WO2002016938A1

WO2002016938A1 - Methode de criblage d'une substance agissant comme ingredient actif dans des conservateurs ou des remedes destines a des maladies neurodegeneratives

Info

Publication number: WO2002016938A1
Application number: PCT/JP2001/007278
Authority: WO
Inventors: Akira Kakizuka; Miho Hirabayashi
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation; Osaka Bioscience Institute
Priority date: 2000-08-24
Filing date: 2001-08-24
Publication date: 2002-02-28
Also published as: CH695467A5; US6905815B2; JP2002071671A; US20030138855A1; JP3854048B2

Description

明細書

神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質の

スクリーニング方法技術分野

この出願の発明は、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質のスクリ一二ング方法とその方法を用いたスクリ一二ングキットに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、神経変性疾患を引き起こすことで知られる異常タンパク質とバロシン含有タンパク質（V C P ) の結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングする方法と、この方法を用いたスクリーニングキッ卜に関するものである。背景技術

パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチン卜ン舞踏病、マシャドジヨセフ病などに代表される神経変性疾患の患者は、単一の疾患について 1 〜 3万人に 1 人程度の確率で発症し、日本国内だけでも 1 0万人以上（ 1 2 0 0人に 1 人の割合）の患者が存在することが確認されている（厚生省、国民衛生の動向 1 9 9 6年より）。そして、その予防方法、治療方法については多くの研究がなされている（Borlongan C. V.， Koutouzis, T. K. , Sanberg, P. R.， Neurosci. Biobehav. Rev. 21, 289-93 (1997) ; Parnetti, し， Sen i n, II. , ecocci. P. ,' The way forward. Drugs. 53, 752-68 (1997)； Pasinetti, G. M. , Neurobiol. Aging. 17, 707-16 (1996) )< これまでの研究により、これらの神経変性疾患においては、いずれも、共通する表現型があることが明らかにされている。つまり、伸張したグルタミン鎖を有する、コンホメーシヨンの異常が見られる、プロテアーゼレジスタン卜である、 i8—シー卜構造を有する等の特徴を有する異常タンパク質が、神経細胞内での凝集、蓄積、 vacuoles形成、細胞死などを起こしていることが確認されているのである（Kakizuka, に， Trends Genet. 14， 396-402 (1998) )。

しかし、このような異常タンパク質の凝集、蓄積が、 vacuoles 形成、細胞死を誘発する過程に関与する原因物質については、これまで特定されておらず、そのため、神経変性疾患の治療薬ゃ予防薬の研究開発が遅れていたのが実情である。

本願の発明者らは、鋭意研究の結果、これらの神経変性疾患に共通する表現型を誘発する因子を同定することに成功し、この物質がバロシン含有タンパク質（V C P )であることをつきとめた。

V C Pは、真核細胞からヒ卜に至る生物に普遍的に存在する A A A ( ATPase Associated with various cel lular Activities) スーパーファミリータンパク質のひとつであり、弱い A T P a s e活性を有し、これまで種々の細胞機能、とくにシグナル伝達等に関与するものであると考えられてきた（Mul ler, JM. , Meyer, H. H. , Ruhrberg, C. , Stamp, G. W. , Warren G. , Shima, D. T. , J. Biol. Cheni. 274, 10154-10162 (1999)； Zhang, し， Ashendel, C. L.， Becker, G. W. , Morre, D. J. , J. Cel l Biol. 127, 1871-1883 (1994) )₀ しかし、これまで、この V C Pが異常タンパク質と結合することによって神経変性疾患を誘発する因子となっていることは全く知られていなかつたのである。

そこで、この新たな知見をもとに、 V C Pと異常タンパク質の結合を阻害するような物質を選別する方法が確立されれば、特定の神経変性疾患のみならず、一連の神経変性疾患に共通の治療薬や予防薬として有効な物質を得ることができると期待される。

この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、神経変性疾患の治療薬ゃ予防薬の有効成分となる物質をスクリーニングする方法を提供することを課題としている。発明の開示

したがって、この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第 1 には、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として作用する物質をスクリ一二ングする方法であって、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質と候補物質を共存させ、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合阻害作用を示す物質を特定することを特徴とするスクリ一二ング方法を提供する。

