welche hybridisieren könnten, um sekundäre mRNA-Strukturen herzustellen, wie z. B. Loops oder Haarnadeln, welche nachteilig die Translation der mRNA beeinflussen würden. Obwohl eine Mutationsstelle vorbestimmt sein kann, ist es nicht notwendig, dass die Natur der Mutation per se vorbestimmt ist. Zum Beispiel kann, um optimale Charakteristika der Mutanten an einer gegebenen Stelle zu selektieren, Zufallsmutagenese am Target-Codon durchgeführt werden und die exprimierten Mutanten auf Indikative biologische Aktivität untersucht werden. Alternativ dazu können Mutationen an bestimmten Loci durch die Synthese von Oligonukleotiden eingeführt werden, welche eine mutante Sequenz flankiert durch Restriktionsstellen enthalten, was die Ligation der Fragmente in die native Sequenz ermöglicht. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz für ein Derivat, welches die gewünschte Aminosäureinsertion, -substitution oder -deletion aufweist.
AD4-Proteine können auch unter der Verwendung von PCR-Mutagenese, chemischer Mutagenese (Drinkwater and Klinedinst, PNAS 83:3402-3406, 1986), durch forcierte Nukleotid-Fehleinfügung (e.g., Liao and Wise Gene 88:107-111, 1990) oder durch die Verwendung von zufallsmutagenisierter Oligonukleotide (Horwitz et al., Genome 3:112-117, 1989) konstruiert werden. Besonders bevorzugte Verfahren zur Konstruktion von Alzheimer-Krankheit-Proteinen werden unten in den Beispielen detaillierter dargestellt.
Proteine können unter anderen Methoden durch Kultivieren von geeigneten Wirts- und Vektorsystemen isoliert werden, um die rekombinanten Translationsprodukte der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Überstände von solchen Zelllinien oder Protein-Einschlüsse oder ganze Zellen, wenn das Protein nicht in den Überstand ausgeschieden wird, können dann durch eine Vielzahl von Reinigungsverfahren behandelt werden, um die gewünschten Proteine zu isolieren. Zum Beispiel kann der Überstand zuerst unter der Verwendung von kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfiltern konzentriert werden, wie z. B. einer Amicon oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit. Nach der Konzentrierung kann das Konzentrat einer geeigneten Reinigungsmatrix zugeführt werden, z. B. einem Antiprotein-Antikörper, der an einen geeigneten Träger gebunden ist. Alternativ dazu können Anionen- oder Kationen-Austauschharze verwendet werden, um das Protein zu reinigen. Als eine weitere Alternative können ein oder mehrere reverse Phase High Performance Flüssigchromatographie (RP-HPLC)-Schritte angewendet werden, um das Protein weiter zu reinigen. Andere Verfahren zur Isolierung von Proteinen der vorliegenden Erfindung sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein Protein wird als „isoliert" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erachtet, wenn kein anderes (unerwünschtes) Protein gemäß SDS-PAGE-Analyse mit nachfolgender Coomassie-Blaufärbung detektiert wird. In anderen Ausführungsformen kann das gewünschte Protein isoliert werden, so dass kein anderes (unerwünschtes) Protein gemäß SDS-PAGE-Analyse mit nachfolgender Silberfärbung detektiert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Manipulation und Expression der oben beschriebenen Gene durch das Kultivieren von Wirtszellen, die einen Vektor enthalten, der zur Expression der oben beschriebenen Gene in der Lage ist, zur Verfügung. Solche Vektoren oder Vektorkonstrukte schließen entweder synthetische oder cDNA-abgeleitete Nukleinsäuremoleküle ein, die für AD4-Proteine kodieren, welche operativ mit geeigneten regulatorischen Transkriptions- oder Translations-Elementen verbunden sind. Geeignete regulatorische Elemente können von einer Vielzahl von Quellen, einschließlich bakteriellen, Pilz-, viralen, Säugetier-, Insekten- oder Pflanzengenen, abgeleitet werden. Die Selektion von geeigneten regulatorischen Elementen hängt von der gewählten Wirtszelle ab und kann leicht durch einen Fachmann erreicht werden. Beispiele für regulatorische Elemente schließen ein: einen Transkriptionspromotor und -verstärker oder eine RNA-Polymerase-Bindungssequenz, einen Transkriptionsterminator und eine ribosomale Bindungssequenz, einschließlich eines Initiationssignals der Translation.
Nukleinsäuremoleküle, die für eines der oben beschriebenen AD4-Proteine kodieren, können einfach durch eine große Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen exprimiert werden, einschließlich bakteriellen, Säugetier-, Hefe- oder anderen Pilz-, viralen, Insekten- oder Pflanzenzellen. Verfahren zur Transformation oder Transfektion solcher Zellen, damit diese fremde DNA exprimieren, sind im Stand der Technik bekannt (siehe z.B., Itakura et al., U.S. Patent Nr. 4,704,362; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978; Murray et al., U.S. Patent Nr. 4,801,542; Upshall et al., U.S. Patent Nr. 4,935,349; Hagen et al., U.S. Patent Nr. 4,784,950; Axel et al., U.S. Patent Nr. 4,399,216; Goeddel et al., U.S. Patent Nr. 4,766,075 und Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; für Pflanzenzellen siehe Czako and Marton, Plant Physiol. 104:1067-1071, 1994 und Paszkowski et al., Biotech. 24:387-392, 1992).
Bakterielle Wirtszellen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen E. coli, B. subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb des Genus Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus sowie viele andere bakterielle Spezies, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind, ein. Repräsentative Beispiele von bakteriellen Wirtszellen schließen DH5α (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) ein.
Bakterielle Expressionsvektoren umfassen bevorzugterweise einen Promotor, welcher in der Wirtszelle funktioniert, einen oder mehrere selektierbare Phänotyp-Marker und einen bakteriellen Ursprung der Replikation. Repräsentative Promotoren schließen das β-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotorsystem (siehe Chang et al., Nature 275:615, 1978), den T7-RNA-Polymerase-Promotor (Studier et al., Meth.Enzymol. 185:60-89, 1990), den Lambda-Promotor (Elvin et al., Gene 87:123-126, 1990), den trp-Promotor (Nichols und Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983) und den tac-Promotor (Russell et al., Gene 20:231, 1982) ein. Repräsentative selektierbare Marke schließen verschiedene antibiotische Resistenzmarker ein, wie z. B. die Kanamycin- oder Ampicillin-Resistenzgene. Viele Plasmide, die geeignet zur Transformation von Wirtszellen sind, sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich unter anderem pBR322 (siehe Bolivar et al., Gene 2:95, 1977), die pUC-Plasmide pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (siehe Messing, Meth. in Enzymology 101:20-77, 1983 und Vieira and Messing, Gene 19:259-268, 1982) und pNH8A, pNH16a, pNH18a und Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, Kalifornien).
Hefe- und Pilz-Wirtszellen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen unter anderem Saccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, die Genera Pichia oder Kluyveromyces und verschiedene Spezies des Genus Aspergillus ein (McKnight et al., U.S. Patent Nr. 4,935,349). Geeignete Expressionsvektoren für Hefe und Pilze schließen unter anderem YCp50 (ATCC-Nr. 37419) für Hefe und den amdS-Klonierungsvektor pV3 (Trunbull, Bio/Technology 7:169, 1989), YRp7 (Strahl et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039. 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8:121-133, 1979), pJDB249 und pJDB219 (Beggs, Nature 275:104-108, 1978) und Derivate davon ein.
Bevorzugte Promotoren zur Verwendung in Hefe schließen Promotoren von glycolytischen Hefegenen (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980; Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982) oder Alkoholdehydrogenase-Genen ein (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al. (eds.), p. 355, Plenum, New York, 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101:192-201, 1983). Beispiele für geeignete Promotoren für Pilz-Vektoren schließen diejenigen ein, die von glycolytischen Genen von Aspergillus nidulans abgeleitet wurden, wie z.B. dem adh3-Promotor (McKnight et al., EMBO J. 4:2093-2099, 1985). Die Expressionseinheiten können ebenso einen Transkriptionsterminator enthalten. Ein Beispiel für einen geeigneten Terminator ist der adh3-Terminator (Mc Knight et al., ibid., 1985).
Wie die bakteriellen Vektoren werden die Hefevektoren im allgemeinen einen selektierbaren Marker enthalten, welcher einer von einer Zahl von Genen ist, die einen dominanten Phänotyp zeigen, für welchen ein phänotypischer Assay existiert, um zu ermöglichen, dass Transformanten selektiert werden. Bevorzugte selektierbare Marker sind diejenigen, die Wirtszell-Auxotrophie ergänzen, antibiotische Resistenz zur Verfügung stellen oder eine Zelle in die Lage versetzen, spezifische Kohlenstoffquellen zu nutzen, und schließen leu2 (Broach et al., ibid.), ura3 (Botstein et al., Gene 8:17, 1979) oder his3 (Strahl et al., ibid.) ein. Andere geeignete selektierbare Marker sind das cat-Gen, welches Chloramphenicol-Resistenz auf Hefezellen überträgt.
Techniken für die Transformation von Pilzen sind in der Literatur bekannt und wurden z.B. von Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1740-1747, 1984) und Russel (Nature 301:167-169, 1983) beschrieben. Der Genotyp der Wirtszelle kann einen genetischen Defekt enthalten, der durch den selektierbaren Marker, der im Expressionsvektor anwesend ist, komplementiert wird. Die Wahl eines bestimmten Wirtes und eines selektierbaren Markers gehört zum Standardwissen des Durchschnittsfachmanns.
Protokolle für die Transformation von Hefe sind dem Durchschnittsfachmann ebenso bekannt. Z.B. kann die Transformation einfach entweder durch die Präparation von Spheroplasten von Hefe mit DNA (siehe Hinnen et al., PNAS USA 75:1929, 1978) oder durch Behandlung mit akalinen Salzen, wie z.B. LiCl (siehe Itoh et al., J. Bacteriology 153:163, 1983) erreicht werden. Die Transformation von Pilzen kann ebenso unter der Verwendung von Polyethylenglycol, wie von Cullen et al. (Bio/Technology 5:369, 1987) beschrieben, durchgeführt werden.
Virale Vektoren schließen diejenigen ein, welche einen Promotor umfassen, der die Expression eines isolierten Nukleinsäuremoleküls steuert, das für ein Alzheimer-Krankheit-Protein kodiert, wie oben beschrieben. Eine große Vielzahl von Promotoren können im Zusammenhang mit dieser Erfindung verwendet werden, einschließlich z.B. Promotoren wie MoMLV LTR, RSV LTR, Friend MuLV LTR, adenoviraler Promotor (Ohno et al., Science 265:781-784, 1994), Neomycin-Phosphotransferase-Promotor/Verstärker, später Parvovirus-Promotor (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994), Herpes-TK-Promotor, SV40-Promotor, Metallothionein IIa-Gen-Verstärker/Promotor, der direkte frühe Cytomegalovirus-Promotor und der direkte späte Cytomegalovirus-Promotor. In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der Promotor ein Gewebe-spezifischer Promotor (siehe z.B. WO 91/02805; EP 0 415 731 ; und WO 90/07936). Repräsentative Beispiele für geeignete Gewebe-spezifische Promotoren schließen den neuralen spezifischen Enolase-Promotor, den Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor β-Promotor, den Knochen-morphogenetischen Protein-Promotor, den humanen alpha 1-Chimaerin-Promotor, den Synapsin I-Promotor und den Synapsin II-Promotor ein. Zusätzlich zu den oben genannten Promotoren können andere viral-spezifische Promotoren (z.B. retrovirale Promotoren, einschließlich diejenigen wie oben angegeben, sowie andere, wie z.B. HIV-Promotoren), Hepatitis-, Herpes- (z.B. EBV) und bakterielle, Pilz- oder parasitische- (z.B. Malaria-) spezifische Promotoren verwendet werden, um auf eine spezifische Zelle oder Gewebe abzuzielen, welche mit einem Virus, Bakterien, Pilz oder Parasit infiziert ist.
Daher können AD4-Proteine der vorliegenden Erfindung von einer Vielzahl von viralen Vektoren exprimiert werden, einschließlich z.B. viralen Herpes-Vektoren (z.B. U.S. Patent Nr. 5,288,641), adenoviralen Vektoren (z.B. WO 94/26914, WO 93/9191; Kolls et al., PNAS 91(1):215-219, 1994; Kass-Eisler et al., PNAS 90(24):11498-502, 1993; Gzuman et al., Circulation 88(6):2838-48, 1993; Guzman et al., Cir. Res. 73(6):1202-1207, 1993; Zabner et al., Cell 75(2):207-216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4(4):403-409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5(10):1287-1291, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5(2):130-134, 1993; Jaffe et. al., Nat. Genet. 1(5):372-378, 1992 und Levrero et al., Gene 101(2):195-202, 1991), adeno-assozierten viralen Vektoren (WO 95/13365; Flotte et al., PNAS 90(22):10613-10617, 1993), Baculovirus-Vektoren, Parvovoirus-Vektoren (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5:457-463, 1994), Pockenvirus-Vektoren (Panicali und Paoletti, PNAS 79:4927-4931, 1982; und Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193(2);653-660, 1993) und Retroviren (z.B. EP 0 415 731 ; WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; U.S. Patent Nr. 5,2197,40; WO 93/11230; WO 93/10218). Ebenso können virale Vektoren konstruiert werden, welche eine Mischung von verschiedenen Elementen (z.B. Promotoren, Hüll-Sequenzen und ähnliches) von verschiedenen Viren oder nicht-viralen Quellen enthalten. In verschiedenen Ausführungsformen kann der virale Vektor selbst oder ein virales Partikel, das den viralen Vektor enthält, in den Verfahren und Zusammensetzungen, wie unten beschrieben, verwendet werden.
Säugetierzellen, die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen unter anderem ein: PC12 (ATCC-Nr. CRL1721), N1E-115-Neuroblastoma, SK-N-BE(2)C-Neuroblastoma, SHSY5-adrenerge Neuroblastoma, NS20Y und NG108-15 murine cholinerge Zellinien oder F2 dorsale Ratten-Wurzelganglien-Linie, COS (z.B. ATCC-Nr. CRL 1650 oder 1651), BHK (z.B. ATCC-Nr. CRL 6281); BHK 570-Zellinie (bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer CRL 10314 hinterlegt), CHO (ATCC-Nr. CCL 61), HeLa (z.B. ATCC-Nr. CCL 2), 293 (ATCC-Nr. 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) und NS-1-Zellen. Andere Säugetier-Zellinien können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Ratten-Hep I (ATCC-Nr. CRL 1600), Raten-Hep II (ATCC-Nr. CRL 1548), TCMK (ATCC-Nr. CCL 139), humane Lungen (ATCC-Nr. CCL 75.1), humane Hepatoma (ATCC-Nr. HTB-52), Hep G2 (ATCC-Nr. HB 8065), Mäuseleber (ATCC-Nr. CCL 29.1), NCTC 1469 (ATCC-Nr. CCL 9.1), SP2/0-Ag14 (ATCC-Nr. 1581), HIT-T15 (ATCC-Nr. CRL 1777) und RINm 5AHT₂B (Orskov and Nielson, FEBS 229(1):175-178, 1988).
Säugetier-Expressionsvektoren, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden einen Promotor einschließen, der in der Lage ist, die Transkription eines klonierten Gens oder cDNA zu steuern. Bevorzugte Promotoren schließen virale Promotoren und zelluläre Promotoren ein. Virale Promotoren schließen den direkten frühen Cytomegalovirus-Promotor (Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985), den direkten späten Cytomegalovirus-Promotor, SV40-Promotor (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981), MMTV LTR, RSV LTR, Metallothionein-1, Adenovirus E1a ein. Zelluläre Promotoren schließen den Maus-Metallothionein-1-Promotor (Palmiter et al., U.S. Patent Nr. 4,579,821), einen Maus V_K-Promotor (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983; Grant et al., Nucl. Acids Res. 15:5496, 1987) und einen Maus-V_H-Promotor (Loh et al., Cell 33:8-93, 1983) ein. Die Wahl des Promotors wird zumindest zum Teil vom Spiegel der gewünschten Expression oder der zu transfizierenden Empfänger-Zellinie abhängen.
