DE69634421T2 - Gene und genprodukte bezogen auf das werner-syndrom - Google Patents

Gene und genprodukte bezogen auf das werner-syndrom Download PDF

Info

Publication number
DE69634421T2
DE69634421T2 DE69634421T DE69634421T DE69634421T2 DE 69634421 T2 DE69634421 T2 DE 69634421T2 DE 69634421 T DE69634421 T DE 69634421T DE 69634421 T DE69634421 T DE 69634421T DE 69634421 T2 DE69634421 T2 DE 69634421T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nucleic acid
seq
wrn
gene
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69634421T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69634421D1 (de
Inventor
Junko Oshima
Ying-Hui Fu
Chang-En Yu
John Mulligan
D. Gerald SCHELLENBERG
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Darwin Molecular Corp
Original Assignee
Darwin Molecular Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Darwin Molecular Corp filed Critical Darwin Molecular Corp
Application granted granted Critical
Publication of DE69634421D1 publication Critical patent/DE69634421D1/de
Publication of DE69634421T2 publication Critical patent/DE69634421T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Werner-Syndrom und spezieller auf für die Benutzung bei der Diagnose und Behandlung des Werner-Syndroms geeignete Verfahren und Zusammensetzungen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Werner-Syndrom ist eine autosomale, rezessive Funktionsstörung mit einem komplexen Phänotyp. Die Funktionsstörung äußert sich durch verfrühtes Auftreten von altersbezogene Krankheiten und das vorzeitige Auftreten einiger physischer Kennzeichen des normalen Alterungsprozesses. Die Symptome treten normalerweise nach der Pubertät auf. Die Funktionsstörung entwickelt sich während des Lebens und die Patienten haben typischerweise eine verkürzte Lebenserwartung mit einem modalen Sterbensalter von 47 Jahren. Die Prävalenz des Werner-Syndroms wird für Heterozygoten auf 1 bis 5 pro 1000 Individuen und für Homozygoten auf 1 bis 22 pro 1.000.000 Individuen geschätzt.
  • Klinische Symptome des Werner-Syndroms schließen sowohl eine Prävalenz der altersbezogenen Funktionsstörung als auch physische Kennzeichen des Alterungsprozesses ein. Solche Krankheiten umfassen Arteriosklerose und Herzerkrankungen, gut- und bösartige Neoplasmen (gewöhnlicherweise Sarkome), Diabetes Mellitus, Osteoporose, und Augenkatarakte. Das physische Erscheinungsbild der WS-Patienten manifestiert sich durch eine kleine Statur, vorzeitiges Ergrauen oder Haarverlust, Hypogonadismus, veränderte Hautpigmentierung, Hyperkeratose, straffe Haut, vogelartiges Gesicht, Hautatrophie, kutane Beingeschwüre und Telangiektasie. Viele dieser Erkrankungen und Kennzeichen treten bei 40 bis 90% der WS-Patienten auf. Die Diagnose des Werner-Syndroms stützt sich hauptsächlich auf das Auftreten einer gewissen Anzahl dieser Erkrankungen und Kennzeichen. Ein biochemischer Test, exzessive Exkretion und Hyaluronsäure im Urin können auch benutzt werden, um die Diagnose zu unterstützen.
  • Außer den genannten Zeichen und Symptomen des Alterungsprozesses, imitiert das Werner-Syndrom den normalen Altersprozess ausgewiesen durch das replikative Potential der von den WS-Patienten isolierten Fibroblasten. Das replikative Potential der Fibroblasten ist bei diesen Patienten im Vergleich zu den von gleichaltrigen Fibroblasten reduziert, und ist vergleichbar mit dem replikativen Potential von aus älteren Personen entnommenen Fibroblasten. Außerdem ist eine höhere Mutationsrate bei WS-Patienten beschrieben worden. Solch eine Anomalie ist als Chromosomensinstabilität, wie z.B. Inversionen, reziproke Translokationen, Deletionen, Pseudodiploidie, und als erhöhte Mutationsrate beim Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase-Gen (HPRT) offenkundig.
  • Das Werner-Syndrom ist als autosomale rezessive Krankheit anerkannt worden. Goto et al. (Got et al. Nature 355: 735–738, 1992) haben das WS-Gen auf dem kurzen Arm des Chromosoms 8 mit Hilfe von 21 betroffenen japanischen Familien kartiert. Dieses Gen liegt zwischen dem Marker D8S131 und Ankyrin (ANK1). Vor kurzem haben verfeinerte Kartierungen das WS-Gen in einem Bereich zwischen dem Marker D8S131 und D8S87, einem 8,3 cM-Intervall, genau lokalisiert. Eine Identifizierung des Gens und des Genprodukts sollte beträchtlich dazu beitragen, die Grundlage des Werner-Syndroms zu verstehen und biochemische und genetische Denkansätze für die Diagnose und die Behandlung ermöglichen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein neues, vorher noch nicht identifiziertes Gen für das Werner-Syndrom und Zusammensetzungen für die Diagnose und Behandlung des Werner-Syndroms, sowie andere zugehörige Vorteile zur Verfügung.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt anspruchsgemäß isolierte Nukleinsäuremoleküle, Primerpaare, virale Vektoren, rekombinante Wirtszellen, isolierte Proteine, Antikörper, Hybridome und transgene nichtmenschliche Tiere zur Verfügung.
  • Kurz gesagt stellt die vorliegende Offenlegung isolierte Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung, die das WS-Gen sowie Teile davon kodieren, wovon einige kennzeichnend auf den Figuren dargestellt sind. Das vom WRN-Gen kodierte Protein wird im folgenden als „WRN-Protein" bezeichnet. In anderen Ausführungsformen werden Nukleinsäuremolküle zur Verfügung gestellt, die ein mutantes WRN-Gen-Produkt kodieren, das die Wahrscheinlichkeit des Auftretens des Werner-Syndroms erhöht (auf statistisch signifikante Weise). Repräsentative parstellungen solcher Mutanten werden im Beispiel 3 dargestellt.
  • Es werden in anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung gestellt, die bestehen aus: (a) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, oder komplementäre Sequenzen davon, wie es in den Figuren dargestellt ist, (b) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül das auf spezifische Weise unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert mit dem Nukleinsäuremolekül (a), und (c) ein isoliertes Nukleinsäuremolekül das ein WRN-Genprodukt (WRN-Protein) kodiert. Wie in diesem Text benutzt, so sollte man verstehen, dass ein Nukleinsäuremolekül „spezifisch" mit einem WRN-Gen (oder der in Beziehung stehenden Sequenz) hybridisieren, falls es detektierbar mit einer solchen Sequenz und nicht signifikant oder detektierbar mit dem Gen des Bloom-Syndroms hybridisiert (Ellis et al., Cell 83: 655–66, 1995).
  • In anderen Ausführungsformen werden Expressionsvektoren zur Verfügung gestellt, die operabel verknüpft sind mit einem der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle. Repräsentative Beispiele von geeigneten Promotern umfassen gewebespezifische Promoteren, ebenso wie den CMV-I-E-Promoter, den SV-Early-Promoter und MuLVLTR. In Beziehung stehenden Ausführungsformen werden virale Vektoren zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, die Expression eines Nukleinsäuremoleküls wie oben beschrieben zu führen. Repräsentative Beispiele solcher viraler Vektoren umfassen Herpes Simplex-Virus-Vektoren, Adenovirusassoziierte-Vektoren und Retrovirus-Vektoren. Es werden außerdem Wirtszellen zur Verfügung gestellt (z.B. Hund-, Menschen-, Affen-, Ratten- oder Mäusezellen) welche die oben beschriebenen Vektoren transportieren.
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Offenlegung werden isolierte Proteine oder Polypeptide, die ein WRN-Genprodukt umfassen, sowie Peptide mit mehr als 12, 13 oder 20 Aminosäuren zur Verfügung gestellt. In einer anderen Ausführungsform ist das Protein ein mutantes WRN-Genprodukt, das die Wahrscheinlichkeit des Werner-Syndroms erhöht.
  • In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Offenlegung werden Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung des Werner-Syndroms (ebenso wie dazu in Beziehung stehende weiter unten ausführlicher diskutierte Krankheiten), ebenso wie den Schritt zur Verabreichung eines oben beschriebenen ein Nukleinsäuremolekül enthaltenden oder exprimierenden Vektors an den Patienten zur Verfügung gestellt, wodurch die Wahrscheinlichkeit des Werner-Syndroms (oder die dazu in Beziehung stehende Krankheit) reduziert oder sein Auftreten beim Patienten verzögert wird. In einer Ausführungsform werden Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung des Werner-Syndroms (oder dazu in Beziehung stehender Krankheit) ebenso wie den Schritt zur Verabreichung eines oben beschriebenen Proteins an den Patienten zur Verfügung gestellt, wodurch die Wahrscheinlichkeit des Werner-Syndroms (oder die dazu in Beziehung stehende Krankheit) reduziert oder sein Auftreten beim Patienten verzögert wird. In gewissen Ausführungsformen können die obigen Verfahren durch eine in vivo-Verabreichung ausgeführt werden.
  • Von der vorliegenden Offenlegung werden auch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die ein Nukleinsäuremolekül, einen Vektor, eine Wirtszelle, ein Protein oder einen Antikörper, zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Träger oder Lösemittel wie es oben beschrieben worden ist, umfassen.
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Offenlegung werden Antikörper, die sich spezifisch an ein WRN-Protein oder einzelnen davon abgeleitenden Proteinen binden, zur Verfügung gestellt. Wie hier beschrieben worden ist, sollte man verstehen, dass ein Antikörper spezifisch für ein WRN-Protein (oder -Peptid) ist, falls es sich detektierbar mit einem Kd von 10–7 M oder weniger (z.B. 10–8 M, 10–9 M, usw.) aber sich nicht detektierbar (oder mit einer Affinität von mehr als 10–7 M (10–6 M, 10–5 M, usw.) an eine fremde Helikase (z.B. das Bloom-Syndrom-Gen, supra), bindet. Es werden außerdem Hybridomas zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, solche Antikörper zu bilden.
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Offenlegung werden Nukleinsäuresoden zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, spezifisch unter Bedingungen hoher Stringenz mit einem WRN-Gen zu hybridisieren (wie es unten de finiert ist). In einer dazu in Beziehung stehenden Ausführungsform umfassen solche Sonden mindestens einen Teil der in den Figuren gezeigten Nukleotidsequenz oder deren komplementären Sequenz, wobei die Sonde in der Lage ist, spezifisch mit einem mutanten WRN-Gen unter Bedingungen hoher Stringenz zu hybridisieren. Repräsentative Sonden der vorliegenden Erfindung sind allgemein mindestens 12 Nukleotidbasen in der Länge, obgleich es 14, 16, 18 oder mehr sein können. Es werden auch Primerpaare zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, alle oder einen Teil jedes der hier offengelegten Nukleinsäuremoleküle spezifisch zu amplifizieren.
  • In anderen Ausführungsformen der Offenlegung werden Verfahren zur Diagnose eines Patienten der eine erhöhte Wahrscheinlichkeit am Werner-Syndrom (oder eine dazu in Beziehung stehende Krankheit) zu erkranken, aufweist, welche folgende Schritte aufweisen: (a): Erhalt einer eine Nukleinsäure aufweisenden biologischen Probe von einem Patienten, (b): Inkubieren der Nukleinsäure mit einer Sonde die in der Lage ist, mit einem mutanten WRN-Gen unter Bedingungen und für eine für eine Hybrisierung ausreichende Zeit zu hybridisieren, und (c): Detektion der Gegenwart einer hybridisierten Sonde, und dabei Bestimmung dass der Patient eine erhöhte Wahrscheinlichkeit hat am Werner-Syndrom (oder eine in Beziehung stehende Krankheit) zu erkranken. In einer anderen Ausführungsform werden Verfahren zur Verfügung gestellt, die folgende Schritte aufweisen: (a): Erhalt einer eine Nukleinsäure aufweisenden biologischen Probe von einem Patienten, (b) Amplifizierung einer mit einem mutanten WRN-Gen assoziierten ausgewählten Nukleinsäuresequenz, (c): Detektion der Anwesenheit einer amplifizierten Nukleinsäuresequenz und dabei Bestimmung dass der Patient eine erhöhte Wahrscheinlichkeit hat, am Werner-Syndrom (bzw. einer damit in Beziehung stehenden Krankheit) zu erkranken. Geeignete biologische Proben umfassen Kerne enthaltende Zellen die aus peripherem Blut, buccale Abstriche oder Gehirngewebe erhalten worden sind.
  • In einer anderen Ausführungsform werden Peptidimpfmittel zur Verfügung gestellt, welche einen Teil eines, eine Mutation enthaltendes mutantes WRN-Genprodukt kombiniert mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Lösungsmittel umfassen.
  • In einer anderen Ausführungsform werden transgene nichtmenschliche Tiere zur Verfügung gestellt, deren Keimzellen und somatische Zellen ein WRN-Gen (oder das Fehlen davon, d.h. ein „knock out") enthalten, das operabel mit einem Promoter verknüpft ist, der wirksam zur Expression des Gens ist, wobei das Gen in das nichtmenschliche Tier in das nichtmenschliche Tier oder in einen Vorfahren des nichtmenschlichen Tiers in einem embryonalen Zustand eingeführt wird. In einer Ausführungsform ist das nichtmenschliche Tier eine Maus, eine Ratte oder ein Hund.. In anderen Ausführungsformen wird das WRN-Gen wie oben beschrieben durch einen Vektor exprimiert. In noch einer anderen Ausführungsform kodiert das WRN-Gen ein mutantes WRN-Genprodukt.
  • Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Offenlegung werden offenkundig unter Bezugnahme auf die folgende Beschreibung und die im Anhang befindlichen Zeichnungen. Außerdem werden verschiedene Bezugnahmen hier fortgesetzt die ausführlicher gewisse Prozeduren oder Zusammensetzungen (z.B. Plasmide, usw.) beschreiben, und deshalb durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit integriert sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN UND SEQUENZAUFLISTUNG
  • Die 1 ist eine genetische und physische Karte der WRN-Region. Die genetische Karte (A) der Region ist sexgleich mit in cM angegebenen Distanzen. Die benutzten polymorphischen Stellen (B) sind zwei- und dreikernige STRP-Orte. Die dargestellte physische Karte (C) weist ungefähre Distanzen auf, die aus den Größen sich überlappender nicht chimerischer YACs und der genomischen DNS-Sequenz der sich überlappender P1-Klone 2233, 2253, 3833, 2236 und 3101 bestimmt worden sind. Die Marker-Reihenfolge ist aus dem Inhalt des „sequence tagged sites" (STS) der YACs, der P1-Klone, und der Cosmid-Klone und aus der genomischen DNA-Sequenz der P1-Klone bestimmt worden. Die dargestellten YACs (D) stellen das „minimal tiling" dar und sind die YACs, die für cDNS-Auswahlversuche benutzt worden sind. Die für den „minimal tiling path" erforderlichen P1-Klone und die Cosmid-Klone werden in (E) gezeigt. Die gezeigten Klone sind außer 8C11, der ein Cosmid-Klon ist, P1-Klone. Die Klon-Reihenfolge ist mit Hilfe des STS-Inhalts hergestellt worden.
  • Die 2A und 2B sind die DNS (Sequenzidentifikation Nr. 70) und erwartete Aminosäurensequenzen (SEQ ID Nr. 71) des WRN-Gentranskripts. Der 1-Letter Aminosäurencode wird in 2B benutzt.
  • Die 3A bis 3C sind die DNS und die erwartete Aminosäurensequenz eines alternativen WRN-Gentranskrips (SEQ ID Nummern 72 und 73).
  • Die 4A bis 4G sind eine Aufreihung des WRN-Genprodukts (SEQ ID Nr. 74) mit den bekannten Helikasen von S. pompe (SEQ ID Nr. 76), E. Coli (SEQ ID Nr. 75), Mensch (SEQ ID Nr. 77) und dem Bloom-Syndrom-Gen „BLM" (SEQ ID Nr. 78).
  • Die 5A bis 5U sind die genomische DNS-Sequenz der ein WRN-Gen (SEQ ID Nr. 79) umfassenden Region.
  • Die 6 stellt eine cDNS-Sequenz des WRN-Mausgens (SEQ ID Nummern 205 und 206) dar.
  • Die 7 ist eine genomische DNS-Sequenz des WRN-Mausgens (SEQ ID Nummern 207 bis 209).
  • Die 8 ist ein Schema des WRN-Genprodukts mit dem Ort der Mutationen A, WRN-cDNS. Die Nummerierung auf der Oberseite bezieht sich auf die DNS-Sequenz sowie in der Genbank L76937.B, erwartetes WRN-Genprodukt nummeriert worden ist. Die Helikasedomäne ist mit „HD" bezeichnet, es sind ebenfalls die Motive I bis VI, die Orte der Mutationen angegeben. Die Nummerierung auf der Unterseite bezieht sich auf die Mutationen: *: Nonsense-Mutation, ^: durch eine einzige Basendeletion erzeugte Frame-Shift-Mutation. Graue Linie: Deletion von Exon(en) erzeugenden Frameshift-Mutationen. D, erwartete Proteine. Die Linien stellen erwartete gekürzte Proteine dar, die aus Mutationen im WRN-Gen produziert worden sind.
  • Die 9A, 9B und 9C sind Darstellungen die die Lokalisation des WRN-Genprodukts durch Fluoreszenz-Antikörper-Färbung (Panel A), Kerne (Panel B) und die Größe von das WRN-Gen exprimierender Zellen (Panel C) zeigen.
  • Die 10 zeigt eine Aufreihung der WRN-Genprodukte von Maus und Mensch.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG.
  • Definitionen
  • Vor der ausführlichen Darlegung der Erfindung kann es für deren Verständnis hilfreich sein, gewisse Ausdrücke zu definieren und die im Folgenden benutzten Abkürzungen aufzulisten und zu definieren.
  • „Genetischer Marker" ist jedes beliebige Segment eines Chromosoms, das unterscheidbar einzigartig im Genom, und polymorphisch in der Population zu finden ist, um Informationen über die Vererbung von verknüpften DNS-Sequenzen, Genen und/oder anderen Markern zur Verfügung zu stellen.
  • Der Ausdruck „Vektor" bezieht sich auf eine Gruppe, die in der Lage ist, die Expression eines WRN-Gens, ebenso wie von jeder zusätzlichen Sequenz(en) oder Gen(e) von Interesse zu leiten. Der Vektor muss Transkriptionspromoterelemente umfassen, die operabel mit den Genen von Interesse verknüpft sind. Der Vektor kann entweder aus Desoxyribonukleinsäuren („DNS"), Ribonukleinsäuren („RNS" oder einer Kombination aus beiden bestehen (z.B. ein chimerisches DNS-RNS). Optional kann der Vektor Polyadenylierungssequenz, eine oder mehrere Restriktionssitze, ebenso wie einen oder mehrere auswählbare Marker wie Neomyzin-Phosphotransferase oder Hygromycin-Phosphotransferase umfassen. Außerdem können, in Abhängigkeit von der gewählten Wirtszelle und dem eingesetzten Vektor, andere genetische Elemente als Ursprung der Replikation, zusätzliche Nukleinsäurerestriktionssitze, Enhancer, Sequenzen, die die Induzierbarkeit der Transkription verleihen, und auswählbare Marker in die hierin beschriebenen Marker integriert werden.
  • Abkürzungen: YAC: künstliches Hefe-Chromosom; EST: exprimierte „sequence tags"; PCR: Polymerasekettenreaktion; RT-PCR: PCR-Verfahren, bei dem die RNS zuerst im, ersten Schritt bei dem die reverse Transkription benutzt wird, in ein DNS transkriptiert wird; cDNS, bei dem jedes DNS durch Kopierung einer RNS-Sequenz in DNS-Form erzeugt wird.