この出願の発明は、第 2には、異常タンパク質は、伸長したグルタミン鎖を有するタンパク質であるスクリーニング方法を、第 3には、異常タンパク質は、コンホメーシヨンに異常のあるタンパク質であるスクリーニング方法を、第 4には、異常タンパク質は、プロテアーゼレジスタン卜なタンパク質であるスクリーニング方法を、そして、第 5には、異常タンパク質は、 iS —シート構造を有するタンパク質であるスクリーニング方法を提供する。

また、この出願の発明は、第 6 には、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質と候補物質は、溶液中で混合して共存させる前記スクリーニング方法を、第 7には、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質と候補物質は、同一培養細胞内に共存させる前記スクリーニング方法を、そして、第 8には、異常タンパク質とバ口シン含有タンパク質と候補物質は、異常タンパク質を有する動物に候補物質を投与して共存させる前記スクリ一二ング方法を提供する。

さらに、第 9には、この出願の発明は、結合阻害作用は、異常夕ンパク質またはバロシン含有タンパク質の一方を標識し、もう一方を担体に固定化し、候補物質の存在下、異常タンパク質とバ口シン含有タンパク質を接触させた後、固定化担体上の標識シグナルの有無により確認する前記いずれかのスクリ一二ング方法を提供する。

この出願の発明は、第 1 0には、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として作用する物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくとも、バロシン含有タンパク質固定化担体と標識化された異常タンパク質試薬を含有することを特徴とするスクリーニングキッ卜を提供する。

そして、第 1 1 には、この出願の発明は、異常タンパク質とバ口シン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として作用する物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくとも、標識化されたバロシン含有タンパク質試薬と異常タンパク質固定化担体を含有することを特徴とするスクリーニングキットをも提供する。図面の簡単な説明図 1 は、この発明の実施例において、テトラサイクリンを除去することにより Flag タグをつけた 7 9 リピー卜のポリダルタミン（Q 7 9 ) を発現する P C 1 2細胞（ P C I 2 /Q 7 9 ) 中の V C Pタンパク質と発現されたポリグルタミンの局在を示した蛍光顕微鏡像および光学顕微鏡像である。

1 ： P C 1 2細胞の内在性 V C Pタンパク質（ a ) 蛍光顕微鏡像；（ b ) 光学顕微鏡像

2 ：テトラサイクリン除去から 4 8時間後の経過の蛍光顕微鏡像（ a ) P C 1 2 Q 7 9における抗 V C P抗体（ 2次抗体- F I T C標識抗ゥサギ抗体）で染色した内在性 V C P ；

( b ) P C I 2 ZQ 7 9における抗 F I a g抗体（ 2次抗体 = texas red 標識抗マウス抗体）で染色したポリグルタミンと、 D A P I 染色した核；（ c ) P C 1 2 ZQ 7 9における抗 V C P抗体（ 2次抗体 = F I T C標識抗ゥサギ抗体）で染色した内在性 V C Pと、抗 F I a g抗体（ 2次抗体 = texas red 標識抗マウス抗体）で染色したポリグルタミンの重ね合せ；

( d ) P C 1 2 ZQ 7 9の光学顕微鏡像

3 ：テ卜ラサイクリン除去から 9 6時間経過後の蛍光顕微鏡像 (a) P C 1 2 ZQ 7 9における抗 V C P抗体（ 2次抗体 =

F I T C標識抗ゥサギ抗体）で染色した内在性 V C P ； ( b ) P C I 2 ZQ 7 9における抗 F I a g抗体（ 2次抗体 = texas red 標識抗マウス抗体）で染色したポリグルタミンと、 D A P I 染色した核；（ c ) P C 1 2 /Q 7 9における抗 V C P抗体（ 2次抗体 = F I T C標識抗ゥサギ抗体）で染色した内在性 V C Pと、抗 F I a g抗体（ 2次抗体 = texas red 標識抗マウス抗体）で染色したポリグルタミンの重ね合せ；（ d ) P C 1 2 /Q 7 9の光学顕微鏡像

