CN102413814A - 用于神经保护和治疗神经变性病症的克拉维酸类物质制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及稳定固体药物组合物的用途，所述药物组合物包括在即释或缓释固体剂型中作为药物活性成分的克拉维酸类物质。所述组合物可用于治疗神经变性疾病、提供神经保护、或防止神经元细胞丧失或死亡的方法中。示例性的神经变性疾病包括帕金森氏病、阿兹海默氏病和多发性硬化。

Description

用于神经保护和治疗神经变性病症的克拉维酸类物质制剂
技术领域
本发明涉及含有克拉维酸、药学上可接收的克拉维酸盐、盐组合物和衍生物的稳定固体口服剂型的用途。具体而言，本发明提供克拉维酸钾的即释组合物(立即释放组合物，immediate release composition)和缓释组合物(延长释放组合物，extended release composition)的用途，所述克拉维酸钾的即释组合物和缓释组合物适于日常使用并实现用于神经变性病症的神经保护和治疗的克拉维酸类物质(clavulanate)的治疗水平。
背景技术
克拉维酸的名称来源于产生克拉维酸的棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)微生物。克拉维酸是由氨基酸精氨酸和糖甘油醛3-磷酸酯生物合成产生的。
克拉维酸具有可忽略的内在抗微生物活性，尽管具有β-内酰胺抗生素的特征性β-内酰胺环。然而，化学结构上的类似性容许该分子充当由某些细菌分泌的β-内酰胺酶的竞争抑制剂而赋予β-内酰胺抗生素抗性。当与一些β-内酰胺抗生素如替卡西林或阿莫西林联合给予时，克拉维酸能够拓展抗生素的抗菌谱并增强抗菌活性(AHFS，1991)。这种协同作用活性是可能的，因为克拉维酸充当天然降解和惰性化β-内酰胺抗生素的细菌β-内酰胺酶的不可逆的竞争性抑制剂(Brown et al.，J Antibiot(Tokyo).1976，29：668-669；Readingand Cole，Antimicrob Agents Chemother.1977，11：852-857)。
除了其对β-内酰胺酶的抑制作用之外，克拉维酸已经显示出神经保护作用以及在治疗焦虑症和性功能障碍方面的功效。对克拉维酸的神经保护和神经学活性已提出了若干机理。Koppel等在美国专利6,489,319；6,610,681；和6,627,625中(通过引用将这些专利作为整体并入本文)描述了克拉维酸自身在腹腔注射给予小于1μg/kg时具有抗焦虑活性。美国专利6,426,342(通过引用将其整体并入本文)描述了当用克拉维酸1μg/kg的腹腔注射剂量处理大鼠时，克拉维酸具有有效的神经保护活性。美国专利7,166,626(通过引用将其整体并入本文)公开了通过给予克拉维酸治疗性功能障碍的方法。美国专利6,489,319报道了在10ng至10μg/kg剂量下，克拉维酸能够改变CNS活性和行为。因此，克拉维酸的独特神经活性特性曲线(分布，profile)提供了这种化合物与独特神经靶组相互作用的强有力的证据。Rothstein等也证实，几种β-内酰胺抗生素能够通过活化谷氨酸神经递质转运器(glutamate neurotransmitter transporter)的基因而提供神经保护作用(Nature，2005，433：73-77)。自从在1928年首次发现青霉素以来，β-内酰胺抗生素已经成为最广泛使用的抗生素，而且在标准抗菌剂量下没有显示出显著毒性的CNS作用。因此，β-内酰胺抗生素可以作为新的安全的治疗性药物用于CNS相关疾病的治疗。
含有克拉维酸及其衍生物或盐(统称为克拉维酸类物质)的许多干制剂的不稳定性，使得必须包含赋形剂的复杂制剂(complex formulation，复合制剂)，包括粘结剂、助流剂(glidants)、崩解剂和甚至干燥剂等以获得药学上可接收的载体。这部分是因为这个事实，即克拉维酸类物质是高度吸湿性的物质，其在含水介质中高度不稳定。配制的方法因此必须确保产品能够在其储存期间保持其效能，并且还能够随后产生满意的溶解速率。WO 92/19227(通过引用将其整体并入本文)中公开了一种这样的方法，并要求同时包含胞内和胞外崩解剂。美国专利4,537,887(通过引用将其整体并入本文)中描述的另一方法特别强调在组合物自身中包含可食用的干燥剂。其它方法证实要在容纳阿莫西林/克拉维酸类物质联合制剂(combination)的容器中包含干燥剂。在这方面，美国专利4,301,149和4,441,609(通过引用将它们整体并入本文)尤为突出。克拉维酸钾比游离酸和最低吸湿性的药用克拉维酸盐更稳定，因此其最常用于商业性制剂。然而，克拉维酸钾仍是极度吸湿性并易于水解的，以致于使阿莫西林/克拉维酸类物质共制剂易于在储存(甚至在低湿度条件下储存)时发生降解。阿莫西林结晶中水的存在可以加剧这种剂型的不稳定性，一旦任何降解作用开始就会加速克拉维酸类物质的分解。
发明内容
克拉维酸类物质因为其湿热敏感性是异常难以配制的物质。仍需要开发单独克拉维酸类物质的稳定固体制剂，即，无抗生素，尤其是在低剂量如10μg至10mg，例如约0.1mg至约5mg下，这种剂量是口服活性的以便提供神经保护或用于神经变性病症的治疗。
本发明是用于提供神经保护和用于治疗神经变性疾病的方法，该方法包括口服给予稳定的含克拉维酸类物质的口服剂型组合物，所述组合物为即释组合物或缓释释放组合物的形式。所述剂型可以由适于日常使用的克拉维酸或其衍生物或盐，例如克拉维酸钾或ClavitesseTM制备。
本发明通过开发稳定的口服克拉维酸类物质药物组合物和使用该组合物以提供神经保护和治疗神经变性疾病的方法，克服并缓解了以上提及的缺陷和缺点。一般而言，本发明涉及稳定的固体药物组合物的用途，尤其是包含克拉维酸类物质作为药物活性成分的即释或缓释的组合物。该药物组合物能够以固体剂型如片剂形式、胶囊、丸剂、锭剂或粉末提供。这种固体药物组合物能够在一种或多种药用赋形剂的存在下包含克拉维酸类物质，其中克拉维酸类物质的存在量为约10μg至约10mg或，例如，约0.1mg至约5mg。这种组合物在给予之后能够提供治疗有用量的克拉维酸类物质。克拉维酸类物质的实例包括克拉维酸、克拉维酸衍生物以及克拉维酸的药用盐。克拉维酸类物质能够存在的量为组合物重量的约0.01％至约10％。在一些实施方式中，组合物的水分含量(湿量，moisturecontent)低于总重量的约4％。这种制剂是片剂、胶囊、丸剂、锭剂或粉末的形式。根据本发明的示例性固体药物组合物在25℃和60％相对湿度下或在30℃和65％相对湿度下储存3个月之后可具有低于10％的水分含量。
在示例性的组合物中，克拉维酸类物质是克拉维酸钾。克拉维酸钾能够作为，例如，粉末或作为与二氧化硅或微晶纤维素的1∶1混合物提供。示例性组合物是即释组合物，其在给予之后大约5至大约30分钟内从药片中释放出超过80％的克拉维酸类物质。在示例性实施方式中，通过其中将克拉维酸钾粉末在一种或多种药用赋形剂存在下冻干的方法来制备这种组合物。在即释组合物的一个实例中，该组合物能够含有约10wt％至约20wt％的粘结剂或稀释剂、约45wt％至约55wt％的填充剂(filler)、约20wt％至约40wt％的崩解剂和约3wt％至约6wt％的润滑剂。在这种实施方式中，示例性粘结剂或稀释剂是Maltrin M150，示例性填充剂是Prosolve SMCC 50，示例性崩解剂是Pharmaburst和/或L HPC LH-11和/或Acdisol，以及示例性润滑剂是硬脂酸。
在其它示例性实施方式中，这种组合物通过其中将克拉维酸钾以1∶1与二氧化硅或微晶纤维素的混合物在一种或多种药用赋形剂存在下冻干的方法进行制备。在即释组合物的另一实例中，药物组合物能够含有约50％-60％的填充剂、约20％-30％的崩解剂、约0.5％-5％的流动增强剂/防潮剂和/或约3％-6％的润滑剂。在这种实施方式中，示例性填充剂是Prosolve SMCC 50，示例性崩解剂是Pharmaburst和/或Acdisol，示例性流动增强剂/防潮剂是Carbosil，而示例性润滑剂是硬脂酸镁。