  • Wie es oben angegeben ist, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen für die Detektion und die Behandlung des Werner-Syndroms und ebenso der dazu in Beziehung stehenden Krankheiten zur Verfügung. Diese Verfahren und Zusammensetzungen umfassen eine Familie von Genen, die mit dem Werner-Syndrom in Beziehung stehen, und die davon kodierten Proteine, die beim Auftreten des Werner-Syndroms impliziert sind. Diese Gene und Proteine, einschließlich der Nukleinsäuresequenzen und Klone, sind auch nützlich bei der Erzeugung von in vitro-Modellen und Tiermodellen und der Screening-Tests, die für die Untersuchung des Werner-Syndroms nützlich sind, wobei die mögliche Identifizierung anderer an dem Werner-Syndrom beteiligter Gene eingeschlossen ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch Vektorkonstrukte, genetische Marker, Nukleinsäuresequenzen, Klone, diagnostische Tests und Zusammensetzungen und Verfahren für die Identifizierung von Patienten die wahrscheinlich unter dem Werner-Syndrom leiden, zur Verfügung.
  • Gene und Genprodukte, die mit dem Werner-Syndrom in Beziehung stehen
  • Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung, die einen Teil des beim Auftreten des Werner-Syndroms beteiligten Gens umfasst. Kurz, kodiert dieses Gen, wie es auf der 4 zu sehen ist, ein Protein, das in der Aminosäuresequenz mehreren bekannten ATP-abhängiger DNS-Helikasen ähnlich ist (Enzyme die das DNS-Duplex abwickeln). Es ähnelt weniger den bekannten RNS-DNS-Helikasen. Helikasen sind bei der Replikation von DNS beteiligt, wobei oft der Replikations-Ursprung und/oder der Replikationskomplex gebunden wird. Außerdem kann die einsträngige DNS die bei der Rekombination beteiligt ist, von DNS-Helikasen erzeugt werden.
  • Obwohl verschiedene Aspekte des WRN-Gens (oder Teile davon) auf den Figuren gezeigt werden, so sollte man doch verstehen, dass im Kontext der vorliegenden Erfindung, die Bezugnahme von einem oder mehrerer Derivate dieser Gene, die im wesentlichen den Genen (und, wo es angepasst ist, die Proteine (einschließlich von Peptiden und Polypeptiden) die von den Genen und ihren Derivaten kodiert worden sind) eingeschlossen ist Wie es hier benutzt wird, ist eine Nukleidsequenz als „im wesentlichen ähnlich" angesehen, falls: (a) die Nukleotidsequenz von der Codierungsregion der beschriebenen Gene deriviert ist und z.B. Teile der Sequenz oder allelische Variationen der oben beschriebenen Sequenzen umfasst oder alternativ eine helikaseähnliche Aktivität kodiert (Bjomson et al., Biochem. 3307: 14306–14316, 1994); (b) die Nukleotidsequenz zur Hybridisierung mit Nukleotisequenzen der vorliegenden Erfindung unter hoher und sehr hoher Stringenz in der Lage ist (siehe Sambrock et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989); oder (c) die Nukleinsäuresequenzen degenerieren wegen des genetischen Codes in die in (a) oder (b) definierten Nukleotinsäuresequenzen. Außerdem umfassen die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen komplementäre und nicht komplementäre Sequenzen, wobei die zur Verfügung gestellten Sequenzen außerdem die hierin ausgeführten Kriterien erfüllen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet hohe Stringenz Standard-Hybridisierungs-Bedingungen (z.B. 5 × SSPE, 0,5% SDS bei 65°C oder etwas äquivalentes) während sehr hohe Stringenz solche Hybridisierungsbedingungen dass die Nukleotidsequenz in der Lage ist, selektiv mit einem einzigen Allel des mit dem Werner-Syndrom in Beziehung stehenden Gens zu hybridisieren.
  • Das WRN-Gen kann aus dem genomischen DNS oder cDNS isoliert werden. Genomische DNS-Bibliotheken, die in Form von Chromosomvektoren konstruiert sind, wie YACs (künstliche Hefe-Chromosomen), bakteriophage Vektoren, wie λEMBL3, λgt10, Cosmide, oder Plasmide sind zum Benutzen geeignet. cDNS-Bibliotheken, die in Form von bakteriophagen Vektoren, Plasmiden oder anders konstruiert sind, sind für ein Screening geeignet. Solche Bibliotheken können konstruiert werden, indem aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren und Techniken benutzt werden (siehe Sambrook et al.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989) oder werden aus kommerziellen Quellen erworben (z.B. Clontech, Palo Alto, CA). In einer Ausführungsform wird das WRN-Gen mit Hilfe von PCR isoliert, die an genomischem DNS, cDNS oder DNS aus den Bibliotheken durchgeführt wird, oder wird durch Sonden-Hybridisierung von genomischer DNS oder cDNS-Bibliotheken isoliert. Primer für PCR und Sonden für Hybridisierungs-Screening können basierend auf der DNS-Sequenz von hier dargestelltem WRN entworfen werden. Die DNS-Sequenz von einem Teil des WRN-Gens und die ganze Kodierungssequenz werden in den Figuren dargestellt. Primer für PCR sollten von Sequenzen in der 5' und 3'-UTR (untranslated region) deriviert werden, um eine ganzlängige cDNS zu isolieren. Die Primer sollten weder selbstkomplementäre noch komplementäre Sequenzen an ihrem 3'-Ende haben (um einer Primer-Dimer-Bildung zu vermeiden). Die Primer haben bevorzugt einen Gc-Inhalt von ca. 50% und enthalten Restriktions-Orte. Die Primer werden mit cDNS verbunden und es werden genügend PCR-Zyklen ausgeführt, um ein leicht durch Gelelektrophorese und Färbung visualisierbares Produkt zu erhalten. Das amplifizierte Fragment wird gereinigt und in einen Vektor wie λgt10 oder pBS(M13+) eingeführt und propagiert. Es kann eine für genomisches Screening oder cDNS-Bibliotheken geeignete Oligonukleotid-Hybridisierungs-Sonde basierend auf der hier zur Verfügung gestellten Sequenz entworfen werden. Bevorzugt ist das Oligonukleotid 20 bis 30 Basen lang. Solch ein Oligonukleotid kann durch automatische Synthese synthetisiert werden. Das Oligonukleotid kann passend am 5'-Ende mit einem Reportermolekül wie einem Radionuklid (z.B. 32p) oder Biotin markiert werden. Die Bibliothek ist von Kolonien oder Phagen in Abhängigkeit vom Vektor belegt und die rekombinante DNS wird auf Nylon- oder Nitrozellulosemembranen transferiert. Nach der Denaturierung, der Neutralisierung und Fixierung der DNS auf der Membran, werden die Membranen mit der markierten Sonde hybridisiert. Die Membranen werden gewaschen und das Reportermolekül detektiert. Die Hybridisierungs-Kolonien oder -Phagen werden isoliert und propagiert. Kandidatenklone oder PCR-amplifizierte Fragmente können durch jedes beliebige Mittel auf WRN-DNS-Gehalt geprüft werden. Die Kandidatenklone können z.B. mit einer zweiten, nicht überlappenden Sonde hybridisiert werden oder einer DNs-Sequenzanalyse unterzogen werden. Auf diese Weise werden Klone enthaltende WRN-Gene welche zur Benutzung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, isoliert.
  • Die Struktur der hier beschriebenen durch Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine kann aus den primären Translationsprodukten unter Benutzung der Hydrophobizitätsplotfunktion von z.B. P/C Gen, Lasergen System, DNA STAR, Madison, Wisconsin oder gemäß den von Kyte und Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105–132, 1982) beschriebenen Verfahren vorhergesagt worden.
  • WRN-Proteine der vorliegenden Erfindung können in der Form von sauren oder basischen Salzen oder in neutraler Form präpariert werden. Außerdem können individuelle Aminosäurenreste durch Oxydierung oder Reduktion modifiziert werden. Außerdem können verschiedene Substitutionen, Deletionen, oder Additionen an den Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen vorgenommen werden, wobei deren klare Wirkung hervorzuheben ist oder die biologische Aktivität des mutanten oder wildtype-Proteins verstärkt oder abschwächt. Außerdem kann es eine erhebliche Variation in der dieselbe Aminosäuresequenz kodierenden Nukleidsequenz wegen der Degenerierung des genetischen Codes geben.
  • Andere Derivate der hierin offen gelegten WRN-Proteine umfassen Konjugate der Proteine zusammen mit anderen Proteinen oder Polypeptiden. Dies kann z.B. durch die Synthese von N-Terminal- oder C-Terminal-Fusionsproteinen ausgeführt werden, welche hinzugefügt werden können um die Purifikation oder Identifikation von WRN-Proteinen zu vereinfachen (siehe U.S. Patent no. 4, 851, 341; siehe auch Hopp et al., Biol. Technology 6: 1204, 1988). Alternativ können Fusionsproteine wie WRN-Protein-Q-Galaktosidase oder WRN-Protein-Luziferase konstruiert werden, um bei der Identifikation, der Expression und der Analyse von WRN-Proteinen zu assistieren.
  • WRN-Proteine der vorliegenden Erfindung können durch Benutzung einer weiten Varietät von hierin beschriebenen Techniken konstruiert werden. Außerdem können Mutationen an besonderen Stellen durch Synthetisierung von einem eine mutante Sequenz aufweisenden Oligonukleotid eingeführt werden, flankiert von Restriktionorte, die eine Bindung mit Fragmenten der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Bindung kodiert die sich resultierende wieder konstruierte Sequenz ein Derivate, das die gewünschte Aminosäureninsertion, -substitution oder -deletion aufweist.
  • Alternativ können Oligonucleotid-orientierte ortspezifische (oder segmentspezifische) Mutageneseprozeduren eingesetzt werden, um ein verändertes besondere, entsprechend der erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion, Codons aufweisendes verändertes Gen zur Verfügung zu stellen. Beispielhafte Verfahren zur Ausführung der oben aufgeführten Veränderungen werden von Walter et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craig (Bio Techniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Prinzipien und Verfahren. Plenum Press, 1981) und Sambrooh et al. (supra) offenbart. Die Deletions- oder gekürzte Derivate der WRN-Proteine (z.B. ein löslicher extrazellulärer Teil) können auch konstruiert werden, indem geeignete an die gewünschte Deletion angrenzende Restriktions-Endonuklease-Orte benutzt werden. Nach der Restriktion, können Überbleibsel eingeführt und die DNS degradiert werden. Beispielhafte Verfahren zum Ausführen der obigen Veränderungen werden von Sambrook et al. (Molecular Cloning: Ein Laborhandbuch, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) offengelegt.
  • Mutationen der vorliegenden Erfindung behalten bevorzugt den Leserahmen der Codierungssequenzen. Außerdem werden die Mutationen bevorzugt keine komplementären Regionen erzeugen, die hybrydisieren könnten, um sekundäre mRNS-Strukturen zu erzeugen, wie Schleifen oder Haarnadeln, was die Translation von mRNS nachteilig beeinflussen würde. Obgleich ein Mutationsort vorherbestimmt werden kann, ist es nicht erforderlich, dass die Natur der Mutation per se bestimmt sein muss. Um z.B. optimale Kennzeichen von Mutanten an einem vorgegebenen Ort auszuwählen, kann eine Zufallsmutagenese beim Zielcodon ausgeführt und die exprimierten Mutanten für eine indikative biologische Aktivität gescreent werden. Alternativ können Mutationen, flankiert von Restriktionsorten, die eine Bindung mit Fragmenten der nativen Sequenz ermöglichen, an besonderen Orten durch synthetisierende eine mutante Sequenz enthaltende Oligonukleotide eingeführt werden. Nach der Bindung kodiert die sich ergebende rekonstruierte Sequenz ein die gewünschten Insertions-, Substitutions- und Deletionssaminosäuren aufweisendes Derivat.
  • WRN-Proteine können auch konstruiert werden, indem Techniken der PCR-Mutagenese und der chemischen Mutagene (Drinkwater und Klinedinst, PNAS 83: 3402–3406, 1986), mit Hilfe erzwungener Nucleotid-Fehlinkorporierung (z.B. Liao und Wise, Gene 88: 107–111, 1990), oder unter Benutzung zufällig mutagenisierter Oligonukleotide (Horwitz et al., Genome 3: 112–117, 1989), benutzt werden. Proteine können, unter anderen Methoden, isoliert werden, indem geeignete Wirts- und Vektorsysteme gezüchtet werden, um die rekombinanten Translationsprodukte der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Überstände solcher Zelllinien oder Proteininklusionen oder ganze Zellen wo das Protein nicht in den Überstand ausgeschieden ist, können mit Hilfe einer Vielzahl von Purifikationsprozeduren behandelt werden, um das gewünschte Protein zu isolieren. Der Überstand kann zuerst z.B. unter Benutzung kommerzieller Proteinkonzentrationsfilter wie z.B. eine Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrations konzentriert werden. Nach der Konzentration kann das Konzentrat auf eine geeignete Purifikationsmatrix wie z.B. auf einen mit einem geeigneten Träger verbundenen Antiprotein-Antikörper aufgetragen werden. Alternativ können Anionen- oder Kationenaustauschharze eingesetzt werden, um das Protein zu purifizieren. Als weitere Alternative können eine oder mehrere Reverse-Phase Hochleistungsflüssigkeitschromatographieschritte (RP-HPLC) für die weitere Purifikation des roteins eingesetzt werden. Andere Verfahren zur Isolierung der Proteine der vorliegenden Erfindung sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
  • Ein Protein muss im Kontext dieser Erfindung „isoliert" werden falls kein anderes (unerwünschtes) Protein entsprechend der Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophoreseanalyse (SDS-PAGE) gefolgt von einer Coomassie-Blaufärbung detektiert worden ist. In anderen Ausführungsformen kann das erwünschte Protein isoliert werden so dass kein anderes (unerwünschtes) Protein nach der SDS-PAGE-Analyse gefolgt von Silberfärbung detektiert wird.
  • Expression eines WRN-Gens
  • Die vorliegende Erfindung trägt auch zur Handhabung nd Expression der oben beschrieben Gene bei, indem Wirtszellen, die einen Vektor enthalten, der in der Lage ist, die oben beschriebenen Gene zu exprimieren. Solche Vektoren oder Vektorprodukte umfassen entweder synthetische oder cDNS-derivierte Nukleinsäuremoleküle die WRN-Proteine kodieren, die mit geeigneten transkriptions- oder translationsregulatorischen Elementen verknüpft sind. Geeignete regulatorische Elemente können von einer Vielzahl von Quellen deriviert werden, die bakterielle, Pilz-, virale, Säugetier-, Insekten- oder pflanzliche Gene umfassen. Eine Auswahl geeigneter regulatorischer Elemente hängt von der gewählten Wirtszelle ab und kann einfach durch einen Fachmann ausgeführt werden. Beispiele für regulatorische Elemente umfassen: einen Transkriptions-Promoter und -Enhancer oder eine RNS-Polymerase-bindende Sequenz, einen Transkripti onsterminator, und eine Ribosomenbindungssequenz, einschließlich eines Translationsintiationssignals.
  • Nukleinsäuremoleküle die jedes der oben beschrieben WRN-Proteine kodieren können einfach mit Hilfe einer großen Vielzahl prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen einschl. bakterieller, Pilz-, viraler, Säugetier-, Insekten- oder pflanzliche Zellen exprimiert werden. Aus dem Stand der Technik sind gut Verfahren zur Transformation oder Transfektion solcher Zellen zur Expression fremder DNS gut bekannt (siehe, z.B. Itakura et al. US Patent No. 4, 704, 362; Hinnen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75: 1929–1933, 1978; Murray et al., US Patent No. 4, 801, 542; Upshall et al. US Patent No. 4, 935, 349; Hagen et al. US Patent No. 4, 784, 950; Axel et al., US Patent No. 4, 399, 216; Goeddel et al. US Patent No. 4, 766, 075; Sambrook et al. Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; für Pflanzenzellen siehe Czako und Marton, Plant Physiol. 104: 1067–1071, 1994; und Paszkowski et al. Biotech. 24: 387–392, 1992).
  • Bakterielle Wirtszellen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen E. Coli, B. Subtilis, Salmonella imurium und verschiedene Spezies in der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus, ebenso wie viele andere dem Fachmann gut bekannte bakterielle Spezies. Repräsentative Beispiele von bakteriellen Wirtszellen umfassen DH5α (Stragene, LaJolla, Kalifornien).
  • Bakterielle Expressionsvektoren umfassen bevorzugt einen in der Wirtszelle funktionierenden Promoter, einen oder mehrere selektierbare phänotypische Marker, und ein bakteriellen Replikationsursprung. Repräsentative Promoter umfassen das β-Laktamase (Penicillinase) und Laktosepromotersystem (siehe Chang et al. Nature 275: 615, 1978) den T7-RNS-Polymerasepromoter (Studier et al., Meth. Enzymol. 185: 60–89, 1990), den Lambdapromoter (Elvin et al., Gene 87: 123–126, 1990), den trp-Promoter (Nichols und Yanofsky, Meth. In Enzymology 101: 155, 1983) und den tac-Promoter (Russe) et al., Gene 20: 231, 1982). Repräsentativ auswählbare Marker umfassen verschiedene antibiotische Resistenzmarker wie die Kanamycin- oder Ampicillinresistenzgene. Viele für die Transformation von Wirtszellen geeignete Plasmide sind aus dem Stand der Technik bekannt, einschließlich unter anderem, pBR322 (siehe Boliva et al., Gene 2: 95, 1977), die pUC-Plasmide pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 (siehe Messing, Meth, in Enzymology 101: 20–77, 1983 und Vieira und Messing, Gene 19: 259–268, 1982) und pNH8A, pNH16a, pNH18a und Bluescript M13 (Stratagene, La Jolla, Kalifornen).
  • Die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeigneten Hefe- und Pilzwirtszellen umfassen u.a. Saccharomyces pompe, Saccharomyces cerevisiae, die Gattungen A. Pichia oder Kluyveromyces und verschiedene Spezies der Art Aspergillus (McKnight et al. US Patent No. 4, 935, 349). Geeignete Expressionsvektoren für Hefe und Pilze umfassen u.a. Ycp50 (ATCC No. 37419) für Hefe und den amdS-Klonierungsvektor pV3 (Turnbull, Biol. Technology 7: 169, 1989), YRp7 (Struhl et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035–1039, 1978), YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121–133, 1979), pJDB249 und pJDB219 (Beggs, Nature 275: 104–108, 1978) und Derivate davon.
  • Bevorzugte Promoter zur Benutzung in Hefe umfassen Promoter glucolytische Hefegene (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 12073–12080, 1980; Alber. und Kawasai, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419–434, 1982) oder Alkohol-Dehydrogenasegene (Young et al. In Genetic Engineering of Microorganisms of Chemicals, Hollaender et al. (eds.), Seite 355, Plenum, New York, 1982: Ammerer, Meth Enzymol. 192–201, 1983). Beispiele nützlicher Promoter für Pilzvektoren umfassen jene, die von glycolytischen Aspergillus nidulans Genen deriviert sind, wie der adh3-Promoter (McKnight et al., EMBO J. 4: 2093–2099, 1985). Die Expressionseinheiten können ebenfalls einen Transkriptionsterminator umfassen. Ein Beispiel eines geigneten Terminators ist der adh3-Terminator (McKnight et al., ibid., 1985).
  • Wie bei den bakteriellen Vektoren, umfassen die Hefevektoren im allgemeinen einen auswählbaren Marker, der einer aus einer beliebigen Vielzahl von Genen die einen dominanten Phänotyp aufweisen, sein kann für den ein phänotypisches Assay existiert, um Transformanten auswählen können. Bevorzugt auswählbare Marker sind die, die Wirtszellenauxotrophy vervollständigen, antibiotische Resistenz zur Verfügung stellen oder eine Zelle in die Lage versetzen, spezifische Kohlenstoffquellen zu benutzen, und leu2 (Broach et al. ibid.), ura3 (Botstein et al. Gene 8: 17, 1979), oder his3 (Struhl et al., ibid.) umfassen. Ein anderer geeigneter auswählbarer Marker ist das cat-Gen, das Chloramphenical-Resistenz auf Hefezellen verleiht.