Solche Expressionsvektoren können auch einen Satz von RNA-Spleiß-Stellen enthalten, die stromab von dem Promotor und stromauf von der DNA-Sequenz, die für das Peptid oder das Protein von Interesse kodiert, lokalisiert sind. Bevorzugte RNA-Spleiß-Stellen können von Adenovirus und/oder Immunoglobulin-Genen erhalten werden. In den Expressionsvektoren ist ebenso ein Polyadenylierungs-Signal enthalten, das stromab von der kodierenden Sequenz von Interesse lokalisiert ist. Geeignete Polyadenylierungs-Signale schließen die frühen oder späten Polyadenylierungs-Signale von SV40 (Kaufman und Sharp, ibid.), das Polyadenylierungs-Signal von der Adenovirus 5 E1B-Region und den Terminator des humanen Wachstumshormon-Gens (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) ein. Die Expressionsvektoren können eine nicht kodierende virale Leitsequenz enthalten, wie z.B. den dreigeteilten Adenovirus 2-Leiter, lokalisiert zwischen dem Promotor und den RNA-Spleiß-Stellen. Bevorzugte Vektoren können ebenso Verstärker-Sequenzen enthalten, wie z.B. den SV40-Verstärker und den Maus-Ig schwere Kette-Verstärker (Gillies, Cell 33:717-728, 1983) Expressionsvektoren können ebenso Sequenzen enthalten, die für Adenovirus VA-RNAs kodieren. Geeignete Expressionsvektoren können von kommerziellen Quellen (z.B. Stratagene, La Jolla, Kalifornien) erhalten werden.
Vektor-Konstrukte, die klonierte DNA-Sequenzen umfassen, können in kultivierten Säugetierzellen z.B. durch Kalziumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham und Van der Eb, Yirology 52:456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982) oder DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987) eingeführt werden. Um Zellen zu identifizieren, die die klonierte DNA stabil integriert haben, wird im allgemeinen ein selektierbarer Marker in die Zellen gemeinsam mit dem Gen oder der cDNA von Interesse eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker zur Verwendung in kultivierten Säugetierzellen schließen Gene ein, die Resistenzen gegenüber Wirkstoffen, z.B. Neomycin, Hygromycin und Methotrexat, übertragen. Der selektierbare Marker kann ein amplifizierbarer selektierbarer Marker sein. Bevorzugte amplifizierbare selektierbare Marker sind das DHFR-Gen und das Neomycin-Resistenzgen. Selektierbare Marker werden von Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, welche hierin durch Referenz eingefügt wird) besprochen.
Säugetierzellen, die einen geeigneten Vektor enthalten, wird erlaubt, für eine Zeitperiode, typischer Weise 1-2 Tage, zu wachsen, um mit der Expression der DNA-Sequenz(en) von Interesse zu beginnen. Wirkstoff-Selektion wird dann angewendet, um auf das Wachstum von Zellen zu selektieren, die den selektierbaren Marker in einer stabilen Weise exprimieren. Bei Zellen, die mit einem amplifizierbaren selektierbaren Marker transfiziert wurden, kann die Wirkstoff-Konzentration in einer schrittweisen Art erhöht werden, um für eine erhöhte Kopienzahl der klonierten Sequenzen zu selektieren, wobei die Expressionsspiegel erhöht werden. Zellen, die die eingeführten Sequenzen exprimieren, werden selektiert und auf die Produktion des Proteins von Interesse in der gewünschten Form oder bei dem gewünschten Spiegel getestet. Zellen, die diese Kriterien befriedigen, werden dann kloniert und die Produktion maßstäblich vergrößert.
Protokolle für die Transfektion von Säugetierzellen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Repräsentative Methoden schließen Kalziumphosphat-vermittelte Transfektion, Elektroporation, Lipofection, retrovirale, adenovirale und Protoplastenfusion-vermittelte Transfektion ein (siehe Sambrook et al., supra).
Zahlreiche Insektenwirtszellen, die im Stand der Technik bekannt sind, können ebenso für die vorliegende Erfindung nützlich sein, im Licht der Subjektspezifikation. Zum Beispiel wurde die Verwendung von Baculoviren als Vektoren für die Expression heterologer DNA-Sequenz in Insektenzellen von Atkinson et al. im Überblick dargestellt (Pestic. Sci. 28:215-224, 1990).
Zahlreiche Pflanzenwirtszellen, die im Stand der Technik bekannt sind, können ebenso für die vorliegende Erfindung nützlich sein, im Licht der Subjektspezifikation. Zum Beispiel wurde die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als Vektoren für die Expression also die Expression von Genen in Planzenzellen von Sinkar et al. im Überblick dargestellt (J. Biosci (Bangalore) 11:47-58, 1987).
AD4-Proteine können durch das Wachsen (typischerweise durch Kultivieren) der oben beschriebenen Wirts/Vektor-Systeme hergestellt werden, um die rekombinanten Alzheimer-Krankheit-Proteine zu exprimieren. Rekombinant hergestellte AD4-Proteine können weiter gereinigt werden, wie in größerem Detail unten beschrieben.
In verwandten Aspekten der vorliegenden Erfindung können AD4-Proteine in einem transgenen Tier exprimiert werden, dessen Keimzellen und somatische Zellen ein AD4-Gen enthalten, welches operativ mit einem Promotor verbunden ist, der effektiv für die Expression des Gens ist, und AD4-Proteine können ebenso in nicht humanen transgenen Tieren exprimiert werden, wie z. B. Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schafen, Hunden und Schweinen (siehe Hammer et al. Nature 315:680-683, 1985; Palmiter et al. Science 222:809-814, 1983; Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442, 1985; Palmiter and Brinster Cell 41:343-345, 1985 und U.S. Patent Nrn. 5,175,383; 5,087,571; 4,736,866; 5,387,742; 5,347,075; 5,221,778 und 5,175,384). Kurz gesagt wird ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül einschließt, das exprimiert werden soll, zusammen mit geeignet positionierten Expressionskontrollsequenzen in Pronuclei von fertilisierten Eiern eingeführt, z. B. durch Mikroinjektion. Die Integration der injizierten DNA wird durch Blot-Analyse von DNA von Gewebeproben detektiert. Es wird bevorzugt, dass die eingeführte DNA in die Keimlinie des Tieres eingeführt wird, so dass es an die Nachkommenschaft des Tieres weitergereicht wird. Gewebe-spezifische Expression kann durch die Verwendung eines Gewebe-spezifischen Promotors oder durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors erreicht werden, wie z. B. eines Metallothionein-Gen-Promotors (Palmiter et al., 1983, ibid), welcher regulierte Expression des Transgens erlaubt.
Vektoren der vorliegenden Erfindung können anstelle oder zusätzlich zu einem AD4-Protein, wie oben beschrieben, eine große Vielzahl von zusätzlichen Nukleinsäuremolekülen enthalten oder entweder von einem oder mehreren separaten Promotoren exprimieren. Zum Beispiel kann der virale Vektor ein Lymphokin oder einen Lymphokin-Rezeptor, eine Antisense- oder Ribozym-Sequenz oder Toxine exprimieren. Repräsentative Beispiele für Lymphokine schließen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Gamma-Interferon und Tumornekrosisfaktoren sowie deren entsprechende Faktoren ein. Repräsentative Beispiele für Antisense-Sequenzen schießen Antisense-Sequenzen ein, welche die Expression von AD4-Protinmutanten blockieren. Repräsentative Beispiele für Toxine schließen Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, Saporin, Gelonin, antivirales Kermesbeeren-Protein, Tritin, Shigella-Toxin und Pseudomonas-Exotoxin A ein.
In anderen Aspekten der Erfindung werden Antisense-Oligonukleotidmoleküle zur Verfügung gestellt, welche spezifisch die Expression von mutanten AD4-Nukleinsäuresequenzen inhibieren (siehe im allgemeinen, Hirashima et al. in Molecular Biology of RNA: New Perspectives (M. Inouye and B. S. Dudock, eds., 1987 Academic Press, San Diego, p. 401); Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression (J.S. Cohen, ed., 1989 MacMillan Press, London); Stein and Cheng, Science 261:1004-1012 (1993); WO 95/10607; U.S. 5,359,051; WO 92/06693 und EP-A2-612844). Kurz gesagt werden solche Moleküle konstruiert, die komplementär sind oder in der Lage sind, Watson-Crick-Basenpaare mit einer Region der transkribierten mutanten AD4-mRNA-Sequenz zu bilden, die eine AD4-Mutation enthält. Die resultierende Doppelstrang-Nukleinsäure interferiert mit der nachfolgenden Prozessierung der mRNA und verhindert damit Proteinsynthese.
In anderen verwandten Aspekten der Erfindung werden Ribozym-Moleküle zur Verfügung gestellt, worbei eine Antisense-Oligonukleotidsequenz in ein Ribozym eingefügt wird, welches spezifisch mRNA-Molküle spalten kann, die von einem mutanten AD4-Gen trans-kribiert werden (siehe im allgemeinen, Kim et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:8788 (1987); Haseloff, et al. Nature 234:585 (1988); Cech, JAMA 260:3030 (1988); Jeffries, et al. Nucleic Acids Res. 17:1371 (1989); U.S. 5,093,246; U.S. 5,354,855; U.S. 5,144,019; U.S. 5,272,262; U.S. 5,254,678 und U.S. 4,987,071). Gemäß diesem Aspekt der Erfindung enthält die Antisense-Sequenz, welche in ein Ribozym eingefügt ist, eine Sequenz, die komplementär ist oder in der Lage ist, Watson-Crick-Basenpaare mit einer Region der transkribierten mutanten AD4-mRNA zu bilden, die eine AD4-Mutation enthält. Die Antisense-Sequenz wird daher zu einem abzielenden Mittel für die Lieferung von katalytischer Ribozym-Aktivität, die spezifisch für mutante AD4-mRNA ist, wo solche katalytische Aktivität die mRNA spaltet, um sie dazu unfähig zu machen, nachfolgend für AD4-Proteintranslation weiterverarbeitet zu werden.
WIRTSZELLEN
Wie oben diskutiert, können Nukleinsäuremoleküle, welche für die AD4-Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren, (oder die Vektoren, welche verwandte Mutanten enthalten und/oder exprimieren) leicht in eine große Vielzahl von Wirtszellen eingeführt werden. Repräsentative Beispiele solcher Wirtszellen schließen Pflanzenzellen, eukaryotische Zellen und prokaryotische Zellen ein. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Nukleinsäuremoleküle in Zellen eines Vertebraten oder warmblütigen Tieres eingeführt, wie z. B. eine Mensch-, Makaken-, Hunde-, Rinder-, Pferde-, Schweine-, Schaf-, Ratten-, Hamster-, Maus- oder Fisch-Zelle oder einen Hybrid davon.
Bevorzugte prokaryotische Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen E. coli, Salmonella, Bacillus, Shigella, Pseudomonas, Streptomyces und andere Genera ein. Techniken für die Transformation dieser Wirte und zur Expression fremder DNA-Sequenzen, die darin kloniert sind, sind im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, welcher hierin durch Referenz eingeführt wird; oder Sambrook et al., supra). Vektoren, die zur Expression klonierter DNA-Sequenzen in bakteriellen Wirten verwendet werden, werden im allgemeinen einen selektierbaren Marker, wie z. B. ein Gen für antibiotische Resistenz, und einen Promotor enthalten, der in der Wirtszelle funktioniert. Geeignete Promotoren schließen die Promoter-Systeme trp (Nichols and Yanofsky, Meth. Enzymol. 101:155-164, 1983), lac (Casadaban et al., J. Bacteriol. 143:971-980, 1980) und Phage λ (Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2:1-10, 1983) ein. Plasmide, die zur Transformation von Bakterien nützlich sind, schließen die pUC-Plasmide (Messing, Meth. Enzymol. 101:20-78, 1983; Vieira and Messing, Gene 19:259-268, 1982), pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113, 1977), pCQV2 (Queen, ibid.) und Derivate davon ein. Plasmide können sowohl virale als auch bakterielle Elemente enthalten.
Bevorzugte eukaryotische Zellen schließen kultivierte Säugetier-Zelllinien (z. B. Nagetier- oder humane Zelllinien) und Pilzzellen einschließlich Spezies von Hefe (z. B. Saccharomyces spp., insbesondere S. cerevisiae, Schizosaccharomyces spp. oder Kluyveromyces spp.) oder filamentöse Pilze (z. B. Aspergillus spp., Neurospora spp.) ein. Stämme der Hefe Saccharomyces cerevisiae werden besonders bevorzugt. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine in einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen sind im allgemeinen im Stand der Technik bekannt (siehe "Gene Expression Technology", Methods in Enzymology, Vol. 185, Goeddel (ed.), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; siehe auch „Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Methods in Enzymology, Guthrie und Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif., 1991). Im allgemeinen wird eine Wirtszelle auf der Basis ihrer Fähigkeit, das Protein von Interesse auf einem hohen Spiegel zu produzieren, oder ihrer Fähigkeit, zumindest einige der Prozessierungsschritte, die für die biologische Aktivität des Proteins notwendig sind, auszuführen, selektiert. Auf diese Weise kann die Zahl der klonierten DNA-Sequenzen, die in die Wirtszelle eingeführt werden müssten, minimiert werden und die Gesamtausbeute an biologisch aktivem Protein maximiert werden.
Die Nukleinsäuremoleküle (oder Vektoren) können in die Wirtszellen mittels einer großen Vielzahl von Mechanismen eingeführt werden, einschließlich z. B. Kalziumphosphatvermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14:725, 1978), Lipofektion; Genwaffe (Corsaro and Pearson, Somatic Cell Gen. 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982), retrovirale, adenovirale, Protoplastenfusion-vermittelte Transfektion oder DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, 1987).
Wirtszellen, die die Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung enthalten, werden danach kultiviert, um ein wie oben beschriebenes DNA-Molekül zu exprimieren. Die Zellen werden gemäß Standardverfahren in einem Kulturmedium kultiviert, das Nährstoffe enthält, die für das Wachstum der ausgewählten Wirtszellen benötigt werden. Eine Vielzahl von geeigneten Medien sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten im allgemeinen eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien, sowie andere Komponenten, z. B. Wachstumsfaktoren oder Serum, welche von den bestimmten Wirtszellen benötigt werden können. Das Wachstumsmedium wird im allgemeinen Zellen, die das DNA-Konstrukt/die DNA-Konstrukte enthalten, durch z. B. Wirkstoffselektion oder Mangel an einem essentiellen Nährstoff selektieren, welcher durch den selektierbaren Marker auf dem DNA-Konstrukt ergänzt wird oder mit dem DNA-Konstrukt ko-transfiziert wird.
Geeignete Wachstumsbedingungen der Hefezellen schließen z. B. das Kultivieren in einem chemisch definierten Medium ein, das eine Stickstoffquelle, welche eine nicht-Aminosäure-Stickstoffquelle oder ein Hefeextrakt sein kann, anorganische Salze, Vitamine und essentielle Aminosäure-Supplemente umfaßt, bei einer Temperatur zwischen 4°C und 37°C, wobei 30°C besonders bevorzugt werden. Der pH des Mediums wird bevorzugterweise bei einem pH, der größer als 2 und kleiner als 8 ist, mehr bevorzugt bei einem pH von 5-6, gehalten. Verfahren zur Aufrechterhaltung eines stabilen pH schließen Puffern und ständige pH-Kontrolle ein. Bevorzugte Mittel zur pH-Kontrolle schließen Natriumhydroxid ein. Bevorzugte puffernde Mittel schließen Bernsteinsäure und Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) ein. Aufgrund der Tendenz von Hefewirtszellen, heterologe Proteine zu hyperglycosylieren, kann es bevorzugt sein, die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung in Hefezellen zu exprimieren, die einen Defekt in einem Gen haben, das für die Asparagin-verbundene Glycosylierung benötigt wird. Solche Zellen werden bevorzugterweise in einem Medium aufgezogen, welches einen osmotischen Stabilisator enthält. Ein bevorzugter osmotischer Stabilisator ist Sorbitol, supplementiert in das Medium mit einer Konzentration zwischen 0,1 M und 1,5 M, bevorzugterweise 0,5 M oder 1,0 M.
Kultivierte Säugetierzellen werden im allgemeinen in kommerziell erhältlichen Serumenthaltenden oder Serum-freien Medien kultiviert. Die Selektion eines Mediums und der Wachstumsbedingungen, die für die bestimmte verwendete Zelllinie geeignet sind, gehören zu den Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns.
ANTIKÖRPER
Antikörper gegen die oben diskutierten AD4-Proteine können durch die hierin zur Verfügung gestellte Offenbarung einfach hergestellt werden. Solche Antikörper können in bestimmten Ausführungsformen das Wildtyp-AD4-Protein eher als das mutante AD4-Protein, mutantes AD4-Protein eher als Wildtyp-AD4-Protein spezifisch erkennen oder Wildtyp und mutantes AD4-Protein in gleicher Weise erkennen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird verstanden, dass Antikörper monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, antiidiotyische Antikörper, Antikörper-Fragmente (z. B. Fab, und F(ab')₂, F_v variable Regionen oder Komplementaritäts-bestimmende Regionen) einschließen. Wie oben diskutiert, wird verstanden, dass Antikörper spezifisch gegen ein AD4-Protein sind, wenn sie mit einem K_a von größer als oder gleich 10^–7M, bevorzugterweise größer als oder gleich 10^–8M binden. Die Affinität eines monoklonalen Antikörpers oder Bindungpartners kann leicht von einem Durchschnittsfachmann bestimmt werden (siehe Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949).