在另一实施方式中，药物组合物是缓释组合物，其在至少约4h内释放克拉维酸钾。缓释组合物能够通过在一种或多种药用赋形剂存在下冻干克拉维酸钾粉末或克拉维酸钾与微晶纤维素的1∶1混合物而进行制备。示例性赋形剂能够包含一种或多种基质(matrix)、填充剂、助流剂和润滑剂。在缓释组合物的一个实例中，这种组合物能够含有约20wt％至约40wt％的基质、约50wt％至约75wt％的填充剂、约0.1wt％至约1wt％的助流剂和约1wt％至约2wt％的润滑剂。在这种实施方式中，示例性基质是Klucel LF、Methocel K100LV Prem CR、Eudragit S100、Carbopol 971P、Carbopol 974P、A型甲基丙烯酸酯共聚物(methacrylate copolymer type A)和B型甲基丙烯酸酯共聚物(methacrylate copolymer type B)及其混合物；示例性填充剂是无水乳糖、Avicel PH-112、Avicel PH-113、Isomalt，或其混合物；示例性助流剂是Carbosil，而示例性润滑剂是硬脂酸镁和滑石中的至少一种。
在其它实施方式中，在本发明的方法中使用的固体药物剂型通过以下进行制备：提供克拉维酸类物质如克拉维酸、克拉维酸衍生物或克拉维酸的药用盐(药学可接受的盐，pharmaceutically acceptable salt)；将该克拉维酸类物质与至少一种赋形剂混合；将克拉维酸类物质和至少一种赋形剂的混合物造粒；以及冻干克拉维酸类物质和至少一种赋形剂的造粒混合物。造粒步骤可以是例如湿法造粒。示例性的克拉维酸类物质是克拉维酸钾，例如以克拉维酸钾粉末或克拉维酸钾与二氧化硅或微晶纤维素的1∶1混合物的形式。在示例性方法中，赋形剂是粘结剂、稀释剂、填充剂、崩解剂、基质、填充剂、助流剂、流动增强剂、防潮剂和润滑剂中的至少一种。该方法可以包括将所述剂型形成片剂或颗粒(珠体，bead)，并可选地用延迟释放聚合物(delay-release polymer)对药片或颗粒进行涂层。本发明包括口服给予根据本发明的稳定固体药物组合物以提供对神经保护或神经变性病症(例如帕金森氏病、阿兹海默氏病(Alzheimer′s disease)或多发性硬化)的治疗有效的克拉维酸类物质的量。
本发明的其它实施方式涉及适用于口服给予的克拉维酸类物质的即释和缓释制剂的用途。
本发明的其它实施方式涉及用于制备药物制剂的冻干方法，其中冻干包括对水合药物组合物脱水的干燥工艺过程。
本发明其它实施方式涉及用于制备含有克拉维酸类物质的药物组合物的方法和其作为药物的用途。
在其它实施方式中，本发明是通过口服给予稳定的口服制剂来治疗神经变性疾病的方法，所述制剂包括治疗有效量的克拉维酸类物质，例如克拉维酸、克拉维酸衍生物或克拉维酸的药用盐。其它示例性的实施方式是提供神经保护的方法，该方法包括口服给予含有克拉维酸类物质的稳定口服制剂。神经保护包括防止由神经变性疾病引起的细胞丧失(细胞损失，cell loss)或细胞死亡(细胞凋亡，cell death)。另一实施方式是防止神经细胞丧失或死亡的方法，该方法包括口服给予克拉维酸类物质的稳定口服制剂。根据本发明的方法可治疗的神经变性疾病的实例包括帕金森氏病、阿兹海默氏病和多发性硬化。治疗可包括，例如，减小发作(突然发作，seizure)或震颤(tremor)的频率、发病时间或严重性；减少失忆；或减少神经细胞死亡。
在根据本发明的示例性方法中，克拉维酸类物质是克拉维酸钾。所述稳定口服制剂的形式可以是片剂、胶囊、丸剂、锭剂、溶液、悬浮液、口含片剂或舌下片剂(buccal or sublingual tablet)、口服崩解剂、薄膜或粉末。所述制剂可以是在至少约4小时内释放克拉维酸类物质的缓释组合物；在少于约0.5小时内释放克拉维酸类物质的即释组合物；或其它形式。在一些实施方式中，所述克拉维酸钾是克拉维酸钾粉末或克拉维酸钾与二氧化硅或微晶纤维素的1∶1混合物。可用于本发明的制剂可以包括基质；填充剂；助流剂；以及润滑剂中的一种或多种。基质可以是，例如，MethocelK100LV Prem CR、Eudragit S100、Carbopol 971P、Carbopol 974P、A型甲基丙烯酸酯共聚物、B型甲基丙烯酸酯共聚物、或其混合物。填充剂可以是，例如无水乳糖、Avicel PH-112、Avicel PH-113、Isomalt，或其混合物。助流剂可以是，例如Carbosil，以及示例性润滑剂是硬脂酸镁、滑石及其混合物。
制备在本发明的方法中使用的制剂的示例性方法包括将克拉维酸类物质与至少一种赋形剂混合；将克拉维酸类物质和至少一种赋形剂的混合物进行造粒；然后冻干克拉维酸类物质和至少一种赋形剂的造粒混合物。
根据本发明，所述制剂可以以约0.001mg/kg/天至约1.0mg/kg/天的克拉维酸类物质的量给予。在一些实施方式中，所述制剂可以以约0.01mg/kg/天至约1.0mg/kg/天的量给予。所述制剂可以以单日剂量或以多剂量给予。
附图说明
图1示出了克拉维酸类物质即释制剂，样品B(●)和C(○)的体外溶解特性曲线。
图2示出了克拉维酸类物质缓释制剂，样品F的体外溶解特性曲线。
图3示出了克拉维酸类物质缓释制剂，样品I的体外溶解特性曲线。
图4举例说明了样品D(5mg/片的克拉维酸钾与微晶纤维素的1∶1混合物)在25℃/60％湿度(●)和30℃/65％湿度(▲)下的稳定性。
图5举例说明了样品E(5mg/片的克拉维酸钾与二氧化硅的1∶1混合物)在25℃/60％湿度(●)和30℃/65％湿度(▲)下的稳定性。
图6举例说明了样品F(5mg/片的克拉维酸钾与微晶纤维素的1∶1混合物)在2-8℃(○)，25℃/60％湿度(●)和30℃/65％湿度(▲)下的稳定性。
图7举例说明了样品G(5mg/片)在2-8℃(○)，25℃/60％湿度(●)和30℃/65％湿度(▲)下的稳定性。
图8示出了酪氨酸羟化酶(TH)在黑质致密部(substantia nigra parscompacta，SNpc)中的免疫组织化学。与正常组相比，MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)-盐水组中TH-阳性神经元的数量显著减少。在MPTP-克拉维酸类物质治疗组中很好地保留了TH-阳性神经元的数量。
图9示出了在MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)治疗的动物中对黑质致密部(SNpc)神经元存活(neuron survival)进行克拉维酸类物质治疗的效果。
图10阐明了在小鼠PD模型中使用爬杆实验(pole test)，克拉维酸类物质对MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)诱导的神经毒性的行为影响(behavioral effect)。
图11示出了在CA3区域克拉维酸类物质对红藻氨酸盐(kainate，KA)诱导的海马(hippocampal)神经毒性的影响。
图12示出了在正常、红藻氨酸盐+盐水、和红藻氨酸盐+克拉维酸类物质治疗组中，CA3区域中甲酚紫(cresyl violet)染色的结果。
具体实施方式
如本文中所用的，术语克拉维酸类物质包括克拉维酸(I)、克拉维酸的药用盐、盐组合物和衍生物，如酯。药用的克拉维酸盐的实例是克拉维酸钾。克拉维酸钾可以作为纯化合物或作为例如ClavitesseTM，克拉维酸钾与微晶纤维素的1∶1混合物、或克拉维酸钾与二氧化硅的1∶1混合物(可以从荷兰DSM Anti-Infectives B.V.获得)提供。
Figure BDA0000102327160000071
示例性的衍生物包括克拉维酸的活性酯，例如，酰氧基烷基基团，如乙酰氧基甲基、新戊酰氧基甲基、β-乙酰氧基乙基、β-新戊酰氧基乙基、1-(环己基羰基氧基)丙-1-基、和(1-氨基乙基)羰基氧基甲基；烷氧基羰基氧基烷基基团，如乙氧基羰基氧基甲基和α-乙氧基羰基氧基乙基；二烷基氨基烷基基团，如乙氧基羰基氧基甲基和β-乙氧基羰基氧基乙基；二烷基氨基烷基基团，特别是二低级烷基氨基烷基基团，如二甲基氨基甲基、二甲基氨基乙基、二乙基氨基甲基或二乙基氨基乙基-2-(烷氧基羰基)-2-烯基基团，如2-(异丁氧基羰基)戊-2-烯基和2-(乙氧基羰基)丁-2-烯基；内酯基团，如酞基(2-苯并[C]呋喃酮亚基，phthalidyl)和二甲氧基酞基(dimethoxyphthalidyl)。
示例性的盐包括克拉维酸的任何药用盐，例如，铝、碱金属盐如钠或钾、碱土金属盐如钙或镁，和铵或取代的铵盐，例如具有低级烷基胺的那些，如三乙胺；羟基低级烷基胺，如2-羟基亚乙基、双(2-羟乙基)胺或三(2-羟乙基)胺；环烷基胺，如二环己胺，或具有普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基乙二胺、1-二苯羟甲胺(1-ephenamine)、N-甲基吗啉、N-乙基哌啶、N-苄基-β-苯乙胺、去氢枞胺(dehydroabietylamine)、N，N′-双脱氢-枞胺、乙二胺，或基于吡啶类，如吡啶、可力丁(collidine)或喹啉，或其它胺，锂盐和银盐。