  • Techniken zur Transformation von Pilzen sind in der Literatur gut bekannt und sind z.B. von Beggs (ibid.), Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929–1933, 1978), Yelton et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 1740–1747, 1984) und Russell (Nature 301: 167–169, 1983) beschrieben worden. Der Genotyp der Wirtszelle kann einen genetischen Defekt aufweisen, der von dem auf dem Expressionsvektor anwesenden auswählbaren Marker ergänzt wird. Die Auswahl eines besonderen Wirts und auswählbaren Markers gehört zum gewöhnlichen Stand der Technik.
  • Protokolle der Transformation von Hefe sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Die Transformation kann z.B. einfach entweder durch die Präparation von Hefesphäroplasten mit DNS erreicht werden (siehe Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929, 1978) oder durch Behandlung mit Alkalinsalzen wie LuCl (siehe Itoh et al., J. Bacteriology 153: 163, 1983) die Transformation von Pilzen kann auch ausgeführt werden indem, wie es durch Cullen et al. (Biol Technology 5 369, 1987) beschrieben wird, Polyethylenglycol benutzt wird.
  • Virale Vektoren umfassen die, welche einen Promoter umfassen, der die Expression eines isolierten Nukleinsäuremoleküls das ein oben beschriebenes WRN-Protein kodiert orientiert. Eine breite Varietät von Promotern kann im Kontext der vorliegenden Erfindung benutzt werden, umfassend z.B. Promoter wie MoMLVLTR, RSVLTR, FriendMuLVLTR, adenovirale Promoter (Ohno et al. Science 265: 781–784, 1994) Neomycinphosphotransferase-Promoter/Enhancer, Late-Parvoviruspromoter (Koering et al. Hum. Gen. Therap. 5: 457–463, 1994), Herpes-TK-Promoter und den Cytomegalovirus-Immediate-Late-Promoter. In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der Promoter ein gewebespezifischer Promoter (siehe z.B. WO 91/02805; EP 0, 415, 731 und WO 90/07936). Repräsentative Beispiele für geeignete gewebespezifiche Promotern umfassen neuronenspezifische Enolasepromoteren, Plättchen-derivierte Wachstumsfaktor-Beta-Promoteren, Synapsin I-Promoteren und Synapsin II-Promoteren. Außer den oben angegebenen Promotern können virusspezifische Promoter (z.b) retroviral Promoter (inklusive die oben genannten, ebenso wie andere wie die HIV-promoter), hepatitis-, herpes- (z.B. ebv), bakterien-, Pilz- oder Parasiten-(z.B. Malaria)-spezifische promter benutzt werden, um eine spezifische Zelle bzw. ein spezifisches Gewebe, das mit einem Virus, Bakterie, Pilz oder Parasit infiziert ist.
  • So können WRN-Proteine der vorliegenden Erfindung durch eine Vielzahl von viralen Vektoren inklusive z.B. virale Herpes-Vektoren (z.B. US Patent No. 5, 288, 641), adenovirale Vektoren z.B. WO 94/26914, WO 93/9191; Kolls et al., PNAS 91 (1): 215–219, 1994; Kass-Eisler et al. PNAS 90 (24): 11 498–502, 1993; Guzman et al., Circulation 88 (6) 28 38–48, 1993; Guzman et al., Cir. Res. 73 (6): 1202–1207, 1993; Zabner et al., Cell 75 (2): 207–216, 1993; Li et al., Hum Gene Ther. 4 (4): 403–409, 1993; Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5 (10) 1287–1291, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5 (2): 130–134, 1993; Jaffe et al., Nat. Genet. 1 (5): 372–378, 1992; und Levrero et al., Gene 101 (2): 195–202, 1991), adenoassoziierte virale Vektoren (WO 95/13365; Flotte et al., PNAS 90 (22): 10613–10617, 1993), Baculovirus-Vektoren, Parvovirus-Vektoren (Koering et al., Hum. Gene Therap. 5: 457–463, 1994), (Panicali und Paoletti, PNAS 79 4927–4931, 1982; und Ozaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193 (2): 653–660, 1993), und Retroviren (z.B. EP 0, 415, 731 ; WO 90/07936; WO 91/0285, WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; US Patent No. 5, 219, 740; WO 93/11230; WO 93/10218. Virale Vektoren, die eine Mischung verschiedener Elemente von verschiedenen Viren oder nicht viralen Quellen enthalten, können ebenfalls konstruiert werden (z.B. Promotoren, Hüllen-Sequenzen, und ähnliches). In verschiedenen Ausführungsformen können entweder die viralen Vektoren selber oder ein virales Teilchen das den viralen Vektor enthält, in den unten beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen benutzt werden.
  • Säugetierzellen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen u.a.: PC12 (ATC No. CRL1712), N1E-115 Neuroblastoma, SK-N-BE (2) C Neuroblastoma, SHSY5 adrenerge Neuroblastoma, NS20Y und NG108-15 cholinergische Maus-Zelllinien, oder Ratten F2 dorsale Hauptganglionlinie, COS (z.B. ATCC No. CRL 1650 oder 1651), BHK (z.B. ATCC No. CRL 6281; BHK 570 Zelllinie, die bei der amerikanischen Kulturtyp-Kollektion mit der Zugangsnummer CRL 10314 hinterlegt ist) CHO (ATCCC No. CCL 61) HeLa (z.B. ATCC No. CCL 2), 293 (ATCC No. 1573; Graham et al. J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977)) und NS-1-Zellen. Andere Säugetierezellen können in der vorliegenden Erfindung benutzt werden, einschließlich Rat Hep I (ATCC No. CRL 1600), Ratten Hep II (ATCC No. CRL 1548), TCMK (ATCC No. CCL 139), Menschenlunge (ATCC No. CCL 75.1), menschliche Hepatoma (ATCC No. HTB-52), Hep G2 (ATCC No. HB 8065), Mäuseleber (ATCC No. CCL 29.1), NCTC 1469 (ATCC No. CCL 9.1), SP 2/0-AG14 (ATCC No. 1581), HIT-T15 (ATCC No. CRL 1777) und RINm 5AHT2B (Orskov und Nielson, FEBS 229 (1): 175–178, 1988).
  • Säuretierexpressionsvektoren zur Benutzung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung umfassen einen Promoter, der in der Lage ist, die Transkription eines klonierten Gens oder cDNS zu führen. Bevorzugte Promoter umfassen virale und Zellpromotoren. Virale Promotoren umfassen den Cytamegalovirus Immediate Early-Promoter (Boshart et al. Cell 41: 521–530, 1985), Cytomomegalovirus immediate Late-Promoter, SV40-Promoter (Subramani et al. Mol. Cell. Biol. 1: 854–864, 1981), MMTV LTR, RSV LTR, Metallothionein-1, Adenovirus Ela. Zellpromoter umfassen den Maus-Metallothionein-1-Promoter (Palmiter et al. US Patent No. 4, 579, 821), einen Maus-VK-Promoter Bergmann et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 7041–7045, 1983; Grant et al., Nucl. Acids Res. 15: 54–96, 1987) und einen Maus-VH-Promoter (Loh et al. Cell 33: 85–93, 1983). Die Wahl des Promoters hängt zumindest teilweise von dem gewünschten Expressionsniveau oder der zu transfektierende Zelllinie ab:
    Solche Expressionsvektoren können auch ein Ensemble von RNS-Spleiss-Stellen enthalten, die dem Promoter nachgeordnet und stromaufwärts von der das Peptid oder Protein kodierenden DNS-Sequenz liegt. Bevorzugte RNS-Spleissorte können aus den Adenoviren und/oder den Immunoglobin-Genen erhalten werden. In den Expressionsvektoren ist auch ein stromabwärts von der kodierenden Sequenz gelegenes Polyadenylationssignal enthalten. Geeignete Polyadenylationssignale umfassen die Early- oder Late-Polyadenylationssignale von SV40 (Kaufmann und Sharp, ibid.), das Polyadenylationssignal von der Adenovirus 5 E1B-Region und dem menschlichen Wachstumshormongen-Terminator (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9: 3719–3730, 1981). Die Expressionsvektoren können auch eine nicht kodierende virale Leadersequence, wie den Adenovirus 2-Tripartite-Leader, der zwischen dem Promoter und den RNS-Splice-sittes liegt.
  • Bevorzugte Vektoren können auch Enhancersequenzen, wie den SV40 Enhancer, umfassen. Expressionsvektoren können auch Sequenzen umfassen, die den Adenovirus VA RNS kodieren. Geeignete Expressionsvektoren können auch kommerziell erworben werden (z.B. Stratagene, La Jolla, Kalifornien).
  • Geklonte DNS-Sequenzen umfassende Vektor-Konstrukte können in gezüchtete Säugetierzellen z.B. durch Kalziumphosphatvermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), Elektroporation (Neumann et al. EMBOJ. 1: 841–845, 1982), oder DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubal et al. (eds.), Geläufige Protokolle in der Molekularbiologie, John Wiley and Sons, Inc. NY, 1987). Um Zellen zu identifizieren, die dauerhaft die geklonte DNS integriert haben, wird im allgemeinen ein selektierbarer Marker in die Zelle zusammen mit dem Gen oder der cDNS von Interesse in die Zellen eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker zur Benutzung in gezüchteten Säuretierzellen umfasst Gene, die Resistenz gegenüber Medikamenten verleihen, wie Neomycin, Hygromycin, und Methotrexat. Der selektierbare Marker kann ein amplifizierbarer selektierbarer Marker sein. Bevorzugte amplifizierbare selektierbare Marker sind das DHFR-Gen und das Neomycin-Resistenz-Gen. Selektierbare Marker werden von Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, was in diesen Text durch Bezugnahme mit einbezogen wird).
  • Einen geeigneten Vektor umfassende Säugetierzellen dürfen während einer Zeitspanne, typischerweise 1 bis 2 Tage, wachsen, um die Expression der DNS-Sequenz(en) von Interesse zu beginnen. Dann wird eine Medikamentenauswahl getroffen, um die Zellen für das Wachstum auszusuchen, die den selektierbaren Marker auf beständige Weise exprimieren. Für Zellen, die mit einem amplifizierbaren, selektierbaren Marker transfektiert worden sind, kann die Medikamentenkonzentration stufenweise erhöht werden um eine erhöhte Anzahl von Kopien der geklonten Sequenzen auszuwählen, wodurch die Expressionniveaus erhöht werden. Zellen, die die eingeführten Zellen exprimieren werden selektiert und für die Produktion von Protein von Interesse in der gewünschten Form und dem gewünschten Niveau gescreent zu werden. Zellen die diese Kriterien erfüllen, können geklont und für die Produktion vermehrt werden.
  • Protokolle für die Transfektion von Säugetierzellen ist gewöhnlichen Fachleuten gut bekannt. Repräsentative Verfahren umfassen die Kalziumphosphat vermittelte Elektroporation, Lipofektion, Retrovirus, Adenovirus und Protoplastfusionsvermittelte Transfektion (siehe Sambrook et al., supra). Entblößte Vektorkonstrukte können auch von Muskelzellen oder anderen geeigneten Zellen nach der Injektion in den Muskel eines Säugetiers (oder anderen Tiers) aufgenommen werden.
  • Zahlreiche aus dem Stand der Technik bekannte Insektenwirtszellen können auch im Licht der Beschreibung in der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Die Benutzung von Baculoviren als Vektoren für die Expression von heterologen DNS-Sequenzen in Insektenzellen ist von Atkins et al. (Pestic. Sci. 28: 215–224, 1990) überprüft worden.
  • Zahlreiche aus dem Stand der Technik bekannte Pflanzenwirtszellen können auch im Licht der Beschreibung in der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Die Benutzung von Agrobacterium rhizogenes als Vektoren für die Expression von Genen in Pflanzenzellen ist von Sinkar et al., (J. Bioscence (Bangalore)) 11: 47–58, 1987) überprüft worden.
  • WRN-Proteine können durch Züchtung das oben beschriebenen Wirts-/Vektorsystem präpariert werden, um die rekombinanten WRN-Proteine zu exprimieren. Rekombinant produzierte WRN-Proteine können außerdem, wie es unten genauer beschrieben worden ist, purifiziett werden.
  • Nach entsprechenden Aspekten der vorliegenden Erfindung, können WRN-Proteine in einem transgenen nichtmenschlichen Tier dessen Keimzellen und somatische Zellen ein WRN-Gen umfassen, das operabel mit einem effektiven Promoter für die Expression des Gens verknüpft ist. Alternativ können transgene nichtmenschliche Tiere, denen da WRN-Gen fehlt, auf ähnliche Weise präpariert werden. (z.B. „knockout"-Mäuse). Solche Transgene können in einer Vielzahl von nichtmenschlichen Tieren, einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen, Schafe, Hunde, Gänse und Schweine (siehe Hammer et al. Nature 315: 680–683, 1985; Palmiter et al. Science 222: 809–814, 1983; Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438–4442, 1985); Palmiter und Brinster Cell 41: 343–345, 1985 und US. Patente 5, 175, 383; 5, 087, 571; „736, 866; 5, 387, 742; 5, 347, 075; 5, 221, 778 und 5, 175, 384).
  • Kurz, ein Expressionsvektor, umfassend ein zusammen mit ungefähr positionierten Expressionssteuersequenzen zu exprimierenden Nukleinsäuremolekül wird in einen Vorkern von befruchteten Eiern z.B. durch Mikroinjektion eingeführt. Die Integration der injizierten DNS wird durch Blot-Analyse der DNS der Gewebeproben detektiert. Es wird vorgezogen, dass die eingeführte DNS in die Keimlinie des Tiers inkorporiert wird, so dass sie auf die Abkömmlinge des Tiers gebracht wird. Gewebespezifische Expression kann durch die Benutzung eines gewebespezifischen Promoters erreicht werden, oder durch die Benutzung eines induzierbaren Promoters wie ein Metallothioneingenpromoter (Palmiter et al., 1983, ibid), der eine regulierte Expression des Transgens erlaubt.
  • Vektoren der vorliegenden Erfindung können eine weite Vielfalt von zusätzlichen Nukleinsäuremolekülen enthalten oder exprimieren, die anstatt oder zusätzlich zu dem oben beschriebenen WRN-Protein entweder von einem oder mehreren getrennten Promtern vorliegen. Der virale Vektor kann z.B. ein Lumphokin oder einen Lymphokinrezeptor, eine antisense oder Ribozym-Sequenz der Toxine exprimieren. Repräsentative Beispiele von Lymphokinen umfassen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, GL-CSF, G-CSF, M-CSF, Alpha-Interferon, Beta-Interferon, Gamma-Interferon, und Tumornekrosefaktoren, ebenso wie ihre resektiven Rezeptoren. Repräsentative Beispiele von Antisense-Sequenzen umfassen Antisense-Sequenzen die die Expression von WRN-Proteinmutanten blockieren. Repräsentative Beispiele von Toxinen umfassen: Rizin, Abrin, Diphteriatoxin, Choleratoxin, Saporin, Gelonin, Pokeweed antivirales Protein, Tritin, Shigella Toxin, und Pseudomonas Exotoxin A.
  • In anderen Aspekten der Erfindung, werden Antisense-Oligonucleotidmoleküle zur Verfügung gestellt, die spezifisch die Expression von mutanten WRN-Nukleinsäuresequenzen bremsen (siehe allgemein, Hirashima et al. In Molekulare Biologie der RNS: New Persectives (M. Inouye und B. S. Dudock Herausgeber, 1987, Academic Press, San Diego, Seite 401); Oligonukleotide: Antisense-Inhibitoren der Genexpression (J. S. Cohen, Herausgeber, 1989 Mac Millan Press, London); Stein und Cheng, Science 261: 1004–1012 (1993); WO 95/10607; US 5, 359, 051 ; WO 92/06693; und EP A2 612844). Kurz, solche Moleküle werden so konstruiert dass sie komplementär zu und fähig zur Bildung des Watson-Crick-Paares sind, mit einer Region einer transkribierten WRN-mutanten-Sequenz umfassend eine WRN-Mutation. Die sich ergebende doppelsträngige Nukleinsäure interferiert mit der folgenden Behandlung der mRNS, wobei die Proteinsynthese vermieden wird.
  • In anderen entsprechenden Aspekten der Erfindung werden Ribozymmoleküle zur Verfügung gestellt, in die eine Antisense-Nukleotidsequenz inkorporiert in ein Ribozym das die von einem mutanten WRN-Gen transkribiertes mRNS-Moleküle spezifisch aufspalten kann. (siehe allgemein, Kim et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8788 (1987); Haseloff et al. Nature 234: 585 (1988); Cech, JAMA 260: 3030 (1988); Jeffries et al. Nucleic Acids Res. 17: 1371 (1989); US 5, 093, 246 ; US 5, 354, 855 ; US 5, 144, 019 ; US 5, 272, 262 ; US 5, 254, 678 ; und US 4, 987, 071 . Nach diesem Aspekt der Erfindung umfasst die in das Ribozym inkorporierte Antisense-Sequenz eine komplementär zu und fähig zur Bildung des Watson-Crick-Paares mit einer Region von transkribierten mutante mRNS-Sequenz umfassend eine WRN-Mutation. Die Antisense-Sequenz wird so ein Zielstoff zur Verfügungstellung einer spezifischen katalytischen Ribozymaktivität für die mutante WRN-mRNS, wo solche katalytische Aktivität die mRNS spaltet, um sie unfähig für eine folgende Verarbeitung für die WRN-Proteintranslation zu machen.
  • Wirtszellen
  • Wie es oben beschrieben worden ist, können Nukleinsäuremoleküle, die die WRN-Proteine der vorliegenden Erfindung (oder die Vektoren, die die betreffenden Mutanten enthalten und/oder exprimieren) kodieren, leicht in eine breite Vielfalt von Wirtszellen eingeführt werden. Repräsentative Beispiele solcher Wirtszellen umfassen Pflanzenzellen, eukaryotische Zellen und prokaryotische Zellen. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Nukleinsäuremoleküle in Zellen Wirbeltiers oder warmblütigen Tiers wie einem Mensch, einem Affen, Hunde-, Kuh-, Pferde-, Schweine-, Schafe-, Ratten-, Hamster- oder Fischzelle oder jedem Hybrid davon eingeführt.
  • Bevorzugte prokaryotische Wirtszellen zur Benutzung in der vorliegenden Erfindung umfassen E. Coli, Salmonella, Bacillus, Shigella, Pseudomonas, Streptomyces und andere Gattungen. Techniken zur Transformation dieser Wirte und zur Expression der hierin geklonten fremden DNS-Sequenzen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe z.B. Maniatis et al., Molekulares Klonen Ein Laborhandbuch, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, welches in diesen Text durch Bezugnahme inkorporiert ist; oder Sambrook et al. Supra). Vektoren, die zur Expression geklonter DNS-Sequenzen in bakteriellen Wirten benutzt werden, umfassen allgemein einen selektierbaren Marker wie z.B. ein Gen für antibiotische Resistenz, und einen Promoter, der in einer Wirtszelle funktioniert. Geeignete Promoter umfassen das trp (Nichols und Yanofsky, Meth Enzymol. 101 155–164, 1983) lac (Casabadan et al., J. Bacteriol. 143: 971–980, 1980), und Phage λ-(Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2: 1–10, 1983)-Promotersysteme. Für die Transformation von Bakterien nützlichen Plasmide umfassen die pUC-Plasmide (Messing, Meth. Enzymol. 101: 20–78, 1983; Viera und Messing, Gene 19: 259–268, 1982), pBR322 (Bolivar et al. Gene2: 95–113, 1977), pCQV2 (Queen, ibiud.) und Derivate davon. Plasmide können beides, d.h. virale und bakterielle Elemente enthalten.