Kurz gesagt können polyklonale Antikörper leicht von einem Durchschnittsfachmann mittels einer Vielzahl von warmblütigen Tieren generiert werden, wie z. B. Pferden, Rindern, verschiedenem Geflügel, Kaninchen, Mäusen oder Ratten. Typischerweise wird ein AD4-Protein oder einzelne AD4-Peptide von 13-20 Aminosäuren (bevorzugterweise konjugiert an Keyhole-Limpet Hämocyanin durch Vernetzung mit Glutaraldehyd) verwendet, um das Tier durch intraperitoneale, intramuskuläre, intraokulare oder subkutane Injektionen zu immunisieren, ein Adjuvans wie z. B. Freund's komplettes oder inkomplettes Adjuvans („Freund's complete or incomplete adjuvant"). Nach mehreren Booster-Immunisierungen werden Proben des Serums gesammelt und auf Reaktivität gegenüber dem AD4-Protein getestet. Besonders bevorzugte polyklonale Antisera werden ein Signal in einem dieser Assays geben, das mindestens dreimal stärker ist als der Hintergrund. Wenn der Titer des Tieres ein Plateau in Bezug auf die Reaktivität des Proteins erreicht hat, können größere Quantitäten von Antisera leicht durch entweder wöchentliche Blutungen oder durch Exsanguination erhalten werden.
Monoklonale Antikörper können leicht durch konventionelle Techniken generiert werden (siehe U.S. Patent Nummern RE 32,011; 4,902,614; 4,543,439 und 4,411,993, welche hierin durch Referenz eingefügt werden; siehe auch Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, und Bechtol (eds.), 1980, und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, welche hierin ebenso durch Referenz eingefügt werden).
Kurz gesagt wird in einer Ausführungsform ein Subjekt-Tier, wie z. B. eine Ratte oder eine Maus, mit einem AD4-Protein oder einem Teil davon, wie oben beschrieben, injiziert. Das Protein kann mit einem Adjuvans, wie z. Freund's komplettes oder inkomplettes Adjuvans, vermischt sein, um die resultierende Immunantwort zu erhöhen. Zwischen einer und drei Wochen nach der initialen Immunisierung kann das Tier mit einer weiteren Booster-Immunisierung reimmunisiert werden und unter der Verwendung der oben beschriebenen Assays auf Reaktivität gegenüber dem Protein getestet werden. Nachdem das Tier ein Plateau in seiner Reaktivität auf das injizierte Protein erreicht hat, wird es geopfert und Organe, welche große Zahlen an B-Zellen enthalten, wie z. B. die Milz und die Lymphknoten, werden geerntet.
Zellen, welche von dem immunisierten Tier erhalten werden, können durch Transfektion mit einem Virus, wie z. B. dem Epstein-Barr-Virus (EBV) (siehe Glasky and Reading, Hybridoma 8(4):377-389, 1989) immortalisiert werden. Alternativ dazu werden in einer bevorzugten Ausführungsform die geernteten Milz- und/oder Lymphknoten-Zellsuspensionen mit einer geeigneten Myeloma-Zelle fusioniert, um eine „Hybridoma" zu kreieren, welche monoklonale Antikörper sekretiert. Geeignete Myeloma-Linien schließen z. B. NS-1 (ATCC-Nr. TIB 18) und P3X63-Ag 8.653 (ATCC-Nr. CRL 1580) ein.
Nach der Fusion werden die Zellen in Kulturplatten gegeben, die geeignetes, wie z. B. RPMI 1640 oder DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagles-Medium) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) sowie zusätzliche Inhaltsstoffe Medium enthalten, wie z. B. fötales bovines Serum (FBS, d. h. von Hyclone, Logan, Utah oder JRH Biosciences). Zusätzlich sollte das Medium ein Reagenz enthalten, welches selektiv das Wachstum von fusionierten Milz- und Myeloma-Zellen erlaubt, wie z. B. HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Nach ungefähr sieben Tagen werden die resultierenden fusionierten Zellen oder Hybridoma getestet, um die Anwesenheit von Antikörpern, welche reaktiv gegenüber einem AD4-Protein sind, zu bestimmen. Eine große Vielzahl von Assays können verwendet werden, um die Anwesenheit der Antikörper, welche reaktiv gegenüber den Proteinen der vorliegenden Erfindung sind, zu bestimmen, einschließlich z. B. Gegenstrom-Immunoelektrophorese, Radioimmunoassays, Radioimmunopräzipitationen, Emzymverbundene Immunosorbent Assays (ELISA), Dot-Blot-Assays, Western-Blots, Immunopräzipitation, Inhibierungs- oder Kompetitions-Assays und Sandwich-Assays (siehe U.S. Patent Nrn. 4,376,110 und 4,486,530; siehe auch Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Nach mehreren klonalen Verdünnungen und Reassays kann eine Hybridoma, die Antikörper, die reaktiv gegen das AD4-Protein sind, isoliert werden.
Es können auch andere Techniken verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu konstruieren (siehe William D. Huse et al., „Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246:1275-1281, Dezember 1989; siehe auch L. Sastry et al., „Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia Coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Sibrary," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, August 1989; siehe auch Michelle Alting-Mees et al., „Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas," Strategies in Molecular Biology 3:1-9, January 1990; diese Referenzen beschreiben ein kommerzielles System, welches von Stratacyte, La Jolla, Kalifornien, erhältlich ist, welches die Produktion von Antikörpern durch rekombinante Techniken ermöglicht). Kurz gesagt wird mRNA von einer B-Zell-Population isoliert und verwendet, um Immunoglobulin-cDNA-Expressionsbibliotheken von schweren und leichten Ketten in den λImmunoZap(H)- und λImmunoZap(L)-Vektoren zu erzeugen. Diese Vektoren können individuell getestet werden oder ko-exprimiert werden, um Fab-Fragmente oder Antikörper zu bilden (siehe Huse et al., supra; siehe auch Sastry at al., supra). Positive Plaques können nachfolgend in ein nicht lytisches Plasmid umgewandelt werden, welches die Expression von hohen Spiegeln an monoklonalen Antikörper-Fragmenten aus E. coli erlaubt.
Gleichermaßen können Teile oder Fragmente, wie z. B. Fab- oder Fv-Fragmente, von Antikörpern unter der Verwendung von konventionellem enzymatischem Verdau oder rekombinanten DNA-Techniken konstruiert werden, um die variablen Regionen eines Gens, welches für einen spezifischen Bindungs-Antikörper kodiert, einzufügen. In einer Ausführungsform werden die Gene, welche für die variable Region einer Hybridoma, die einen monoklonalen Antikörper von Interesse produziert, kodieren, unter der Verwendung von Nukleotidprimern für die variable Region amplifiziert. Diese Primer können von einem Durchschnittsfachmann synthetisiert werden oder können von kommerziell erhältlichen Quellen gekauft werden. Stratacyte (La Jolla, Kalifornien) verkauft Primer für variable Maus- und variable humane Regionen, einschließlich u. a. Primer für V_Ha, V_Hb, V_Hc, V_Hd, C_H1, V_L, und C_L-Regionen. Diese Primer können verwendet werden, um variable Regionen der leichten oder schweren Kette zu amplifizieren, welche dann in Vektoren eingefügt werden können, wie z. B. ImmunoZAP^TM H bzw. ImmunoZAP^TM L (Stratacyte). Diese Vektoren können dann in E. coli, Hefe oder Säugetier-basierte Systeme zur Expression eingeführt werden. Unter Verwendung dieser Techniken können große Mengen an Einzelketten-Protein, das eine Fusion der V_H und V_L-Domänen enthält, produziert werden (siehe Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Zusätzlich können solche Techniken verwendet werden, um einen „murinen" Antikörper in einen „humanen" Antikörper umzuwandeln, ohne die Bindungspezifität des Antikörpers zu verändern.
Nachdem geeignete Antikörper erhalten wurden, können sie durch viele Techniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, isoliert oder gereinigt werden (siehe Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press 1988). Geeignete Techniken schließen Peptid- oder Protein-Affinitätssäulen, HPLC oder RP-HPLC, Reinigung an Protein A- oder Protein B-Säulen oder jede Kombination dieser Techniken ein.
Antikörper der vorliegenden Erfindung haben viele Anwendungen. Zum Beispiel können Antikörper in der Durchflußzytometrie verwendet werden, um Zellen zu sortieren, die ein solchen AD4-Protein tragen. Kurz gesagt können die Zellen, um das Protein oder Peptid von Interesse auf den Zellen zu detektieren, mit einem markierten monoklonalen Antikörper inkubiert werden, welcher spezifisch an das Protein von Interesse bindet, gefolgt durch Detektion der Anwesenheit des gebundenen Antikörpers. Diese Schritte können ebenso durch zusätzliche Schritte erreicht werden, wie z. B. Waschschritte zur Entfernung von ungebundenem Antikörper. Markierungen, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich u. a. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Meerrettich-Peroxidase (HRP) und kolloidales Gold. Insbesondere bevorzugt für die Verwendung in der Durchflusszytometrie ist FITC, welches gemäß der Methode von Keltkamp in „Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. I. Experiments on the Conditions of Conjugation", Immunology 18:865-873, 1970, an gereinigte Antikörper konjugiert werden kann. (siehe auch Keltkamp, „Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. II. A Reproducible Method," Immunology 18:875-881, 1970; Goding, "Conjugation of Antibodies with Fluorochromes; Modification to the Standard Methods," J. Immunol. Methods 13:215-226, 1970.).
ASSAYS
Assays, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen diejenigen Assays zur Detektion von Agonisten oder Antagonisten von AD4-Proteinaktivität ein. Andere Assays sind nützlich für das Screening von Peptid-Bibliotheken oder von Bibliotheken organischer Moleküle. Noch andere Assays sind nützlich für die Identifizierung und/oder Isolierung von Nukleinsäuremolekülen und/oder Peptiden in der vorliegenden Erfindung oder für die Diagnose eines Patienten mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit der Erkrankung an Alzheimer-Krankheit.
A. Nukleinsäure-basierende diagnostische Tests
Kurz gesagt stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Sonden und Primer für die Detektion der AD4-Gene und/oder deren Mutanten zur Verfügung. In einer Ausführungsform dieses Aspekts werden Sonden zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, spezifisch an RNA oder DNA des AD4-Gens zu hybridisieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Sonden „in der Lage", an AD4-Gene DNA oder RNA „zu hybridisieren", wenn sie an ein AD4-Gen unter Bedingungen von entweder hoher oder moderater Stringenz (siehe Sambrook et al., supra) hybridisieren, aber nicht signifikant oder detektierbar an das AD3-Gen hybridisieren. Bevorzugterweise kann die Sonde verwendet werden, um an geeignete Nukleotidsequenzen unter Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren, wie z. B. 5x SSPE, 1x Denhardt's Lösung (Sambrook et al., supra), 0,1% SDS bei 65°C und mindestens einem Waschschritt, um Überschuss an Sonde in der Anwesenheit von 0,2x SSC, 1x Denhardt's Lösung, 0,1% SDS bei 65°C zu entfernen. Außer wenn es hierin anderweitig dargestellt wird, sind die Sondenä-Sequenzen so ausgeführt, dass Hybridisierung an AD4-Gene, aber nicht an DNA- oder RNA-Sequenzen von anderen Genen, wie z. B. AD3, erlaubt ist. Die Sonden werden z. B. verwendet, um an Nukleinsäure zu hybridisieren, welche in einer biologischen Probe anwesend ist, die von einem Patienten isoliert wurde. Die hybridisierte Sonde wird dann detektiert, wobei die Anwesenheit der gewünschten zellulären Nukleinsäure angezeigt wird. Bevorzugterweise wird die zelluläre Nukleinsäure vor der Hybridisierung einer Amplifizierungsprozedur unterzogen, wie z. B. PCR. Alternativ dazu kann das AD4-Gen amplifiziert werden und das amplifizierte Produkt einer DNA-Sequenzierung unterzogen werden. Mutanten von AD4 können durch DNA-Sequenzanalyse oder Hybridisierung mit Allel-spezifischen Oligonukleotid-Sonden unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend sind, um Hybridiesierung an das spezifische Allel zu erlauben, detektiert werden. Typischerweise werden der Hybridisierungspuffer und die Wasch-Lösung Tetramethylammoniumchlorid oder ähnliches (siehe Sambrook et al., supra) enthalten.
Nukleinsäuresonden der vorliegenden Erfindung können entweder aus Deoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), Nukleinsäure Analoga (z. B. Peptidnukleinsäure) oder einer Kombination davon aufgebaut sein und können so wenige wie ungefähr 12 Nukleotide lang, gewöhnlicherweise ungefähr 14 bis 18 Nukleotide lang und möglicherweise so groß wie die gesamte Sequenz eines AD4-Gens sein. Die Selektion der Sondengröße hängt etwas von der Verwendung der Sonde ab und gehört zu den Fähigkeiten des Fachmanns.
Geeignete Sonden können unter der Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, konstruiert und markiert werden. Kürzere Sonden von z. B. 12 Basen können synthetisch generiert werden und unter der Verwendung von T₄-Polynukleotidkinase mit ³²P markiert werden. Längere Sonden von ungefähr 75 Basen bis weniger als 1,5 kb werden bevorzugterweise durch z. B. PCR-Amplifizierung bei Anwesenheit von markierten Vorläufern generiert, wie z. B. [α-³²P]dCTP, Digoxigenin-dUTP oder Biotin-dATP. Sonden von mehr als 1,5 kb werden im allgemeinen am einfachsten durch Transfizieren einer Zelle mit einem Plasmid, das die relevante Sonde enthält, Wachsen der transfizierten Zelle in großen Quantitäten und Reinigen der relevanten Sequenz aus den gentranfizierten Zellen amplifiziert. (Siehe Sambrook et al., supra.)
Sonden können durch eine Vielzahl von Markern markiert werden, einschließlich z. B. radioaktiven Markern, fluoreszierenden Markern, enzymatischen Markern und chromogenen Markern. Die Verwendung von ³²P wird insbesondere für die Kennzeichnung oder Markierung einer bestimmten Sonde bevorzugt.
Es ist ein Merkmal dieses Aspekts der Erfindung, dass Sonden verwendet werden, um die Anwesenheit von AD4-mRNA oder -DNA in einer Probe zu detektieren. Wenn jedoch die Nukleinsäure nur in einer limitierten Zahl vorhanden ist, kann es nützlich sein, die relevante Sequenz zu amplifizieren, so dass sie einfacher detektiert oder erhalten werden kann.
Eine Vielzahl von Verfahren kann verwendet werden, um eine selektierte Sequenz zu amplifizieren, einschließlich z. B. RNA-Amplifizierung (siehe Lizardi et al., Bio/Technology 6:1197-1202, 1988; Kramer et al., Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clinical Chem. 35(9):1826-1831, 1989; U.S. Patent Nr. 4,786,600) und DNA-Amplifizierung unter der Verwendung von LCR oder Polymerase-Kettenreaktion („PCR") (siehe U.S. Patent Nrn. 4,683,195; 4,683,202 und 4,800,159) (siehe auch U.S. Patent Nrn. 4,876,187 und 5,011,769, welche ein alternatives Detektions/Amplifizierung-System, umfassend die Verwendung von spaltbaren Verbindungen, beschreibt) oder andere Nukleinsäure-Amplifizierungsverfahren, welche zum Standardwissen des Durchschnittsfachmanns gehören. In Bezug auf PCR kann das Verfahren, z. B. wie im Stand der Technik bekannt, modifiziert werden. Verstärkung der Transkription von PCR kann durch die Einfügung von RNA-Polymerase-Promotorsequenzen des Bakteriophagen T7 in eines der primären Olionukleotide erreicht werden und immunoenzymatische Detektion der Produkte der verstärkten Emitter kann unter der Verwendung von anti-RNA:DNA-Antikörpern beeinflusst werden (Blais, Appl. Environ. Microbiol. 60:348-352, 1994). PCR kann auch in Kombination mit Reverse-Dot-Blot-Hybridisierung verwendet werden (Iida et al., FEMS Microbiol. Lett. 114:167-172,1993). PCR-Produkte können durch Einführung von dUTP quantitativ analysiert werden (Duplàa et al., Anal. Biochem. 212:229-236, 1993) und Proben können für die PCR-Gen-Sonden-Detektion filtriert werden (Bej et al., Appl. Environ. Microbiol. 57:3529-3534, 1991).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird PCR-Amplifizierung verwendet, um DNA des AD4-Gens zu detektieren. Kurz gesagt wird, wie detaillierter unten beschrieben, eine DNA-Probe bei 95°C denaturiert, um Einzelstrang-DNA zu generieren. Spezifische Primer werden dann an die Einzelstrang-DNA bei 37°C bis 70°C angelagert, in Abhängigkeit vom Verhältnis von AT/GC in den Primern. Die Primer werden bei 72°C mit Taq-DNA-Polymerase verlängert, um den Gegenstrang der Matrize zu generieren. Diese Schritte stellen einen Zyklus dar, welcher wiederholt werden kann, um die selektierte Sequenz zu amplifizieren.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform wird LCR-Amplifizierung für die Amplifizierung verwendet. LCR-Primer werden synthetisiert, so dass die 5'-Base des stromauf-Primers in der Lage ist, an ein einzelnes Basenpaar in einem gewünschten Gen zu hybridisieren, um spezifisch ein AD4-Gen zu detektieren.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Sonden in einer automatisierten nicht-isotopischen Strategie verwendet, wobei Target-Nukleinsäuresequenzen durch PCR amplifiziert werden und danach gewünschte Produkte durch einen kolorimetrischen Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) bestimmt werden (Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:8923-8927, 1990).