本文中所用的术语“口服给予”包括向主体递送任何形式的治疗药剂或其组合物，其中药剂或组合物放置于主体口内，无论药物或组合物吞咽与否。因此，“口服给予”包括口腔和舌下以及食道给予。药物吸收能够发生于包括嘴、食道、胃、十二指肠、回肠和结肠的消化道的任何一个或多个部位。
正如本文中所用，治疗药剂或其组合物能够向其给予的“主体”包括任意性别和任何年龄的人类患者，也包括任何非人类动物，尤其是家畜或宠物，举例而言有猫、狗或马。
术语“神经变性病症”是指与神经系统的变性、功能的全部或部分丧失，或功能不齐相关的症状、病症和/或疾病。因此，以此方式影响神经系统(中枢或周围)的任何构件(组分，component)或方面的任何症状、病症和/或疾病都可被认为是神经变性病症，神经变性病症包括但不限于认知障碍、运动障碍、精神障碍、疼痛障碍、睡眠障碍等。示例性的神经变性病症包括，但不限于，帕金森氏病、阿兹海默氏病和多发性硬化。示例性的运动障碍可包括各种运动困难例如震颤、肌张力障碍、舞蹈病、手足徐动症、抽动障碍(tic disorder)、睑痉挛以及偏身抽搐、肌阵挛、局部张力障碍，例如书写痉挛和斜颈，腿多动综合征和扑翼样震颤(asterixis)。这些过度的或其他形式的异常非自愿运动(involuntary movement)可以在速度、频率、周期和进行性(progressionary)特征方面显著变化。这样的运动有时可以在重叠病症(overlapping disorder)例如帕金森氏病；原发性震颤(essential tremor)，又名良性震颤或家族性震颤；抽动障碍，例如Tourette′s综合征；初发性张力障碍(诱导书写痉挛)，进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy)和威尔逊氏病中看到。
如本文中所使用的，术语“治疗(treat)”“治疗(treating)”等是指病症、或者病症或疾病的任何症状的任何可检测的、临床显著的改善、发作延迟、发作预防、或缓解。治疗并不需要或要求治愈。
“神经保护”具体是指延迟或防止神经变性或神经病学病症(即影响神经学或神经系统，包括中枢或周围神经系统的病症)发作的方法。可以凭经验测量神经保护或神经保护的效果，例如通过行为或认知变化或其缺乏，生理上，例如通过与未治疗的对照组相比，显示出保留或缺少或减少神经元破坏或神经元死亡，或测量对神经系统的任何部分缺少副作用的任何其它测量。其中示出了神经元存活或减少缺乏的示例性位置包括黑质致密部(SNpc)和海马(神经)的CA3区域。
本文中所使用的术语“赋形剂”是指这样的任何物质，其自身并非治疗药物，作为载体或媒剂用于向主体递送治疗药剂或加到药物组合物中改进其加工、处理、储存、崩解、分散、溶解、释放或器官感觉特性，或容许或有利于组合物剂量单位配制成离散制品，如适用于口服给予的胶囊或片剂。赋形剂能够包括，以举例说明而非限制性的方式，稀释剂、崩解剂、粘结剂、粘合剂、润湿剂、聚合物、润滑剂、助流剂、加入其以掩蔽或抵销不愉快的味道或气味的物质、调味剂、染料、芳香剂和加入其以改善组合物外观的物质。
因此，本发明涉及克拉维酸钾或ClavitesseTM适用于口服给予的即释或缓释制剂的用途。本发明的制剂含有一定量的克拉维酸类物质快速释放制剂或一定量的克拉维酸类物质缓慢释放(或缓释(extended release，延长释放))制剂。即释制剂的特征为克拉维酸类物质的快速释放，快速释放通过在给予之后大约5至大约30分钟获得克拉维酸类物质的最大释放表征。缓释制剂通过例如在至少4h的时间内较缓慢地释放克拉维酸类物质进行表征。在示例性实施方式中，这种缓释制剂能够在至少约6h或至少约8h内释放克拉维酸类物质。这些或其它实施方式能够在初始给予之后释放克拉维酸类物质至少约3h，至少约4h，至少约5h，至少约6h，至少约7h，或至少约8h。在示例性实施方式中，本发明是含有即释或缓释制剂的片剂或胶囊，基于制剂中药物的总量而不是制剂的总重量，其含有活性化合物的量为约10μg至10mg，或活性化合物总重量的约0.01％至10％。
根据本发明的神经保护和神经变性病症的治疗可以通过口服给予克拉维酸类物质的稳定固体制剂来实现。可以以很多方法来评估治疗，包括主体存活、行为测试、免疫组织学评价，例如测定细胞或神经元的存活，或测定指示该病症的特定症状的频率或强度。在动物模型或人类研究中，行为测试可以包括，例如，评价确定自身方位的能力，评价与例如速度和方向等相关的运动损伤。行为测试还可以包括通过使用迷宫，例如Morris水迷宫测试等来测试记忆。免疫组织学评价可以在无染色漂浮切片上实施，随后进行细胞计数或本领域中公知的其它技术。症状测试可以包括，例如，评价各种症状(例如发作或震颤)的次数、频率或强度，或评价记忆保留。
根据本发明，已经发现，在MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)诱导的帕金森氏病动物模型中，与MPTP-盐水组相比，在通过口服给予稳定固体克拉维酸类物质进行预治疗的组中，TH(酪氨酸羟化酶)-阳性神经元的数量得以保持。此外，用克拉维酸类物质预治疗的动物对红藻氨酸盐诱导的海马细胞死亡显示出明显的神经保护作用。与对照相比，经治疗的动物还显示出距发作的时间较长以及发作活动性(强度，activity)较温和。
在用于神经保护或治疗神经变性疾病的一些实施方式中，稳定固体制剂可以以提供约0.001mg/kg至约1.0mg/kg克拉维酸类物质的量来给予。在一些实施方式中，稳定固体制剂可以以提供约0.01mg/kg至约1.0mg/kg克拉维酸类物质的量来给予。在一些实施方式中，稳定固体制剂可以以提供约0.1mg/kg至约1.0mg/kg克拉维酸类物质的量来给予。如疗效评价所指示的，这样的剂量可以每天一次，每天两次，每天三次，或更多次来给予。可以以对给予而言任何适合和方便的单位剂量来配制剂型，例如0.1mg/剂量、0.5mg/剂量、1.0mg/剂量、5mg/剂量等。在示例性的实施方式中，稳定固体制剂包括约5mg克拉维酸类物质/剂量。
每日剂量可以以单剂量给予，或划分为多剂量给予从而在一天过程中给予。多剂量给予可以是每天两次、三次、四次或多次剂量。如将领会到的那样，当递送相似的每日总剂量时，缓释组合物可以提供降低必须服用的每日剂量总次数的方法。稳定固体剂型尤其有利于在本发明中使用，因为其能够保证不足剂量或过量剂量较少发生。这在当前的应用中尤其有意义，其中甚至绝对小量的分解都能够导致实际给予的克拉维酸类物质的百分比发生相对大的变化。在一些克拉维酸类物质的较早应用中，例如在作为如助剂而结合抗生素如β-内酰胺酶抑制剂而使用时，稳定性的缺乏可以通过使用过量的克拉维酸类物质而解决，这样分解对功效影响不大。然而，在如本文中所描述的应用中，其中克拉维酸类物质是活性药物成分，更加重要的是，医师能够以适合于治疗目的的可预测的预定量给予克拉维酸类物质。这能够进一步提高治疗的功效以及患者的顺应性。
该药剂诸如片剂或胶囊的口服给予具有优于非肠道给予如静脉给予或肌肉注射的某些优点。需要采用疼痛的可注射制剂治疗的疾病被认为是比那些能够用口服剂型治疗的病症更严重的病症。然而，采用口服制剂的主要优点在于其自我给予的适用性，而非肠道给予大多数情况下必须通过医师或辅助医护人员进行给予。对于本发明，显示了口服给予至少就神经变性病症的某些指标而言具有增加的功效。
各种药物的性质，例如，粒径分布、容积密度(bulk density)、可流动性、润湿性能、表面积和粘着性，都有很大的不同，并且能够影响固体剂型如片剂的可加工性。克拉维酸类物是高度吸湿性的，而一旦接触水，就会从晶体状态变为无定形态，这表明稳定性很差。这些障碍组合到一起就使得标准片剂的生产加工过程变得极其困难，使得克拉维酸类物质制剂的储存产生很大问题，并且导致含有克拉维酸类物质的制剂的储存和制备需要特殊的条件。
克拉维酸钾，尽管属于最常见的且易于处理的形式，仍属于异常难以配制的物质，是极端吸湿性的和水份敏感性的。在水和含水介质存在下易于发生降解。在如本文中所描述的应用中，其中克拉维酸类物质是活性药物成分，更加重要的是，医师能够以适合于治疗目的的可预测的预定量给予克拉维酸类物质。在这些情况下，给予合适的口服剂型对于治疗用途而言是合乎需要的。
因此，需要克服上述问题(考虑到克拉维酸类物质的性质)的合适且强效的克拉维酸类物质制剂，用于神经保护和治疗神经变性病症，其中，克拉维酸类物质是唯一的活性成分。在低剂量如10μg至10mg的情况下，克拉维酸类物质制剂所遇到的问题尤其具有挑战性，其中即使发生小程度降解，也会导致主体可利用的克拉维酸类物质的量显著变化。