  • Bevorzugte eukaryotische Zellen umfassen gezüchtete Säuretierzelllinien (z.B. Nager- oder menschliche Zelllinien) und Pilzzellen, die Hefe-Spezies umfassen (z.B. Saccharomyces spp., insbesondere S. Cerevisiae, Schizosaccharomyces spp., oder Kluyveromyces spp.) oder Fadenpilze (z.B. Aspergillus spp., Neuropspora spp.) Hefestränge werden besonders vorgezogen. Verfahren zur Produktion rekombinanter Proteine in einer Vielzahl von prokaryotischen und eurokaryotischen Wirtszellen sind allgemein aus dem Stand der Technik bekannt (siehe, „Genexpressionstechnologie"; Verfahren in der Enzymologie, Band 185, Goeddel (Herausg.), Academic Press, San Diego, Kalifornien, 1990; siehe auch „Führer der Hefe-Genetik und Molekularbiologie," Methoden in der Enzymologie, Guthrie und Fink (Herausg.), Academic Press, San Diego, Kalifornien, 1991); Im allgemeinen wird eine Wirtszelle auf der Basis seiner Fähigkeit ausgesucht, Proteine von großem Interesse zu produzieren oder nach seiner Fähigkeit, mindest einige für die biologische Aktivität des Proteins erforderlichen Verarbeitungsschritte auszuführen. Auf diese Weise kann die Anzahl der in die Wirtszelle ein zuführenden geklonten DNS-Sequenzen minimiert werden und die Gesamtausbeute an biologisch aktivem Protein maximiert werden.
  • Die Nukleinsäuremoleküle (oder Vektoren) können in die Wirtszellen durch eine breite Anzahl von Mechanismen eingeführt werden, einschließlich z.B. Kalziumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978) Lipofektion; Genkanone (Corsaro und Pearson, Somatic Cell Gen. 7: 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841–845, 1982), retrovirale, adenovirale, Protoplast fusionsvermittelte Transfektion oder DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausebel et al., (Herausg.), Geläufige Protokolle in der Molekularbiologie, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, 1987).
  • Wirtszellen, die die Vektorkonstrukte der vorliegenden Erfindung umfassen, werden dann dann gezüchtet, um ein DNS-Molekül zu exprimieren, wie es oben beschrieben worden ist. Die Zellen werden nach Standardverfahren in einem Zuchtmedium gezüchtet das Nährstoffe enthält, die für das Wachstums der ausgewählten Wirtszellen erforderlich sind. Aus dem Stand der Technik ist eine Vielzahl geeigneter Media bekannt und umfassen allgemein eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essentielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien ebenso wie andere Komponenten, z.B. Wachstumsfaktoren oder Wachstumsseren, die für besondere Wirtszellen erforderlich sind. Das Züchtungsmedium wird im allgemeinen für Zellen ausgesucht, die das bzw. die DNS-Konstrukt(e) enthalten, z.B. mit Hilfe der Medikamentenauswahl oder Mangel an einem wesentlichen Nährstoff der durch den auswählbaren Marker auf dem DNS-Konstrukt ergänzt wird oder mit dem DNS-Konstrukt kotransfektiert wird.
  • Geeignete Züchtungsbedingungen für Hefezellen beinhalten z.B. die Züchtung in einem chemisch definierten Medium, umfassend: eine Stickstoffquelle, die eine Stickstoffquelle ohne Aminosäure sein kann oder ein Hefeextrakt, anorganische Salze, Vitamine und essentielle Aminosäure bei einer Temperatur zwischen 4°C und 37°C, mit bevorzugter Weise 30°C. Der pH-Wert des Mediums wird bevorzugt bei einem pH-Wert über 2 und unter 8, bevorzugter zwischen 5 und 6 gehalten. Verfahren, einen stabilen pH-Wert aufrechtzuerhalten, umfassen die Pufferung und konstante pH-Wert-Kontrolle. Bevorzugte Stoffe zur pH-Kontrolle um fassen Natriumhydroxid. Puffermittel umfassen bevorzugt Bernsteinsäure und Bis-Tris (Sigma Chemical Co., St. LOUIS, MO.) Wegen der Tendenz der Hefewirtszellen zu heterologen Hypoglycosylat-Proteine, kann es vorgezogen werden, die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung in Hefezellen zu exprimieren die einen Defekt in einem Gen erfordern, was für eine Asparagin-verknüpfte Glycosylation erforderlich ist. Solche Zellen werden bevorzugt in einem Medium gezüchtet, das einen osmotischen Stabilisator enthält. Sorbitol ist ein bevorzugter osmotischer Stabilisator, der in das Medium mit einer Konzentration zwischen 0.1 M und 1.5 M, bevorzugt bei 0.5 M oder 1.0 M hinzugefügt wird.
  • Gezüchtete Säugetierzellen sind allgemein in im Handel zur Verfügung stehenden Serum enthaltenden oder kein Serum enthaltenden Medien gezüchtet worden. Die Auswahl eines Mediums und der Züchtungsbedingungen, die für die besondere benutzte Zelllinie geeignet sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Antikörper
  • Antikörper für die oben diskutierten WRN-Proteine können leicht mit Hilfe der hier angegeben Offenlegung präpariert werden. Solche Antikörper können in gewissen Ausführungsformen spezifisch Wildtyp-WRN-Protein eher als ein mutantes WRN-Protein, ein mutantes WRN-Protein eher als ein Wildtyp-Protein, oder erkennt gleichermaßen beide, die mutante und die Wildtypform des WRN-Proteins. Antikörper können zur Isolierung des Proteins benutzt werden, wodurch eine intrazelluläre Lokalisierung des WRN-Proteins ausgeführt wird, und wodurch die Aktivität des Proteins gebremst wird (antagonistisch), oder indem die Aktivität des Proteins erhöht wird (agonistisch). Die Kenntnis der intrazellulären Lokalisierung des WRN-Proteinprdukts kann bei Patienten mit WRN-Mutationen anormal sein, was die Entwicklung eines schnellen Screeningversuchs erlaubt. Ebenso werden Versuche für kleine Moleküle die mit dem WRN-Genprodukt zusammenwirken die Entwicklung von Antikörpern und Lokalisierungsuntersuchungen vereinfachen.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden Antikörper so verstanden, dass sie monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, antiidiotypische Antikörper und Antikörperfragmente (z.B. Fab, und F(ab')2, Fv variable Regionen, oder komplementäre bestimmende Regionen) umfassen. Wie es oben diskutiert worden ist, werden Antikörper als spezifisch gegen ein WRN-Protein verstanden, wenn es mit einem Kd größer oder gleich 10–7 M bevorzugt größer oder gleich 10–8 M bindet. Die Affinität von einem monoklonalen Antikörper oder Bindungspartner kann leicht von einem Fachmann bestimmt werden (siehe Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660–672, 1949).
  • Kurz gesagt, polyklonale Antikörper können leicht von einem Fachmann aus einer Vielzahl von warmblütigen Tieren wie Pferden, Kühen, verschiedene Geflügel, Kaninchen, Mäuse oder Ratten erzeugt werden. Typischerweise wird ein WRN-Protein oder ein einzelnes Peptid davon mit 13 bis 20 Aminosäuren (bevorzugt konjugiert mit Keyhole Limpet Hämocyanin durch Vernetzung mit Glutaraldehy benutzt, um das Tier mit Hilfe von intraperitonaler, intramuskulärer, intraokulaerer und subktaner Injektionen zu immunisieren, wie z.B. einem Zusatzstoff wie dem kompletten oder inkompletten Freundschen Zusatz. Es wird vor allen Dingen als Beispiel ein Peptid das Resten von 1375 bis 1387 der WRN-Polypeptidsequenz entspricht benutzt, um ein Kaninschenpolyklonal-Antiserum zu erhalten. Entsprechend folgenden Booster-Immunisierungen werden Serumproben gesammelt und auf ihre Reaktivität gegenüber dem WRN-Protein oder WRN-Peptid getestet. Besonders bevorzugte polyklonale Antiseren geben ein Signal bezüglich eines dieser Assays das mindestens dreimal größer als der Hintergrund ist. Sobald der Titer des Tiers ein Reaktivitäts-Niveau erreicht hat mit dem Protein, können leicht größere Antiserummengen entweder durch wöchentliches Ausbluten des Tiers erreicht werden.
  • Monoklonale Antikörper können auch leicht durch konventionelle Techniken erzeugt werden (siehe US Patent n° RE 32, 011; 4, 902, 614; 4, 543, 439, welche in diesem Text durch Bezugnahme integriert sind, siehe auch Monoklonale Antikörper, Hybridomas: Eine Neue Dimension in der Biologischen Analyse, Plenum Press, Kennett, McKeam, und Bechtol (Herausg.), und Antikörper: Ein Laborhandbuch, Harlow und Lane (Herausg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, welche in diesen Text durch Bezugnahme integriert sind).
  • Kurz, in einer Ausführungsform wird einem Tier wie einer Ratte oder einer Maus ein WRN-Protein oder ein Teil davon wie oben beschrieben injiziert. Das Protein kann mit einem Zusatz, wie einem kompletten oder unvollständigen Freundschen Zusatz gemischt werden, um die Immunantwort zu verstärken. Zwischen einer und drei Wochen nach der anfänglichen Immunisierung kann das Tier mit einer anderen Booster-Immunisierung wieder immunisiert werden, und dann auf Reaktivität gegenüber dem Protein getestet werden, indem die oben beschriebenen Versuche benutzt werden. Sobald das Tier ein Reaktivitätsniveau gegenüber dem injizierten Protein erreicht hat, wird es getötet und Organe die eine große Anzahl von B-Zellen enthalten, wie die Milz und die Lymphknoten werden entnommen.
  • Zellen die von immunisierten Tieren erhalten werden, können durch Transfektion mit einem Virus wie dem Eppstein-Barr-Virus (EBV) (siehe Glasky und Reading, Hybridoma 8 (4): 377–389, 1989) immortalisiert werden. Alternativ werden die geernteten Milz- und/oder Lymphknotenzellsuspensionen mit einer geeigneten Myelomezelle fusionniert um ein „Hybridoma" zu erzeugen. Geeignete Myelomalinien umfassen z.B. NS-1 (ATCC No. TIB 18) und P3X63 – AG 8.653 (ATCC No. CRL 1580).
  • Nach der Fusion können die Zellen in Kulturplättchen gebracht werden, die ein geeignetes Medium enthalten wie RPMI 1640 oder DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) ebenso wie Zusatzstoffe wie fötales Rinderserum (FBS, z.B., von Hyclone, Logan, Utah, oder JRH Biosciences). Außerdem soll das Medium ein Reagenz enthalten, das selektiv die Züchtung von fusionierten Milz- und Myelomazellen wie HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, und Thymidin) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouiri) erlaubt. Nach ungefähr sieben Tagen können die sich daraus ergebenden fusionierten Zellen oder Hybridomas gescreent werden, um die Anwesenheit von Antikörpern, die gegenüber WRN-Proteinen reagieren, zu bestimmen. Eine breite Vielfalt von Versuchen kann benutzt werden, um die Anwesenheit von Antikörpern, die gegenüber Proteinen der vorliegenden Erfindung reagieren, einschliesslich z.B. Gegenstrom-Imunoelektrophorese, Radioimmunoassays, ELISA, Dot-Blot-Assays, Western-Blots, Immunoausfällung, Inhibitions- oder Kompetitionsassays, und Sandwich-Assays (siehe US Patente nr. 4, 376, 110 und 4, 486, 530; siehe auch Antikörper: Ein Laborhandbuch, Harlow and Lane (Herausg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Es können mit Hilfe einiger klonaler Lösungen und reassays, Hybridome erzeugende Antikörper die gegen das WRN-Protein reagieren, isoliert werden.
  • Es können auch andere Techniken benutzt werden, um monoklonale Antikörper zu konstruieren (siehe Wiliam D. Huse et al., Erzeugung einer großen kombinatorischen Bibliothek des Immunoglobulin-Verzeichnisses im Bakteriophagen Lambda), Science 246: 1275–1281, Dezember 1989; siehe auch L. Sastry et al., Klonierung des Immunologischen Verzeichnisses in Escherichia Coli zur Erzeugung Monoklonaler Katalytischer Antikörper: Konstruktion einer spezifischen H-Ketten-variable Regionen-cDNS-Bibliothek, „Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 5728–5732, August 1989; siehe auch Michelle Alting-Mes et al. „Monoklonale Antikörper-Expressions-Bibliothek: eine schnelle Alternative zu den Hybridomas, „ Strategien in der Molekularbiologie 3: 1–9, Januar 1990, diese Referenzen beschreiben ein kommerzielles System, das bei Stratcyte, La Jolla, Kalifornien zur Verfügung steht und das die Produktion von Antikörpern mit Hilfe rekombinanter Techniken ermöglicht). Kurz, ird mRNS aus einer B-Zellenpopulation isoliert und benutzt, um H-Ketten und L-Ketten-Immunoglobulin-cDNS Expressions-Bibliotheken den λImmunoZap(N)- und ImmunoZap(L)-Vektoren zu erzeugen. Diese Vektoren können individuell gescreent oder koexprimiert werden, um Fab-Fragmente oder Antikörper zu builden (siehe Huse et al. supra; siehe auch Sastry et al. supra). Positive Zonen können anschließend in ein nicht lytisches Plasmid konvertiert werden das eine starke Expression von monoklonalen Antikörperfragmenten von E. coli erlaubt.
  • Auf ähnliche Weise können auch Teile oder Fragmente wie Fab- oder fv-Fragmente von Antikörpern konstruiert werden, indem konventionelle enzymatische Verdauung oder rekombinante DNS-Techniken benutzt werden, um die variablen Regionen eines Gens das einen spezifischen Bindungsantikörper kodiert, zu integrieren. In einer Ausführungsform werden die Gene, die die variable Region der Hybridoma die einen monoklonalen Antikörper von Interesse kodiert, amplifiziert unter Benutzung von Nukleotidprimern der variablen Region. Diese Primer können von einem Fachmann synthtisiert oder von kommerziellen Quellen erworben werden. Stratcyte (Jolla, Kalifornien) vekauft Primer für variable Regio nen bei Maus und Mensch und umfassen u.a. Primer für VHa-, VHb-, VHc-, VHd-, CH1-, VL- und CL-Regionen. Diese Primer können benutzt werden, um Schwere und leichte Kettenvariablen-Regionen zu amplifizieren, die in Vektoren, wie jeweils ZAP TM H oder ImmunoZATM L (Stratacyte) eingeführt werden können. Diese Vektoren können dann in E. coli, Hefe, oder säugetierbasierte Systeme für die Expression eingeführt werden. Bei Benutzung dieser Techniken können große Mengen eines einkettigen Proteins das eine Fusion von den Domänen VH und VL enthält produziert werden (siehe Bird et al. Science, 242: 423–426, 1988). Außerdem können solche Techniken benutzt werden, um einen Mäuse-Antikörper in einen menschlichen Antikörper zu verwandeln, ohne dass die Bindungspezifizität des Antikörpers geändert wird.
  • Nachdem geeignete Antikörper erhalten worden sind, können sie mit Hilfe zahlreicher aus dem Stand der Technik gut bekannter Techniken isoliert oder purifiziert werden (siehe Antikörper: A Laboratory Manual (ein Laborhandbuch), Harlow und Lane (Herausg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Geeignete Techniken umfassen Peptid- oder Protein-Affinitäts-Säulen, HPLC oder RP-HPLC, Purifizierung auf Protein A- oder Protein B-Säulen, oder irgendeine Kombination dieser Techniken.
  • Assays
  • Im Kontext dieser Erfindung nützliche Assays umfassen die Assays zur Detektion von Agonisten und Antagonisten der WRN-Proteinaktivität. Andere Assays sind nützlich für das Screening von Peptid- oder Bibliotheken organischer Moleküle. Noch andere Assays sind nützlich für die Identifikation und/oder Isolierung von Nukleinsäuremolekülen und/oder Peptiden in der vorliegenden Erfindung, der Identifikation von Proteinen, die mit dem WRN-Protein zusammenwirken oder sich damit binden, für die Diagnose eines Patienten, mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit am Werner-Syndrom zu erkranken oder eine Diagnose für einen Patienten, für eine Neigung am Werner-Syndrom zu erkranken oder die Manifestierung einer mit WRN in Beziehung stehenden Krankheit.
  • Nukleinsäurebasierte Diagnosetests
  • Kurz, ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt Sonden und Primer zur Detektion von WRN-Genen und/oder Mutanten davon zur Verfügung. In einer Ausführungsform dieses Aspekts werden Sonden zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind die DNS oder RNS eines WRN-Gens spezifisch zu hybridisieren. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung sind „Sonden in der Lage" DNS oder RNS eines WRN-Gens zu hybridiseren, wenn sie ein WRN-Gen unter Bedingungen hoher oder gemäßigter Stringenz (siehe Sambrock et al., supra) aber nicht signifikant oder detektierbar ein entsprechendes Helikasegen wie das Bloom-Syndrom hybridisieren (Ellis et al. Cell 83: 655–666, 1995). Bevorzugt hybridisiert die Sonde geeignete Nukleotidsequenzen unter Bedingungen hoher Stringenz wie die Hybridisierung in 5 × SSPE, 1c Dengard-Lösung, 0,1% SDS bei 65°C und mindestens eine Wäsche, um die unhybridisierte Sonde bei Gegenwart von 5 × SSPE, 1c Dengard-Lösung, 0,1% SDS bei 65°C zu entfernen. Außer dem was sonst hierin zur Verfügung gestellt worden ist, sind die Sondensequenzen so konzipiert, dass sie eine Hybridisierung von WRN-Genes, aber nicht von DNS- oder RNS-Sequenzen von anderen Genen erlauben. Die Proben werden z.B. benutzt, um Nukleinsäure zu hybridisieren, die in einer bei einem Patienten isolierten Probe anwesend ist. Die hybridisierte Sonde wird dann detektiert, und dabei wird die Anwesenheit der gewünschten zellulare Nukleinsäure angegeben. Bevorzugt wird die zellulare Nukleinsäure vor der Hybridisierung einer Amplifizierungsprozedur wie PCR unterworfen. Alternativ kann das WRN-Gen amplifiziert werden und das amplifizierte Produkt wird einer DNS-Sequenzierung unterworfen. Mutanten des WRN können durch eine DNS-Sequenzanalyse oder Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonukleotidsonden detektiert werden und zwar unter Bedingungen und während einer Zeit, die ausreicht die Hybridisierung einers spezifischen Allels durchzuführen. Typischerweise enthält der Hybridisierungspuffer und die Hybridisierungswäsche Tetramethylammomniyumchlorid oder etwas ähnliches (siehe Sambrook et al. supra).
  • Nukleinsäuresonden der vorliegenden Erfindung können sowohl aus DNS, RNS analogen Nukleinsäuren (z.B. Peptidnukleinsäure) oder jeder beliebigen Kobination daraus bestehen und können so wenig wie 12 Nukleotide in der Länge gewöhnlich ca. 14 bis 18 Nukleotide in der Länge und wenn möglich so groß wie die ganze Sequenz des WRN-Gens sein. Die Wahl der Sondengröße hängt en bisschen von der Benutzung der Sonde ab und ist aus dem Stand der Technik bekannt.
  • Geeignete Sonden können konstruiert und markiert werden, indem Techniken benutzt werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind. Kürzere Sonden von z.B. 12 Basen können synthetisch erzeugt werden und mit 32p unter Benutzung von T4 Polynukleotid-Kinase markiert werden. Längere Sonden von ungefähr 75 Basen bis weniger als 1,5 kb werden bevorzugt durch z.B. PCR-Amplifizierung in Gegenwart von markierten Vorläufern wie [α-32P] dCTP, Digoxigenin-dUTP, oder Biotin-dATP. Sonden mit einer Länge von mehr als 1,5 kb werden allgemein leichter amplifiziert indem eine Zelle mit einem Plasmid transfektiert wird, das die einschlägige Sonde enthält, die transfektierte Zelle in großer Menge züchtet und die einschlägige Sequenz von transfektierten Zellen purifiziert (siehe Sambrook et al., supra).
  • Sonden können mit einer Vielzahl von Markern markiert werden, unter Einschließung z.B. von radioaktiven Markern, fluoreszenten Markern, enzymatischen Markern und chromogene Marker. Die Benutzung von 32P wird bevorzugt für die Markierung oder Labelisierung einer besonderen Sonde benutzt.
  • Es ist ein Kennzeichen dieses Aspekts der Erfindung, dass die Sonden benutzt werden können, um die Anwesenheit von WRN-mRNS oder WRN-DNS in einer Probe zu detektieren. Jedoch, falls die einschlägige Probe nur in geringer Anzahl vorliegt, kann es nützlich sein, die einschlägige Sequenz zu amplifizieren, so dass sie leichter zu detektieren und zu erhalten ist.