Primer für die Amplifizierung einer selektierten Sequenz sollten aus Sequenzen ausgewählt werden, die für AD4 (und nicht AD3) hoch spezifisch sind und stabile Duplexe mit der Target-Sequenz bilden. Die Primer sollten auch nicht-komplementär sein, insbesondere am 3'Ende, sollten keine Dimere mit sich selbst oder anderen Primern bilden und sollten keine sekundären Strukturen oder Duplexe mit anderen Regionen der DNA bilden. Im allgemeinen sind Primer von ungefähr 18 bis 20 Nukleotiden bevorzugt und können einfach unter der Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, synthetisiert werden. PCR-Produkte und andere Nukleinsäure-Amplifizierungs-Produkte können unter Verwendung von Techniken quantifiziert werden, die im Stand der Technik bekannt sind (Duplàa et al., Anal. Biochem. 212-229-236, 1993; Higuchi et al., Bio/Technology 11:1026-1030.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird Restriktionsenzym-Analyse verwendet, um ein mutantes AD4-Gen zu detektieren. Zum Beispiel kreiert in einer Ausführungsform die N141I-Mutation in AD4 eine Sau3A I-Restriktionsstelle. cDNA, genomische DNA oder amplifizierte AD4-cDNA oder genomische DNA wird mit Sau3A I geschnitten. Wenn das AD4-Gen die N141I-Veränderung enthält, wird das Sau3A I-Fragment oder das amplifizierte Produkt, das Codon 141 enthält, in zwei kleinere Fragmente geschnitten werden. Die Spaltung wird einfach durch Elektrophorese in Agarose oder Acrylamid-Gelen detektiert und durch Ethidiumbromid-Fluoreszenz oder Sonden-Hybridisierung unter Verwendung von AD4-Genfragmenten oder Oligonukleotiden visualisiert.
B. Antikörper-basierte diagnostische Tests
Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Antikörper, wie oben diskutiert, für die Detektion von AD4-Genprodukten in diagnostischen Tests zur Verfügung. Eine Vielzahl von Assays kann verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, die spezifisch an das gewünschte Protein oder Peptid binden. Exemplarische Assays sind im Detail in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 beschrieben. Rspräsentative Beispiele für solche Assays schließen ein: Gegenstrom-Immunoelektrophorese (CIEP), Radioimmunoassays, Radioimmunopräzipitationen, Enzym-verbundene Immunosorbent Assays (ELISA), Dot-Blot-Assays, Inhibierungs- oder Kompetitions-Assays und Sandwich-Assays, Immunostab (Meßstab)-Assays, simultane Immunoassays, Immunochromatographische Assays, Immunofiltrations-Assays, Latex-Kugel-Agglutinations-Assays, immunofluoreszierende Assays, Biosensor-Assays und niedrig-Licht-Detektions-Assays ("low-light detection assays") (siehe U.S. Patent Nrn. 4,376,110 und 4,486,530; siehe auch Antibodies: A Laboratory Manual, supra).
Ein fluoreszierender Antikörper-Test (FA-test) verwendet einen Fluoreszenz-markierten Antikörper, der in der Lage ist, an eines der Proteine der Erfindung zu binden. Für die Detektion werden visuelle Bestimmungen von einem Techniker unter der Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie gemacht, was zu einem qualitativen Ergebnis führt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Assay für die Untersuchung von Gewebeproben und histologischen Sektionen verwendet.
In Latex-Kugel-Agglutinations-Assays werden Antikörper gegen eines oder mehrere Proteine der vorliegenden Erfindung an Latex-Kugeln konjugiert. Die Antikörper, die an Latex-Kugeln konjugiert sind, werden dann mit einer Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die den Antikörpern erlaubt, an die gewünschten Proteine in der Probe, sofern vorhanden, zu binden. Die Ergebnisse werden dann visuell abgelesen, was zu einem qualitativen Ergebnis führt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann dieses Format zur Testung vor Ort verwendet werden.
Enzym-Immuno-Assays (EIA) schließen eine Reihe von verschiedenen Assays ein, die imstande sind, Antikörper zu verwenden, die durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt werden. So verwendet z. B. ein heterogener indirekter EIA eine feste Phase, die an einen Antikörper der Erfindung gekoppelt ist, und eine Affinitäts-gereinigte anti-IgG-Immunoglobulin-Präparation. Bevorzugterweise ist die feste Phase eine Polystyrol-Mikrotiter-Platte. Die Antikörper und die Immunoglobulin-Präparation werden dann mit der Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die Antikörperbindung erlauben, wobei diese Bedingungen im Stand der Technik bekannt sind. Die Ergebnisse eines solchen Assays können visuell abgelesen werden, werden aber bevorzugterweise unter Verwendung eines Spektrophotometers abgelesen, wie z. B. eines ELISA-Plattenlesegerätes, um ein quantitatives Ergebnis zu erhalten.
Ein alternatives Festphasen-EIA-Format schließt Plastik-beschichtete Eisenmetall-Kugeln ein, die in der Lage sind, während der Verfahren des Assays durch die Mittel eines Magneten bewegt zu werden. Eine noch andere Alternative ist ein niedrig-Licht-Detektion-Immunoassay-Format (low-light detection immunoassay format). In diesem sehr sensitivem Format wird die Lichtemission, die durch geeignet markierte gebundene Antikörper produziert wird, automatisch quantifiziert. Bevorzugterweise wird die Reaktion unter Verwendung von Mikrotiter-Platten durchgeführt.
In einem Fänger-Antikörper-Sandwich-Enzyme-Assay ist das gewünschte Protein zwischen einem Antikörper, der an eine feste Phase, bevorzugterweise eine Polystyrol-Mikrotiter-Platte, angeheftet ist und einen markierten Antikörper gebunden. Bevorzugterweise werden die Ergebnisse unter Verwendung eines Spektrophotometers, wie z. B. eines ELISA-Plattenlesegeräts, gemessen.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein radioaktiver Tracer für die Enzym-vermittelte Detektion in einem EIA substituiert, um einen Radioimmuno-Assay (RIA) zu produzieren.
In einem sequenziellen Assay-Format wird den Reagenzien erlaubt, mit dem Fänger-Antikörper in einer schrittweisen Art zu inkubieren. Die Testprobe wird zuerst mit dem Fänger-Antikörper inkubiert. Nach einem Waschschritt folgt eine Inkubation mit dem markierten Antikörper. In einem simultanen Assay werden die zwei beschriebenen Inkubationsperioden des sequenziellen Assays kombiniert. Dies eliminiert eine Inkubationsperiode plus einen Waschschritt.
Ein Meßstab/Immunostab-Format ist im wesentlichen ein Immunoassay, außer dass die feste Phase nicht eine Polystyrol-Mikrotiter-Platte ist, sondern ein Polystyrol-Paddel oder – Meßstab. Die Reagenzien sind die gleichen und das Format kann entweder simultan oder sequenziell sein.
In einem chromatographischen Streifentest-Format werden ein Fänger-Antikörper und ein markierter Antikörper auf einem chromatographischen Streifen getrocknet, welcher typischerweise Nitrozellulose oder Nylon von hoher Porosität gebunden an Zelluloseacetat ist. Der Fänger-Antikörper wird gewöhnlicherweise als eine Linie an einem Ende des Streifens Spray-getrocknet. An diesem Ende befindet sich ein absorbierendes Material, das in Kontakt mit dem Streifen ist. Am anderen Ende des Streifens wird der markierte Antikörper auf eine Weise abgelagert, die verhindert, dass er in die Membran absorbiert wird. Gewöhnlicherweise ist die Markierung, die an den Antikörper angeknüpft ist, eine Latex-Kugel oder kolloidales Gold. Der Assay kann durch Aufbringen der Probe unmittelbar vor dem markierten Antikörper initiiert werden.
Immunofiltrations/Immunokonzentrations-Formate kombinieren eine große Festphasenoberfläche mit gerichtetem Fluss von Probereagenzien, welche die Bindung von Antigen an Antikörper konzentriert und beschleunigt. In einem bevorzugten Format wird die Testprobe mit einem markierten Antikörper präinkubiert und dann auf die Festphase, wie z. B. Faserfilter oder Nitrozellulose-Membranen oder ähnliches, aufgebracht. Die Festphase kann auch mit Latex- oder Glas-Kugeln, die mit Fänger-Antikörper beschichtet sind, vorbeschichtet sein. Die Detektion von Analyt erfolgt auf die gleiche Weise wie im Standard-Immunoassay. Der Fluß von Probe/Reagenzien kann entweder durch Vakuum oder den Docht-Effekt eines unterliegenden absorbierenden Materials moduliert werden.
Ein Schwellen-Biosensor-Assay ist ein sensitiver, instrumentierter Assay, der für das Screening von großen Zahlen an Proben bei niedrigen Kosten geeignet ist. In einer Ausführungsform umfasst ein solcher Assay die Verwendung von leicht adressierbaren potentiometrischen Sensoren, wobei die Reaktion die Detektion einer pH-Änderung aufgrund der Bindung des gewünschten Proteins durch Fänger-Antikörper, Brücken-Antikörper oder Urease-konjugierte Antikörper beinhaltet. Nach der Bindung wird eine pH-Änderung hervorgerufen, welche durch Übersetzung in ein elektrisches Potential (μVolt) messbar ist. Dieser Assay wird typischerweise in einem sehr kleinen Reaktionsvolumen durchgeführt und ist sehr sensitiv. Weiterhin ist das berichtete Detektionslimit des Assays 1000 Moleküle Urease pro Minute.
C. Andere Assays
Transmembranrezeptoren sind in viele zelluläre Kommunikationsprozesse involviert und sind die Ziele von zahlreichen pharmakologischen Screening-Assays für die Identifizierung und Entwicklung von neuen therapeutischen Mitteln. Viele dieser Screening-Assays schauen auf Liganden-induzierte Veränderungen in Zelllinien, die rekombinanten Rezeptor exprimieren. In einigen Fällen werden sekundäre Botenstoffe („second messengers") direkt getestet, während in anderen der Rezeptor in eine Zelllinie tranfiziert wird, die ein Rezeptorgen-Konstrukt enthält, dessen Expressionsspiegel durch funktionelle Aktivierung des Rezeptors (positiv oder negativ) beeinflußt werden kann. Ein übliches Ergebnis der Stimulierung von vielen verschiedenen „second messenger"-Systemen sind transiente Veränderungen der intrazellulären Kalizum-Homeostase. Dies kann das Ergebnis der Ca++-Freisetzung von verschiedenen intrazellulären Kompartimenten oder des Einstroms extrazellulären Kalziums sein.
Kalzium-Transienten bieten eine sehr sensitive und selektive Methode für die Charakterisierung der AD4-Genfunktion. Die Expression von rekombinantem AD4 in Zelllinien, die zuvor mit einem Aequorin-Reporter-Konstrukt transferiert wurden, kann verwendet werden, um einen AD4-Liganden zu testen und zu identifizieren. Aequorin ist ein 21 kDa-Photoprotein, das nach Ca++-Bindung eine irreversible Reaktion begleitet von der Produktion von Licht im sichtbaren Bereich durchmacht. Weil die Anteilsrate des Aequorin-Verbrauchs proportional zum physiologischen [Ca++] ist, wurde es für viele Jahre als ein sensitiver Indikator für intrazelluläres Kalzium verwendet. Kürzlich wurden mehrere verschiedene Aequorin-cDNAs entwickelt, welche das selektive Abzielen der Aequorin-Expression in verschiedenen intrazellulären Kompartimenten erlaubt, einschließlich des Zytoplasmas, des Kerns und des endoplasmatischen Retikulums. Dies erlaubt, dass eine Vielzahl von „second messenger"-gekoppelten Stoffwechselwegen/Kompartimenten geteset wird.
Daher kann in einer Ausführungsform eine Zelllinie, welche mutantes AD4 exprimiert, verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, welche die mutante Proteinfunktion auf eine Weise modifizieren, die Wildtyp-AD4-Aktivität imitiert.
MARKIERUNGEN
AD4-Proteine, Nukleinsäuremoleküle, welche für solche Proteine kodieren, anti-AD4-Protein-Antikörper und Agonisten oder Antagonisten, wie oben und nachfolgend beschrieben, können mit einer Vielzahl von Molekülen markiert werden, einschließlich z. B. fluoreszierenden Molekülen, Toxinen und Radionukliden. Repräsentative Beispiele von fluoreszierenden Molekülen schließen Fluorescein, Phycobili-Proteine, wie z. B. Phycoerythrin, Rhodamin, Texas-Rot und Luciferase ein. Repräsentative Beispiele für Toxine schließen Ricin, Abrin, Diphtherie-Toxin, Cholera-Toxin, Gelonin, antivirales Kermesberen-Protein, Tritin, Shigella-Toxin und Pseudomonas Exotoxin A ein. Repräsentative Beispiele für Radionuklide schließen Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 und Bi-212 ein. Zusätzlich können die oben beschriebenen Antikörper auch markiert sein oder an einen Partner eines Liganden-Bindungspaares konjugiert sein. Repräsentative Beispiele schließen Avidin-Biotin und Riboflavin-Riboflavin-Bindungsprotein ein.
Verfahren zur Konjugierung oder Markierung der AD4-Proteine, Nukleinsäure-Moleküle, welche für solche Proteine kodieren, anti-AD4-Protein-Antikörper und Agonisten oder Antagonisten, wie oben diskutiert, mit den repräsentativen Markierungen, wie oben dargestellt, könnten einfach von einem Durchschnittsfachmann erreicht werden (siehe Trichothecene Antibody Conjugate, U.S. Patent Nr. 4,744,981; Antibody Conjugate, U.S. Patent Nr. 5,106,951; Fluorogenic Materials and Labeling Techniques, U.S. Patent Nr. 4,018,884; Metal Radionuclide Labeled Proteins for Diagnosis and Therapy, U.S. Patent Nr. 4,897,255; und Metal Radionuclide Chelating Compounds for Improved Chelation Kinetics, U.S. Patent Nr. 4,988,496; siehe auch Inman, Methods In Enzymology, Vol. 34, Affinity Techniques, Enzyme Purification: Part B, Jakoby and Wilchek (eds.), Academic Press, New York, p. 30, 1974; siehe auch Wilchek and Bayer, „The Avidin-Biotin Complex in Bioanalytical Applications," Anal. Biochem. 171:1-32, 1988).
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
Wie oben erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung auch eine Vielzahl von pharmazeutischen Zusammensetzungen, umfassend eines der oben beschriebenen AD4-Proteine, Nukleinsäure-Moleküle, Vektoren, Antikörper, Wirtszellen, Agonisten oder Antagonisten, zusammen mit einem pharmazeutischen oder physiologisch akzeptablen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel zur Verfügung. Im allgemeinen sollen solche Träger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen für den Empfänger nicht toxisch sein. Gewöhnlicherweise bringt die Präparation solcher Zusammensetzungen das Kombinieren des therapeutischen Mittels mit Puffern, Antioxidantien, wie z. B. Ascorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als ungefähr 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten, einschließlich Glukose, Sucrose oder Dextrine, gelatierende Mittel, wie z. B. EDTA, Glutathion und andere Stabilisatoren und Hilfsstoffe, mit sich. Neutrale gepufferte Saline oder Saline gemischt mit nicht spezifischem Serumalbumin sind exemplarische geeignete Verdünnungsmittel.