本发明涉及克拉维酸类物质的稳定口服剂型的制备及其用于神经保护和在神经变性病症治疗中的用途。用于本发明用途的固体口服剂型能够包含一般适用于制备固体口服剂型的添加剂或赋形剂。固体口服剂型例如包括片剂、胶囊剂、丸剂、锭剂和粉末剂。在胶囊剂的情况下，固体口服剂型可以是包埋于胶囊当中的颗粒。在本发明的示例性实施方式中，固体口服剂型是合适的固体片剂。
可以使用通常在片剂制剂中使用的片剂助剂(tabletting aid)，并可参考有关该主题的广泛文献，具体参见Fiedler的“Lexicon der Hilfstoffe”，第四版，ECV Aulendorf 1996(其结合于本文中作为参考)。这些包括但不限于，填充剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂或稀释剂、表面活性剂、成膜剂、软化剂、颜料等。
填充剂包括淀粉，例如，土豆淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和微晶纤维素，例如，以注册商标AVICEL、FILTRAK、HEWETEN、Prosolve SMCC50或PHARMACEL可获得的产品。填充剂的其它实例包括麦芽糖、异麦芽糖醇(isomalt)、乳糖(例如作为
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蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和碳酸钙。
粘结剂包括淀粉、糖、纤维素、或改性纤维素如羟丙基纤维素、乳糖、或糖醇如木糖醇、山梨醇或麦芽糖醇。示例性粘结剂是麦芽糖糊精(maltodextrin)(Maltrin M1 50)。
作为崩解剂，能够提及的是羧甲基纤维素钙(CMC-Ca)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、交联的PVP(例如CROSPOVIDONE、POLYPLASDONE或KOLLIDON XL)、海藻酸、海藻酸钠和瓜尔胶。交联的PVP(CROSPOVIDONE)、交联的CMC(Ac-Di-Sol)、羧甲基淀粉-Na(PIRIMOJEL和EXPLOTAB)、Pharmaburst和羟丙基纤维素(L HPCLH-11)都是示例性崩解剂。
基质可包括，例如，Methocel K100Prem-M或Eudragit RS PO粉末、甲基丙烯酸共聚物(例如，A型甲基丙烯酸共聚物、B型甲基丙烯酸共聚物、聚羧乙烯(Carbopol))，以及本领域公知的其他基质。
助流剂的实例包括胶态硅石(colloidal silica)，如胶态二氧化硅，例如，气相二氧化硅(fumed silica)(Cabosil，Aerosil)，三硅酸镁(Mg)，粉末化纤维素，淀粉，滑石和磷酸三钙，或这些(物质)与填充剂或粘结剂的组合，例如硅酸化微晶纤维素(PROSOLV)。Cabosil(胶态氧化硅)也能起到流动增强剂/防潮剂的作用。
而且，填充剂或稀释剂可包括糖果厂商的糖、可压缩糖、葡萄糖结合剂(dextrate)、糊精、右旋糖、乳糖、甘露醇、微晶纤维素，例如密度为约0.45g/cm3的微晶纤维素，如AVICEL，粉末化纤维素、山梨醇、蔗糖和滑石。
润滑剂包括硬脂酸和其盐，如硬脂酸镁、硬脂酸铝和硬脂酸钙，PEG4000-PEG8000，滑石，氢化蓖麻油，甘油酯，Na-硬脂酰富马酸盐，氢化棉籽油等。常见的润滑剂是硬脂酸和硬脂酸镁。
片剂和胶囊能够另外采用肠包衣和其它出于轻度保护和可吞咽性目的的受控释放包衣(release-controlling coating)进行制备。肠包衣的实例可以包括由以下制备的化合物，例如，甲基丙烯酸共聚物、纤维素乙酸酯(及其琥珀酸酯和邻苯二甲酸酯形式)、苯乙烯马来酸共聚物、聚甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟乙基乙基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯、纤维素乙酸酯四氢邻苯二甲酸酯、丙烯酸树脂、偏苯三甲酸酯(timellitate)和虫胶。肠包衣示例性的聚合物包括甲基丙烯酸共聚物如Eudragit。肠包衣的其它合适聚合物在本领域内是已知的。这些包衣可以采用药用染料着色。包衣液中的染料和其它赋形剂的含量可以变化，并且将不会影响即释或缓释片剂的性能。包衣液一般含有成膜聚合物，如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、纤维素酯或醚、丙烯酸聚合物或聚合物的混合物。包衣溶液一般是进一步含有丙二醇、山梨糖醇单油酸酯、山梨酸、诸如二氧化钛的填充剂、药用染料的水溶液。
用于本发明用途的固体稳定口服剂型含有作为活性剂的治疗有效量的克拉维酸类物质和作为添加剂的填充剂。其它添加剂可包括但不限于，粘结剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、稀释剂、表面活性剂、成膜剂、颜料、软化剂和防粘剂(antitacking agent)等。
克拉维酸钾当暴露于约35％相对湿度96h时具有相对低的水分含量(基于干重＜1％)，如表10中所示。然而，看起来在任何超过40％相对湿度的湿度下最终都会发生潮解。当暴露于50％的相对湿度时，干克拉维酸钾的水分吸收以大约1.44％/小时的速率发生。
在制备含有克拉维酸类物质的药物组合物期间采用冻干或冷冻干燥，将克拉维酸类物质片剂的稳定性提高至约97％(参见表11)。
用于本发明用途的稳定固体口服药物组合物可包含作为药物活性成分(API)的克拉维酸类物质，其剂量范围为约10μg至10mg，例如，约0.1mg至约5mg。在示例性实施方式中，克拉维酸类物质是克拉维酸盐，例如克拉维酸钾。据报道，10ng至10μg/kg腹膜内剂量范围的克拉维酸能够改变CNS活性和行为(参见美国专利6,489,319)。
根据本发明，可以多种剂型给予克拉维酸类物质，包括例如即释和缓释剂型，其含有约10μg至约10mg克拉维酸类物质，例如约0.1mg至约5mg克拉维酸类物质。这种剂型能够用于神经保护和治疗神经变性病症及其症状。
即释形式合乎需要地在少于约30分钟内提供克拉维酸类物质的至少约80％(w/v)的溶解，如按照本文公开的标准分析方法测定的那样。根据本发明实施方式的即释药物组合物能够迅速地溶解于合适水溶液(例如水、盐水、果汁)或胶体状悬浮液(例如，婴儿配方奶或牛奶)中，以方便向不能处理固体剂型的患者给予。这种患者的实例有婴儿、幼儿和可能经受吞咽困难的成年人。在示例性实施方式中，从组合物放置于水溶液中的时间开始约15分钟，至少约80％的克拉维酸类物质就溶解于水溶液中。在其它实施方式中，在将组合物暴露于水溶液之后约30分钟，或约15分钟，至少约90％的克拉维酸类物质释放到水溶液中。如图1所示，用于实施本发明的示例性即释组合物在暴露于水溶液之后约15分钟内，释放90％的克拉维酸类物质。
缓释组合物能够长时间(例如经约8小时或经约10小时)释放活性成分，即克拉维酸类物质。缓释制剂能够从制剂一到达消化道即开始释放活性成分，并继续以大约恒定的方式缓慢溶解和释放活性成分。这种特性是所需的，因为这在给予之后在血流中提供较稳定的活性成分水平。如图2中所示，用于实施本发明的示例性缓释组合物在给予之后能够提供高达约8至10小时的克拉维酸类物基本水平的释放。
根据本发明实施方式应用的药物组合物提供了重要的优点。水含量的控制在含克拉维酸类物质的组合物的配制和储存中是主要问题，因为克拉维酸类物是吸湿性的并且在水中不稳定或水解。采用冻干法制备稳定的即释或缓释组合物，提供了出人意料的增强的稳定性，尤其是当克拉维酸类物质在冻干之前组合赋形剂，更是如此。
用于本发明用途的实施方式可以是克拉维酸类物质的冻干组合物，能够使用的包括：(1)通过将克拉维酸类物质与至少一种赋形剂混合而形成克拉维酸类物质组合物；(2)在0℃或低于0℃冷冻一定量的克拉维酸类物组合物，例如克拉维酸类物质，直至转化成冷冻的固体；和(3)在气密性容器中对克拉维酸类物质组合物脱水。粉末化形式的脱水(冻干)组合物(包括药物)能够与其他赋形剂混合之后压制成片剂或制备成一定粒度的颗粒。
最终干制剂的水分含量低。本文中使用的各个实施方式将具有的最终水分含量不超过约10％(按重量计)，不超过约5％，或不超过约4％，或甚至更低。根据本发明的这些实施方式的干制剂在诸如25℃和60％相对湿度或30℃和65％相对湿度的条件下对于长期储存是高度储存稳定的，如例如约30天、约60天或约90天是稳定的。一旦用合适的液体稀释，基本上在其所述的初始剂量下，它们完全有效(fully potent)。