図 2は、この発明の実施例において、シャペロンタンパク質（ H s p 7 0、 H J D - 2 ) を、 V C Pとともに G S T— M J D Q 7 9と共存させ、 M J D Q 7 9と V C Pとの結合阻害を起こすか否かを確認した才ートラジオグラフィーの結果を示した図である。 ( &) じ、 5 7 0、 1"1 」 0— 2の 1 n p u tを 1 として、 G S Tおよび G S T— M J D Q 7 9と共存させる H s p 7 0もしくは H J D— 2の量を変化させたときの G S T— M J D Q 7 9と V C Pの相互作用；（ b )図 2 aにおけるレーン 7、 8、 9、 1 1 、および 1 2を数値化したグラフ（G S T— M J D Q 7 9と V C P の相互作用）；（ c ) M J D Q 7 9、 H s p 7 0、 H J D— 2の I n p u tを 1 とし、 G S Tおよび G S T— V C Pと共存させる H s p 7 0もしくは H J D— 2の量を変化させたときの G S T— V C Pと M J D Q 7 9の相互作用；（ d )図 2 cにおけるレーン 1 0、 1 1 、および 1 2を数値化したグラフ（G S T— V C Pと M J D Q 7 9の相互作用）

図 3は、この発明の実施例において、アミロイド） 8タンパク質前駆タンパク質と V C Pの結合を示す才ー卜ラジオグラフィーの結果を示した図である。

図 4は、この発明の実施例において、 0 し 8にぉけるし 6 \/乂小体を抗 V C P抗体で染色した際の顕微鏡観察像を示した図である。（▼)

図 5は、この発明の実施例において、ュビキチンポジティブな核内封入体を染色した際の顕微鏡観察像を示した図である。（ a ) 抗ュビキチン抗体で染色；（ b ) 抗 V C P抗体で染色発明を実施するための最良の形態

本願の発明者らは、鋭意研究により、異常タンパク質がバロシン含有タンパク質（V C P ) と結合することにより、神経細胞の変性や脱落を生じさせ、神経変性疾患を引き起こすことを明らかにし、この出願の発明の神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質のスクリーニング方法に至った。

この出願の発明において、異常タンパク質とは、神経細胞内で凝集、蓄積し、 vacuol ization や細胞死を引き起こすタンパク質をいう。例えば、伸張したグルタミン鎖を有するもの、コンホメーシヨンに異常があるもの、プロテアーゼレジスタン卜であるもの、）8—シート構造を有するもの等の種々の異常タンパク質が挙げられる。

この出願の発明のスクリ一二ング方法は、任意の異常タンパク質と V C Pと候補物質を共存させ、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質の結合が阻害されるか否かを確認することにより、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリ一二ングするものである。

このとき、異常タンパク質、 V C Pおよび候補物質を共存させる方法はとくに限定されない。たとえば、異常タンパク質と V C Pを候補物質の存在下で混合し、溶液中で共存させてもよいし、これらを酵母、培養細胞（バクテリア等を含む）内でインキュべ一卜し、共存させてもよい。さらには、異常タンパク質を発現した卜ランスジエニック動物（脊椎動物、線虫、ショウジヨウバエなど）中において、 V C Pを共存させ、候補物質を導入してもよい。このとき、共存させる環境については、温度、濃度、 P H、時間等はとくに限定されず、異常タンパク質と V C Pが結合するのに十分で、かつ、候補物質が有効に結合を阻害しうるような条件であればよい。とくに、同一細胞内において、異常蛋白質と V C Pを共存させ、候補物質を種々の手法によって細胞内に導入する方法が好ましく例示される。