  • Es kann eine Vielzahl von Verfahren benutzt werden, um eine gewählte Sequenz zu amplifizieren, einschließlich z.B. RNS-Amplifizierung (siehe Lizardi et al., Biotechnology 6: 1197–1202, 1988; Kramer et al., Nature 339: 401–402, 1989; Lomeli et al. Clinical Chem. 35 (9): 1826–1831, 1989; US Patent nO. 4, 786, 600), und DNS-Amplifizierung unter Benutzung von LCR oder einer Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction: "PCR") (siehe US Patente No. 4, 683, 195; 4, 683, 202; und 4, 800, 159) (siehe auch US Patente No. 4, 876, 187 und 5, 011, 769, welche ein alternatives Detektions-/Amplifizierungssystem be schreiben, das die Benutzung von spaltbaren Verknüpfungen umfasst) oder andere Nukleinsäure-Amplifizierungsprozeduren, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind. In Bezug auf PCR z.B. kann das Verfahren nach dem Stand der Technik modifiziert werden. Die Transkriptionsverstärkung von PCR kann durch die Integrierung von Bakteriophagen T7 RNS-Polymerase-Promotersequenzen in einer der primären Oligonukleotide durchgeführt werden und die immunoenzymatische Detektion der Produkte des verstärkten Emitters kann unter Benutzung von Anti-RNS:DNS-Antikörpern ausgeführt werden (Blais, Appl. Environ. Microbiol. 60: 348–352, 1994). PCR kann auch in Kombination mit reverser Dot-Blot-Hybridisierung benutzt werden (Lida et al. FEMS Microbiol. Lett. 114: 167–172, 1993) PCR-Produkte können quantitativ analysiert werden durch die Inkorporierung von dUTP (Duplaa et al. Anal. Biochem. 212: 229–236, 1993) und Proben können für eine PCR-Gen-Sondendetektion (Bej. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57: 3529–3534, 1991) gefiltert werden.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die PCR-Amplifizierung benutzt, um die WRN-DNS zu detektieren. Kurz, wie es weiter unten genauer im Detail erklärt worden ist, wird eine DNS-Probe bei 95°C denaturiertem eine einsträngige DNS zu erzeugen. Die DNS-Probe kann eine von einer RNS generierte cDNS sein. Spezifische Primer werden dann zum einsträngigen DNS bei 37° bis 70°C, in Abhängigkeit von dem Verhältnis AT/GC in den Primern, hinzugefügt. Die Primer werden bei 72°C mit Taq DNS Polymerase oder anderen thermostabilen DNS-Polymerasen verlängert, um den der Matrize entgegengesetzten Strang zu erzeugen. Diese Schritte stellen einen Zyklus dar, der wiederholt werden kann, um die gewählte Sequenz zu amplifizieren. Für eine größere Spezifizität kann eine verschachtelte PCR ausgeführt werden. In verschachtelten PCR wird eine zweite Amplifizierung unter Benutzung eines zweiten Primersatzes der von den Sequenzen im ersten amplifizierten Produkt abgeleitet ist, ausgeführt. Die ganze Kodierungsregion des WRN kann vom cDNS amplifiziert werden, indem drei Primersätze benutzt werden, um Fragmentlängen zu erzeugen, die eine geeignete Größe zur Bestimmung ihrer Sequenz aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine verschachtelte PCR ausgeführt.
  • In einer alternativen Ausführungsform wird die LCR-Amplifizierung als Amplifizerung benutzt. Die LCR-Primer werden synthetisiert so dass die 5'-Base des Stromaufwärts-Primer in der Lage ist, in ein einziges Basenpaar in einem gewünschten Gen zu hybridisieren, um ein WRN-Gen spezifisch zu detektieren.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden in einer automatischen, nicht isotopischen Strategie benutzt, bei der die Zielnukleinsäuresequenzen durch PCR amplifiziert werden, und dann werden die gewünschten Produkte durch einen kolorimetrischen Oligonukleotid-Ligations-Assay (OLA) bestimmt (Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 8923–8927, 1990).
  • Primer der Amplifizierung einer ausgewählten Sequenz soll aus Sequenzen ausgewählt werden die hochspezifisch für das WRN sind (und nicht, z.B. das Gen des Bloom-Syndrom, supra) und bildet stabile Duplexe mit der Zielsequenz. Die Primer sollen auch nicht komplementär sein, besonders am 3'-Ende, soll keine Dimer mit sich selber oder anderen Primern bilden und soll keine sekundären Strukturen oder Duplexe mit anderen Regionen der DNS bilden. Allgemein werden Primer von ca. 18 bis 20 Nukleotiden vorgezogen und können leicht unter Benutzung von Techniken aus dem Stand der Technik Synthetisiert werden. PCR-Produkte und andere Nukleinsäureamplifizierungsprodukte können unter Benutzung der aus dem Stand der Technik bekannten Techniken quantifiziert werden (Duplaa et al., Anal. Biochem. 212: 229–236, 1993; Higuchi et al., Biol. Technology 11: 1026–1030).
  • In einer Ausführungsform der Erfindung kann eine Nukleinsäureanalyse entwickelt werden, die in der Lage ist, die Präsenz des Werner-Syndroms oder verschiedener damit in Beziehung stehender Krankheiten, die vom Werner-Syndrom erzeugt werden, zu detektieren. Kurz gesagt, können ernsthafte Mutationen im WRN-Gen zum Werner-Syndrom führen, sowohl als Wirt von entsprechenden Krankheiten einschließlich z.B. die Zunahme der Häufigkeit von einigen gutartigen und bösartigen Neoplasmen (besonders Sarkome), Katarakte, Kardiovaskuläre Krankheiten, Osteoporose, Diabetes vom Typ I und II, Katarakte, Sklerodomaähnliche Hautveränderungen und Hyperkeratose. Weniger ernsthafte Mutationen des Gens können zum Eintreten derselben Gruppe von Krankheiten, aber in höherem Alter führen. Außerdem können viele der entsprechenden Krankheiten mit Mutationen im WRN-Gen in Verbindung gebracht werden. Diabetes und Osteoporose stehen oft mit dem Alter in Verbindung. Alternde Bevölkerung und Individuen mit diesen (oder anderen) Krankheiten werden nach Mutationen im WRN gescreent. Es kann jeder beliebige der hier beschriebenen Assays kann benutzt werden. RT-PCR wird besonders in Verbindung mit der Bestimmung der DNS-Sequenz bevorzugt. Um eine Mutation oder einen Polymorphismus mit einer Krankheit zu korrelieren, sind Geschwister-Paare bei denen ein Geschwisterteil krank ist, sind bevorzugte Subjekte. Wenn eine Mutation einmal identifiziert ist, können andere geeignete Screening-Assays benutzt werden, um besondere Nukleotidänderungen zu untersuchen.
  • Da die Sequenzen von zwei Kopien des Gens von nicht am Werner-Syndrom erkrankten Individuen mit den medizinischen Geschichten dieser Patienten korreliert werden kann, um diese Beziehungen zu definieren, können diese Allele deshalb benutzt werden, um die Empfindlichkeit gegenüber diesen Krankheiten zu diagnostizieren, sobald die Beziehung einmal definiert worden ist. Gewisse nichtnull Formen des Gens beeinflussen z.B. sowohl im homozygoten als auch im heterozygoten Zustand einschlägig die Neigung der zu Träger, z.B. einen Krebs zu entwickeln. Diese Neigungen können bestätigt werden, indem die Sequenzen des Gens (beide Kopien) in einer statistisch signifikanten Probe von Krebspatienten geprüft werden. Andere Krankheiten (siehe oben) auf signifikante Korrelationen mit gewissen Allelen geprüft werden. Um eine solche kausale Beziehung zu detektieren, kann ein Chi-Quadrattest oder andere statistische Tests benutzt werden, um die Signifikanz jeder Korrelation zwischen geeigneten Genotypen und dem Krankheitszustand wie er in medizinischen Aufzeichnungen aufgezeichnet ist, zu untersuchen wobei gute Standardpraktiken der medizinischen Epidemiologie benutzt werden. Die jedes der Allele definierenden Sequenzen sind dann gültige diagnostische Indikatoren für eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der Krankheit. So kann aus den hier zur Verfügung gestellten Nukleinsäuresequenzen eine breite Vielzahl von mit dem Werner-Syndrom in Beziehung stehender Krankheiten detektiert werden.
  • Ein anderer zellulärer Phänotyp der Zelen von Werner-Syndrom-Patienten ist die erhöhte Häufigkeit von Deletions-Mutation dieser Zellen. Klar gesagt, führt die defekte Helikase in diesen Zellen zu einem spezifischen Mutationsphänotyp, ohne die Zellen gegenüber einer Vielzahl von chemischen oder physikalischen Mutagenen, die die DNS beschädigen, wie z.B. Ionisierungsstrahlung empfindlich zu machen. Krankheitszustände oder Empfindlichkeiten die aus einer erhöhten Deletionshäufigkeit resultieren, können deshalb teilweise durch Veränderung des Werner-Gens kontrolliert werden und einige Allele können deshalb von Wert für die Diagnose für diese Klasse von medizinischen Bedingungen sein.
  • Assays für Agonisten und Antagonisten
  • Von der vorliegenden Offenlegung werden auch Agonisten und Antagonisten WRN-Genprodukts zur Verfügung gestellt, umfassend ein Protein, Peptid, chemisch oder peptidomimetisch, das an das WRN-Genprodukt bindet so dass die Bindung des Agonisten oder des Antagonisten die Aktivität des WRN-Genprodukt beeinflusst. Ein Agonist aktiviert oder erhöht die Aktivität des Genprodukts. Ein Antagonist bremst oder mindert die Aktivität des Genprodukts. Die Aktivität des Genprodukts kann in einem Assay gemessen werden. so wie ein Helikase-Assay oder ein anderes Assay das eine Aktivität des Genprodukts misst. Andere Assays messen die Bindung des Protein, das mit dem WRN zusammenwirkt und für seine Aktivität erforderlich ist.
  • Agonisten und Antagonisten des WRN-Genprodukts können benutzt werden, um die Aktivität des Genprodukts zu verstärken oder zu mindern. Solche Agonisten und Antagonisten können mit Hilfe einer Vielzahl von Verfahren identifiziert werden. Proteine z.B. die WRN binden und aktivieren, können unter Benutzung eines Hefe 2-Hybrid-Detektionssystems identifiziert werden. In diesem System wird das WRN-Gen entweder mit einer DNs-bindenden oder einer Aktivierungsdomäne eines Hefegens wie GAL4 fusioniert. Es wird eine cDNS-Bibliothek in einem Vektor konstruiert so das die Einsätze mit einer dieser Domänen fusioniert werden. Die Vektoren werden in die Hefe cotransfektiert und für eine transkriptionelle Aktivierung eines Reportergens ausgewählt (Fields und Song, Nature 340: 245, 1989). Das bzw. die Protein (e) die an das WRN binden sind Agonisten-Kandidaten. Es sind drei verschiedene Proteine die WRN binden in einem Initial-Screening unter Benutzung des 2-Hybrid-Systems identifiziert worden.
  • Wenn der Bindungsort auf dem WRN-Genprodukt bestimmt worden ist, können Moleküle die das WRN-Molekül binden und aktivieren, konzipiert und evaluiert werden. Es kann z.B. eine Computermodellierung des Bindungsorts erzeugt und die bindende Mimetik konzipiert werden. Es können Antikörper zum Bindungsort und ebenso Analoge von nativen Bindungsproteinen erzeugt werden. Es wird jedes dieser Moleküle durch eine funktionelle Prüfung des WRN-Genprodukts auf seine Agonisten- bzw. Antagonistenaktivität getestet. Um z.B. auf die Antagononistenaktivität zu prüfen, wird Hefe mit dem WRN und dem bindenden Protein cotransfektiert, wobei jedes mit einer DNS-Bindungsdomäne bzw. einer Aktivierungsdomaine fusioniert wird. Das Testmolekül wird verabreicht und die Aktivierung überacht. Ein Antagonist bremst die Aktivierung des Reportergens um mindestens 50%. Auf ähnliche Weise kann die Agonistenaktivität entweder durch die Erhöhung der WRN-Aktivität in einem Hefe-2-hybridsystem oder durch die Kopplung der Testverbindung mit einer DNS-Bindungs oder Aktivierungsdomäne und die Überwachung der Aktivität des Reportergens gemessen.
  • Markierungen
  • WRN-Proteine, Nukleinsäuremoleküle die solche Proteine kodieren, Anti-WRN-Protein-Antikörper und Agonisten oder Antagonisten, wie es oben und weiter unten beschrieben worden ist, können mit Hilfe einer Vielzahl von Molekülen inklusive z.B. fluoreszierende Moleküle, Toxine, und Radionuclide markiert werden. Repräsentative Beispiele für fluoreszierende Moleküle umfassen Fluoreszin, Phycobili-Proteine, wie Phycoerythrin, Rhodamin, Texas Rot und Luciferase. Repräsentative Beispiele für Toxine umfassen Rizin, Abrin-Diphteria-Toxin, Choler-Toxin, Gelonin, Pokeweed-Antivirales Protein, Ritin, Shigella Toxin, und Pseudomonas Exotoxin A. Repräsentative Beispiele für Radionuklide umfassen Cu-64, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 und Bi-212. Außerdem können die oben beschriebenen Antikörper auch markiert und mit einem Partner eines ligandenbindenden Paares konjugiert werden. Repräsentative Beispiele umfassen Avidin-Biotin und das Riboflavin-Riboflavin-bindende Protein.
  • Verfahren, zur Konjugierung oder Markierung von WRN-Proteinen, Nukleinsäuremolekülen, die solche Proteine kodieren, Anti-WRN-Protein-Antikörper und Agonisten oder Antagonisten, wie oben diskutiert, können mit den oben dargelegten repräsentativen Markierungen leicht von einem Fachmann durchgeführt werden (siehe Trichothecen Antikörper-Konjugat, US-Patent no. 4, 744, 981; An tikörper-Konjugat US-Patent No. 5, 106, 951; fluorogene Materialien und Markierungstechniken, US-Patent No. 4, 081, 884; metallische mit Radionuklid markierte Proteine für die Diagnose und Therapie, US Patent No. 4, 897, 255; metallische Radionuklid und chelatbildende Verbindungen für eine verbesserte Chelatbildungskinetik; US-Patent No. 4, 988, 496; siehe auch Inman, Verfahren der Enzymologie, Band 34, Affinitätstechniken. Enzympurifikation: Teil B, Jakoby und Wilchek (Herausg.), Academic Press, New York, Seite 30, 1974; siehe auch Wilchek und Bayer, „der Avidin-Biotin-Komplex in bioanalytischen Anwendungen, „Anal. Biochem. 171: 1–32, 1988).
  • Pharmazeutische Kompositionen
  • Wie es oben bemerkt worden ist, stellt die vorliegende Erfindung auch eine Vielzahl von pharmazeutischen Kompositionen zur Verfügung, umfassend eines der oben beschriebenen WRN-Proteine, Nukleinsäuremoleküle, Vektoren, Antikörper, Wirtszellen, Agonisten oder Antagonisten mit einem pharmazeutisch oder physiologisch akzeptierbaren Träger, Exzipienten oder Lösemittel. Allgemein sollten solche Träger nicht toxisch gegenüber dem Empfänger bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen sein. Gewöhnlicherweise bringt die Zubereitung solcher Komositionen die Kombinierung therapeutischer Wirkstoffe mit Puffern, Antioxidantien wie Ascorbinsäure, Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als ca. 10 Reste), Proteine, Aminosäuren, Kohlenstoffhydrate mit Glukose, Sukrose oder Dextrinen, chelatbildende Wirkstoffe wie EDTA, Gluthation, und andere Stabilisierungsmittel und Exzipienten mit sich. Neutral gepufferte Salzlösungen oder mit nicht spezifischem Serumalbumin gemischte Salzlösungen sind beispielhaft geeignete Lösemittel.
  • Außerdem können die pharmazeutischen Kompositionen der vorliegenden Erfindung zur Verabreichung auf einer Vielzahl von Wegen präpariert werden. Außerdem können die pharmazeutischen Kompositionen der vorliegenden Erfindung in verschiedene Behälter untergebracht werden mit einem Verpackungsmaterial das Anweisungen betreffend die Benutzung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Verfügung stellt. Im allgemeinen umfassen solche Anweisungen handfeste Erklärungen, die wie in gewissen Ausführungsformen die Wirkstoffkonzentration beschreibt und die relativen Mengen von Arzneimittel-Zutaten oder -Lösemittel (z.B. Wasser, Salzlösung oder PBS) welche erforderlich sein können um die pharmazeutische Zusammensetzung zu rekonstituieren.
  • Verfahren zur Behandlung und Vorsorge betreffend das Werner-Syndrom
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Behandlung und Vorsorge betreffend das Werner-Syndrom zur Verfügung (oder damit in Beziehung stehende Krankheiten), umfassend die Stufe zur Verabreichung eines Vektors an den Patienten (z.B. Expressionsvektor, viraler Vektor, oder virale einen Vektor enthaltende Partikel) oder nur Nukleinsäuremolküle, wie oben beschrieben, wodurch die. Wahrscheinlichkeit des Auftretens des Werner-Syndroms reduziert oder die Verzögerung des Eintritts des Werner-Syndroms erreicht wird (oder die damit in Beziehung stehenden Krankheiten).
  • Auf ähnliche Weise können therapeutische Peptide, Peptidomimetika, oder kleine Moleküle benutzt werden um das Auftreten des Werner-Syndroms zu Verzögern, die Symptome zu verringern, oder die Progression der Krankheit zu stoppen oder zu verzögern. Solche Therapeutika können in einem transgenen Tiermodell, das das mutante Protein, das Wildtypprotein und das mutante Protein exprimiert, getestet werden oder in einem in vitro Assay-System (z.B. einem Helikaseassay wie es von Bjornson et al., Biochem. 3307: 14306–14316, 1994 beschrieben wird).
  • Wie es oben angegeben ist, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung oder Vorsorge betreffend das Werner-Syndrom durch die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antagonisten oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie sie hierin beschrieben wird an einen Patienten, zur Verfügung. Solche Patienten können durch klinische auf den klassischen Symptomen des Werner-Syndroms basierenden Diagnose identifiziert werden.
  • Wie es für einen Fachmann offenkundig ist, hängt die Menge und die Häufigkeit der Verabreichung natürlich von solchen Faktoren wie der Natur und des Ernstes der zu behandelnden Indikation, der gewünschten Antwort, der Kondition des Patienten usw. ab. Typischerweise können die Zusammensetzungen mit Hilfe einer Vielzahl von Techniken verabreicht werden, wie es oben angegeben ist.
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung können die Vektoren die die oben beschriebenen WRN-Proteine kodierenden Nukleinsäuremoleküle enthalten oder exprimieren, oder sogar die Nukleinsäuremolküle selber enthalten, mit Hilfe einer Vielzahl von alternativen Techniken verabreicht werden, umfassend z.B. die Verabreichung von Asialoospmucoid (ASOR) konjugiert mit Poly-L-Lysin-DNS-Komplexen (Cristano et al., PNAS 92122–92126, 1993), mit gekillten Adenoviren verknüpfte DNS (Curizel et al., Hum Gene Therapy 3 (2): 147–154, 1992), Cystofektion-vermittelte Einführung (DMRIE-DOPE, Vical, Kalifornien), direkte DNS-Injektion (Acsadi et al., Nature 352: 815–818, 1991); DNS-Ligand (WU et al., J. of Biol. Chem. 264: 16985–16987, 1989); Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417, 1989); Liposome (Pickering et al., Circ. 89 (1): 13–21, 1994; Wang et al.; PNAS 84: 7851–7855, 1987); Mikroprojektil-Bombardierung (Williams et al., PNAS 88: 2726–2730, 1991); und direkte Lieferung von Nukleinsäuren die das WRN-Protein selber kodieren entweder allein (Vile und Hart, Cancer Res. 53: 3860–3864, 1993) oder unter Benutzung von PEG-Nukleinsäurekomplexen.