可通过以下制备用于本发明的制剂：干混聚合物，例如基质，如Eudragit(甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的阴离子共聚物)，粘结剂/稀释剂如Maltrin M50和/或崩解剂如Pharmaburst，填充剂，克拉维酸类物，和其它赋形剂(参见实施例)，然后采用水对混合物造粒直至获得合适的颗粒物。造粒通过本领域已知的方法完成。湿颗粒在冻干机中冻干，筛分并磨碎成合适的尺寸。润滑剂能够与干燥的颗粒物混合而获得最终制剂(finalformulation)。由于克拉维酸类物是吸湿性的而在水中不稳定，最小化混合物保持湿润的时间是必要的，例如从称重和造粒至冻干的加工时间可以为约1h。
例如以片剂或胶囊剂的形式口服给予用于本发明的组合物。片剂能够通过本领域内已知的技术制备，并含有治疗有用量的克拉维酸类物和通过此类技术形成片剂所必需的赋形剂。还可不使用克拉维酸类物质但使用相同的组合物来制备安慰剂颗粒(placebo particle)。
可在成年人主体中用于神经保护和治疗神经变性疾病的稳定固体克拉维酸类物质制剂的示例性剂量可以是每天约5mg至每天约100mg。在示例性实施方式中，日剂量是约5mg至约70mg，例如约5mg至约50mg、或约7mg至约70mg。其他示例性剂量可以是每天约10mg至每天约50mg、每天约5mg、每天约7mg、每天约10mg、每天约20mg、每天约25mg、或每天约35mg。如之前所公开的那样，可每天一次、每天两次、每天三次或更多次地给予日剂量。应当理解，给予更少的每日剂量通常需要采用缓释制剂。例如，可如下给予10mg的每日剂量：单次10mg剂量、两次5mg剂量、三次约3.33mg剂量或四次2.5mg剂量。可针对特定个体的所需剂型，计算其他的给予量。
用于根据本发明给予的稳定固体剂型可作为单位剂型提供。单位剂型是含有预定量的克拉维酸类活性物质的单次剂量。单位剂型的实例包括，但不限于，片剂、锭剂、胶囊剂以及含有粉末的小包(packet)。用于根据本发明给予的单位剂型可包括例如0.1mg、0.25mg、1mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、5.0mg、7.5mg、10mg或其他量的克拉维酸类物质。单次剂量可包含单个单位剂型、多个单位剂型或部分单位剂型。例如，可如下给予5mg剂量：两个单位剂型，每个含有2.5mg克拉维酸类物质；单个单位剂型，含有5.0mg克拉维酸类物质；或半个含有10mg克拉维酸类物质的单位剂型。可容易地计算包含其他单位剂型的其他剂量。
药代动力学研究
对于本发明制剂的生物利用度研究，通过向健康主体以片剂形式给予即释或缓释制剂，并在24小时内以不同时间间隔测定血浆中克拉维酸类物质的水平(浓度)而测得。血浆样品通过BAS分析(West Lafayette，Ind)采用类似于文献中描述的经验证的(validated)高效液相色谱方法对克拉维酸类物质进行分析。例如参见Chu S-Y，等人，“Simultaneousdetermination of clarithromycin and 14(R)-hydroxyclarithromycin in plasmaand urine using high performance liquid chromatography with electrochemicaldetection”，J.Chromatography，571，pp 199-208(1991).。
实施例
以下实施例仅仅出于举例说明目的而并非意在限制所附权利要求的范围。
实施例1：克拉维酸类物质片剂的制备
实施例1A-使用克拉维酸钾粉末制备即释克拉维酸类物质的片剂
片剂制备工艺方法的示例性描述：已经发现湿法造粒片剂制剂方法，其中水包含在造粒步骤内，接着通过干燥而获得低水分含量(＜3％)的颗粒。干燥的制剂相比于现有技术的制剂是非吸湿性的，而且维持了由其制备的片剂的等同物理特性(例如，溶解性、崩解性、生物利用度和其它物理性质)。片剂制备通过用水在粘结剂/稀释剂的存在下造粒克拉维酸类物质来实施。
对于样品C的制备，将Maltrin M150(130g)溶解于纯水中并加入克拉维酸钾(API；59.5g)。称重Prosolve SMCC-50(490.5g)、Pharmaburst(130.0g)、L HPC LH-11(120.0g)、Acdisol(20.0g)和硬脂酸(50g)，并在袋(bag)中通过振荡和旋转袋而进行混合。将混合物转移至Hobart混合机的转筒(bowl)中，向混合物中加入API/Maltrin M150溶液并搅拌10min。在完成湿聚结(wet massing)之后，将Hobart混合机转筒的内容物转移到挤出机中并挤出。将挤出物置于搓圆机(spheronizer)中并在袋中收集搓圆的物质并在gortex-lyoguard托盘中冻干。筛分干燥的物质并压制成片剂或制成一定尺寸的颗粒(sized bead)。按照和样品C相同的方法制备样品A和B。
实施例1B-使用Clavitesse TM 制备即释克拉维酸类物质的片剂
对于样品D的制备，称重ClavitesseTM(API；50.6g)、Prosolve SMCC50(213.4g)、Pharmaburst(100.0g)、Acdisol(8.0g)、Cabosil(8.0g)和硬脂酸镁(20.0g)，并在gortex-lyoguard托盘中于2-8℃下冻干过夜。第二天，在袋中混合API、Prosolve SMCC 50、Pharmaburst和Acdisol，通过#40目筛进行筛分，卸载到V型混合器(V blender)中混合7分钟。将混合物再次筛分并在V型混合器中混合4分钟。筛分Cabosil和硬脂酸镁并在V型混合机中与含有API的混合物混合4分钟。掺混物在gortex-lyoguard托盘中冻干过夜。将物料压制成片剂，并将片剂在gortex-lyoguard托盘中冻干并包装。按照与样品D相同的方式制备样品E。
实施例1C-使用Clavitesse TM 制备缓释克拉维酸类物质的片剂
对于样品F的制备，称重适量的Clavitesse(API；41.07g)、MethocelK100LV Prem CR(90.0g)、Isomalt(83.55g)、Avicel PH-112(80.04g)、Cabosil(1.5g)、滑石(2.4g)和硬脂酸镁(1.5g)，并施加到gortex-lyoguard托盘中于2-8℃下在冻干机中干燥过夜。筛分每一成分并收集在独立的袋中。将API和Methocel K100LV Prem CR载入V型混合机中，混合，通过合适的筛子进行筛分并继续混合。将Avicel PH-112和Isomalt加入到混合物中并混合。筛分所得的混合物并再次混合。将Cabosil和滑石混合并加入到混合物中进行混合。将硬脂酸镁在V型混合机中与混合物混合。最后的掺混物在gortex-lyoguard托盘中冻干过夜并压制成片剂或制备成一定尺寸的颗粒。将片剂压制至更高硬度以进行缓释包衣。采用延迟释放聚合物，Eudragit对片剂或颗粒进行包衣。
实施例1D-使用克拉维酸钾粉末制备缓释克拉维酸类物质的片剂
对于使用克拉维酸钾的缓释片剂(样品G)的制备，将克拉维酸钾(API；20.69g)通过#60目筛进行筛分，而其它赋形剂，MethocelK100LVPrem CR(90.02g)、Isomalt(83.56g)、Avicel PH-112(100.41g)、Cabosil(1.52g)、滑石(2.4g)和硬脂酸镁(1.5g)通过#40目筛进行筛分。在独立的袋中收集每一成分。将API和Methocel K100LV Prem CR载入V型混合机中，混合5分钟。筛分混合物并再混合5分钟。将AvicelPH-112和Isomalt加入到混合物中并在V型混合机中混合5分钟。筛分所得的混合物并再混合5分钟。将Cabosil和滑石混合后载入到混合物中并随后混合所得混合物2分钟。最后，使硬脂酸镁在V型混合机中与混合物混合3分钟并使最后的掺混物在gortex-lyoguard托盘中冻干过夜，并随后压制成片剂或制备成一定尺寸的颗粒。将片剂压制至更高硬度以用于缓释包衣。采用延迟释放聚合物，Eudragit包衣片剂或颗粒。与和样品G相同的方式制备样品H和I。
实施例2：克拉维酸类物质的分析