Zusätzlich können die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung für die Verabreichung auf einer Vielzahl von verschiedenen Wegen hergestellt werden, obwohl die intrakraniellen Wege bevorzugt werden. Zusätzlich können pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in Behältnisse zusammen mit Verpackungsmaterial gegeben werden, welches Instruktionen in Bezug auf die Verwendung von solchen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verfügung stellt. Im allgemeinen werden solche Instruktionen eine konkrete Äußerung enthalten, welche die Reagenzien-Konzentration beschreibt sowie in bestimmten Ausführungsformen relative Mengen an Hilfsstoff-Inhaltsstoffen oder Verdünnungsmittel (z. B. Wasser, Saline oder PBS), welche notwendig sein können, um die pharmazeutische Zusammensetzung wiederherzustellen.
VERFAHREN ZUR BEHANDLUNG ODER VORBEUGUNG DER ALZHEIMER-KRANKHEIT
Die vorliegende Erfindung stellt auch Methoden für die Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit zur Verfügung, die für die Verabreichung eines Vektors (z. B. Expressionsvektor, viraler Vektor oder virales Partikel, enthaltend einen Vektor) oder eines Nukleinsäuremoleküls allein, wie oben beschrieben, an einen Patienten geeignet sind, wobei die Wahrscheinlichkeit von Alzheimer-Krankheit reduziert wird oder der Ausbruch von Alzheimer-Krankheit verzögert wird.
Gleichermaßen können therapeutische Peptide, Peptidomimetika oder kleine Moleküle verwendet werden, um den Ausbruch der Alzheimer-Krankheit zu verzögern, die Symptome zu verhindern oder das Fortschreiten der Krankheit aufzuhalten oder zu verzögern. Solche Therapeutika sind für das Testen in einem transgenen Tiermodell, welches mutantes Protein, Wiltyp- und mutantes Protein exprimiert, oder für das Testen in einem in vitro Assay-System geeignet.
Ein solches in vitro Assay-System misst die Menge an hergestelltem Amyloid-Protein. Kurz zur Illustration, eine Zelle, die das AD4-Gen-Produkt und Amyloid exprimiert, wird bei Anwesenheit eines Kandidaten eines therapeutischen Moleküls kultiviert. Das von der Zelle exprimierte AD4-Protein kann entweder Wildtyp oder mutantes Protein sein. In jedem Fall wird die Menge an produziertem Amyloid-Protein der Zellen gemessen, welche mit oder ohne (Kontrolle) dem therapeutischen Kandidaten inkubiert werden. Kurz als Beispiel, Zellen werden in Medium, das ³⁵S-Methionin enthält, markiert und bei Anwesenheit (oder Abwesenheit) des therapeutischen Kandidaten inkubiert. Amyloid-Protein wird im Kulturüberstand durch Immunopräzipitation und SDS-PAGE-Elektrophorese oder durch ELISA detektiert. Eine statistisch signifikante Reduktion von Amyloid-Protein im Vergleich zur Kontrolle deutet auf ein Therapeutikum hin, das geeignet ist zur Anwendung in der Vorbeugung oder Behandlung der Alzheimer-Krankheit.
Alternativ dazu können transgene Tiere, die Alzheimer-Krankheit-Protein exprimieren, verwendet werden, um Kandidaten-Therapeutika zu testen. Amyloid-Protein wird gemessen, oder, in dem Fall dass die Tiere andere Krankheitssymptome zeigen, wie z. B. Gedächtnis oder Lernverlust, wird eine Steigerung des Gedächtnisses oder Lernens gemessen. Gedächtnis und Lernen werden in Nagetieren durch das Morris-Wasser-Labyrinth („Morris water maze") (Stewart and Morris in Behavioral Neuroscience, R. Saghal, Ed. (IRLPress, 1993, p. 107) und das Y-Labyrinth („Y-maze") (Brits et al., Brain Res. Bull. 6:71, 1981) getestet. Die Therapeutika werden den Tieren vor der Testung verabreicht. Die Antwortzeit in Tests wird gemessen und eine Verbesserung des Gedächtnisses und Lernens wird durch eine statistisch signifikante Abnahme in den Zeit-Tests demonstriert.
Wie oben angeführt, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit durch die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge eines Antagonisten oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie hierin beschrieben, an einen Patienten zur Verfügung. Solche Patienten können durch klinische Diagnose, die auf Symptomen der Demenz oder des Lern- und Gedächtnisverlustes basieren, welche nicht anderen Ursachen zugeschrieben werden können, identifiziert werden. Zusätzlich können Patienten auch durch die Diagnose einer Hirnatrophie, die durch magnetisches Resonanz-Imaging bestimmt wird, identifiziert werden.
Kognitives Verhalten bei AD kann durch einen von verschiedenen Tests gemessen werden (siehe Gershon et al., Clinical Evaluation of Psychotropic Drugs: Principles and Guidelines, Prien and Robinson (eds.), Raven Press, Ltd., New Youk, 1994, p. 467). Ein solcher Test, BCRS, ist so ausgeführt, um nur kognitive Funktionen zu messen: Konzentration, Kurzzeitgedächtnis, Vergangenheitsgedächtnis, Orientierung, Funktionieren und Selbstfürsorge. Dieser Test sowie der Weschler-Memory-Scale und der Alzheimer-Krankheitassoziierte Scale können verwendet werden, um Verbesserung nach einer therapeutischer Behandlung zu bestimmen. „Verbesserung" bei der Alzheimer-Krankheit liegt vor, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in der Richtung der Normalität in dem Weschler-Memory-Scale-Test vorliegt. Zum Beispiel werden die Testergebnisse der Leistung von behandelten Patienten mit Mitgliedern der Placebo-Gruppe oder zwischen nachfolgenden Tests verglichen, die mit demselben Patienten durchgeführt werden. Eine Verbesserung im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst auch eine Verzögerung des Alters, in dem Alzheimer-Krankheit ausbricht.
Wie dem Fachmann offensichtlich sein wird, wird die Menge und Frequenz der Verabreichung natürlich von solchen Faktoren wie der Natur und Schwere der Indikation, die behandelt wird, der gewünschten Antwort, dem Zustand des Patienten usw. abhängen. Typischerweise können die Zusammensetzungen durch eine Vielzahl von Techniken verabreicht werden, obwohl die intra-kraniellen Wege oftmals bevorzugt werden.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung können die Vektoren, welche die Nukleinsäuremoleküle, welche für die oben beschriebenen AD4-Proteine kodieren, enthalten oder exprimieren, oder sogar die Nukleinsäuremoleküle selbst mittels einer Vielzahl von alternativen Techniken verabreicht werden, einschließlich z. B. Verabreichung von Asialoosomucoid (ASOR), konjugiert mit Poly-(L-Lysin)-DNA-Komplexen (Cristano et al., PNAS 92122-92126, 1993); DNA, die mit getötetem Adenovirus verbunden ist (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3(2):147-154, 1992), Cytofectin-vermittelte Einführung (DMRIE-DOPE, Vical, Kalifornien), direkte DNA-Injektion (Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991); DNA-Ligand (Wu et al., J. of Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989); Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989); Liposome (Pickering et al. Circ. 89(1):13-21, 1994; und Wang et al., PNAS 84:7851-7855, 1987); Mikroprojektil-Bombardierung (Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991) und direkte Zuführung von Nukleinsäuren, welche für das AD4-Protein selbst kodieren, entweder allein (Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864, 1993) oder unter der Verwendung von PEG-Nukleinsäure-Komplexen.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration und nicht zur Limitierung angeboten.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Gen-Kartierung des AD-Locus der Wolga-Deutschen-Verwandtschaft
Die Wolga-Deutschen-Verwandtschaften sind eine Gruppe von 7 verwandten Familien mit autosomaler dominanter Alzheimer-Krankheit (AD) mit frühem Ausbruch. Diese Familien stammen von einer Gruppe von Deutschen, welche in den 1760er Jahren in die Region des Wolgaflusses in Russland emigrierten. Die Wolga-Deutschen (VG) blieben kulturell verschieden von der umgebenden russischen Bevölkerung und waren offensichtlich relativ isoliert bis in dieses Jahrhundert. 1987 identifizierten Bird und Kollegen (Bird, et al., Ann. Neurol. 23:25-31, 1988) 5 VG-Verwandtschaften mit AD mit frühem Ausbruch. Nachfolgend wurden 2 zusätzliche VG-Familien mit frühem Ausbruch identifiziert (Bird, et al., Ann. Neurol. 25:12-25, 1989). Zusätzlich wurden andere Familien mit frühem Ausbruch der Krankheit identifiziert, in welchen ebenso wie bei der VG-Verwandtschaft das APP-Gen und der Chromosom 14-Locus als Träger des ursächlichen Gens ausgeschlossen wurden. Zu diesen Familien gehören 4 schwedische Familien mit einem mittleren Alter des Ausbruchs im Bereich von 55 bis 64 Jahren und 2 holländische Familien mit einem mittleren Ausbruchsalter von 52 und 59 Jahren. Die 7 VG-Familien sind Nachfahren von Einwohnern von 3 benachbarten Dörfern der Wolgaregion in Rußland. Obwohl ein gemeinsamer Vorfahre nicht gefunden werden konnte, spricht der einzigartige ethnische Ursprung gekoppelt mit 150 Jahren relativer genetischer Isolation dafür, dass AD in diesen Familien wahrscheinlich das Ergebnis eines gemeinsamen genetischen Begründers ist. Die Vererbung von AD in diesen Verwandten scheint autosomal dominant zu sein. Der Ausbruch von AD in diesen Familien reicht von 40 bis 81 Jahren mit einem Familiendurchschnittsalter des Ausbruchs im Bereich von 51 bis 65 Jahren (Bird et al., supra, Tabelle 1). Zahlreiche betroffene Subjekte in diesen Familien wurden extensiv charakterisiert und zwar klinisch und neuropathologisch und bei mindestens einem betroffenes Subjekt von jeder Familie wurde die Diagnose von AD durch Autopsie bestätigt. Außer des relativ frühen Alters des Ausbruchs ist AD in den VG klinisch und pathologisch von typischer AD nicht unterscheidbar. Neurofibilläre Tangles, Aβ- neuritische Plaques und andere Veränderungen, die mit AD assoziiert sind, wurden in multiplen Autopsien beobachtet. Tabelle 1. VG-Verwandte, die für Verbindungsanalyse verwendet wurden.

* schließt ein unbetroffenes Subjekt ein, an dem Autopsie durchgeführt wurde.
✞ Zahlen in Klammern zeigen an, dass DNA-Proben entweder als Paraffinblöcke oder gefrorenes Gehirn von Autopsie-Material erhalten wurden.

Der Locus, der für AD in den VG-Verwandten verantwortlich ist, wurde nicht zuvor genetisch kartiert. Verbindungs-Analyse sowie Mutations-Analyse der VG-Familien mit Chromosom 21- und Chromosom 14-Markern (AD3-Locus und APOE-Locus) führte zu negativen Ergebnissen. Weiterhin kosegregiert der Locus, der für AD in den VG-Verwandten verantwortlich ist, nicht mit den Markern des APP-Locus, und im APP-Gen konnten keine Mutationen detektiert werden.
Verbindungs-Analyse wurde verwendet, um das Genom nach dem Locus, der AD in diesen VG-Familien verursacht, abzusuchen. DNA wurde von Lymphoblastoiden-Zelllinien von 139 Individuen, einschließlich 37 betroffenen Subjekten, präpariert. Wenn suggestiver Beweis für Verbindung gefunden wurde, wurde Autopsie-abgeleitetes Gewebe, entweder gefroren oder in Paraffin eingelegt, verwendet, um DNA von 8 zusätzlichen betroffenen Subjekten zu präparieren, von denen kein anderes Gewebe erhältlich war. Die Marker auf allen Chromosomen wurden genotypisiert und analysiert unter Verwendung der LOD-Score-Methode (Morton, Am. J. Hum. Genet. 7:277, 1955; Hodge, et al., Am J. Hum. Genet. 35:1139, 1983). Für den Genom-Screen wurde der Beweis für Verbindung evaluiert unter der Annahme von autosomaler dominanter Vererbung mit Alters-abhängiger Penetranz und einer 0%igen sporadischen Rate. LOD-Punktzahlen („lod scores") wurden ebenso unter der Verwendung eines Niedrig (1%)-Penetranzmodells berechnet, welches keine Annahme über den Krankheitsstatus von Risikoindividuen macht und dadurch als Kontrolle dafür dient, dass Information über Verbindung primär von den betroffenen Individuen abgeleitet ist (in welchen der Genotyp des Krankheits-Locus genauer bekannt ist im Vergleich zu den Risikosubjekten). Publizierte Marker-Allel-Frequenzen (genomische Datenbank) wurden verwendet, wenn nicht kritische Allel-Frequenzen signifikant niedriger waren als diejenigen, die in den VG geschätzt wurden. In diesem Fall wurden Frequenzen, die von den VG-Stammbäumen erhalten wurden, unter der Verwendung aller Subjekte (Betroffene, Risiko und Ehegatten) verwendet. Dieser konservative Ansatz wurde während des Screenings verwendet, weil die Unterschätzung der Frequenz eines Allels, was mit der Krankheit kosegregiert, einen falsch positiven Beweis für Verbindung ergeben kann (Ott, Am. J. Hum. Genet. 51:283, 1992). Jedoch wird dieser Ansatz LOD-Punktzahlen („lod scores") unterschätzen, wenn die wahre Allel-Sequenz niedriger als erwartet ist. In dieser Studie wurden 162 öffentlich erhältliche Marker genotypisiert. Unter diesen waren 70 STRP-Marker mit Heterozygosität-Werten von meistens > 0,70, die ≥20 cM voneinander entfernt waren.
Diese Arbeit demonstriert die Anwesenheit eines zuvor nicht kartierten AD-Locus auf Chromosom 1g31-42.
Anfängliche suggestive LOD-Punktzahlen („lod scores") für Chromosom 1 wurden von den Markern D1S103 (Z_max = 1.79, θ = 0,10) und D1S249 (Z_max = 1,76, θ = 0,20) erhalten (Tabelle 2), welche ungefähr 25 cM separiert sind (1). Nachfolgend wurden 21 andere Marker in dieser Region umfassend 55 cM analysiert (Tabelle 2). Unter der Verwendung der konservativen Screening-Analyse-Bedingungen wurde signifikanter Beweis für Verbindung (Z_max ≥3,0) mit D1S479 (Z_max = 4,40, θ = 0,11) erhalten. Dieser LOD-Punktwert („lod score") war ähnlich zu den durch frühere Power-Analysen vorhergesagte. Der größte Anteil des Beweises für Verbindung stammt von den Familien HB und R, wobei positive LOD-Werten ebenso für Familien W, H und HD beobachtet wurden (Tabelle 3). Nachfolgend kosegregierte ein 112 bp-Allel von D1S479 mit der Krankheit in 5 von 7 Familien, was mit einem gemeinsamen genetischen Begründer konsistent ist. Andere Marker in der Region ergaben positive, wenn auch nicht signifikante LOD-Werte (z. B. D1S439, Z_max = 2,82, θ = 0,17; D1S320, Z_max = 1,87, θ = 0,14; D1S103, Z_max = 2,40, θ = 0,008; Tabelle 2).
Tabelle 2 demonstriert, dass FAD mit Chromosom 1-Markern verbunden ist. Genotypen wurden durch konventionelle Methoden, wie z. B. PCR, durchgeführt. Alle Genotypen für D1S479 wurden als Duplikat bestimmt. Für Marker D1S227, D1S320, D1S213, D1S439, D1S479, D1S225 und D1S103 wurden die Genotypen von 8 Proben von betroffenen Subjekten bestimmt, die entweder von Paraffinblöcken oder gefrorenem Gehirnmaterial stammten (nicht alle Proben amplifizierten mit allen Markern). LOD-Punktzahlen („lod scores") wurden unter Verwendung des Computerprogramms LIPED (Ott, Am. J. Hum. Genet, 26:588, 1974) unter der Annahme von Alters-abhängiger Penetranz (Morton, Am. J. Hum. Genet, 7:277, 1955) berechnet. Tabelle 2. LOD-Punktzahlen („lod scores") für die Verbindung von FAD mit Chromosom 1-Markern* Rekombinations-Fraktion (θ)

* LOD-Punktzahlen („lod scores") wurden unter der Verwendung von veröffentlichten Allel-Frequenzen berechnet, außer für D1S479. Für diesen Marker wurde die Allel-Frequenz für das 112 bp-Allel von den VG-Subjekten als eine Gruppe abgeleitet, während die Sequenzen für die anderen Allele von publizierten Werten (17) stammen.
✞ Het., Heterozygosität.