  • Die folgenden Beispiele werden mit Hilfe von Illustrationen und nicht begrenzend gezeigt.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • KLONIERUNG DES WRN-GENS DES CHROMOSOMS 8
  • Der WS-Ort (WRN) wurde anfänglich mit herkömmlichen Kartierungs-Verfahren bei 8p12 lokalisiert (Goto et al., Nature 355: 735–738, 1992) und die genetische Position wurde unter Benutzung des meiotischer und homozygotischer Kartierung verfeinert (Schellenberg et al., 1992; Nakura et al., Genomics 23: 600–608, 1994; Thomas, Genomics 16: 685–690, 1993). Der letztere Ansatz ist möglich, da viele WS-Subjekte die Folge von Blutshochzeiten sind (Tabelle 1). Eine anfängliche Kartierung-Arbeit (Nakura et al., Genomics 23: 600–608, 1994; Oshima et al., Genomics 23: 100–113, 1994) die in den WRN-Ort in ein von D8S137 und D8S87 (1) flankierten 8.3 cM Intervall platziert sind. D8S339, ein Marker in diesem Intervall war der naheste getestete Ort (q = 0,001, Zmax = 15,93). Die Multipoint-Analyse platzierte WRN in 0,6 cM von D8S339, obgleich die Region zwischen D8S87 und FGFR nicht ausgeschlossen werden konnte. Dann wurden die Short-Tandem-Polymorphismus(STRP)-Marker bei der Gluthanionreduktase (GSR) und D8S339 in einem Verknüpfungsungleichgewicht mit WS bei den japanischen WS-Subjekten (Yu, American Journal of Human Genetics 55: 356–364, 1994) gefunden.
  • Um das WRN-Gen zu klonen, wurde ein künstliches Hefechromosom (YC) P1 und ein Cosmid-Contig erzeugt, wobei bei der GSR/D8S339-Region begonnen wurde und durch „Walking"-Verfahren ausgedehnt, um ungefähr 3 Mb zu überdecken. Es wurden zusätzliche 16 STRP-Marker in der Yac-Contig (1B) identifiziert, um Rekombinante zu definieren und die Grenzen der Verknüpfungsungleichgewichtsregion abzugrenzen. Es wurden auch Cosmids und P1-Klone für das Ordnen der Marker und die Genidentifizierung isoliert und benutzt, um ein kleinkloniges partielles Contig der Region (1E) zu konstruieren. Die WRN-Region wurde durch erforderliche Rekombinante bei C41 C3S3 unter Ausschluss der in Bezug auf den Marker telomerischen Region und bei y896R9 unter Ausschluss der in Bezug auf den Marker zentromerischen Region definiert. So wird die Region von C41C3S2 bis y896R9, die sich ungefähr auf 1,2 Mb (1C) beläuft, als Minimalregion betrachtet.
  • Gene in der WRN-Region wurden durch Exon-Trapping unter Benutzung des Vektors pSL3 identifiziert (Buckler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4005–4009, 1991; Church et al., Nat. Genet. 6: 98–105, 1994), Hybridisierung von cDNS-Bibliotheken um die YACS zu immobilisieren (Parimoo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3166–3169, 1991) und Vergleich der genomischen Sequenz mit den DNS-Sequenz-Datenbasen, die BLAST benutzen (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410, 1990) und das die Exons findende Programm GRAIL (Überbacher und Mural, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1261, 1991). Es wurde die genomische Sequenz für die von den P1-Klonen 2233, 2253, 3833, 2236, 2237, 2932, 6738 und 2934 definierte Region und den Cosmid-Klon 176 C6 bestimmt. Jedes Verfahren identifiziert kurze Segmente von exprimierten Sequenzen, welche dann dazu benutzt werden, eine geordnete Fibroblast-cDNS-Bibliothek zu screenen, um längere cDNS-Klone zu identifizieren. Diese Bibliothek wurde ge wählt, da WS-Fibroblasten einen vorzeitigen Vergreisungs-Phänotyp in vitro haben, wobei angegeben wird, dass das WRN-Gen wahrscheinlich in diesem Zelltyp exprimiert ist. Durch diesen Prozess identifizierte Gene wurden nach WRN-Mutationen gescreent, wobei die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt wurde. Anfänglich wurden acht Subjekte nach Mutationen gescreent; 5 WRN-Subjekte (2 Kaukasier und 3 Japaner) und 2 Kontrollsubjekte (1 Kaukasier und 1 Japaner). Vor der Identifizierung des WRN-Gens wurden die folgenden Gene aus der Region nach Mutationen gescreent; GSR, PP2AB, TFIIEB und Gene die anderen exprimierten ESTs entsprechen.
  • Der zu suchende WRN-Ort-Gen wurde anfänglich detektierte, indem die genomische Sequenz des P1-Klons 2934 benutzt wurde, um die DST-Datenbasis zu suchen. Ein einziges 245 bp EST, R58879, wurde detektiert, welches mit zwei Segmenten der genomischen Sequenz ist, die von der erwartete intronische Sequenz getrennt worden war. Es wurde die Sequenz von R58879 benutzt, um längere cDNS-Klone aus einer normalen Fibroblasten-cDNS-Bibliothek zu identifizieren. Ein anfänglicher 2.1 kB cDNS-Klon, der EST R58879 enthält, was dem 3'-Ende des Gens entspricht, wurde durch Screening eines arrays von Klonen mit Hilfe von PCR erhalten, indem die Primer A und B (siehe unten) benutzt wurden. Die Primer A und B sind von der R58879-Sequenz abgeleitet und ergeben ein 145 bp-Fragment nach der Amplifizierung. Längere Klone wurden durch PCR-Screening mit den Primern 5EA und 5EB identifiziert, welche von den Sequenzen in einem erwarteten Exon, das in p2934 und 5' liegt, abgeleitet wurden in Sequenzen, die in dem anfänglichen 2.1 kb-Klon enthalten sind. Es wurden sechs zusätzliche Klone identifiziert. Es wurden 8 zusätzliche Klone durch Zonen-Hybridisierung erhalten. Der längste Klon ist 4.0 kb lang. Es wurde eine zusätzliche Sequenz durch das RAGE-Verfahren erhalten, indem der Primer 5EA benutzt wurde um die cDNS-Synthese des ersten Strangs zu primen. Es wurde ein 2.5 kb-Produkterhalten, das ein zusätzliches 1.4 kb der Sequenz enthielt.
  • Es wurde offenkundig durch die Northern-Blot-Analyse dass R58879 exprimiert wurde, bei der 6.5 kb und 8 kb-Transkripte in einer Vielzahl von Geweben einschließlich Herz, Plazenta, Muskel, und Pankreas detektiert wurde. Es wurden auch Transkripte detektiert BY RT-PCR-Produkte des Fibroblast- und Lyphoblastezellinien-RNS.
  • BEISPIEL 2
  • KLONIERUNG DES WRN-GENS VON SUBJEKTEN
  • Das WRN-Gen kann von Patienten und Mutationen oder Polymorphismen isoliert werden, die durch Sequenzanalyse bestimmt worden sind. Es werden periphere Blutzellen durch Venenpunktur und hypotonische Lyse von Erytrozyten erhalten. DNS oder RNS wird aus diesen Zellen isoliert und das WRN-Gen wird durch Amplifizierung isoliert. Die Gensequenz kann durch Amplifizierung der Exone von der genomischen DNS oder durch RT-PCR erhalten werden, gefolgt von der Bestimmung der DNS-Sequenz. Für die Bestimmung der DNS-Sequenz und zur Durchführung von RT-PCR geeignete Primer (Primer A-R sind die jeweiligen SEQ ID Nummern 1–18, und die Primer 5EA-5EG sind die jeweiligen SEQ ID Nummern 19–25). Zwei cDNS sind identifiziert worden und werden auf den 2 und 3 gezeigt. Es gibt eine gewisse Unsicherheit betreffend die Identität einiger Basen in der 5'-UTR-Region in der 2.
  • Es werden zwei RT-PCR-Reaktionen benutzt, um das Gen aus verschiedenen Geweben zu erhalten. Die Synthese des ersten cDNS-Strangs wird nach den Standardprozeduren ausgeführt (z.B. mit einem Stratascript-Kit von Stratagene). Die cDNS wird einem Paar von verschachtelten PCR-Amplifizierungen unterworfen, die erste mit den Primern I und J (SEQ ID Nummern 9 und 10), gefolgt von den Primern K und L (SEQ ID Nummern 11 und 12) und die zweite mit den Primern 5ED und P (SEQ ID Nummern 22 und 16) gefolgt von den Primern 5EE und B (SEQ ID Nummern 23 und 2). Diese Fragmente werden isoliert und für die Sequenzierung benutzt, um die Unterschiede in der Gensequenz oder dem Spleiss-Muster zu identifizieren. Die Primer A-H (SEQ ID Nummern 1–8) und K-R (SEQ ID Nummern 11–18) werden für die Sequenzierung des ersten RT-PCR-Fragments benutzt. Primer B, 5EA, 5EB, 5EC, 5EE, 5EF, und 5EG (jeweils die SEQ ID Nummern 2, 19, 20, 21, 23, 24 und 25) wurden für die Sequenzierung des zweiten RT-PCR-Fragments benutzt. Die Sequenzierung wird auf ABI373A unter Benutzung des Sequenzierungskits von Applied Biosystems Division von Perkin-Elmer FS nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
  • Figure 00440001
  • Die Exone des 3'-Endes des WRN-Gens können von DNS-Proben unter Benutzung der unten aufgelisteten Primer (die Primer E1A-E13B sind jeweils die SEQ ID Nummern 26–57). Die DNS-Sequenz wird unter Benutzung derselben Primer ABI373A und des Sequenzierungskits von Applied Biosystems Division von Perkin-Elmer FS nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt
  • Figure 00440002
  • Figure 00450001
  • BEISPIEL 3
  • IDENTIFIZIERUNG MUTANTER ALLELE
  • Die cDNS-Sequenz (2) wurde mit der genomischen Sequenz aligniert, um die Exon-Struktur zu identifizieren, und es wurden Primer für die PCR-Amplifizierung von jedem Exon synthetisiert. Die DNS-Sequenz von allen 13 Exons wurde für 5 Patienten und zwei nicht befallene Individuen bestimmt. Bei 4 von 5 Patienten führen die Änderungen von Einzel-Basenpaaren zu Spleiss-Defekten oder stoppen die Codons in dem Open-Reading-Frame des Gens.
  • Beim fünften Patienten führt eine Änderung von Einzel-Basenpaaren zu einem Cystein-Arginin-Übergang, was die Genfunktion unterbrechen kann. Jeder der Exone wurde auch in 96 nicht erkrankten Kontrollindividuen (48 Kaukasier und 48 Japaner) sequenziert, und keine der Mutationen wurde in ANY der Kontrollindividuen gefunden.
  • Die erste Mutation ist eine Mutation an einem Spleiss-Akzeptor-Ort. In der unteren Sequenz, beginnt die GGTAGAAA-Sequenz beim Nukleotid 2030 (2). Die g zu c-Änderung führt zu einer Deletion von 95 bp.
  • Die Präparation von DNS für die RT-PCR-Mutationsanalyse hat zu Tage geführt, dass das Amplifizierungsprodukt für ein Objekt kürzer war als es in den Produkten anderer WS und Kontrollsubjekten war. Die DNS-Sequenz-Analyse des RT-PCR-Produkts hat offenbart dass 95 bp verglichen mit anderen Proben fehlte. Die fehlende Sequenz entspricht einem einzigen Exon. Dieses Exon und die angrenzenden genomischen Segmente waren von dem WS-Subjekt sequenziert und kontrolliert und eine einzige Basenänderung (G → C) wurde an dem Spleiss-Donor-Stelle entdeckt. Das Subjekt war der Nachkomme einer ersten Vetternheirat und war, wie erhofft homozygot für diese Mutation. Dieselbe Mutation wurde in einer Gesamtheit von 18 aus 30 japanischen WS-Subjekten gefunden und so findet die verbreiteste japanische Mutation statt. Deletion von dem Exon führt zu einem Wechsel in der erwarteten Open-Reading-Frame und einem vorzeitigen Stopcodon. Diese Mutation wurde nicht bei 46 Kontroll-Japanern und 46 Kontroll-Kaukasiern beobachtet. Unter Mutationsträgern, hatten 12/16 das 141 bp-Allel bei GSR2-STRP.
  • Figure 00460001
  • Die zweite Mutation ändert ein C in ein T beim Nukleotid 2384 (2), was ein Glutamin in ein Stopcodon ändert, was zu einem erwarteten gekürzten Protein führt. Diese Mutation wurde bei einem einzigen Subjekt beobachtet. Die Primer E11A und E11B grenzen an diese Sequenz an und amplifizieren ein 360 bp-Fragment.
  • Figure 00470001
  • Die dritte Mutation ändert ein C in ein T beim Nukleotid 2804 (2), was einen Arginin-Codon in ein Stop-Codon ändert, was zu einem erwarteten gekürzten Protein führt. Vier japanische WS-Subjekte und 1 kaukasisches WS-Subjekt haben ihre Mutation. Die Primer E8A und E8B grenzen an diese Sequenz an und amplifizieren ein 267 bp-Produkt.
  • Figure 00470002
  • Die vierte Mutation ist eine 4 bp-Mutation über eine Spleiss-Bindung. Die unten gezeigte Exon-Sequenz beginnt beim Nukleotid 2579 (2) Diese Mutation wurde bei einem syrischen WS-Kind identifiziert. Die Primer E4A und E4B grenzen an diese Mutation an und amplifizieren ein 267 bp-Fragment.
  • Figure 00470003
  • Die fünfte Mutation ist eine Missense-Mutation. Ein T wird in ein G beim Nukleotid 2113 (2 geändert, wodurch der Wildtyp phe Codon in einen leu Codon geändert wird. Diese Änderung ist ein Polymorphismus wobei jedes Allel mit einer Häufigkeit von ca. 0,5 präsent ist. Es gibt keine Korrelation mit WS.
  • Figure 00470004
  • Die sechste Mutation ist eine Missense-Mutation, die ein T in ein C beim Nukleotid 2990 (2) und ein cys-Codon in ein arg-Codon ändert.
  • Figure 00480001
  • Diese Punktmutationen können auch durch PCR identifiziert werden, indem Primer benutzt werden, die als meistverbreitete 3'-Basis entweder den Wildtyp oder das mutante Nukleotid enthalten. Es werden zwei separate Reaktionen durchgeführt, indem einer dieser und ein gemeinsamer zweiter Primer benutzt werden. Die Amplifizierung ist in der Reaktion die einen angepassten Primer enthält, detektierbar.
  • BEISPIEL 4
  • KENNZEICHNUNG DES WRN-GENS UND DES GEN-PRODUKTS
  • Die 2 kb WRN-cDNS hybridisiert in ein 6,5 kb RNS und eine weniger häufige 8 kb RNS bei einem Northern Blot, was es nahe legt, dass eine Kodierungsregion mit voller Länge ca 5,2 kb lang ist. Ein überlappender cDNS-Klon ist isoliert worden, der die Sequenz um 2 kb ausdehnt. Der Einsatz von diesem Klon wird benutzt, um cDNS-Bibliotheken zu sonden, um andere Klone zu identifizieren die das 5'-Ende der cDNS oder eine Sequenz mit voller Länge enthalten. Es sind alternative Spleiss-Ereignisse detektiert worden, indem die volle cDNS-Sequenz aus einer Anzahl verschiedener Gewebe sequenziert worden ist, einschließlich voll differentiierte Zellen und Stammzellen, und eine gesamte Spanne von Gentranskripten durch Sequenzvergleich identifiziert worden ist. Zusätzliche Exons sind wie oben durch weitere genomische Sequenzierung und GRAIL-Analyse identifiziert worden.
  • Die erwartete Aminosäurensequenz wird auf den 2B und 3 gezeigt. Die 2 zeigt cDNS und erwartete Aminosäuresequenzen des WRN-Gens. Die 3 präsentiert cDNS und erwartete Aminosäuresequenzen eines weniger häufigen Transkripts des WRN-Gens. Das längste Open-Reading-Frame wird vom ersten Methionin in diesem Frame gezeigt. Das erwartete WRN-Protein besteht aus 1432 Aminosäuren, die drei Regionen unterteilt sind: eine N-Terminal Region, eine Zentralregion, die 7 Motive aufweist (I, Ia, II, III, IV, V und VI), die charakteristisch für die DNS und RNS-Superfamilie von Helikasen ist (Gorbalenya et al. Nucleic Acid Res. 17: 4713, 1989) und eine C-Terminal-Region (8). Ungleich der Zentralregion, zeigen die N-Terminal und die C-Terminal-Domäne des erwarten Proteins keine Aminosäurenidentität TO anderen Helikasen oder irgendeinem vorher beschriebenen Protein. Da viele Helikasen als Teil eines Multiproteinkomplexes funktionieren, können die N-Terminal- und/oder die D-Terminal-Domäne Interaktionsorte für diese anderen Proteine enthalten, während die zentrale Helikasedomäne im aktuellen enzymatischen Abwicklung von DNS- oder RNS-Duplex funktioniert.
  • Die N-Terminal-Region, die ungefähr die Codon 1 bis 539 umfasst, ist sauer; es gibt 109 Aspartat- oder Glutamatreste, einschließlich eine Streckung von 14 sauren Resten in einer 19 Aminosäurensequenz Codon 507 bis 526), es werden Streckungen von sauren Resten in der Xeroderma pigmentosum (XP) Kemplementierungsgruppe B-Helikase, der Bloom-Syndrom-Helikase und der X-Chromosome-gelinkten α-thalassemia-Schwachsinn-Syndrom-Helikase gefunden. In dem WRN-Gen enthält diese Region auch eine Tandem-Verdoppelung von 27 Aminosäuren in denen jede Kopie von einem einzigen Codon kodiert wird. Da diese Verdoppelung auf dem Nukleotidniveau exakt ist, und da auch angrenzende intronische Sequenzen für zwei Exons die kodieren die Verdoppelung auch sehr ähnlich ist, so nimmt man an, dass es das Ergebnis eines relativ neuen Ereignisses ist. Die verdoppelten Regionen sind auch sehr sauer mit Glutamat- oder Aspartamatresten von 27 Aminosäuren und nur zwei basischen Aminosäuren (ein Histidin- und ein Lysinrest).
  • Die Zentralregion des WRN-Gens, die ungefähr die Codon 540–593 überspannt, ist sehr homolog in Bezug auf andere Helikasen aus einer großen Menge von Organismen einschließlich das ReqQ-Gen von E. Coli, dem SGS1-Gen von S. cerevisiae, eine erwartete Helikase (F18C5C) von C. elegans, und mehrere menschliche Helikasen. Wegen der Sequenzähnlichkeit ist das WRN-Gen so ein Mitglied der Superfamilie der DExH-box-DNS und RNS-Helikasen. Die haupt sächlichen konservierten Sequenzen bestehen aus 7 Motiven, die in anderen Helikasen gefunden worden sind. Diese Motive umfassen eine erwartete Nukleotid-Bindungs-Stelle (Motiv 1) und eine Mg2+-Bindungsstelle (Sequenz DEH, Motiv II). Mann nimmt an, dass einige oder alle der 7 Motive den ezymatisch aktiven Ort für DNS/RNS Abwicklung bilden. Die Anwesenheit der DEAH-Sequenz und ein ATP-Bindungsmotiv legt nahe, dass das WRN-Genprodukt eine funktionelle Helikase ist.
  • Das C-Terminal-Ende des WRN-Gens, von den Codons 964 bis 1432, hat eine begrenzte Identität mit anderen Genen. Die einzige identifizierte Identität ist eine verlorene Ähnlichkeit mit dem E. coli-ReqQ-Gen und dem C. elegans-Gen F18C5.2.