通过Waters HPLC(高效液相色谱)系统(柱：μBondapack-NH2(10μm)300mm×3.9mm，流动相：CH3CN∶pH 5.2KH2PO4＝65∶35，流速：1.0ml/min)，采用以下步骤来测定所制备药物组合物的克拉维酸类物质含量：将约10个片剂精确称重并碾碎，加入100mL水并将混合物超声破碎20分钟。在用水稀释之后，过滤部分溶液并注射到HPLC中。通过对应于HPLC标准制备品色谱的样品保留时间来确定主峰。基于分析物响应因子相对于参照标准的响应因子来计算克拉维酸类物质％。
在0.01mg/mL的标称浓度下，以参照标准的25、50、75、100、125、150％来检验克拉维酸类物质标准曲线的线性度(linearity)。R2为0.9998。在克拉维酸类物质0.01mg/mL的标称浓度下，采用6个RSD百分数为1.4的样品来检验精度。通过一式三份制备和分析0.01mg/mL的50％、100％和150％的掺安慰剂的掺混物，来确定准确度(accuracy)。
实施例3：示例性制剂和特性
以下实验描述了设计为即释(IR)片剂和缓释(ER)片剂的不同剂量的片剂制剂。下表也示出了根据本发明制剂的片剂的物理性质。
实施例3A-采用克拉维酸钾的即释组合物
如表1所示，即释组合物由克拉维酸钾粉末和赋形剂，采用以上描述的方法进行制备。
表1
API*：活性药物成分。
表2总结了采用克拉维酸钾粉末的即释片剂的特性。样品C片剂显示出优异的稳定性，在2-8℃下1星期之后含有94.4％的克拉维酸钾。
表2
Figure BDA0000102327160000192
实施例3B-采用Clavitesse TM 的即释组合物
采用如表3中所示的ClavitesseTM制备含有5mg克拉维酸类物质的即释组合物。
表3
Figure BDA0000102327160000201
API*：活性药物成分。
表4总结了采用ClavitesseTM的即释片剂的特性。
表4
Figure BDA0000102327160000202
实施例3C-采用Clavitesse TM 和克拉维酸钾粉末的缓释组合物
如表5-8中所示采用ClavitesseTM或克拉维酸钾粉末制备缓释组合物。
表5
Figure BDA0000102327160000211
API*：活性药物成分。
表6
Figure BDA0000102327160000212
API*：活性药物成分。
表7
API*：活性药物成分。
表8
Figure BDA0000102327160000222
API*：活性药物成分。
表9总结了采用ClavitesseTM和克拉维酸钾粉末的缓释片剂的特性。
表9
Figure BDA0000102327160000231
实施例4：体外溶解研究
将片剂置于500mL的溶剂(对于即释片剂是去离子水；对于缓释片剂第一个2h是pH 1.2的溶液而接下来8h是pH 7.0的柠檬酸盐缓冲液)中。混合物在100rpm下于37℃涡旋振荡并定期收集样品，并通过HPLC检测溶解的克拉维酸类物质的量。
结果如图1-3所示。图1是显示克拉维酸类物质的即释制剂样品B和样品C的体外溶解特性曲线图。如图1所示，即释片剂在暴露于水溶液之后15分钟内溶解了90％或更多的克拉维酸类物质。图2是克拉维酸类物质的缓释制剂样品F的体外溶解特性曲线图。图3是克拉维酸类物质的缓释制剂样品I的体外溶解特性曲线图。如图2和图3所示，在缓释片剂中克拉维酸类物质的总剂量经侵蚀和溶解机理缓慢释放至少约8至10小时的一段时间。在缓释形式中的克拉维酸类物质的释放在pH 1.2的溶液中未检测到。
实施例5：稳定性测试
克拉维酸钾在其固体形式中在水蒸汽存在下既是吸湿性的又是不稳定的。通过色谱法监控，进行克拉维酸类物质的稳定性研究。通过在不同相对湿度的室内储存样品以尝试产生吸收等温线(sorption isotherm)来进行静态或平衡研究。吸收等温线表示平衡水分含量和大气中相对湿度(RH)之间的定量关系。表10显示了克拉维酸钾粉末在暴露于不同湿度条件之后水分含量的变化。
表10
如表10中所示，在暴露于约35％或更低的相对湿度中96小时的情况下，克拉维酸钾具有相对较低的水分含量(基于干重＜1％)。然而，似乎在超过约40％相对湿度的任何湿度下潮解实际上都将会发生。暴露于约50％相对湿度的干克拉维酸钾的水分吸收，以大约1.44％每小时的速率发生。
克拉维酸钾是异常难以配制的物质，其是极度湿热敏感性的。在水分和含水介质存在下易于发生降解。已测试了几种方法以找到在湿法造粒之后去除水分而保持活性成分克拉维酸类物质完整性的合适条件。样品C中的物质通过湿法造粒和球粒化(spheronized)来制备。将含水分的球粒化制剂转移至托盘中并经受不同的储存条件以除去水分。
正如在表11中所总结的，在30℃下储存69小时(储存1)，或在45℃下储存75小时(储存2)，结果克拉维酸钾的降解分别高达45％和60％。在流化床系统中干燥导致仅在1.5小时内克拉维酸类物质就降解了13％。这些数据表明，克拉维酸钾也是温度敏感性的。在21小时的冻干处理之后冻干保持了97％的活性成分。表11中的结果表明，克拉维酸类物质的冻干能够用于降低克拉维酸类物质制剂中的水分含量并提高制剂的稳定性。
表11
Figure BDA0000102327160000251
对由ClavitesseTM制备的即释制剂，样品D和样品E的稳定性，进行长达3个月的评估。图4是显示样品D(5mg/片克拉维酸钾和微晶纤维素的1∶1混合物)在25℃/60％湿度下和在30℃/65％湿度下的稳定性的曲线图。图5是显示样品E(5mg/片克拉维酸钾和二氧化硅的1∶1混合物)在25℃/60％湿度和30℃/65％湿度下的稳定性的曲线图。如表4和图4和图5所示，根据样品D和样品E制备的两种片剂初始含有不到4％的水分，而且在25℃/60％湿度(对于克拉维酸类物质而言是相对高的湿度条件)下降解低于7％。对由ClavitesseTM制备的缓释片剂，样品F和G的稳定性进行长达2个月的评估。图6是显示样品F(5mg/片克拉维酸钾和微晶纤维素的1∶1混合物)在2-8℃，在25℃/60％湿度和30℃/65％湿度下的稳定性的曲线图。图7是样品G(5mg/片)在2-8℃，25℃/60％湿度和30℃/65％湿度下的稳定性的曲线图。正如表5和图6和7中所示，根据样品F和G制备的片剂初始含有不到4％的水分而在30℃/65％湿度(对于克拉维酸类物质而言是相对高的湿度条件)下降解低于1.6％。因此，似乎在ClavitesseTM中的微晶纤维素或二氧化硅可以进一步有助于通过捕获片剂中的水分而提高克拉维酸钾的稳定性。
实施例6：药代动力学研究
通过LC/MS/MS方法测定比格犬(beagle dog)血浆中克拉维酸类物质的含量。分析物的色谱分离在反向PLRP-S聚合物柱上进行。克拉维酸钾和他唑巴坦(参照化合物)的保留时间分别为8.51和8.54分钟。总色谱运行时间为25分钟。M/S分析在Applied Biosystems′API 2000三重四极杆质谱仪上通过以负电喷雾离子化模式多重反应监控而进行。质谱数据通过Analyst 1.4.1(Applied Biosystems)分析。通过采用PK Solutions 2.0(Summit Research Services)进行药代动力学分析。
实施例6A-在雄性比格犬中口服给予即释(IR)片剂
在整个研究的交叉设计中使用三只雄性比格犬，在治疗之间具有清除期(washout period)。这些犬经由口服途径给予作为实施例3A的IR片剂的测试物质，在剂量给予之间采用不短于24小时的清除期。这些动物在给予测试物质之前禁食过夜而在剂量给予之后4小时进食。在整个治疗期间，在剂量给予0、5、15、30分钟，1、1.5、2、2.5、3、4、6、9和12小时之后将血样(1.5mL)从头静脉通过静脉穿刺抽入到肝素化管中。经由3,000rpm离心10分钟获得血浆并通过LC-MS/MS系统进行分析。表12中提供了相关的平均药代动力学参数。
实施例6B-在雄性比格犬中静脉给予克拉维酸钾溶液
在整个研究的交叉设计中使用三只雄性比格犬，在治疗之间具有清除期(washout period)。这些犬经由静脉注射途径给予作为水溶液的测试物质，在剂量给予之间采用不短于24小时的清除期。这些动物在给予测试物质之前禁食过夜而在剂量给予之后4小时进食。在整个治疗期间，在剂量给予0、5、15、30分钟，1、1.5、2、2.5、3、4、6、9和12小时之后将血样(1.5mL)从头静脉通过静脉穿刺抽入到肝素化管中。血浆经由3,000rpm离心10分钟获得并通过LC-MS/MS系统进行分析。表12中提供了相关的平均药代动力学参数。
实施例6C-在雄性比格犬中口服给予缓释(ER)片剂