In Tabelle 3 wird die Familien-LOD-Punktzahl („lod score") für die Verbindung von AD zu dem Marker D1S479 dargestellt. Bedingungen 1 und 2 sind Alters-abhängige Penetranz mit VG bzw. CEPH-Allel-Sequenzen; Bedingungen 3 und 4 sind Alters-abhängige Penetranz mit einer sporadischen Korrektionsfunktion unter der Verwendung von VG bzw. CEPH-Allel-Frequenzen. Für die H-, HB- und R-Familien wurde die maximale LOD-Punktzahl mit D1S479 erhalten. Für andere Familien wurden maximale LOD-Werte mit anderen Markern erhalten (HD; D1S103, Z_max = 1,75, θ = 0,001, Bedingung 4), D1S249 (KS; D1S412, Z_max = 1,20, θ = 0,10, Bedingung 2) und D1S439/D1S227 (W; D1S227 und D1S439, Z_max = 0,78, θ = 0,001, Bedingung 4). Kein Marker war für die WFL-Familie unter irgendeiner Bedingung positiv. Nachdem Niedrig (1%)-Penetranzmodell betrugen Z_max Werte 3,04 (θ = 0,10) und 1,27 (θ = 0,15) für die Kontrolle bzw. VG-Allel-Frequenzen.
Tabelle 3. Familien-LOD-Punktzahl („lod scores") für die Verbindung von AD mit D1S479
In den VG-Stammbäumen sind die Genotypen von vielen verstorbenen Individuen, die mit den geprobten Subjekten verwandt sind, nicht erhältlich (z. B. alle Individuen in Generationen I-III in 2). Aufgrund des Problems der fehlenden Daten können Marker-Allel-Frequenzen die Verbindungs-Analyseergebnisse beeinflussen. Für die meisten der verwendeten Marker waren die Allel-Sequenzen in den VG-Familien mit denen der Kontrollen gleich. Jedoch war D1S479 in 5 der Familien (H, HB, HD, R und W) substantiell häufiger in den betroffenen Subjekten (0,32 in betroffenen Subjekten, 0,18 in allen VG-Subjekten) im Vergleich zur Frequenz von 0,04 in den Kontrollen. So eine Erhöhung in der Frequenz für ein eng verbundenes Marker-Allel wird erwartet. Wenn Kontroll-Sequenzen basierend auf nicht betroffenen VG-Ehegatten für das 112 bp D1S479-Allel verwendet wurden, erhöhte sich die maximale LOD-Punktzahl („lod score") für D1S479 von Z_max = 4,40 (θ = 0,11) auf Z_max = 6,29 (θ = 0,10) (Tabelle 3).
Verbindungsanalyse kann durch die Anwesenheit von Phänokopien in den Stammbäumen (nicht-AD Demenz-Fälle oder AD, die durch etwas anderes als das Hauptgen, segregierend in diesen Familien, verursacht wird) beeinflusst werden. Phänokopien können die Kraft (Power), Verbindung zu detektieren und das geschätzte θ zu erhöhen, reduzieren (Cavalli-Sforza and King, Am. J. Hum. Genet. 38:599, 1986). Phänokopien sind ein potentielles Problem in den VG-Verwandten, weil der Bereich des Ausbruchs-Alters für AD in diesen Familien sich bis auf ein Alter von 82 Jahren ausdehnt (Tabelle 1), welches mit dem üblichen späten Ausbruch von AD überlappt. Um die Anwesenheit von AD-Fällen mit spätem Ausbruch in diesen Familien zu korrigieren, wurde ein Phänokopie-Korrektionsmodell verwendet (Schellenberg, et al., Am J. Hum. Genet. 53:619, 1993), dass annimmt, wenn das Alter des Ausbruchs für ein Subjekt zunimmt, die Wahrscheinlichkeit, dass der Fall eine Phänokopie ist, erhöht ist. Trotz des Faktes, dass bei Abwesenheit von wahren Phänokopien dieses Modell die Kraft („power"), Verbindung zu detektieren, reduziert, erhöhten sich die LOD-Punktzahlen für alle analysierten Marker (Margaritte et al., Am. J. Hum. Genet. 50:1231, 1992). Für D1S479 erhöhten sich die Z_max-Werte von 6,29 auf 6,51 und von 4,40 auf 4,60 unter der Verwendung der Kontrolle bzw. VG-Allel-Sequenz für das 112 bp-Allel. Bei diesem Modell betrug die maximale D1S479 LOD-Punktzahl für eine einzelne Familie für D1S479 2,95 (θ = 0,09) für die R-Familie. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass mindestens einige der AD-Fälle in diesen Familien möglicherweise Phänokopien sind.
Für die R-Familie wurden Haplotypen unter der Verwendung der 23 Marker, umfassend ungefähr 55 cM von Chromosom 1, konstruiert (7). Ein gemeinsamer Haplotyp zwischen D1S439/D1S479 und D1S306 wurde in allen bis auf eines der betroffenen Subjekte beobachtet (IV-1, 7). Dieses Individuum teilte nicht den Krankheits-Haplotyp entlang der gesamten Region, hatte ein Ausbruchsalter von 67 Jahren, welches größer als 2 SD über dem Familiendurchschnitt liegt, und hatte einen ε4/ε4-Genotyp auf dem APOE-Locus. Dieser APOE-Genotyp wird mit niedrigem Ausbruchsalter für AD mit spätem Ausbruch assoziiert (Corder, et al., Science 261:921, 1993). Daher kann dieses Subjekt eine Phänokopie sein. In anderen Familien war ein genaues Bestimmen eines gemeinsamen Krankheits-Haplotys aufgrund fehlender Daten schwierig und wird extensive Multi-Analyse benötigen. Jedoch segregierte für D1S479 das 112 bp-Allel mit der Krankheit in den H, HB, HD, W und R-Stammbäumen. In der HD-Familie hat das eine betroffene Subjekt, welches nicht das 112 bp Allel hat, ein Ausbruchsalter von 75 Jahren und war ε3/ε4 auf dem APOE-Locus. Jedoch könnte das Ausbruchsalter allein nicht verwendet werden, um unzweideutig zu bestimmen, ob ein Subjekt eine Phänokopie ist. In der HB-Familie teilten Subjekte mit Ausbrüchen von bis zu 75 Jahren das D1S479 112 Allel mit anderen jüngeren betroffenen Subjekten. Die KS-Familie ist die einzige VG-Verwandtschaft, in welcher keines der betroffenen Subjekte das D1S479 112 bp-Allel hat. Die Analyse dieser Familie ist aufgrund des späten Ausbruchsalters (64,8 Jahre) und weil von den 8 betroffenen Subjekten 3 APOE ε4/ε4-Homozygote (Ausbruchsalter von 57, 58 und 67 Jahren) und 4 ε4-Heterozygote (Ausbruchsalter 67, 68, 68 und 71 Jahren) waren, kompliziert. Daher könnte die KS-Familie ein Beispiel für genetische Heterogenität innerhalb der VG-Verwandten sein, obwohl Gruppen-Heterogenitätstests keine Heterogenität detektierten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass das Auffinden desselben seltenen Allels, das mit AD in den meisten VG-Stammbäume segregiert, die Hypothese von einem gemeinsamen genetischen Begründer für die meisten der Familien unterstützt. Wie hierin beschrieben, bestätigen die Sequenzdaten von den VG-Patienten diese Hypothese.
Zusammengenommen demonstrieren diese Daten die Anwesenheit eines AD-Locus auf 1q31-42. Die Analyse von Rekombinanten in der R-Familie definiert die Kandidatenregion als zwischen D1S225 (Subjekte VI-3 und V-3 in 2) und D1S217 (Subjekt IV-16), eine Region umfassend 14 cM (8).
BEISPIEL 2
Klonierung des AD4-Gens von Chromosom 1 unter der Verwendung von YACS
YAC-Klone, abgeleitet von Chromosom 1, wurden von der CEPH-Genethon-Bibliothek erhalten und wurden für die Region, umfassend D1S229 bis D1S103 durch 2 verschiedene Verfahren identifiziert.
Im ersten Verfahren wurde die CEPH-Genethon-YAC-Bibliothek für PCR-basiertes Screening angeordnet. Diese öffentlich erhältliche Bibliothek (Bellanne-Chantelot, et al., Cell 70, 1059-1068, 1992) wurde von Glen Evans (Salk Institute) als 21.792 Klone in 227 96-Well-Platten erhalten. Für die DNA-Präparation wurden Kolonien separat in 1,5 ml flüssigem Medium gewachsen, geerntet und zusammengeführt. Spheroplasten wurden durch Verdau mit Lyticase hergestellt. DNA wurde durch Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Extraktionen gereinigt und durch Addition von Natriumacetat und Ethanol präzipitiert. Nach Resuspension und RNase-Behandlung war die DNA fertig für die PCR-Amplifizierung.
Ein zweidimensionales YAC-Zusammenführungs-Schema erlaubte die Identifizierung von spezifischen YAC-Adressen durch PCR-Screening (Amemiya, et al., Nucl. Acids. Res. 20:2559-2563, 1992). Die Bibliothek wurde in fünf Sätze unterteilt (4 × 48 und 1 × 35 Ablagen). Duplikate wurden von jedem Satz angefertigt. Eine Kopie von jedem der 5 Sätze wurde für die erste Dimension der horizontalen Basis-Pool verwendet (jeder Pool stellt alle Klone von einer einzelnen 96-Well-Platte dar). Die zweite Kopie wurde für die zweite Dimension der vertikalen Basis-Pools verwendet (die Pools enthalten Klone von einer spezifischen Well-Position, wie z. B. A1 für Platten von einem Satz). Die Pools innerhalb jedes Satzes werden weiterhin kombiniert, um PCR-Screening zu ermöglichen. Für jeden Satz wurden horizontale Pools kombiniert, um 4 super-horizontale Pools zu generieren. Jeder super-horizontale Pool enthielt Klone von 12 aufeinander folgenden Platten (Platten 1-12, 13-24, 25-36, 37-48). Die zweite Dimension wurde kombiniert, um 8 super-vertikalale Pools pro Satz zu produzieren. Jeder super-vertikale Pool enthielt Klone von jeder Reihe in einem Satz (A, B, C, ... etc.). Damit war die gesamte Bibliothek auf 19 super-horizontale Pools (4 × 4 Sätze + 3 × 1 Satz) und 40 super-vertikale Pools (8 × 5 Sätze) reduziert. Auf diese Weise können Kandidaten-Klone nach zwei PCR-Runden gefunden werden, das heißt eine erste Runde mit Super-Pool und eine zweite Runde mit dem Basis-Pool. Wenn multiple Treffer vorkommen, ist eine finale PCR-Runde notwendig.
Die YAC-Bibliothek wurde unter der Verwendung von Primern für STS D1S320 und D1S479 gescreent, wie in 9 gezeigt. Dieses Screening führte zu den folgenden YACs: 920e7, 859b6, 9043.
In dem zweiten Verfahren wurde eine Datenbank befragt. Die CEPH-Genethon INFO-Klon-Datenbank enthält Informationen bezüglich der genetischen Marker und des STS-Gehaltes von YACs in der CEPH-Genethon- YAC-Bibliothek. Diese Datenbank wurde mit den folgenden Markern befragt: D1S229, D1S227, D1S213, D1S479, D1S439, D1S225, D1S103, D1S495. Die identifizierten YACs waren 857h3, 9342, 957g10, 881b8, 913e10, 810e5, 921d12, 865c8, 920e7, 859b6, 736b6, 746d7, 748h9, 748e2, 753a5, 753d8, 753d9, 7531, 753fl2, 753h3, 757d8, 759b10, 757f9, 761h10, 767b1, 767d1, 767g1, 769fl1, 786a8, 786fl1, 820g5, 824g8, 824g9, 824g11, 826b3, 826b5, 831e4, 849a7, 856a7, 880d12, 897f9, 899f1, 899h1, 920g1, 9043, 915e8, 922a10, 933a8, 958e10, 978g10 und 9793. Einige dieser YACs enthalten den Marker, der in der Abfrage verwendet wurde, und einige sind mit den YACs verbunden, welche den Marker enthalten, der in der Datenbankabfrage verwendet wurde. Insgesamt wurden durch die kombinierten Verfahren 60 YACs identifiziert.
YAC-DNA wurde von jedem YAC-Klon präpariert. Die YAC-DNA wurde danach unter der Verwendung der Primer, wie in 9 gezeigt, amplifiziert. Eine YAC-Contig-Karte („YAC contig map"), die teilweise die Region von D1S229 bis D1S103 erfaßt, wurde konstruiert.
EST T03796 (10) wurde in der EST GenBan-Datenbank als eine Sequenz mit Homologie zu den AD-Genklonen von Chromosom 14 auf der Nukleotidebene und der Aminosäureebene identifiziert. Oligonukleotid-Primer EP1F und EP1R und KM7749 und KM7750 wurden für die PCR-Amplifizierung verwendet (11). Aufgrund der gegebenen EST-Sequenz betrug die erwartete Größe ungefähr 140 bp (für Primer EP1F und EP1R) oder 190 bp (für Primer KM7749 und KM7750). Wenn humane genomische DNA amplifiziert wurde, wurde eine 1.300 bp-Bande beobachtet. Die Amplifizierung der YACs der Wolga-Deutschen-Genregion von Chromosom 1 mit denselben Primern führte zu einem 2,5 kb-Fragment von vier verschiedenen Isolaten von YAC 921d12. Ein Isolat von 921d12 führte nicht zu diesem Fragment, aber es war kleiner und vermutlich gelöscht für das 2,5 kb-Fragment. Für YAC 921d12 wurde kürzlich gezeigt, dass es die Marker D1S439 und D1S479 enthält.
Zusätzlich wurde eine Reihe von Nagetier-humanen Hybrid-Zelllinien, die von dem Coriell Institute for Medical Research erhalten wurden, mit denselben Primern amplifiziert. Diese Zelllinien enthalten eines oder einige humane Chromosomen auf einem Nagetier-Hintergrund (entweder Maus oder Hamster). Nur Zellen, die humanes Chromosom 1 enthielten, hatten die 2,5 kb-Bande.
DNA von YAC 921d12 wurde mit den Primern EP1F und EP1R und nachfolgend mit WWF und WWR (11) amplifiziert, um ein 2,5 kb-Fragment zu produzieren. DNA-Sequenz-Analysen dieses 2,5 kb-Fragments wurde mit den Primern WWF und WWF1L (2) durchgeführt, um Sequenz ELL 1.1 zu erhalten (10). Diese Sequenz enthält an ihrem 5' Ende einen Teil von EST T03796. Dieses 2,5 kb-Fragment wurde ebenso mit den Primern WWR und WWR1R sequenziert, was zur Sequenz ELL1.2 führte, welche ebenso einen Teil der DNA-Sequenz von T03796 enthielt. Die 2,5 kb-Bande von YAC 921d12 wurde reamplifiziert, gereinigt und mittels der Primer WWF, WWF1L, WWR und WWR1R sequenziert. Die Sequenz dieser DNA-Moleküle ist in 10 gezeigt. In diesem Fragment waren 119 bp an dem 5' Ende und 96 bp an dem 3' Ende mit der EST-Sequenz identisch. Zusätzlich wurden ein Spleiß-Akzeptor und eine Donor-Sequenz an beiden Verbindungen („junctions") der EST-Sequenz beobachtet, was vorschlägt, dass die Zwischensequenz ein Intron des Chromosom 1-Gens ist. Daher ist EST T03796 auf YAC 921D12 und ist ein Kandidat, der mindestens einen Teil des Wolga-Deutschen-AD-Gens enthält.
cDNAs, die für das AD-Gen kodieren, wurden wie folgt isoliert. Eine Million Klone von einer Werner-Syndrom Fibroblasten-cDNA-Bibliothek oder einer B616 humanen Gehirn-cDNA-Bibliothek wurden ausplattiert und auf Duralon-Membranen (Stratagene) transferiert. Die Filter wurden für eine halbe Stunde in Church-Gilbert Hybridization Solution (0,5 M Na-Phosphat, pH 7, 0,7% (w/v) SDS, 1% (w/v) BSA) bei 65°C prä-hybridisiert und unter der Verwendung von 500.000 cpm/ml eines 140 bp PCR-Produktes, das von den EP1-Primern amplifiziert wurde (140 bp der EST T03796), oder eines 190 bp PCR-Produktes, das von den Primern KM7749 und KM7750 amplifiziert wurde, gescreent. Die Sonde wurde unter Verwendung einer „random primed"-Methode (Boehringer-Mannheim) für eine halbe Stunde markiert und nicht eingebaute Nukleotide wurden durch eine Microspin s-200 HR-Säule (Pharmacia) entfernt. Die Filter wurden für 16 Stunden hybridisiert und danach jeweils 15 Minuten bei 65°C in 2X SSC/0,1%SDS gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt in 0,1X SSC/0,1% SDS. Audioradiographen wurden für 16 Stunden belichtet und vier primäre Kandidaten wurden von der Fibroblasten-Bibliothek und fünf primäre Kandidaten wurden von der Gehirn-Bibliothek isoliert. Die primären Kandidaten waren positiv nach wiederholtem Screening. Sekundäre Positive wurden in SM-Puffer gepickt und unter Verwendung von veröffentlichten Protokollen (Statagene) gerettet.