また、異常タンパク質と V C Pの結合が候補物質によって阻害されているか否かを確認する方法もとくに限定されない。例えば、異常タンパク質を H i sや F I a g等のタグや、 ³⁵S等の放射性同位体によって標識し、 V C Pを固定化させた担体に異常タンパク質を接触させ、一定時間保持した後、担体上の標識シグナルの有無を確認する方法、標識した異常タンパク質と、 V C Pを混合してインキュベートし、 V C Pと特異的に結合する物質を固定化したカラムにインキュベー卜後の混合溶液を通して、カラム上、あるいは流出液中の標識シグナルの有無を確認する方法などが挙げられる。さらに、異常タンパク質を発現する細胞（例えば、 P C 1 2 / Q 7 9 ： Yasuda, S.， Inoue, ， Hi rabayashi, M. , Higashiyama, Η. , Yamamoto, Υ. , Fuyuh i ro, Η. , Komure, 0. , Tanaka, F. , Sobue, G.， Tsuchiya, K. , Hamada, Κ. , Sasaki, Η. , Takeda, Κ. , lchijo, Η. , Kaki zuka, A. , Genes Cel ls 4, 743-756 (1999) ) と V C Pと候補物質を共存させ、異常タンパク質と V C Pの結合による vacuol izationが細胞質に生じるかを観察することによって候補物質による結合阻害を確認する方法、 G F P、 Y F P、 C F Pなどの蛍光タンパク質によって標識した V C Pと異常夕ンパク質を発現する細胞と候補物質を共存させ、 vacuol ization の有無や細胞中での異常蛋白質と V C Pの局在化や蛍光ェ不ルキー移動 ( FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer) の変化によって候補物質の有効性を確認する方法なども例示される。

この出願の発明のスクリーニング方法では、具体的には、 G S Tプルダウンアツセィゃイースト 2ハイブリッド法など、生物化学実験の手法として一般的に知られる方法が適用できる。また、表面プラズモン共鳴の測定により、結合の度合いを確認できる B I A C 0 R Eは、リアルタイ厶で大量のサンプルのスクリーニングを行う方法として好ましい。しかし、この出願の発明のスクリ一二ング方法は、異常タンパク質と V C Pと候補物質を共存させ、異常蛋白質と V C Pの結合が候補物質により阻害されるか否かを確認できるものであれば、これらに限定されない。

この出願の発明の神経変性疾患予防薬および治療薬の有効成分となる物質のスクリーニング方法は、以上のとおりに、異常タンパク質、 V C P、および候補物質を共存させて、異常タンパク質と V C Pの結合が阻害されることを確認するものであればよく、上記のとおりに例示される各方法は、どのような細胞、試薬、濃度、温度、 P H等の条件下で行われるものであってもよい。

また、この出願の発明のスクリーニング方法において、スクリ一二ングされる候補物質は、タンパク質ゃァミノ酸等の天然物質であってもよいし、人工的に合成されたポリべプチド等の物質であってもよく、高分子化合物、低分子化合物、公知、新規の種々の物質が適用される。

この出願の発明は、さらに、上記のとおりのスクリーニング方法を用いて、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのキットをも提供する。このようなスクリーニングキッ卜としては、種々のものが考えられるが、例えば、 V C Pを固定化した担体と標識化された異常タンパク質を含む試薬を有するものが挙げられる。

このようなキッ卜では、標識化された異常タンパク質試薬と V C Pと異常タンパク質の結合を阻害すると考えられる候補物質を混合し、 V C P固定化担体上に流して一定時間放置した後、溶媒等で担体を洗浄し、担体上の標識シグナルの有無を観察すれば候補物質が有効に作用するものか否かを確認することができる。つまり、担体から標識シグナルが発せられれば担体上に固定化された V C Pと異常タンパク質が結合したことが示され、スクリー二ングした候補物質は、神経変性疾患の予防薬または治療薬として有効ではないものであることが分かる。反対に、担体が標識シグナルを発しなければ、 V C Pと異常タンパク質の結合が阻害されたことが示され、候補物質は神経変性疾患の予防薬または治療薬として有効であることが確認できる。

このようなスクリーニングキットにおいては、 V C P固定化担体は、 V C Pが固定化されていればどのようなものであってもよく、ゲル、フイルム、シート、ビーズ、カラム等、様々な材料や形状からなるものが考えられる。また、 V C Pはどのような方法で担体に固定化されていてもよく、直接的な化学的結合、タグなどを介した結合、ビーズ等への物理的な包含など、様々な形態が例示される。さらに、異常タンパク質試薬は、 M J D Q 7 9 (マシャドジヨセフ病原因タンパク質）のように伸張したポリダル夕ミン鎖を有するタンパク質、コンホメーションの異常が確認されるタンパク質などの異常タンパク質を含有するものであればよく . 他に、溶媒、緩衝液、添加剤等を含んでいてもよい。また、異常タンパク質の標識も、グルタチ才ン S 卜ランスフェラ一ゼ ( G S T ) や蛍光蛋白等の種々のタグ、放射性同位体など、どのようなものを用いてもよい。さらに、このようなスクリーニングキットには、 V C P固定化担体と標識化された異常タンパク質試薬以外に、溶媒、緩衝液、添加剤、種々の機器や器具等が含まれていてもよい。また、 V C Pと異常蛋白質の結合を確認する操作は、以上のとおりのものに限定されず、タンパク質合成、融合タンパク質の発現、遠心分離や H P L Cによる精製、 S D S— P A G E等による電気泳動測定、プロッティング等の種々の実験操作を含んでいてもよい。