在整个研究的交叉设计中使用四只雄性比格犬，在治疗之间具有清除期(washout period)。这些犬经口服途径给予作为实施例3C的ER片剂的测试物质，在剂量给予之间采用不短于24小时的清除期。这些动物在给予测试物质之前禁食过夜而在剂量给予之后4小时进食。在整个治疗期间，在剂量给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12小时之后将血样(1.5mL)从头静脉通过静脉穿刺抽入到肝素化管中。血浆经由3,000rpm离心10分钟获得并通过LC-MS/MS系统进行分析。表12中提供了相关的平均药代动力学参数。
表12
Figure BDA0000102327160000271
*PK参数：T最大：达到最大浓度的时间，C最大：最大浓度，AUC：曲线下的面积，CL：清除率，Vd：分布容量，Vss：稳态下分布容量，t1/2：半衰期，MRTinf：平均保留时间，F：生物利用度
当口服给予时，证明克拉维酸钾在禁食动物中吸收良好，平均生物利用度为30％～41％。表观最终半衰期为0.5小时。
实施例7：帕金森氏病动物模型
步骤
在MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶)诱导的帕金森氏病动物模型中测试克拉维酸类物质的神经保护效果。将8周龄雄性C57BL/6小鼠分成6组，每组10只。在MPTP处理之前，以特定剂量和给予途径(组2-5)用克拉维酸类物质处理10只动物3次(每天一次)，而给剩余的动物(组1和6)给予盐水媒剂。(参见表13)。以20mg/kg剂量腹膜内给予MPTP4次(总共80mg/kg)。MPTP处理后，另外向动物给予克拉维酸类物质或盐水媒剂两次(每天一次)。测试动物的行为改变。在MPTP处理中存活的动物在7天后处死，并检查它们大脑黑质致密部(SNpc)的组织学改变。处死作为实验动物的相同重量和年龄的10只未处理的对照动物，并将它们的海马形态作为用于比较的标准品。
表13
 组   MPTP   克拉维酸类物质剂量   给予途径
 组1   是   无(仅有盐水)
 组2   是   0.01mg/kg   腹膜内
 组3   是   0.1mg/kg   腹膜内
 组4   是   0.1mg/kg   管饲
 组5   是   1.0mg/kg   管饲
 组6   否   无(仅有盐水)
行为测试
爬杆实验(pole test)已有效地用于评估帕金森氏病的啮齿类动物模型。在这一测试中，将小鼠置于向上的金属杆顶端，并测量向下定向和爬下的时间。运动神经损伤(motor impairment)与延长的向下定向和爬下的时间相关。
将小鼠置于已缠在线中间的杆(50cm高，1cm宽)的顶部。将该杆的基部置于动物的笼中。然后记录向下定向和爬下杆所需的时间。已知MPTP处理的小鼠具有更慢的向下定向和爬下杆的时间。在测试当天，在5个试验中记录动物，并计算在该5次表现中的均值。如果小鼠在任何给定试验中从杆上落下或不能爬下杆，则对该次不成功的测试记录该动物的前(几次)试验中最长的时间。
与正常组相比，MPTP-盐水组显示出自发活动时间(locomotor activitytime)的显著延长。在低剂量克拉维酸类物质治疗组(0.01mg/kg，腹膜内和0.1mg/kg，管饲)中，TH-IR(酪氨酸羟化酶-免疫反应性)神经元的自发活动时间显著降低。然而，MPTP和高剂量克拉维酸类物质治疗组之间的时间没有显著差异。图10示出了在小鼠PD模型中，应用爬杆测试的克拉维酸类物质对MPTP诱导的神经毒性的行为效果。每一个柱表示平均值±S.E.M。*：与对照组相比，P值＜0.05；##：P值＜0.01，###：与仅有MPTP处理的组相比，P值＜0.001。(T-LA：自发活动时间；ga，管饲)。表14显示了克拉维酸类物质对MPTP诱导的PD模型的自发活动时间的行为效果。
表14
Figure BDA0000102327160000291
组织处理
在试验结束时，通过IP注射10mg/kg戊巴比妥钠麻醉动物，之后在5分钟期间用10ml pH 7.4的PBS、随后用50ml在PBS中的4％多聚甲醛经心灌流(perfuse transcardially)。从颅中移除大脑，并通过浸入在相同的固定溶液(fixative solution)中4h来进行后期固定(post-fix)，然后转移至在PBS中的30％蔗糖中。用蔗糖溶液平衡后，应用冷冻切割术将冠状部分以40μm的厚度切至储存溶液中，并在染色之前在4℃储存。
酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学
在自由漂浮切片上进行免疫组织化学。所有染色均在5个切片系列(series of sections)中的一个上进行。应用相同的抗体溶液同时染色所有切片，并且保证每一大脑的温育时间和洗涤是相同的。使用了以下方案。在PBS中洗涤切片。在PBS中的3％过氧化氢中浸泡10分钟淬灭内源过氧化物酶活性，随后洗涤并在PBS中再平衡。在PBS中的3％标准山羊血清/0.1％Trixon X-100的溶液中预温育1小时后，在室温下使切片在用1％标准山羊血清/0.1％Trixon X-100以1∶2000稀释的多克隆抗-TH(酪氨酸羟化酶)抗体(Chemicon)中温育过夜。在彻底洗涤后，施用在0.1％TritonX-100(在PBS中)中的生物素化抗兔抗体(Vector，1∶200)90分钟。然后洗涤切片15分钟，然后施用在PBS中的ABC溶液(Vector，1∶100)1小时，随后在PBS中彻底洗涤。通过在含有0.1μl/ml过氧化氢的PBS中的0.02％DAB溶液中温育3分钟，来显示辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)。将切片安放在白明胶包被的显微玻片上，在递增的乙醇系列中脱水，洁净并用Histomount介质封片(盖片，cover-slip)。
数据的量化和统计分析
应用光学分馏器(optical fractionator)计数神经元，这是一种不受参照物的体积影响，也不受所计数的元素(神经元)的大小影响的用于计数细胞的无偏差方法(unbiased method)。这一方法应用计算器辅助的图像分析系统来进行，所述系统由包含装备有计算器控制的自动镜台的Zeiss平面复消色差物镜(planapochromat objective)的Axiophot显微照相机(Zeiss，德国)、摄影机和Stereo Investigator软件(MicroBrightField，Williston，VT)组成。应用标准小鼠寰椎(Paxinos和Franklin，2004)作为解剖参照，通过在整个SN的程度上计数每一第五切片的SNpc上神经元的数目，从而进行细胞计数。
通过Students t检验评估每一实验组的统计分析。当p＜0.05时，认为差异是显著的。所有统计分析均应用GraphPad Prism软件进行。
结果
在正常组中，许多TH-免疫反应性(IR)神经元分布在黑质致密部，以及一些TH-IR神经元分散在黑质网状部(substantia nigra pars reticulata)。MPTP-盐水组显示出与正常组相比TH-IR神经元的显著减少。在克拉维酸类物质治疗组(腹膜内和管饲)中，TH-IR神经元显著地受到保护而免于MPTP诱导的TH-IR神经元损伤。图8示出了黑质致密部(SNpc)中酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学。与正常组相比，MPTP-盐水组的TH-阳性神经元的数目显著减少。在MPTP-克拉维酸类物质治疗组中，TH-阳性神经元的数目得以很好地保存。图9显示了克拉维酸类物质治疗对MPTP处理动物的黑质致密部(SNpc)神经元存活的作用。在MPTP处理组中，SNpc内TH-阳性神经元显著减少。在两个克拉维酸类物质治疗组(腹膜内和管饲)中，存在SNpc内TH-阳性神经元的显著保护，其中管饲治疗后细胞保护更大。在SNpc的AP-3.16侧部直至分开中部SNpc和侧部SNpc的第三颅神经根的最宽范围，两侧对称地计数TH阳性SNpc神经元。(*：与正常组相比，P值＜0.05；##：P值＜0.05，###：与仅有MPTP处理的组相比，P值＜0.001，ip腹膜内；ga，管饲)
实施例8：红藻氨酸盐动物模型
步骤
在红藻氨酸盐动物模型中测试了作为神经保护剂的克拉维酸类物质。将30只300-350克的雄性Sprague Dawley大鼠分成3组。在红藻氨酸盐处理之前一小时，以10μg/kg的IP剂量用克拉维酸类物质处理7只动物，而给剩余的动物给予盐水媒剂。以20mg/kg剂量IP给予红藻氨酸盐至7只克拉维酸类物质处理的动物和13只盐水媒剂处理的动物。在接下来的60分钟，观察动物的发作活动。红藻氨酸盐处理后60分钟，再次给予动物IP注射(10μg/kg)的克拉维酸类物质或盐水媒剂。在红藻氨酸盐处理中存活的动物在7天后处死，并检查它们大脑中的海马组织学改变。处死作为实验动物的相同重量和年龄的10只未处理对照动物，并将它们的海马形态作为用于比较的标准品。