Zusätzlich wurden 600.000 Klone in einer angeordneten Version (Munroe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:2209-2213, 1995) der obigen Fibroblasten-cDNA-Bibliothek unter der Verwendung von PCR-Methoden gescreent. Die EP1- und WW1-Primerpaare wurden verwendet, um die Platten-Pools (1-48) zu srceenen. Das EP1-Primerpaar ergab Positive auf den Platten 11, 17 und 36, wohingegen die WW1-Primer Positive auf den Platten 17 und 36 ergaben. Wenn PCR durchgeführt wurde, um Säulen und Reihen-Adressen zu bestimmen, konnten nur 2 Adressen bestimmt werden: Platte 17 C7 (beide Primerpaare) und 17 C11 (nur WW1). Bestätigende PCR in den individuellen Wells zeigte nur Produkt für 17 C11. Beide Wells wurden für tertiäres Screening ausplattiert, um Plaque-gereinigten Phagen zu erhalten. Das EP1-PCR-Produkt wurde für das Screening wie oben verwendet. Positive Plaques wurden für 17 C11 isoliert und wie oben gerettet. Positive Plaques wurden letztendlich gereinigt und als 11, 15A, 15B und C11, PS2-6, PS2-10 und PS2-41 bezeichnet.
Die Sequenz von Chromosom 1 wurde dann verwendet, um verschiedene cDNA-Bibliotheken zu screenen. Positive Klone mit 2,2 kb Länge wurden isoliert und sequenziert. Die in 1 gezeigte Sequenz zeigt klares Überlappen mit den Enden des PCR-Fragments. Zusätzliche EST-Sequenzen mit überlappender Sequenz und zusätzliche cDNA-Sequenzen wurden durch weitere Bibliotheken-Screenings erhalten.
BEISPIEL 3
Mutationen in betroffenen VG-Patienten Beispiel 1
Unter der Verwendung von RT-PCR wurde das gesamte Gen von betroffenen VG-Individuen und anbetroffenen Individuen amplifiziert. Die nicht betroffenen Individuen sind von VG-Familien und von nicht verwandten Linien. Die erhaltenen Sequenzen wurden analysiert. In betroffenen Individuen gibt es einen Nukleotidwechsel in Codon 141 (AAC → ATC), der zu einer Aminosäureänderung von Asparagin zu Isoleucin (N141I) führt. Eine solche Änderung wurde in keinem der nicht betroffenen Individuen von vergleichbarem Alter gefunden. Die Aminosäurensequenz in der Region der Veränderung ist LLNSVLNTLIMISVIVVMTI in den nicht betroffenen Individuen und LLNSVLITLIMISVIVVMTI in den betroffenen Individuen, die untersucht wurden. Betroffene Subjekte, die die N141I-Mutation tragen, wurden in 5 (H, HB, HD, R, W) der 7 VG-Familien identifiziert, die anfänglich gescreent wurden. Alle Subjekte mit der N141I-Mutation trugen auch das D1S479 112 bp-Allel (Allel H, 7). Nachfolgend wurden 2 zusätzliche VG-Familien (E und BE) auf die N141I-Mutation untersucht. In beiden Verwandtschaften tragen die betroffenen Subjekte die N141I-Mutation und das D1S479 112 bp-Allel. Insgesamt wurde die N141I-Mutation in 20 betroffenen Subjekten direkt beobachtet und es wurde gefolgert, dass sie in Ehegatten/Kinder-Genotypen in zusätzlichen 6 AD-Subjekten anwesend ist; das Ausbruchsalter für die 26 Subjekte reichte von 44 bis 75 Jahre. Die N141I-Mutation wurde ebenso in 15 Risiko-Subjekten (Blutsverwandte der betroffenen N141I-Träger) mit einem Alter im Bereich von 23 bis 67 Jahren beobachtet. Kein VG-Ehegatte (n = 17) trug die N141I-Mutation. Zusätzlich durchsuchte Populationen schlossen 84 normale Kaukasier, Ehegatten, Risiko-Subjekte und betroffene Subjekte von 67 familiären FAD-Familien mit spätem Ausbruch (n = 223 betroffene Subjekte) und 48 betroffene sporadische Subjekte einer klinischen AD-Population ein.
Zusätzlich zu der N141I-Mutation wurden drei weitere Varianten an Nukleotid 436 (C → T, Subjekt HB), 496 (C → T, Subjekte HD und W) und 628 (C → T, Subjekte HD und W) identifiziert. Diese Varianten veränderten nicht die Aminosäure, die an diesen Stellen kodiert war (Alanin, Asparagin bzw. Histidin).
BEISPIEL 4
Charakterisierung des AD4-Gens und seiner Proteinprodukte
Die Sequenz der VG von Chromosom 1 wurde von der Sequenz von verschiedenen Klonen, wie beschrieben, konstruiert. Die Sequenz ist in 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz, die von dieser DNA-Sequenz abgeleitet wurde, ist in 2 gezeigt. Der Vergleich dieser Sequenz mit der Sequenz des AD3-Gens von Chromosom 14 zeigt Sequenzhomologie. Ein Abgleich der Proteine und Gene, wie konstruiert, unter der Verwendung des Programms GAP von dem Wisconsin Package der Sequenzanlayse-Software (Ver. 8.0.1 - UNIX, September 1994) ist in 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenz von AD4 zeigt ungefähr 67% Identität mit dem AD3-Genprodukt. Einige bemerkenswerte Charakteristika des AD4 Genproduktes sind in 5 gezeigt.
Das Protein, das durch das Chromosom 1 AD-Gen kodiert wird, ist ein Membranprotein, was aufgrund der sieben hydrophoben Segmenten beurteilt wurde, von denen vermutet wird, dass sie Membran-durchspannende Regionen sind (4). Das AD4-Protein wird auch als STM2 bezeichnet. Alle putativen Transmembran-Helices von STM2 sind an den Carboxylterminalen Enden durch einen Lysin-Rest abgedeckt, der entweder am Ende oder innerhalb weniger Reste vom Ende der transmembranen Domänen gefunden wird. Die N141I-Mutation, die zu einer Änderung von einem hydrophilen Asparagin-Rest zu einem hydrophoben Isoleucin-Rest führt, befindet sich an einer Position, die direkt benachbart zu der ersten vorhergesagten transmembranen Domäne ist.
Ein Northern-Blot (Clontech), der 2 μg einer humanen Poly-A-plus mRNA enthält, die von Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel und Pankreas abgeleitet ist, wurde mit den 2,3 kb AD4-cDNA-Klon als eine Sonde hybridisiert. Die Hybridisierung wurde in 0,75 M NaCl, 0,05 M NaH₂PO₄, 5 mM Na₂EDTA, 10X Denhardt's-Lösung, 100 μg/ml Lachsspermien-DNA, 50 % Formamid, 2 % SDS bei 42°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden mit 0,1X SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen. Northern-Blot-Analyse mit RNA von einer Vielzahl von humanen Geweben offenbarte zwei AD4-verwandte Transkripte, welche ungefähr 2,4 und 2,8 kb groß sind. Das größere Transkript scheint primär in der Plazenta, im Skelettmuskel und Herz exprimiert zu sein, wohingegen das kleinere Transkript im Herz, Gehirn, in der Plazenta, Leber, im Skelettmuskel und in der Niere, aber nicht in der Lunge detektiert wird. Eine Sequenz-markierte Stelle („sequence-tagged site") (STS) von der 3' nicht translatierten Region wurde verwendet, um zu bestätigen, dass AD4 sich auf Chromosom 1 und auf YAC 921d12 abbildet. Die zwei beobachteten Transkripte sind möglicherweise das Ergebnis von alternativer Polyadenylierung, da zwei putative Polyadenylierungs-Signale in der 3' nicht translatierten Region, an Nukleotiden 1834 und 2309, identifiziert wurden. Die übermittelten Größen für STM2 von der Northern-Blot-Analyse (2,4 und 2,8 kb) sind etwas größer als die Größe von 2,3 kb, die von der Volllängen-DNA-Sequenz vorhergesagt wurde, und die Größe von 1,8 kb, die von der zweiten in der Sequenz beobachteten Polyadenylierung-Stelle vorhergesagt wurde. Diese offensichtliche Diskrepanz kann sich aus der anormalen Migration der Größen-Marker ergeben, was früher schon mit diesem Northern-Blot-Typ beobachtet wurde.
Die normale zelluläre Funktion von STM2 ist unbekannt. Wenn dieses Protein funktional gleich zu spe4, dem C. elegans-Gen mit Sequenzsimilarität zu STM2, ist, könnte es eine Rolle in der zytoplasmatischen Partionierung von Proteinen spielen. Mutationen in STM2 könnten intrazelluläres Protein-„Trafficking" von APP verändern und letztendlich zu verändertem APP-„Processing" und erhöhter Produktion von Aβ1-40 oder Aβ1-42 (Amyloid β-Protein) führen. Übereinstimmend mit dieser Ansicht hat kürzliche Arbeit mit Fibroblasten-Zelllinien von AD3-Trägern gezeigt, dass die Sekretion von Aβ, das in Position 42 endet, relativ zu Nicht-Träger-Zelllinien erhöht ist. Alternativ dazu kann STM2 als ein G-Protein gekoppelter Rezeptor oder als ein Ionenkanal fungieren.
BEISPIEL 5
Klonierung des AD-Gens auf Chromosom 1
Das Gen kann von genomischen oder cDNA-Bibliotheken oder von genomischer DNA oder mRNA erhalten werden. Die hierin zur Verfügung gestellte Nukleotidsequenz des Gens kann verwendet werden, um Oligonukleotide zu entwerfen. Die Primer sind optimalerweise 18-25 Nukleotide lang und enthalten bevorzugterweise nicht mehr als 50% AT-Basenpaare, enden nicht auf A und sollten keine selbst-komplementären Regionen enthalten.
Die Oligonukleotide können als Hybridisierungs-Sonden auf cDNA oder genomischen Bibiliotheken verwendet werden. Für cDNA-Bibliotheken wird mRNA von einer spezifischen Quelle, wie z. B. einer Zelllinie oder Gewebeprobe, in cDNA transkribiert und in einen geeigneten Vektor inseriert (z. B. λgt10, λZAP, pBS oder pSPORT). (Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989). Der rekombinante Vektor wird in einen geeigneten Bakterienstamm eingeführt (z. B. DH5a oder KW257) und die Zellen auf Wachstumsmedium ausplattiert. Alternativ dazu werden cDNA-Bibliotheken, die RNA von verschiedenen Quellen repräsentieren, kommerziell erworben (z. B. Clontech Laboratories). In jedem Fall werden Kolonien (für Plasmide) oder Plaques (für Phagen) auf eine Nitrozellulose- oder Nylon-Membran transferiert und für die Hybridisierung präpariert (Sambrook, supra). Oligonukleotid-Sonden werden an ihrem 5'Ende mit ³²P unter der Verwendung von T4-Polynukleotid-Kinase markiert. Die Hybridisierung und Waschschritte werden unter Standardbedingungen gemäß der Länge und dem GC-Gehalt der Sonde durchgeführt (siehe Sambrook et al, supra).
Für die Isolierung von genomischen Klonen, die das AD4-Gen enthalten, werden genomische Bibliotheken unter Standardmethoden konstruiert (Sambrook et al., supra) oder von kommerziellen Quellen erhalten (Clontech, Stratagene, Research Genetics and Genome Systems). Bibliotheken werden in Phagen, Kosmiden, P1, BACs oder YACs konstruiert und wie für cDNA-Bibliotheken beschrieben, sondiert. Kolonien oder Phagen, die hybridisieren, werden gepickt, gereinigt und für die Präparation von DNA gewachsen.
Falls keine Volllängen-Sequenz durch die beschriebene Klonierung und Screening-Methoden erhalten wird, können Volllängensequenzen durch das Screening von zusätzlichen Klonen, durch RACE (Frohman and Martin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8998-9002, 1992), Ligations-verankerte PCR (ligation-anchored PCR) (Toutt et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:9823-9825, 1992) oder andere ähnliche Verfahren erhalten werden. Die Verifizierung, dass ein Klon AD4-Sequenzen enthält, kann durch die Bestimmung der DNA-Sequenz des Klons und ihrem Vergleich mit der hierin zur Verfügung gestellten Sequenz von AD4 erhalten werden. Sequenz-Identität von 90% oder mehr zeigt an, dass ein Klon für AD4 kodiert. Einige Nichtübereinstimmungen (mismatch) können aufgrund von Polymorphismen oder DNA-Sequenzfehlern entstehen.
BEISPIEL 6
Detektion von Mutationen
Mutationen in dem AD4-Gen können durch Nukleotid-Sequenzanalyse bestimmt werden. Periphere Blutzellen werden von Patienten durch Venipunktur und hypotronische Lysis von Erythrozyten erhalten. DNA oder mRNA wird von diesen Zellen isoliert und das AD4-Gen durch Amplifizierung isoliert. Oligonukleotid-Primer werden basierend auf der hierin zur Verfügung gestellten cDNA-Sequenz oder der genomischen Sequenz ausgewählt. Ein Computerprogramm, wie z. B. Primer 2.2, welches über den Web-Server beim Whitehead/MIT Center for Genome Research öffentlich erhältlich ist, assistiert in der Auswahl der Oligonukleotid-Primer. Wenn mRNA als Quelle von Nukleinsäuren verwendet wird, wird die Erststrang-cDNA durch Standardmethoden synthetisiert. Die Amplifizierung von DNA wird durchgeführt und die DNA-Sequenz des PCR-Produktes wird bestimmt. Ein Vergleich der Sequenz, die von dem Patienten und von einer normalen Kontrolle erhalten wurde, erlaubt die Identifizierung von Mutationen.
Zusätzlich kreiert die N141I-Mutation im AD4-Gen eine Sau3A I-Restriktionsstelle, welche verwendet werden kann, um schnell auf mutante Allele zu testen. Genomische DNA oder cDNA kann direkt auf die Anwesenheit der Sau3A I-Restriktionsstelle getestet werden oder durch PCR unter der Verwendung von Primern, welche das 141-Codon flankieren, amplifiziert werden. DNA oder amplifizierte DNA wird mit Sau3A I verdaut und auf einem Gel mit geeignetem Agarose-Anteil eletrophoretisch getrennt. Die Anwesenheit der Sau3A I-Stelle wird durch Ethidiumpromid-Fluoreszenz des amplifizierten Produktes oder durch Sonden-Hybridisierung nach Transfer des Gels auf eine Nylon-Membran detektiert. Geeignete Sonden sind Oligonukleotide oder DNA-Fragmente, die eine Sequenz nahe des 141-Codons oder das 141-Codon umgebend enthalten. Bevorzugterweise enthält im Falle einer Oligonukleotid-Sonde diese mindestens 24 Basen, die nicht das Codon 141 umfassen.
Wie in 12 gezeigt, ist die N141I-Mutation nach Amplifizierung detektierbar. Ungefähr 60-100 ng genomischer DNA wurden mit Primern WWF und INTIR (intronischer Primer 5'-GTGGGGCAGACGGAGAGAA-3') mit jeweils 40 ng, 1,5 mM MgCl₂ und 200 μM dNTPs amplifiziert. Die Amplifizierung wurde mit einer anfänglichen Inkubation bei 95°C für 3 Minuten durchgeführt, gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 60°C und 45 sec bei 72°C mit einer Endinkubation für 10 min bei 72°C. Das 160 bp PCR-Produkt (in 20 μl) wurde mit 10 U Sau3A I verdaut und die Fragmente durch Elektrophorese in einem nicht-denaturierenden 12% Polyacrylamid-Gel aufgelöst. Die Fragmente wurden durch Ethidiumbromid-Färbung visualisiert. Die N141I-Mutation führte zu Fragmenten von 102 bp, 58 bp, 43 bp und 15 bp (nicht gezeigt), während Nicht-Träger nur die 102 bp und 58 bp-Fragmente haben. Die Spuren sind: 1, Risiko, 79 Jahre alt; 2, betroffen, Ausbruch mit 60 Jahren; 3, Risiko, 67 Jahre alt; 4, betroffen, Ausbruch mit 75 Jahren (vermutete Phänokopie); 5, DNA-Größenstandard V von Boehringer Mannheim; 6, betroffen, Ausbruch mit 52 Jahren; 7, betroffen, Ausbruch mit 46 Jahren; 8, betroffen, Ausbruch mit 49 Jahren.