この出願の発明の神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングするためのスクリーニングキットは、標識化された V C P試薬と異常タンパク質を固定化した担体を有するものであってもよい。このようなキットは、上に例示されたキットと同様の操作により、神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分となる物質をスクリーニングすることができるものである。つまり、標識化された V C P試薬と V C Pと異常タンパク質の結合を阻害すると考えられる候補物質を混合し、異常夕ンパク質固定化担体上にこの溶液を流し、一定時間、適当な条件で保持した後に、溶液を洗い流し、標識シグナルの有無を観察することにより、担体上で V C Pと異常タンパク質が結合しているか否か、つまり、候補物質が神経変性疾患の予防薬または治療薬として有効に作用する物質であるか否かを確認できるのである。担体上に標識シグナルが見られれば、 V C Pと異常タンパク質が結合していることが示され、候補物質はこれらの結合を阻害せず、神経変性疾患の予防薬または治療薬の成分として有効でないことが分かる。一方、担体上に標識シグナルが確認されなければ、

V C Pと異常タンパク質の結合は、候補物質によって阻害されたこととなり、この物質は、神経変性疾患の予防薬または治療薬の成分として十分に作用するものであることが分かる。

このようなスクリーニングキットにおいても、担体の形状、材質、標識化された V C P以外の試薬中の成分等は限定されず、様々なものが考慮される。また、 V C Pと異常蛋白質の結合を確認する操作は、以上のとおりのものに限定されず、タンパク質合成、融合タンパク質の発現、遠心分離や H P L Cによる精製、 S D S - - P A G E等による電気泳動測定、プロッティング等の種々の実験操作を含んでいてもよい。もちろん、この出願の発明のスクリ一ニングキッ卜は、これらの操作を実施するために必要な器具、試薬、さらには溶媒等を含むものであってもよい。

以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。実施例

実施例 1 ポリグルタミン鎖を有するタンパク質と V C Pの結合によるポリグルタミンの凝集

P C 1 2細胞を固定し、 1 次抗体として抗 V C P抗体を、 2次抗体として F I T C標識した抗ゥサギ抗体を用いて染色し、蛍光顕微鏡で観察し、内在性 V C Pの局在を調べた。図 1 一〗に蛍光顕微鏡像（ a ) 及び光学顕微鏡像（ b ) を示した。これより、 V C Pが細胞全体に発現していることが確認された。

次に、 P C 1 2 / Q 7 9細胞の培地からテ卜ラサイクリンを除去し、 F l agタグをつけた 7 9 リピートのポリグルタミン（Q 7 9 ) を発現させた。テ卜ラサイクリン除去後 4 8時間と 9 6時間後に細胞を固定し、内在性の V C Pとポリグルタミンの局在を観察した。抗 V C P抗体（ 2次抗体として F I T C標識抗ゥサギ抗体を使用）、抗 F I a g抗体（ 2次抗体として texas red標識抗マウス抗体を使用）を用いて染色し、蛍光顕微鏡で V C Pとポリグルタミンの発現、局在を観察した。

蛍光顕微鏡像を図 1 一 2 a〜 c ( 4 8時間後）、および図 1 _ 3 a〜 c ( 9 6時間後）に示した。また、ポリグルタミン発現後の P C Ί 2 /Q 7 9細胞の光学顕微鏡像を図 1 — 2 d ( 4 8時間後）. および図 1 一 3 d ( 9 6時間後）に示した。

図 1 一 2より、まず、ポリグルタミンは、発現誘導後、細胞質に凝集体を形成し（図 1 一 2 b )、 V C Pはポリグルタミンと co-local izeすることが確認された（ 1 一 2 c )。

また、図 1 一 3ょリ、時間の経過に伴って、ポリグルタミンが徐々に核にも凝集体を形成し（図 1 — 3 b )、 V C Pは、この核内の凝集体とも Co- local izeすることが確認された（図 1 — 3 c )。

さらに、光学顕微鏡による観察より、ポリグルタミンの発現とともに、細胞質における vacuol izationが確認された（図 1 一 2 d、図 1 一 3 d )。実施例 2 異常タンパク質 M J D Q 7 9と V C Pの結合およびシャペロンタンパク質（H s p 7 0、 H J D— 2 ) による結合阻害の確認

( 1 ) 伸張したポリグルタミン鎖を有する異常タンパク質として、マシャドジヨセフ病原因タンパク質で、ポリグルタミンの長さが 7 9個である M J D Q 7 9を選択した。 M J D Q 7 9は、グルタチオン s 卜ランスフェラーゼ（G S T ) の融合夕ンパク質として大腸菌に発現させた。

V C Pは、 in vitroで網状赤血球のライセー卜を用いて発現させ、 ³⁵S標識した。

ダル夕チ才ンァガロースビーズに結合した G S T— M J D Q 7 9 と、 ³⁵S— V C Pを混合し、 4 °Cでゆっくりとインキュベートした後（ 2時間）、洗浄と遠心を繰り返し、ビーズと共に沈降したタンパク質を S D S— P A G Eで分離し、オートラジオグラフィ一を行った。

( 2 ) シャペロンタンパク質（H s p 7 0、 H J D - 2 ) を V C Pとともに、 G S T— M J D Q 7 9に添加し、 M J D Q 7 9 と V C Pとの結合阻害を起こすか否かを確認した。

図 2 aにォー卜ラジオグラフィーの結果を示した。 I n p u t で添加した物質の量を 1 として、各反応系に添加した物質量を示した。レーン 1 〜 1 3の条件を次の表〗に示した。表 1

また、図 2 bに図 1 aのレーン 7、 8、 9、 1 1 、および 1 2 の V C Pの量を数値化したグラフを示した。縦軸は、 input で添加した V C Pの量を 1 0 0として表示した。

図 2 aに見られるように、 V C P量を 1 としたとき、 H s p 7 0の量が 0、 1 、 5と増加するに従い、 V C Pのバンドが薄くなつた（図 2 a レーン 7、 8、 9 )。また、 H J D— 2の量が 0、 1 、 5と増加するに従い、 V C Pのバンドが薄くなつた（図 2 aレーン 7、 1 1 、 1 2 )。これらのバンド濃度の減少は、図 2 bのダラフからも確認できた。つまり、 H s p 7 0と H J D— 2の添加量が増加するに従い、 G S T— M J D Q 7 9 と V C Pの相互作用が小さくなることが示された。

以上の結果より、 V C Pと M J D Q 7 9の結合が H s p 7 0および H J D - 2により阻害されていることが確認された。また、このような阻害は、 H s p 7 0と H J D— 2がそれぞれ G S T— M J D Q 7 9と結合するために生じることが示唆された（図 2 a レーン 1 0、 1 3 )。

( 3 ) M J D Q 7 9タンパク質を ³⁵ S標識し、 in vitroで合成した。また、 V C Pを G S Tとの融合タンパク質として大腸菌に発現させた。

( 1 ) と同様の操作により、 G S T— V C Pと ³⁵ S— M J D Q 7 9の結合を確認した。

図 2 cに才ー卜ラジオグラフィーの結果を示した。 I n p u t で添加した物質の量を 1 として、各反応系に添加した物質量を示した。レーン〗〜 1 4の条件を次の表 2に示した。

表 2

また、図 2 dに図 2 cのレーン 1 0、 1 1 、および 1 2の M J D Q 7 9の量を数値化したグラフを示した。縦軸は、 input として添加した M J D Q 7 9の量を 1 0 0として表示した。