组织处理和甲酚紫染色
在试验结束时，通过IP注射10mg/kg戊巴比妥钠来麻醉动物，之后在5分钟期间用100ml pH 7.4的PBS、随后用250ml在PBS中的4％多聚甲醛经心灌流。从颅中移除大脑，并通过浸入在相同的固定溶液中4h来后期固定，然后转移至在PBS中的30％蔗糖中。在蔗糖溶液中平衡后，应用冷冻切割术将冠状部分以40μm的厚度切至储存溶液中，并在染色之前在4℃储存。所有染色均在5个切片系列中的一个上进行。如下那样应用一般的神经元染色甲酚紫染色来自每一大脑的一个切片系列。将切片安放在白明胶包被的显微载玻片上，并且使其在室温下干燥过夜。然后通过在递减的乙醇系列(90％、80％、和70％乙醇)中浸泡5分钟、然后在蒸馏水中浸泡30分钟，从而水合载玻片。通过在甲酚紫溶液(在0.1M醋酸钠缓冲液中5％，pH 3.5)浸泡3分钟进行染色。在递增的乙醇系列(70％、80％、90％、95％和100％乙醇)中进行染色的区分(differentiation of thestain)和脱水，然后在二甲苯中清洁，并应用Histomount固定介质(mountingmedium)封片。
数据量化和统计分析
为评估克拉维酸类物质抗红藻氨酸盐诱导的神经元损伤的效果，应用装备有基于计算机的CCD相机(Multiscan，Fullerton，CA)的图像分析系统来测量神经元数目。在每只动物的5个切片中的海马的1mm直径内计数甲酚紫阳性神经元的数目。将甲酚紫阳性神经元数与对照组相比较。数据表示为平均值±SEM。通过单向ANOVA SPSS程序评估数据，并应用Duncan’s多重范围检验(multiple-range test)评估平均值。在P＜0.05即认为统计学差异。
结果
与仅给予盐水的对照相比，给予克拉维酸类物质的动物显示出更长的发病时间和轻微的发作活动性。红藻氨酸盐+盐水组的6只动物分别在红藻氨酸盐处理的24小时内死亡。但是，克拉维酸类物质+红藻氨酸盐组没有显示死亡。表15列表了发作率等级(Sperk等人，1983)。在红藻氨酸盐处理后60-120分钟测量发作率(seizure rate)。
给予克拉维酸类物质的动物显示出对红藻氨酸盐诱导的海马细胞死亡的显著神经保护效果。图11显示了克拉维酸类物质对红藻氨酸盐(KA)诱导的海马神经毒性的效果(影响，effect)。在KA处理大鼠(KA+盐水)中，CA3中的神经元数目显著减少。对KA处理大鼠的克拉维酸类物质治疗显示出在CA3区域的强神经保护效果。在红藻氨酸盐-盐水治疗组中，在红藻氨酸盐处理7天后，锥体细胞层(stratum pyramidale)中甲酚紫阳性CA3细胞显著减少。与正常组相比，这一组中锥体细胞层中甲酚紫阳性神经元为29.7％。在克拉维酸类物质治疗组中，88.7％的锥体神经元(pyramidal neuron)对甲酚紫呈阳性。图12显示了在正常、红藻氨酸盐+盐水、和红藻氨酸盐+克拉维酸类物质治疗组中，在CA3区域中的甲酚紫染色。与正常组相比，KA+盐水组显示出甲酚紫阳性神经元的显著减少。在克拉维酸类物质治疗组中，在CA3区的锥体细胞层中观察到大量的甲酚紫阳性神经元。每个柱表示平均值±S.E.M.(*：与对照组相比，P值＜0.05。#：与KA+盐水相比，P值＜0.05)。此外，与红藻氨酸盐-盐水处理的动物相比，克拉维酸类物质治疗的大鼠表现为具有正常的CA3中的神经元形态。
表15
 组   存活率(％)   发作率
 红藻氨酸盐+盐水   53.8(7/13)   4
 红藻氨酸盐+克拉维酸类物质   100(7/7)   0-1
 盐水   100(10/10)   0
在本说明书中举例说明和讨论的实施方式仅意在教导本领域技术人员本发明已知的最佳方式以制备和使用本发明。在本说明书中的任何内容不应被认为是限制本发明的范围。所有示出的实施例均是代表性的而非限制性的。如本领域技术人员根据以上的教导内容所理解的那样，可以对以上描述的本发明的实施方式进行修改或变化，而不会偏离本发明。因此，应该理解到，在权利要求和其等同替换的范围内，本发明可以按照与具体描述不同的方式进行实施。

Claims (19)

1.一种治疗神经变性疾病的方法，包括口服给予含有治疗有效量的克拉维酸类物质的稳定口服制剂；其中，所述克拉维酸类物质选自由克拉维酸、克拉维酸衍生物或克拉维酸的药用盐所构成的组。
2.一种提供神经保护的方法，包括口服给予含有治疗有效量的克拉维酸类物质的稳定口服制剂；
其中，所述克拉维酸类物质选自由克拉维酸、克拉维酸衍生物或克拉维酸的药用盐所构成的组。
3.一种预防神经元细胞丧失或死亡的方法，包括口服给予含有治疗有效量的克拉维酸类物质的稳定口服制剂；
其中，所述克拉维酸类物质选自由克拉维酸、克拉维酸衍生物或克拉维酸的药用盐所构成的组。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，神经保护包括预防由神经变性疾病引起的细胞丧失或细胞死亡。
5.根据权利要求1或4中一项所述的方法，其中，所述神经变性疾病选自由帕金森氏病、阿兹海默氏病和多发性硬化所构成的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述克拉维酸类物质是克拉维酸钾。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述口服制剂为片剂、胶囊、丸剂、锭剂、溶液、悬浮液、口含或舌下片剂、口服崩解片剂、薄膜或粉末的形式。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述制剂是在至少约4小时释放所述克拉维酸类物质的缓释组合物。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述制剂是在少于约0.5小时内释放所述克拉维酸类物质的即释组合物。
10.根据权利要求6的方法，其中，所述克拉维酸钾是克拉维酸钾粉末、或作为与二氧化硅或微晶纤维素的1∶1混合物的克拉维酸钾。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述制剂通过以下方法制备：混合所述克拉维酸类物质与至少一种赋形剂；对所述克拉维酸类物质和所述至少一种赋形剂的混合物进行造粒；以及对经造粒的所述克拉维酸类物质和所述至少一种赋形剂的混合物进行冻干。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述制剂以提供约0.001mg/kg/天至约1.0mg/kg/天的克拉维酸类物质的量给予。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述制剂以单次日剂量给予。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述制剂以多剂量给予。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，治疗包括减小发作或震颤的频率、发作时间或严重性。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，治疗包括减少记忆丧失。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述治疗包括减少神经元细胞死亡。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述制剂包括以下中的一种或多种：基质、填充剂、助流剂以及润滑剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述基质选自由MethocelK100LV Prem CR、Eudragit S100、Carbopol 971P、Carbopol 974P、A型甲基丙烯酸酯共聚物和B型甲基丙烯酸酯共聚物以及它们的混合物所构成的组；所述填充剂选自由无水乳糖、Avicel PH-112、AvicelPH-113、Isomalt、以及它们的混合物所构成的组；所述助流剂是Carbosil以及所述润滑剂是硬脂酸镁和滑石中的至少一种。
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