  • BEISPIEL 5
  • IDENTIFIZIERUNG UND ENTDECKUNG VON MUTATIONEN IN DEM WRN-GEN
  • Mutationen oder Polymorphismen von WRN können mit Hilfe verschiedener Verfahren identifiziert werden, einschließlich der Sequenzanalyse. Obwohl jede Zelle (ausser den Erythrozyten) benutzt werden kann, um Nukleinsäuren zu isolieren, werden periphere einzellige Blutzellen vorgezogen (PBMC). Periphere einzellige Blutzellen werden mit Hilfe der Venenpunktur und einer anschließenden hypotonischen Lyse von Erythrozyten erhalten. Es wird RNS isoliert und eine Primärstrang-cDNS-Synthese unter Benutzung eines Strata-script-RT-PCR-Kits gemäß den Anweisungen des Fabrikanten ausgeführt (Stratagene, La Jola, Teilenummer 200347 und 200420). Drei RT-PCR-Fragmente werden unter Benutzung eines LA PCR Kits Ver. 2 amplifiziert unter Benutzung eines Puffers der 1,65 mM MG+2 (TaKaRa Shuzo Co., Ltd., Japan, Teil-Nummer RR013A). Es wird verschachtelte PCR ausgeführt. In dieser Reaktion wird ein zweites PCR unter Benutzung eines Primerpaares in der durch die erste PCR-Reaktion amplifizierten Sequenz ausgeführt. Die Zyklus-Bedingungen für jede Amplifizierung sind folgende: 10 Minuten bei 95°C, 35 Zyklen von 1 Minute bei 60°C, 1 Minute bei 72°C und 1 Minute bei 95°C gefolgt von 7 Minuten bei 72°C in einer Perkin-Elmer-9600 PCR-Maschine. Die amplifizierten Fragmente werden unter Benutzung von 96-Well-Plate-Spin-Säulen (Wang et al., Anal Biochem. 226: 85–90, 1995) Die DNS-Sequenz wird unter Benutzung eines FS-Dye-Terminator Sequenzierungs-Kits (Applied Biosystems Division von Perkin Elmer) und der unten beschrieben Primer bestimmt. Es wird ein automatisierter ABI373A-DNS-Sequenzierer von Applied Biosystem zur Bestimmung der Sequenz benutzt. Die amplifizierten Fragmente und die geeignete Primer sind in der Tabelle 1 aufgelistet und die Primer sind in der Tabelle 2 aufgelistet.
  • Die DNS-Sequenzen sind aufgereiht mit bekannten Sequenzen (2A) unter Benutzung des Programms Sequencher (Gene Codes, Michigan) um jede Diskrepanz zwischen den Proben der Patienten und der Referenzsequenz.
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • BEISPIEL 6
  • ISOLIERUNG VON DAS WERNER-SYNDROM UMFASSENDER GENOMISCHER DNS
  • Um die Mutationsanalyse des WRN-Gens zu vereinfachen, wird die Intron-Exon-Struktur bestimmt. Das WRN-Gen ist in der Genomsequenz des P1-Klons 2934 gelegen. Dieser Klon enthält nur das 3'-Ende des Gens (Exone 21 bis 35). Genomklone die das 5'-Ende enthalten, werden aus einer Chromosom 8-spezifischen Cosmid-Biobliothek LA08NC01 (Wood et al, Cytogenet. Cell Genet. 59: 243, 1992) durch Screening für die dem P1-Klon 2934 benachbarten Klone erhalten. Kurz, diese Bibliothek ist für ein PCR-Screeening aufgestellt, wie es bei Amemiya et al. (Nucl. Acids Res. 20: 2559, 1992) beschrieben worden ist. Wenn enthaltende Cosmide werden unter Benutzung des Primersatzes 5E6:5EY, 5ED/5E12 und CD-A/CD-B (Tabelle 3) identifiziert, die von der WRNcDNS-Sequenz abgeleitet sind (1; GenBank Accession No. L76937). Es wurden durch vier „walking steps" vier Cosmide 193B5, 114D2, 78D8 und 194C3, die die verbleibenden Exons enthalten, erzeugt. Vom WRN-cDNS abgeleitete Primer wurden für die anfängliche Sequenzanalyse des Cosmidklone benutzt. Die sich ergebende Sequenz (5) wird mit der cDNS-Sequenz verglichen, um die Intron-Extron-Grenzen zu identifizieren. Aus den Intronsequenzen werden dann die Sequenzierungsprimer konzipiert um die Sequenzierung in der umgekehrten Richtung zu erhalten und um die zweite, die Intron-Exon-Verbindung definierende Grenze zu erhalten. Diese Strategie wird benutzt, um die nicht auf dem P1-Klon 2934 anwesenden Exons zu definieren.
  • Tabelle 3 Primer-Sequenz und PCR-Bedingungen für die WRN-Analyse
    Figure 00530001
  • Die Annealing-Temperatur war 60°C für alle Primersätze.
  • Die Tabelle 4 präsentiert eine Summe von Strukturen, des genomischen WRN-Gens. Die erste Zeile identifiziert das Exon, die zweite Spalte gibt die Basennummern der cDNS an, die vom Exon abgeleitet sind, die dritte Spalte gibt die Größe des Exons in bp an, die vierte Spalte zeigt die Sequenz der Grenzen mit Intronsequenzen in kleinen Buchstaben und Exonsequenzen mit großen Buchstaben an, die fünfte Spalte gibt besondere Kennzeichen der Exons an.
  • Tabelle 4. Intron-Exon-Struktur des WRN-Gens
    Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Anmerkungen: Die Exons sind in grossen Buchstaben und die Intronsequenzen in kleinen Buchstaben.
  • Wie es oben gezeigt ist, enthält WRN insgesamt 35 Exon mit einer Größe on 68 bp (Exon 14) bis 768 (Exon 35). Die Kodierungsregion beginnt im zweiten Exon (Tabelle 2). Wie es vorher angegeben ist, gibt es eine verdoppelte Region in der WRN-cDNS-Sequenz welche 27 Aminosäuren lang ist. Diese Verdoppelung wird genau beibehalten im Nukleotidniveau in cDNS. Auf dem Genomniveau waren die verdoppelten Sequenzen als 2 Exone gegenwärtig (Exon 10 und 11), wobei jedes Exon nur zwei verdoppelte Nukleotide enthält. Die zu diesen 2 Exons benachbarten Intronsequenzen werden auch in starkem Masse konserviert, wobei es nahe liegt, dass das relativ neue Verdoppelungsereignis verantwortlich für diese wiederholten Exons ist. Außerdem war es nicht möglich, da die umgebenden Intronsequenzen konserviert blieben, Primers zu entwerfen, die die Exons 10 und 11 auf spezifische Weise amplifizieren konnten.
  • Die Helikaseregion des WRN-Gens ist in den Exons 14–21 enthalten. Das Helikasemotiv 1 ist aufgeteilt zwischen den Exons 14 und 15 während die verbleibenden Motive jedes in einem individuellen Exon (Tabelle 4) bleibt. Diese Region vom Codon 569 bis zum Codon 859 hat Sequenzähnlichkeit mit dem 7 Signatur-Helikase-Motiven. Außerdem ist das Raster für eine weite Spanne von Spezies sehr ähnlich in den Genen, obgleich die Sequenzen zwischen den Motiven nicht konserviert bleiben. Die Helikasedomänen in dem E. coli RecQ-Gen findet man z.B. in einer Spanne von 288 Aminosäuren verglichen mit den 291 Aminosäuren für das WRN-Gen.
  • BEISPIEL 7
  • IDENTIFIKATION VON MUTATIONEN
  • Anfänglich wurden 4 verschiedene Mutationen in der C-Terminaldomäne des WRN identifiziert. Diese Mutationen wurden zu mehr als 80% den untersuchten japanischen WS-Patienten zugewiesen. Alle 4 Mutationen befinden sich in der C-Terminal Domänenregion des WRN und das sich ergebende erwartete Protein enthielt eine intakte Helikasedomäne. Zusätzliche WS-Subjekte wurden gescreent um weitere Mutationen zu identifizieren. Es wurde Information über die Genomstruktur benutzt, um OCR-Primer für die Amplifizierung jedes Exons zu entwerfen, welches dann einer DNS-Sequenzanalyse unterzogen wurde. Es werden fünf zusätzliche WRN-Mutationen beschrieben; 2 liegen in den übereinstimmenden Helikasemotiven und weitere zwei werden verkürzte Proteine ohne die Helikasedomänen erzeugen. Diese Mutationen legen nahe, dass in mindestens einigen WS-Subjekten die enzymatische Helikaseaktivität zerstört ist und ein kompletter Verlust der Funktion des WRN-Genprodukts erzeugt das Werner-Syndrom.
  • Obwohl jede Zelle benutzt werden kann, um DNS zu erzeugen, wird PBLC vorgezogen. Wie oben, wird PBMC durch Venenpunktur erhalten und eine darauf folgende hypotonische Lyse von Erythrocythen. PBMC wird gelyst durch Hinzugabe von Detergentien n wie 0,5% NP-40, 0,50% Triton X100 oder 0,5% SDS. Wenn ein nicht ionisches Detergentium benutzt wird, ist keine weitere Purifikation von DNS erforderlich, aber eine Proteinase K-Behandlung und ein folgendes Hitzeabtötung des Enzyms (95% XC während 10 Minuten) ist nötig. Wie oben erwähnt, wird gemäß PCR-Bedingungen unter Benutzung von den auf der Tabelle 5 aufgelisteten Primern Genom-DNS amplifiziert. Die Exons 9 und 10 sind in einer DNS-Region enthalten, die verdoppelt ist. Das Primerpaar für die Exons 9 und 10 verbindet sich zu Sequenzen außerhalb der Verdoppelung. Das amplifizierte Produkt wird durch eine DNS-Sequenzbestimmung, die Hybridisierung mit der allelspezifischen Sonde, oder anderen Mutationsentdeckungsverfahren analysiert. Wenn die DNs-Sequenzen bestimmt sind, wird die Sequenz des amplifizierten Exons aufgereiht mit der bekannten Sequenz (2A) und jede Diskrepanz zwischen den Patientenproben und der Referenzsequenz wird identifiziert.
  • Tabelle 5
    Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Die Annealing-Temperatur war 60°C für alle Primersätze.
  • Die Mutationen werden entdeckt, indem die WRN-Exone von Genom-DNS amplifiziert werden und wenn die PCR-Produkte direkt durch eine Färbungs-Terminator-Zyklus-Sequenzierung (Parkin-Elmer) und einen automatischen ABI373 DNS-Sequenzierer-Zyklus-sequenziert werden. Vor der Sequenzierung werden die PCR-amplifizierten Exonfragmente unter Benutzung eines QIAquick-8-Purifizierungskits (Quiagen) purifiziert. Die sich ergebenden Sequenzen wurden durch eine PASTA-Analyse (GCG) aufgereiht. Nukleotiddifferenzen zwischen WS und Kontrollen werden anschließend durch Sequenzierung des reversen Stranges bestätigt.
  • Auf reverser Transkriptase PCR (RT-PCR) basierte Verfahren wurden benutzt, um einige Mutationen zu identifizieren (Mutationen 1 bis 4 und 9, Tabelle 6) und um die erwarteten Konsequenzen der Spleiss-Verbindungs-Mutationen zu bestätigen. RT-PCR-Produkte wurden aus mRNS, das aus Lymphoblastoidzelllinien isoliert waren, synthetisiert (Quiagen Oligotex, Quiagen) Die große Genomdeletion wurde in dem Genom-DNS unter Benutzung von weitspannigem PCR (Expand Long Template PCR System, Boehringer Mannheim) entdeckt.
  • Diagnostische Kriterien. WS-Patienten kamen aus einem Internationen Register von Werner-Syndrom-Subjekten. Diagnostische Kriterien sind auf folgenden Zeichen und Symptomen basiert (Nakura et al. 1994). Hauptzeichen sind: 1) Beidseitige Katarakte; 2) Charakteristische dermatologische Pathologie (straffe Haut, atrophe Haut, Pigmentveränderungen, Ulceration, Hyperkeratose, regionale subkutane Atrophy) und charakteristische Fazies („Vogel"-Fazies); 3) kleine Statur; paternelle Blutsverwandschaft (dritter Cousin oder mehr) oder erkrankte Geschwister; 5) vorzeitige Ergrauung und/oder Verdünnung des Skalphaares; 6) positiver 24 h Hyaloronsäuretest im Urin, wenn er zur Verfügung steht; Weitere Kriterien sind: 1) Diabetes mellitus; 2) Hypogonadismus (sekundäre sexuelle Unterentwicklung, verminderte Fertilität, Hoden- oder Gebärmutter-Atrophy); 3) Osteoporose; 4) Ostesklerose des distalen Phalangen der Finger und/oder Zehen (Röntgenstrahlendiagnose); 5) sanfte Gewebekalzifizierung; 6) Evidenz von vorzeitiger Artherosklerose (z.B. Ablauf des Myocardinfarkts); 7) mesenchymale Neoplasmen, seltene Neoplasmen oder multiple Neoplasmen; 8) Stimmveränderung (hoch, piepsig oder Pferdestimme); 9) Plattfüsse. Diagnostische Klassifikationen sind folgende: „Definitiv", alle Kardinalzeichen (#6, wenn verfügbar) und beliebige 2 andere; „wahrscheinlich", die ersten drei Kardinalzeichen und 2 beliebige andere; „möglich", entweder Katarakte oder dermatologische Veränderungen und 4 beliebige andere; „ausgeschlossen", Ausbruch von Zeichen und Symptomen vor der Pubertät (außer kleine Statur da geläufige Daten über ein Vorpubertäts-Wachstumsmuster nicht geeignet sind) oder ein negativer Hyaloronsäure-Test. Die Familienangaben werden wie oben benutzt (Nakura et al. 1994; Goddard et al. 1996; Yu et al. 1996).
  • Mutationen bei WS-Subjekten. AnfangsScreening des WRN-Gens war auf einer Sequenz nur von dem 3'-Ende des Gens (Exons 23–35) basiert. So waren die ersten vier Mutationen (bezeichnet mit 1–4, Tabelle 3) in der 3'-Region der Helikasedomäne. In diesem Mutationsscreening, amplifizieren Primer Exone 2– 35 mit ungefähr 80 bp der angrenzenden Intronsequenz (Tabelle 5). Anfänglich wurden 9 WS-Subjekte (Kaukasische Subjekte DJG, EKL und FES und japanische Subjekte IB, KO, OW, KUN, WKH und WSF) nach Mutationen gescreent. Diese Subjekte wurden ausgewählt basiert auf einer Haplotypanalyse, was nahe legte, dass jedes Subjekt eine verschiedene Mutation haben kann (Yu et al., 1994; Goddard et al. 1996). Ein Eine Gesamtheit von 30 japanischer und 36 kaukasischer Subjekte wurden schließlich nach jeder Mutation durch eine DNS-Sequenzanalyse des geeigneten Exons gescreent.
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Tabelle 7 Mutationsstatus der Werner-Syndrom(WS)-Subjekte
    Figure 00640002
  • Fünf neue WS-Mutationen wurden in dem WRN-Gen entdeckt (bezeichnet 5–9, Tabelle 6). Zwei der Mutationen (5 und 6) waren einbasige Substitutionen die NONSENSE Codons erzeugten. Mutationen. Die Mutation 5 resultiert in eine Transition C → T, was ein Arg in einen Endcodon (Tabelle 6, 6) verwandelt. Das erwartete Protein ist verkürzt bei 368 Aminosäuren, ausschließlich der Helikaseregion die bei Codon 569 beginnt. Drei japanische und drei kaukasische Subjekte waren homozygot, und ein Japaner und 4 Kaukasier wären heterozygot für diese Mutation (Tabelle 7). Mutation 6 ist auch eine Tränsition C → T, was ein Arg in einen Nonsense-Codon verwandelt. Ein kaukasisches WS-Subjekt war homozygot für diese Mutation und ein zweites war ein zusammengesetzter Heterozygot. Das erwartete Proteinprodukt hat 888 Aminosäuren. Eine dritte Substitutionsmutation (Mutation 7) war ein Wechsel G → T an einer Spleiss-Rezeptor-Stelle, was ein verkürztes mRNS-Lehrstelle des Exons 20 und ein vorzeitig beendetes WRN-Protein bei der Aminosäure 760 erzeugt. Ein einziges WS-Subjekt war homozygot für diese Mutation.
  • Es wurden zwei Deletionen beobachtet. Eine (Mutation 8) ist eine 1 bp-Deletion beim Codon 389, was in einem Frame-Shift und einem erwarteten verkürzten Protein, das 391 Aminosäuren lang ist. Diese Mutation ist bei einem kaukasischen Patienten als heterozygot gefunden worden. Die zweite (Mutation 9) ist eine viel größere Deletion. Diese Deletion wurde zuerst in RT-PCR-Experimenten gefunden wenn zwei verschiedene RT-PCR-Produkte von einem von einem Subjekt DJg präparierten RNS erhalten worden ist. Die von den Primern 5EE und B (Tabelle 5) erzeugten RT-PCR-Produkte erzeugten 2 verschiedene Produkte, eines mit der erwarteten Größe von 2009 bp und ein zweites kürzeres Produkt, ca. 700 bp kleiner. Die DNs-Sequenz des kürzeren Produkts zeigte, dass die Exons 19 bis 23 fehlten. Um weiter die Natur dieser Mutation zu erstellen, wurden die Primer, Exon 18A und Exon 24A, Tabelle 5) die von den Exons, die an diese potentiell große Deletion angrenzen, (Exons 18 und 24) benutzt, um das genomische DNS vom Subjekt DJG unter Benutzung eines weitreichenden PCR-Protokolls amplifiziert. Ein einziges 5 kb Fragment wurde beobachtet, das dem kürzeren RT-PCR-Produkt entsprach. (Das normale Fragment, das als > 20 kb eingeschätzt war, wurde nicht beobachtet) Die komplette DNS-Sequenz dieses 5 kb-Fragments wurde bestimmt und enthielt jeweils die erwarteten 3' und 5'-Enden der Exone 18 und 24. Es wurden keine Sequenzen von den Exonen 19–23 in dem 5 kb-Fragment gefunden. In anderen Subjekten und Kontrollen, enthielt die Intronsequenz im Intron 3' zum Exon 18 531 bp der einzelnen Sequenz gefolgt von einem 241 bp Alu Repeat-Element. Ähnlicherweise gibt es für die Region 5' zum Exon 24 ein Alu-Repeat-Element das von dem Exon 24 durch 3460 bp einer einzigen Sequenz getrennt war. Das 4938-bp-Fragment vom Subjekt DJG enthielt diese einzelnen an das Exon angrenzenden Intronsequenzen die von einem einzigen Alu-Element. So erscheint diese Deletion wahrscheinlich aufgrund von einem Rekombinationsirrtum bei 2 hochhomogen Alu-Elementen im WRN-Gen. Ein Primerset, GD-A und GD-D (Tabelle 5) wurde entwickelt, um spezifisch ein kurzes Fragment (426 bp) durch diesen Verbindungspunkt zu amplifizieren. Ein einziger zusätzlicher kaukasischer WS-Patient, SUG, wurde gezeigt um diese Genomdeletion zu enthalten. Eine weitere PCR-Amplifizierung der Exons in dieser deletierten Region zeigte, dass beide, DJG und SUG heterozygot für diese Mutation sind.