図 2 cに見られるように、 M J D Q 7 9のみを G S T— V C P と共存させたときと比較して、 H s p 7 0を共存させたときの M J D Q 7 9のバンドが薄かった（図 2 c レーン 1 0、 1 1 )。また、 M J D Q 7 9、 G S T— V C P、および H J D— 2を共存させた場合も、 M J D Q 7 9のみを G S T— V C Pと共存させた場合に比べてバンドが薄くなった（図 2 c レーン 1 0、 1 2 )。

これらのバンド濃度の低下は、図 2 dのグラフからも確認できた。つまり、 H s p 7 0と H J D— 2を添加した系では、 M J D Q 7 9と G S T— V C Pの相互作用が小さくなることが示された。以上の結果より、 V C Pと M J D Q 7 9の結合が H s p 7 0および H J D— 2により阻害されていることが確認された。また、このような阻害は、 H s p 7 0と H J D— 2がそれぞれ G S T - V C Pと結合するために生じることが示唆された（図 2 c レーン 1 3、 1 4 )。実施例 3 ポリダルタミン由来の神経変性のシャぺ口ンタンパク質（ H s p 7 0、 H J D— 2 ) による緩和機構

ポリグルタミンによる神経変性は、 H s p 7 0や H J D— 2 ( H s p 4 0ファミリー）などのシャペロンタンパク質を過剰に発現させることにより、緩和できることが報告されている（Warrick J. M. , Chan, Η. Υ. , Gray-Board, G.し， Chai, Υ.， Paulson, H.し， Bonini, N. M. , Nat. Genet. 23, 425-428 (1999)； Kazemi-Esfari jani, P. , Benzer, S. , Science 287, 1837-1840

(2000)； Muchowski, P. J. , Schaf far, G. , Sittler, A. , Wanker, E. E. , Hayer-Hartl, M. K. , Hartl, F. U. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 97, 7841-7846 (2000) ) が、これまで、これらのタンパク質がどのような機構でポリグルタミンの神経変性を阻害しているのかは、明らかにされていなかった。

前記実施例 2の結果より、 H s p 7 0と H J D— 2がそれぞれ V C Pとポリグルタミンを含むタンパク質にそれぞれ結合し、 V C Pと異常蛋白の結合と競合することにより、量依存的にその結合を阻害することが示された。

したがって、シャペロンタンパク質が V C Pとポリグルタミンとの結合を阻害することによってポリグルタミンの毒性を緩和するというメカニズムが明らかになった。

以上の結果から、シャペロンタンパク質の量や組み合せを変化させることにより、さらに強い結合阻害が期待できると考えられる。

すなわち、ポリグルタミンの毒性を緩和する薬剤のスクリー二ングには、 V C Pとポリダルタミンの結合阻害を指標にすることが有効であることが確認された。実施例 4 アミロイド i8タンパク質前駆タンパク質と V C Pの結アルツハイマー病の原因タンパク質として知られるアミロイド 3タンパク質前駆タンパク質（ A P P ：この実験では、 /3セクレターゼ切断部位から C末端まで）を in vitroで合成し、 ³⁵Sで標識した。 0 3丁ー〇？と ³⁵3— ？を混合し、 4 °Cで 2時間インキュベートした後、 S D S— P A G Eで分離し、オートラジ才グラフィ一をラつた。ポジティブコントロールとして伸張したポリグルタミンを含むタンパク質（M J D Q 7 9 ) を用い、ネガティブコントロールとしてグルタミン部分のドメインを含まないタンパク質（M J D Δ Q) を用いた。

図 3にオートラジオグラフィ一の結果を示した。図中に示されるとおり、各レーンは、左から、 I n p u t (合成タンパク質）、 G S Tのみで沈降させたものを泳動したもの、 G S T— V C Pで沈降させたものを泳動したものを示す。

実施例 1 および 2と同様に、ポリグルタミンが存在するとき、 V C Pと M J D夕ンパク質の結合が生じるが、ポリグルタミンが存在しない M J Dタンパク質は、 V C Pと結合しないことが確認された。

同じように、異常タンパク質である A P Pは、 V C Pと結合することが確認された。

したがって、伸張したポリグルタミン鎖を含む異常タンパク質以外の異常蛋白質を原因とする神経変性疾患の一つであるアルッハイマー病についても、異常タンパク質（A P P ) と V C Pの結合を阻害する物質をスクリーニングすることによって、その予防薬や治療薬の有効成分となる物質を特定することができることが示唆された。実施例 5 L e w y小体を伴う痴呆症（ D L B： Dementia with Lewy Bodies) における L e w y小体と V C Pの結合

パーキンソン病と同様の脳幹病変に加え、大脳皮質においても L e w y小体が出現し、痴呆を呈する疾患である D L Bの患者から採取した L e w y小体を抗 V C P抗体で染色した。図 4に示されるように、 L e w y小体は、抗 V C P抗体により染色された。

これより、 D L Bの表現型である L e w y小体と V C Pの結合の存在が確認された。したがって、このような結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、 D L Bの予防薬または治療薬となりうる物質を特定できることが示唆された。実施例 6 脊髄小脳変性症におけるのュビキチンポジティブな核内封入体と V C Pの結合

幼児期に発症し、急速に進行した脊髄小脳変性症のュビキチンポジティブな核内封入体を抗ュビキチン抗体および抗 V C P抗体でそれぞれ染色した。

図 5より、ュビキチンポジティブな核内封入体は、抗ュビキチン抗体で染色される（図 5 a ) のと同様に、抗 V C P抗体によつても染色されることが確認された（図 5 b )。

これより、脊髄小脳変性症におけるュビキチンポジティブな核内封入体が V C Pと結合していることが確認された。したがって、このような結合を阻害する物質をスクリーニングすることにより脊髄小脳変性症の予防薬または治療薬となりうる物質を特定することが可能となることが示唆された。産業上の利用可能性

以上詳しく説明したとおり、この発明によって、神経変性疾患の予防薬や治療薬の有効成分とすることができる物質をスクリ一ニングする方法と、神経変性疾患の治療薬や予防薬の有効成分とすることができる物質をスクリーニングするためのスクリーニングキッ卜が提供される。この発明のスクリーニング方法やスクリ一二ングキットを用いることにより、従来困難とされてきた神経変性疾患の予防薬や治療薬の研究、開発、製品化の加速化が大ぃに期待される。

Claims

請求の範囲 . 異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として作用する物質をスクリ一二ングする方法であって、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質と候補物質を共存させ、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合阻害作用を示す物質を特定することを特徴とするスクリー二ング方法。. 異常タンパク質は、伸長したグルタミン鎖を有するタンパク質である請求項 1 のスクリーニング方法。. 異常タンパク質は、コンホメーシヨンに異常のあるタンパク質である請求項 1 のスクリーニング方法。 . 異常タンパク質は、プロテアーゼレジスタン卜なタンパク質である請求項 1 のスクリーニング方法。 . 異常タンパク質は、 iS —シート構造を有するタンパク質である請求項 1 のスクリーニング方法。 . 異常タンパク質とバロシン含有タンパク質と候補物質は、溶液中で混合して共存させる請求項 1 ないし 5のいずれかのスクリ一二ング方法。 . 異常タンパク質とバロシン含有タンパク質と候補物質は、同一培養細胞内に共存させる請求項 1 ないし 5のいずれかのスクリ一二ング方法。 . 異常タンパク質とバロシン含有タンパク質と候補物質は、異常タンパク質を有する動物に候補物質を投与して共存させる請求項 1 ないし 5のいずれかのスクリ一二ング方法。. 結合阻害作用は、異常タンパク質またはバロシン含有タンパク質の一方を標識し、もう一方を担体に固定化し、候補物質の存在下、異常タンパク質とバロシン含有タンパク質を接触させた後、固定化担体上の標識シグナルの有無により確認する請求項 1 ないし 8のいずれかのスクリ一二ング方法。 0 . 異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として作用する物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくとも、バロシン含有タンパク質固定化担体と標識化された異常タンパク質試薬を含有することを特徴とするスクリーニングキット。

1 . 異常タンパク質とバロシン含有タンパク質との結合を原因とする神経変性疾患の予防薬または治療薬の有効成分として作用する物質をスクリーニングするためのキットであって、少なくとも、標識化されたバロシン含有タンパク質試薬と異常夕ンパク質固定化担体を含有することを特徴とするスクリーニングキッ卜。