BEISPIEL 7
Bestimmung der DNA-Sequenz der genomischen AD4-Region
Ein 2,5 kb-Fragment der DNA von dem AD4-Gen wurde von YAC 921d12 DNA unter der Verwendung der Primer WWF und WWR amplifiziert und durch Nick-Translation radioaktiv markiert (Sambrook et al., supra). Ein humaner genomische Klon, der an dieses Fragment hybridisiert, wurde in einer kommerziell erhältlichen Bibliothek (Genome Systems P1-Bibliothek) identifiziert. Die Hybridisierung wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. Die PCR-Amplifizierung unter der Verwendung der Primer, die spezifisch für die 5' und 3' Enden der AD4 cDNA sind, bestätigte, dass der P1-Klon (Klon Nr. 6004 in der Nomenklatur von Genome Systems) das gesamte AD4-Gen trägt.
Die DNA von P1-Klon 6004 wurde geschert und in den M13mp19-Vektor subkloniert, der durch Verdau mit SmaI und Dephosphorylierung präpariert war. Der Vektor wurde von Novagen (Katalog Nr. 69996-1) gekauft und die Fragmente wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers kloniert. Ungefähr 1600 Klone wurden isoliert. Die Sequenz des Inserts wurde durch Fluoreszenzdetektion an einem ABI373A gemäß den Anleitungen des Herstellers bestimmt. Die Daten wurden unter Verwendung des Programmes Xgap (Staden, R. (1994) The Staden package, In „Methods in molecular biology" A.M. Griffan and H.G. Griffan, Eds. Vol 25, pp. 9-170, Humana Press) zusammengesetzt. Exons wurden durch Einfügen der cDNA-Sequenzen in die Zusammenstellung („assembly") identifiziert.
Die Sequenzen der 12 Exons und die flankierende Intron-Sequenz des AD4-Gens sind in den 13 bis 19 gezeigt. Die relativen Positionen der Exons in diesen Sequenzen sind in Tabelle 4 aufgelistet.
Tabelle 4. Position der Exons in der genomischen Sequenz
BEISPIEL 8
Isolierung des Gens von Patienten-DNA und Detektion von Polymorphismen
Die Behandlung von Alzheimer-Krankheit ist effektiver, wenn sie vor dem Beginn der neuralen Degeneration begonnen wurde. Die derzeitigen diagnostischen Mittel identifizieren Patienten jedoch erst effektiv nach einem substantiellen Verlust kognitiver Funktion. Im Grunde genommen ist der Verlust an kognitiver Funktion in einem älteren Patienten ohne eine detektierbare Ursache der primäre Indikator von Alzheimer-Krankheit. Eine strikte Bestätigung der Diagnose wird durch Autopsie durchgeführt. Jede Behandlung, welche den Beginn oder das Fortschreiten von Alzheimer-Krankheit blockiert, wird viel effektiver sein, wenn eine frühe Diagnose gemacht wird.
Von einer dominanten Mutation des AD4-Gens ist bekannt, dass sie den frühen Ausbruch der Alzheimer-Krankheit verursacht. Andere Mutationen in diesem Gen oder in anderen Mitgliedern der gleichen Gen-Familie können Alzheimer-Krankheit verursachen oder dazu beitragen. Wir stellen hierin Verfahren zur Detektion von Mutationen im AD4-Gen zur Verfügung. Dieselben Techniken werden die Detektion von Mutationen in anderen Mitgliedern der Gen-Familie erlauben.
Zehn Paare von Oligonukleotid-Primern wurden verwendet, um zehn Fragmente, die die 12 AD4-Exons, die in Tabelle 5 aufgeführt sind, tragen, mittels PCR zu amplifizieren. DNA wird von Patienten-Blutproben isoliert und individuelle PCR-Reaktionen werden mit jedem Satz von Primern unter der Verwendung des Perkin-Elmer PCR-Kits gemäß den Instruktionen des Herstellers in einer Perkin-Elmer 9600 PCR-Maschine mit den folgenden Zyklus-Bedingungen durchgeführt: 2 Minuten bei 92°C, 35 Zyklen von 20 Sekunden bei 92°C, 45 Sekunden bei der angezeigten „Annealing"-Temperatur und 3 Minuten bei 72°C, gefolgt von 7 Minuten bei 72°C. Die PCR-Fragemente werden durch Gelfiltration in einem 96-Well-Format an Zentrifugationssäulen mit Sephracyl-500HR-Harz gereinigt (Wang, Gan Boysen and Hood, Anal. Biochem. 226:85-90, 1995). Mutationen werden durch Fluoreszenzfarbstoffterminator-Sequenzierung an einem ABI373A unter Verwendung der Sequenzierungs-Primer, die für jedes Exon spezifisch sind, wie in Tabelle 6 aufgeführt, detektiert. Viele andere Formate zur Detektion von Mutation sind unter der Verwendung der PCR-amplifizierten Fragmente möglich.
Ein diagnostischer Test wird verschiedene Verwendungen zusätzlich zur letztendlichen Verwendung in der gezielten Patienten-Therapie für die frühe Intervention mit Alzheimer-Wirkstoffen haben. Zuerst werden klinische Untersuchungen eines Alzheimer-Wirkstoffes Vorteile aus der Überwachung der Allel-Variationen in Genen ziehen, die eine Veranlagung in Richtung der Krankheit schaffen. Der genetische Hintergrund der Patienten kann mit verschiedenen Mechanismen zur Initiierung der Krankheit korreliert werden: Ein Wirkstoff, welcher effektiv gegen einen Krankheitsmechanismus ist, kann möglicherweise nicht effektiv gegenüber der Krankheit sein, die durch einen anderen Mechanismus verursacht wird. Zweitens können diagnostische Mittel verwendet werden, um die geeigneten Behandlungen auszuwählen, wenn klinische Untersuchungen zeigen, dass verschiedene genetische Hintergründe mit der Wirksamkeit von Wirkstoffen korreliert werden können.
Tabelle 5 Primer für die PCR von Exon-Fragmenten
Tabelle 6. Primer für die Sequenzierung der Exons von PCR-Matrizen
BEISPIEL 9
Expression von STM2
Das Expressionsmuster von STM2 wurde in multiplen Geweben durch Northern Blot-Analyse untersucht (20). Eine Sonde wurde durch Amplifizieren des STM2-cDNA-Klons unter der Verwendung der Primer ADC22R2 und ADC22L5 generiert. Identische Muster wurden mit Sonden erhalten, die unter Verwendung der Primerpaare DMO1418 und DMO1021 oder DMO1009 und DMO1014 hergestellt wurden. Ein 2,4 kb Signal, das mit STM2 korrespondiert, wurde in allen untersuchten Geweben beobachtet, einschließlich aller untersuchten Regionen des Gehirns. (In der Niere, Leber und Lunge zeigten längere Belichtungen desselben Northern Blots, dass STM2 mit niedrigen Spiegeln in diesen Geweben anwesend ist; Daten nicht gezeigt). Hohe Expressionsspiegel wurden im Pankreas, Herz und Skelettmuskel beobachtet. In diesen drei Geweben wurde ein zweites 2,8 kb Transkript beobachtet. Von der STM2 cDNA-Sequenz wurden zwei potentielle Polyadenylierungs-Signale bei den Nukleotiden 1834 und 2309 identifiziert (Gesamtlänge des Klons, 2167 bp). Um zu bestimmen, ob die 2,4 und 2,8 kb Transkripte verschieden lange 3' UTR-Polyadenylierungs-Varianten repräsentieren könnten, wurden RNA-Blots mit einer Sonde, die die gesamte 3' UTR umfasst, und einer Sonde, die nach der ersten Polyadenylierungs-Stelle beginnt, hybridisiert. Beide Sonden ergaben identische Muster, was anzeigt, dass nur die zweite Polyadenylierungs-Stelle verwendet wurde.
Bei dem Versuch, Homologe von STM2 zu identifizieren, wurde Leber und Pankreas-cDNA mit degenerativen Primern, die auf der STM2-Sequenz basieren, amplifiziert. Zweiundzwanzig M13 rekombinante Klone wurden identifiziert und sequenziert, welche alle mit STM2 korrespondierten. Sieben der 22 Klone hatten die Sequenz GAGATGGAAGAC, beginnend bei Nukleotid 1327 in der cDNA-Sequenz, welche 3 bp kürzer ist, als die zuvor berichtete Sequenz (AGATGG|AAGAAGAC, wobei „|" die Verbindung („junction") zwischen den Exons 9 und 10 anzeigt). Das kürzere Transkript kodiert für ein vorhergesagtes Protein, das eine Aminosäure kürzer ist (EMED versus EMEED) ohne Rahmenverschiebung. Das kürzere Transkript ist wahrscheinlich das Ergebnis von alternativem Spleißen des Exons 10, wobei das erste kodierende AG-Dinukleotid als die Spleiß-Akzeptor-Sequenz oder ein Polymorphismus verwendet wird. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurde RNA und DNA von einer Lymphoblastoid-Zelllinie von einem normalen (nicht-AD) VG-Subjekt in der HD-Familie präpariert. Beide Transkripte waren in RT-PCR-Produkten unter Verwendung der Primer EX103L und EX102R von Exons 9 und 10 anwesend. Wenn jedoch die Region von Intron 9 bis Exon 10 der genomischen DNA derselben Subjekte sequenziert wurde, wurde eine einzige Sequenz, die mit der genomischen Sequenz korrespondiert, erhalten. Daher entstehen die zwei verschiedenen Transkripte durch alternatives Spleißen. Beide Transkripte wurden ebenso in Leukozyten, im Skelettmuskel und in einer fötalen Hirn-Bibliothek (Clontech) beobachtet, wobei das längere Transkirpt reichlicher vorhanden war. Jedoch wurde in einer anderen fötalen Hirn-Bibliothek (Stratagene) nur das lange Transkript beobachtet, während in einer Vorhaut-Fibroblasten-Bibliothek nur das kürzere Transkript gefunden wurde.
Tabelle 7. Primer für die RNA-Analyse
Seqenzprotokoll

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die in 2 angegebene Aminosäure umfaßt, oder die dazu komplementäre Sequenz.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül die Nukleotid-Sequenz wie in 1 angegeben aufweist, oder die dazu komplementäre Sequenz.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das für die in 2 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, die eine Aminosäuresubstitution an Rest 141 aufweist, oder die dazu komplementäre Sequenz.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei die Aminosäuresubstitution an Rest 141 von Asparagin zu Isoleucin ist.
Expressionsvektor, umfassend einen Promotor, der operativ an ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-4 verbunden ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem CMV I-E Promotor, einem SV40 frühen Promotor und einem MuLV LTR.
Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der Promotor ein gewebespezifischer Promotor ist.
Viraler Vektor, enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1-4 der in der Lage ist dessen Expression zu steuern.
Viraler Vektor nach Anspruch 8, wobei der Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Herpes-Simplex viralen Vektor, einem adenoviralen Vektor, einem Adenovirus assoziierten viralen Vektor und einem retroviralen Vektor.
Wirizzelle, die einen Vektor nach einem der Ansprüche 5-9 trägt.
Wirtzzelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer menschlichen Zelle, einer Hundezelle, einer Affenzelle und einer Mauszelle.
Isoliertes Protein, umfassend die Aminosäuresequenz wie in 2 angegeben.
Isoliertes Protein, umfassend die Aminosäuresequenz wie in 2 angegeben, das eine Aminosäuresubstitution an Rest 141 aufweißt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 13, wobei die Substitution an Rest 141 eine Substitution von Asparagin zu Isoleucin ist.
Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält oder exprimiert zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Morbus Alzheimer.
Vektor, der eine Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält oder exprimiert zur Verwendung in der Therapie.
Protein nach einem der Ansprüche 12-14 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments, wobei das Medikament die Wahrscheinlichkeit des Ausbrechens von Morbus Alzheimer verringert oder den Ausbruch verzögert.
Protein nach einem der Ansprüche 12-14 zur Verwendung in der Therapie.
Antikörper, spezifisch für ein Protein nach einem der Ansprüche 13-14 zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Morbus Alzheimer.
Antikörper, der für ein Protein nach einem der Ansprüche 13-14 spezifisch ist, zur Verwendung in der Therapie in einer in vivo Verabreichung.
Pharmazeutisches Produkt, umfassend einen Vektor, der das Nukleinsäuremolekül nach entweder Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfaßt, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Wirtszelle nach entweder Anspruch 10 oder 11, gemeinsam mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach Anspruch 12, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Antikörper, der spezifisch an das Protein nach einem der Ansprüche 12-14 bindet.
Antikörper nach Anspruch 24, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 25, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fab Fragment, einem Fv Fragment und einem Einzelkettenfragment.
Hybridom, das in der Lage ist, den Antikörper nach Anspruch 25 herzustellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 24-26, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Paar von Primern, die in der Lage sind, alles oder einen Teil eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1-4 zu amplifizieren.
Primer nach Anspruch 29, wobei die Primer mindestens 12 Nukleotidbasen umfassen.
Verfahren zum Diagnostizieren eines Patienten, der eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Erkrankung an Alzheimer Erkrankung aufweist, umfassend: (a) In Kontakt bringen (1) einer Probe, die ein Nukleinsäuremolekül umfaßt, wobei die Probe von einem Patienten erhalten wurde, mit (2) einer Sonde, die in der Lage ist, spezifisch an die Nukleinsäure zu hybridisieren, umfassend die in 1 angegebene Sequenz, wobei die Sequenz die Aminosäuresequenz wie in 2 angegeben kodiert, wobei der Aminosäurerest 141 von Asparagin zu Isoleucin verändert ist, unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend ist, um das Auftreten einer Hybridisierung zu ermöglichen; und (b) Nachweisen der Anwesenheit der hybridisierten Sonde und dadurch Nachweisen, daß der Patient eine erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung an Morbus Alzheimer aufweist.
Verfahren zum Diagnostizieren eines Patienten, der eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Erkrankung an Alzheimer Erkrankung aufweist, umfassend: (a) In Kontakt bringen einer Probe, die ein Nukleinsäuremolekül umfaßt, wobei die Probe von einem Patienten erhalten wurde, mit Primern, die in der Lage sind, spezifisch eine Nukleinsäure zu amplifizieren, die die in 1 angegebene Nukleotidsequenz umfaßt, wobei die Nukleotidsequenz für die Aminosäuresequenz wie in 2 angegeben kodiert, wobei der Aminosäurerest 141 von Asparagin zu Isoleucin verändert ist; und (b) Nachweisen der Anwesenheit der amplifizierten Nukleinsäuresequenz und dadurch Bestimmen, daß der Patient eine erhöhte Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung an Morbus Alzheimer aufweist.
Verfahren zur Diagnostizierung eines Patienten, der eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Erkrankung an Morbus Alzheimer aufweist, umfassend: (a) In Kontakt bringen (1) einer biologischen Probe, die von einem Patienten erhalten wurde, mit (2) einem Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid bindet, umfassend die Aminosäuresequenz wie in 2 angegeben, worin der Aminosäurerest 141 von einem Asparagin zu Isoleucin verändert ist unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend ist, um die Bindung eines Antikörpers an das Protein zu ermöglichen; und (b) Nachweisen der Anwesenheit des gebundenen Antikörpers.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Peptid umfassend einen Teil eines Polypeptids das die in 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist, wobei der Teil ein Isoleucin an Aminosäurerest 141 umfaßt, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Nicht-menschliches transgenes Tier, dessen Keimzellen und somatischen Zellen ein Gen enthalten, das in der Lage ist, für die in 2 angegebene Aminosäuresequenz zu kodieren, operativ verbunden mit einem Promotor, der für die Expression des Gens effektiv ist, wobei das Gen in das Tier oder einem Vorfahren des Tieres, in einer embryonalen Phase eingeführt wurde.
Transgenes Tier nach Anspruch 35, wobei das Tier ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Maus, einer Ratte oder einem Hund.
Transgenes Tier nach Anspruch 35, wobei die wie in 1 angegebne Sequenz von einem Vektor nach einem der Ansprüche 5-9 exprimiert wird.
Transgenes Tier nach Anspruch 35, wobei das Gen für die wie in 2 angegebene Aminosäuresequenz kodiert, wobei der Aminosäurerest 141 von Aspargin zu Isoleucin verändert ist.
Isoliertes DNA Molekül, umfassend eine AD4 Gensequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz wie angegeben in 13, 14, 15, 16, 17, 18 und 19.