  • Ursprünge der WRN-Mutationen. Weil viele Subjekte dieselbe Mutation und dieselbe Mutation bei verschiedenen ethnischen Gruppen beobachtet wurde, so haben mindestens einige der Mutationen wahrscheinlich ihren Ursprung mindestens einige der Mutationen gemeinsame Ursachen. Die Evidenz für einen Forscher wurde geprüft unter Benutzung von zwei STRP in dem WRN-Gen. Diese STRPs, D8S2162 und p2934AT1 wurden von demselben P1-Klon (p2934) isoliert und befinden sich in 17,5 kb von jedem. Während D8S2162 ist nicht besonders polymorph (Heterozygosität = 54% bei Japanern und 70% der Kaukasier) und ist primär ein 2-Allele-System (140 und 142 bp-Allele), p2934AT1 ist hochpolymorph (Heterozygosität = 78% bei den japanischen und kaukasischen Populationen). Für die Mutation 4, die nur bei japanischen Subjekten beobachtet, alle ausser einem hatten den D8S2164/p2934AT1-Haplotyp von 140–148 (Tabelle 8). Die einzige Ausnahme, JO2, hat den Haplotyp 140–150, wobei das p2934AT1-Allel sich um 2 bp von dem 148 bp-Allel das bei anderen Subjekten mit der Mutation 4 beobachtet wird unterscheidet. Diese 2 bp-Differenz kann das Ergebnis von eier 2 bp-Mutation sein, wie es üblicherweise bei den Dinukleotid-Repeat-STRP-Stellen beobachtet wird (Weber und Wong, 1993). Die Haplotypdaten sind in Übereinstimmung mit einer gemeinsamen Ursache und mit dem bei denselben japanischen Subjekten für andere Marker in der WRN-Region (Yu et al., 1994; Goddard et al. 1996) beobachteten Eindungs-Ungleichgewicht. Für die Mutationen 2 und 5 bei dem japanischen Subjekt sind die 896R18-p2934AT1-Maplotypen für die kleine Anzahl von verfügbaren Subjekten in Übereinstimmung mit gemeinsamen Ursachen für jede Mutation. Die nicht japanischen Subjekte mit Mutatioen 2 und 5 haben diskordante p2934AT1-Genotypen wenn sie mit jepanischen Subjekten mit denselben Mutatioen verglichen werden. Diese Resultate unterstützen nicht eine gemeinsame Ursache für die japanischen und nicht japanischen Subjekte mit den Mutationen 2 und 5. Bei den nicht japanischen Subjekten für die Mutation 5 muss es so viel wie 3 verschiedene Ursachen geben, da in beiden Fällen verschiedene Subjekte mit der Mutation 5 diskordant für p2934AT1 (vgl z.B. A000780 bei EKL) sind. Es soll angemerkt werden, dass die Abwesenheit von Evidenz für eine gemeinsame Ursache nicht notwendigerweise die Möglichkeit eines einzigen ursprünglichen Mutationsereignisses ausschließt. Intragene Rekombination und/oder Mutationen die neue Allele erzeugen beim 2 STRP-Ort verschleiern mit der Zeit die Ursprünge der verschiedenen WRN-Mutationen.
  • Die hier identifizierten 5 Mutationen zeigen, dass die WS-Mutationen nicht auf das 3'-Ende des Gens beschränkt sind, sondern auch in anderen Regionen des WRN gefunden werden. Ausserdem spalten die Mutationen 5 und 7 bis 9 jeweils entweder einen Teil oder die ganze Helikaseregion. So werden die homozygoten WS-Subjekte für diese Mutation ebenso wie für das 3'-Ende des Proteins völlig fehlen. Obwohl die Möglichkeit besteht, dass das verkürzte 368-Aminosäurenprotein eine partiell verbleibende Funktion hat, so führt die Mutation 5 möglicherweise zu einem völligen Verlust der ganzen Aktivität des WRN-Proteins. Der WS-Phänotyp in diesen Subjekten ist jedoch fühlbar unterschiedlich vom WS-Phänotyp, der von den anderen hier beschrieben Mutationen erzeugt worden ist. So können alle Mutationen in dem WS-Gen vollständig ihre Mutationsfunktion verloren haben.
  • Tabelle 8: STRP-Gentypen am WRN-Gen1
    Figure 00680001
  • BEISPIEL 8
  • IDENTIFIKATION DES MÄUSE-WRN-GENS
  • Das Maus-WRN-cDNS wurde durch ein Screening der Mäuse-Splenocyten cDNs-Bibliothek isoliert mit geringer Strringenz mit einer menschlichen WRN- cDNs als Sonde die Mäuse-cDNS-Sequenz wird auf der 9 dargestellt. Die HOMOLOGy zwichen einer Menschen- und Mäuse WRN-cDNS-Sequenz ist ungefähr 80%. Auf dem Aminosäurenniveau, zeigt das Menschen- und Mäusegenprodukt eine Identität von ca. 90%. Besonders das wiederholte Exon in der menschlichen WRN-cDNS (EXONS 10 und 11) ist nur einmal in der Mäuse-WRN-cDNS vorhanden.
  • Der genomische Mäuse-WRN-Klon wurde isoliert, indem spezifische Mäuse-WRN-Primer benutzt wurden, um die genomische Mäuse-BAC-Bibliothek zu screenen. Die genomische DNs-Sequenz ist in der 6 dargestellt.
  • Die genomische DNS-Sequenz wird auf der 7 und den SEQ ID Nummern 207 bis 209 dargestellt. Die DNS-Sequenz ist auf der 6 und den SEQ ID Nummern 205 und 206 dargestellt.
  • BEISPIEL 9
  • Es wird ein in ein Peptid des WRN-Genprodukts verwandeltes polyklonales Kaninschenserum in einem direkten Immunofluoreszens-Assay benutzt, um die intrazelluläre Lokalisierung des WRN-Proteins zu bestimmen.
  • Es wird ein polyklonales Kaninschenserum in ein Phe-Pro-Gly-Ser-Glu-Glu-Ile-Cys-Ser-Ser-Lys-Arg Peptid (FPGSEEICSSSKR) (SEQ ID Nummer 204) nach Standardverfahren (siehe Harlow und Lane, Antikörper, Ein Laborhandbuch, CSH Press, Cold Spring Harbor 1989; Geläufige Protokolle in der Immunologie, Green Publishing, 1995) ausgeführt. Das Peptid entspricht den Resten 1375 bis 1387 des WRN-Polypeptids.
  • Zellen, wie Epithelzellen werden auf einer Kunstoff- oder Glasoberfläche gezüchtet, mit 3% Paraformaldehyd fixiert und während 2 Minuten mit einem Puffer, der 0,5% Triton X-100, 10 mM PIPES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 300 mM Saccharose, und 3 mM MgCl2 (siehe z.B. Fey et al. J. Biol. Chem. 98: 1973, 1984) permeabilisiert. Die Zellen werden dann während 20 Minuten mit einer geeigneten Lösung von Antipeptid-Antikörper (1:1500) gefärbt, gewaschen, mit einem geeigneten zweiten Antikörper (z.B. FITC-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper) gefärbt, gewaschen, und zur Visualisierung in ein Fluoreszenzmikroskop eingebracht. Kontrollfärbungen umfassen Bis-Bezimidin (Sigma, St. Louis, MO) das DNS gefärbt, und Phalloidin (Molecular Probes, OR, BODIPY 558/568 Phalloidin) das das filamentöse Aktin färbt.
  • Wie es auf der 9 zu sehen ist, ist das WRN-Genprodukt fast vollständig im Kern gelegen. Kernfärbung wird leicht in den Epithelzellen auf dem Boden links im Panel A festgestellt. Die Zellen befinden sich nahe am Umfang des sich ausdehnendes Klons von menschlichen Prostataepithelzellen. Zellen die sich nicht schnell teilen, (z.B. Zellen die näher am Zentrum des Klons liegen), wie die die man rechts oben vom Panel A sieht, sind im Zythoplasma und dem Zellkern gefärbt. Die Lage und die Größe der Kerne in diesen Zellen wird gezeigt, indem die DNS gefärbt wird mit eingeschalteter Bis-Benzimidin-Färbung (Hoechst 33258), Panel B. Die Gesamtgröße der Zellen und in einigen Fällen Zythoskelett Haupt-Kennzeichen werden gezeigt, indem mit F-Aktin gefärbt wird.
  • BEISPIEL 10
  • ISOLIERUNG EINES PROTEINS, DAS AN DAS WRN-GENPRODUKT BINDET
  • Es wird ein Hefe-2-Hybrid Interaktionsscreen benutzt (Hollenberg et al., Mol. Cell Biol. 13: 3813, 1995) um ein Zellprotein zu identifizieren und zu isolieren das an die Carboxyl-Terminal-443-Aminosäuren (Reste 990 bis 1432) des WRN-Genprodukts bindet.
  • Eine Bibliothek von 1,1 × 106 unabhängige cDNS-Klone, die von der RNS, die von stimulierten menschlichen einkernigen peripheren Blutzellen isoliert sind, erzeugt worden sind, wird in pACT-2 (Clontech, Palo Alto, CA) erzeugt, wodurch cDNS/GAL4 Aktivierungdomänenfusionen, und ist cotransfektiert in Hefe, das pLEXA mit dem WRN-Gen-Fragment enthält, um WRN/LEXA-DNS-bindende Funktionen erzeugt. Wirtshefezellen, L40, werden gezüchtet auf einem Medium, dem LeuKin, Tryptophan, und Histidin fehlt, und 4 mM 3AT, einen für das Histidin toxischen Katabolit enthält. Es wurden 67 Kolonien auf diesem Medium gezüchtet. Von diesen wurden 60 befreit von den pLEXA-Plasmids durch Züchtung auf einem Medium, das Cycloheximid enthält und mit einem Hefestrang vereinigt, der eine Fusion von „klebrigem" Laminin und der GAL4-Aktivierungsdomäne exprimiert. Von diesen 6 enthielten Sequenzen, die mit keiner Sequenz von GenBank durch BLAST-Suche übereinstimmen. Zwei andere Klone kodierten Kamiunin-Palmitoyl-Transferase I und eine Propyl-4-Hydrolase B-Untereinheit. Sechs unabhängige Klone kodierten eine 70K-Komponente vom U1 snRNP-Komplex (GenBank Zugangsnummer M22636). Ausserdem derivierten alle sechs von der RNS-Motiverkennungsregion des 70K-Proteins.
  • Aus dem vorstehenden kann man erkennen, obgleich spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung in diesem Text beschrieben Orden sind, so können doch verschiedene Modifikationen ausgeführt werden ohne den Sinn und den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Die Erfindung ist entsprechend, ausser durch die Patentansprüche, dadurch nicht begrenzt.

Claims (20)

  1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend (a) eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 70, 72 und 205 und deren komplementären Sequenzen; (b) eine Nukleinsäure, die spezifisch hybridisiert mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt, aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO 70, 72 und 205 und deren komplementären Sequenzen, unter Bedingungen hoher Stringenz; und (c) eine Nukleinsäure die, aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, für ein Protein kodiert, das durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß (a) oder (b) kodiert wird; wobei die Nukleinsäure gemäß (b) oder (c) nicht folgende Sequenz besitzt:
    Figure 00720001
  2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das spezifisch an die Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 (a) unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert, wobei die Nukleinsäure nicht die Sequenz T39125 oder R58879 wie in Anspruch 1 definiert besitzt.
  3. Primerpaar, das spezifisch ein ganzes oder einen Teil eines Nukleinsäuremoleküls gemäß Anspruch 1 Teile (a) bis (c) amplifiziert.
  4. Primerpaare nach Anspruch 3, wobei das Primerpaar ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus (a) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 9 und SEQ ID NO 10, (b) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 11 und SEQ ID NO 2, (c) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 22 und SEQ ID NO 16, (d) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 23 und SEQ ID NO 2, (e) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 21 und SEQ ID NO 10, (f) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 85 und SEQ ID NO 12, (g) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 88 und SEQ ID NO 82, (h) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 89 und SEQ ID NO 80, (i) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 164 und SEQ ID NO 165, (j) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 22 und SEQ ID NO 166, und (k) Nukleinsäuremolekülen mit den Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO 167 und SEQ ID NO 168.
  5. Primerpaar gemäß Anspruch 3, wobei das Primerpaar ein bestimmtes Exon der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 70 amplifiziert, und wobei das Exon ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Exonen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 und 35 wie in Tabelle 4 definiert.
  6. Expressionsvektor, umfassend einen Promotor, der operabel verknüpft ist mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1.
  7. Expressionsvektor gemäß Anspruch 6, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CMV I-E-Promotor, SV40 Early-Promotor, und MuLV LTR.
  8. Expressionsvektor gemäß Anspruch 6, wobei der Promotor ein gewebespezifischer Promotor ist.
  9. Expressionsvektor gemäß Anspruch 6, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.
  10. Viraler Vektor gemäß Anspruch 9, wobei das Virus aus der Gruppe bestehend aus Herpes Simplex-Virus-Vektor, Adenovirus-Vektor, Adenovirusassoziiertes Virus-Vektor, und Retrovirus-Vektor ausgewählt ist.
  11. Rekombinante Wirtszelle, die einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10 trägt.
  12. Rekombinante Wirtszelle gemäß Anspruch 11, wobei die Zelle ausgewählt ist aus aus der Gruppe bestehend aus einer menschlichen Zelle, Hundezelle, Affenzelle, Rattenzelle und Mauszelle.
  13. Isoliertes Protein enthaltend ein WTN-Genprodukt, kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 Teil (a) oder (c).
  14. Antikörper, der spezifisch an ein Protein bindet, das kodiert ist durch eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 Teil (a) oder (c).
  15. Antikörper gemäß Anspruch 14, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
  16. Antikörper gemäß Anspruch 14, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fab-Fragment, einem Fv-Fragment, und einem Einzelketten-Antikörper.
  17. Hybridom, das in der Lage ist, einen Antikörper gemäß Anspruch 15 zu produzieren.
  18. Transgenes nichtmenschliches Tier, dessen Keimzellen und somatische Zellen ein WRN-Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 Teile (a) oder (c) enthalten, das operabel verknüpft ist mit einem Promotor, der wirksam ist zur Expression der Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure in das nicht-menschliche Tier oder einen Vorfahren jenes Tiers in einem embryonalen Zustand eingeführt wird.
  19. Transgenes nichtmenschliches Tier gemäß Anspruch 18, wobei das Tier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Maus, einer Ratte und einem Hund.
  20. Transgenes nichtmenschliches Tier, dessen Keimzellen und somatische Zellen ein WRN-Gen enthalten, das operabel mit einem Promotor verknüpft ist, der wirksam zur Expression des WRN-Gens ist, wobei das WRN-Gen in das nichtmenschliche Tier oder in einen Vorfahren des nichtmenschlichen Tiers in einem embryonalen Zustand unter Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10 eingeführt wurde.
DE69634421T 1995-12-29 1996-12-30 Gene und genprodukte bezogen auf das werner-syndrom Expired - Lifetime DE69634421T2 (de)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US594242 1990-10-09
US58053995A 1995-12-29 1995-12-29
US940995P 1995-12-29 1995-12-29
US580539 1995-12-29
US9409P 1995-12-29
US59424296A 1996-01-30 1996-01-30
US1083596P 1996-01-30 1996-01-30
US10835P 1996-01-30
US63217596A 1996-04-12 1996-04-12
US632175 1996-04-12
PCT/US1996/020785 WO1997024435A1 (en) 1995-12-29 1996-12-30 Genes and gene products related to werner's syndrome

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69634421D1 DE69634421D1 (de) 2005-04-07
DE69634421T2 true DE69634421T2 (de) 2005-12-29

Family

ID=27533341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69634421T Expired - Lifetime DE69634421T2 (de) 1995-12-29 1996-12-30 Gene und genprodukte bezogen auf das werner-syndrom

Country Status (8)

Country Link
US (3) US6090620A (de)
EP (1) EP0953043B9 (de)
JP (1) JP4009321B2 (de)
AT (1) ATE290072T1 (de)
AU (1) AU730999B2 (de)
CA (1) CA2241726C (de)
DE (1) DE69634421T2 (de)
WO (1) WO1997024435A1 (de)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090620A (en) * 1995-12-29 2000-07-18 University Of Washington Genes and gene products related to Werner's syndrome
US6335435B1 (en) * 1997-07-25 2002-01-01 Agene Research Institute Co., Ltd. Human gene RecQ4 encoding helicase
US6228583B1 (en) 1997-08-04 2001-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Assays for compounds which extend life span
JPH11313673A (ja) * 1998-04-30 1999-11-16 Hoechst Marion Roussel Kk ヒトｂｍｐ−２プロモーターおよびこれを用いた骨関連物質の探索法
ES2317704T3 (es) 1998-09-02 2009-04-16 Diadexus, Inc. Un nuevo metodo para el diagnostico, seguimiento, estadificacion. imagineria y tratamiento de distintos canceres.
EP1124840A4 (de) * 1998-10-28 2002-07-17 Baylor College Medicine Ovarspezifische gene und proteine
US20060079674A1 (en) * 1998-10-28 2006-04-13 Baylor College Of Medicine Wyeth Contraceptive targets
US7335737B2 (en) * 1998-10-28 2008-02-26 Baylor College Of Medicine Ovary-specific genes and proteins
US20020042926A1 (en) * 1998-10-28 2002-04-11 Matzuk Martin M. Ovary-specific genes and proteins
US7081522B2 (en) 1999-01-19 2006-07-25 Agene Research Institute Co., Ltd. Gene causative of Rothmund-Thomson syndrome and gene product
US6969763B1 (en) * 1999-05-12 2005-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Molecular interaction sites of interleukin-2 RNA and methods of modulating the same
US6448080B1 (en) * 2001-02-23 2002-09-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of WRN expression
US20040067512A1 (en) * 2001-11-09 2004-04-08 Neurogenetics, Inc. Single nucleotide polymorphisms and mutations on Alpha-2-Macroglobulin
WO2003051174A2 (en) * 2001-11-09 2003-06-26 Neurogenetics, Inc. Single nucleotide polymorphisms and mutations on alpha-2-macroglobulin
US7355024B2 (en) * 2002-01-11 2008-04-08 Gmp Endotherapeutics, Inc. Regulatory sequences for modulation of INGAP expression and reporter constructs
WO2004042057A1 (ja) * 2002-11-07 2004-05-21 Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. 遺伝子変異検出法
WO2004099384A2 (en) * 2003-05-02 2004-11-18 Sigma-Aldrich Co. Solid phase cell lysis and capture platform
JPWO2004108929A1 (ja) * 2003-06-04 2006-07-20 学校法人日本大学 高親和性ＩｇＥ受容体β鎖発現調節
WO2005000234A2 (en) * 2003-06-12 2005-01-06 Sars Scientific Corp. Novel coronavirus inhibitors
AU2005245932A1 (en) * 2004-05-19 2005-12-01 Trustees Of Boston University Modulation of WRN-mediated telomere-initiated cell signaling
WO2006026248A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-09 Sigma-Aldrich Co. Compositions and methods employing zwitterionic detergent combinations
CN108441539B (zh) * 2018-04-11 2022-01-28 四川农业大学 一种使用寡序列检测林木染色体端部的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090620A (en) * 1995-12-29 2000-07-18 University Of Washington Genes and gene products related to Werner's syndrome

Also Published As

Publication number Publication date
AU1568297A (en) 1997-07-28
CA2241726C (en) 2012-06-19
AU730999B2 (en) 2001-03-22
JP4009321B2 (ja) 2007-11-14
ATE290072T1 (de) 2005-03-15
EP0953043B1 (de) 2005-03-02
CA2241726A1 (en) 1997-07-10
JP2002515735A (ja) 2002-05-28
EP0953043B9 (de) 2007-02-28
WO1997024435A1 (en) 1997-07-10
DE69634421D1 (de) 2005-04-07
US6090620A (en) 2000-07-18
US7285641B2 (en) 2007-10-23
US20040006779A1 (en) 2004-01-08
US6583112B1 (en) 2003-06-24
EP0953043A1 (de) 1999-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69634421T2 (de) Gene und genprodukte bezogen auf das werner-syndrom
DE69635207T2 (de) Auf Chromosom 1 lokalisiertes Gen dessen Genprodukt mit der Alzheimerschen Krankheit assoziiert ist.
US20080131411A1 (en) Identification of the gene causing the mouse scurfy phenotype and its human ortholog
WO1997003192A9 (en) Chromosome 1 gene and gene products related to alzheimer's disease
WO1997024435A9 (en) Genes and gene products related to werner's syndrome
DE69504808T2 (de) Corticotropin freisetzende rezeptoren des faktor 2
WO2000064920A9 (en) Compositions, methods, and kits relating to resistin
US6248555B1 (en) Genetic alterations related to familial alzheimer's disease
DE60124380T2 (de) Angiogenese-assoziierte proteine und dafür kodierende nukleinsäure
MXPA98005301A (en) Genes and products of genes related to the wer syndrome

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition