JP5621105B2 - 根管充填材 - Google Patents
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Description
歯内治療では根管形態の複雑性から、NiTi合金製ロータリーファイルが普及してきた。しかし、完璧な抜髄、根管拡大、及び根管充填は不可能に近い。そのため、抜髄は後に根尖性歯周炎を導き、結果として歯を失う可能性も多いに秘めている。
歯の寿命を高めるには歯髄をできるだけ保存する方法を開発する必要がある。そのためには、歯再生の3要素と考えられる1)形態形成因子(BMPs(骨形成因子)等)2)歯髄組織幹細胞、3)微小環境(足場、細胞外基質等)を駆使して、象牙質及び歯髄を再生させる新しいう蝕治療法の技術開発が進められている。
まず、非特許文献1に記載されているように、生体外細胞導入法又は遺伝子導入法として、歯髄幹細胞に生体外でBMP蛋白質の投与又はBMP遺伝子を導入し、三次元培養を行って分化した象牙芽細胞を露髄面上に移植し、早期且つ大量の象牙質の再生手法がある。
また、非特許文献2に記載されているように、上述の手法を実際臨床応用するため、免疫拒絶反応を起こさないヒト歯髄幹細胞を大量に創生する技術開発が進められており、幹細胞を多く含むside population(SP)細胞を分取し、その幹細胞の分子生物学的特徴の解析が行われている。
歯髄組織が偶発的露髄又は可逆性歯髄炎程度であれば、上述の象牙質の再生手法は有効であると考えられる。しかし、不可逆性歯髄炎で疼痛がある場合は、抜髄せざるを得ない。
これまで、ヒト歯根未完成歯の自家移植に関しては、移植後高頻度に歯髄の治癒が生じることが知られている。そして、石灰化組織による歯髄腔の閉鎖、歯根の成長及び根尖孔の閉鎖を伴い、歯根破折を防止できる。歯髄は壊死していても感染がなければ残った細胞外基質は血管及び細胞の侵入のためのscaffoldとして働く可能性がある。
また、移植時、根尖部付近の細胞は生存しており、移植後に歯冠部方向に遊走、増殖する可能性がある。
一方、イヌの歯根未完成歯では、抜髄をした後に移植しても同様に歯髄が再生される。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、徹底的な根管洗浄・消毒を行い、3種抗菌剤の貼薬後、セメント・象牙境まで血餅を満たしMineral trioxide aggregate(MTA)及びCavitで窩洞を完全封鎖することにより、歯髄が再生されるとの報告がある。
また、非特許文献3に記載されているように、イヌの健全歯根完成歯においても、抜歯後抜髄し、根尖部を切断した後、移植した場合には、血餅により歯髄再生がみられるといわれている。
しかしながら、根管内歯髄再生の報告は、根未完成歯についての報告が大半である。深いう蝕で歯髄炎を生じている場合又は根尖性歯周炎の歯根完成歯の場合における歯組織再生方法及び歯組織再生のための根管充填材の開発はなされていない。
特許文献1及び特許文献2には、人工物で形成されている根管充填材が記載されている。しかし、これらの根管充填材は、根管充填後に、根管充填材が剥離又は断裂する可能性がある。更に、これらの根管充填材は、数年後には根尖性歯周炎が発生する可能性もある。
また、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、前記歯髄幹細胞の含有率は、1×103セル/μl以上1×106セル/μl以下であることも可能である。
図1Bは、細胞外基質に歯髄幹細胞を含む細胞を付着させて形成される根管充填材を説明する模式図である。
図1Cは、対象となる歯髄炎の説明図である。
図1Dは、抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図である。
図1Eは、根管充填材を注入するところを説明する模式図である。
図1Fは、スポンゼル(ゼラチン)及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
図1Gは、抜歯窩に再移植するところを説明する模式図である。
図1Hは、歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。
図1Iは、形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図である。
図1Jは、象牙質再生を示す模式図である。
図1Kは、細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性歯周炎の模式図である。
図2Aは、歯髄幹細胞を含む細胞を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に遊走因子を付着させている根管充填材を説明する模式図である。
図2Bは、根管充填材を注入するところを説明する模式図である。
図2Cは、抜歯窩に再移植するところを説明する模式図である。
図3は、SP細胞のフローサイトメトリー分析を説明する図である。
図4は、CD31及びCD146抗体でラベルしてSP細胞を分画する図である。
図5Aは、0.2%BSAのコントロールにおいて、CD31−;CD146−SP細胞の増殖活性を説明する図である。
図5Bは、50ng/ml VEGFにおいて、CD31−;CD146−SP細胞の増殖活性を説明する図である。
図5Cは、50ng/ml bFGFにおいて、CD31−;CD146−SP細胞の増殖活性を説明する図である。
図5Dは、50ng/ml EGFにおいて、CD31−;CD146−SP細胞の増殖活性を説明する図である。
図5Eは、50ng/ml SDF1において、CD31−;CD146−SP細胞の増殖活性を説明する図である。
図5Fは、50ng/ml IGF1において、CD31−;CD146−SP細胞の増殖活性を説明する図である。
図6は、CD31−;CD146−SP細胞の遊走能を、VEGF濃度を変化させた場合に示す図である。
図7は、CD31−;CD146−SP細胞の遊走能を、遊走因子を変化させた場合に示す図である。
図8は、HUVEC(血管内皮細胞)に対する歯髄CD31−;CD146−SP細胞の培養上清の増殖活性を説明する図である。
図9は、100nM staurosporineによりアポトーシスを生じさせたHUVEC(血管内皮細胞)を用いたフローサイトメトリーによる壊死細胞及びアポトーシス細胞の割合の測定を説明する図である。
図10は、自家歯髄CD31−;CD146−SP細胞をイヌ生活歯髄切断面上に移植して14日後を説明する図である。
図11は、自家歯髄CD31+;CD146−SP細胞をイヌ生活歯髄切断面上に移植して14日後を説明する図である。
図12は、細胞を含まない、I型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合である混合コラーゲンをイヌ生活歯髄切断面上に移植して14日後を説明する図である。
図13は、CD31−;CD146−SP細胞を移植して14日後を説明する拡大図である。
図14は、CD31+;CD146−SP細胞を移植して14日後を説明する拡大図である。
図15は、CD31−;CD146−SP細胞が再生歯髄の底部に見られるところを説明する図である。
図16は、CD31+;CD146−SP細胞が窩洞全体に分散して存在するところを説明する図である。
図17は、血管内皮細胞をCD146抗体で染色したものであり、DiIラベルされたCD31−;CD146−SP細胞が新生血管に隣接して存在することを説明する図である。
図18は、歯冠部上部のリン酸セメントに接する部分で象牙芽細胞の分化及び細管象牙質形成が見られるところを説明する図である。
図19は、neurofilament抗体で染色したものであり、再生された歯髄中に、切断された歯根部歯髄の神経から伸びる神経軸索が示されているところを説明する図である。
図20は、残存した歯髄中に、切断され修復された歯根部歯髄の神経が示されているところを説明する図である。
図21は、I型及びIII型コラーゲンにSDF1及び自家CD31−;CD146−SP細胞を吸着させて、抜髄後の根管内に注入した14日後を説明する図であり、根管内のほぼ全部が歯髄組織で再生されている。
図22は、I型及びIII型コラーゲンにSDF1を吸着させて、抜髄後の根管内に注入した14日後を説明する図であり、根管内の根尖側のごく一部のみ歯髄組織で再生されている。
図23は、I型及びIII型コラーゲンにCD31−;CD146−SP細胞のみを吸着させて抜髄後の根管内に注入した14日後を説明する図であり、ごくわずかしか歯髄組織は再生されていない。
図24は、I型及びIII型コラーゲンのみを注入した14日後を説明する図であり、ほとんど歯髄組織は再生されていない。
図25は、I型及びIII型コラーゲンにSDF1及びCD31−;CD146−SP細胞を注入した14日後の根尖側の毛細血管の高倍像を説明する図である。
図26は、I型及びIII型コラーゲンにSDF1及びCD31−;CD146−SP細胞を注入した14日後の歯冠側の毛細血管の高倍像を説明する図である。
図27は、BS−1 lectinによる血管内皮細胞染色を説明する図である。
図28は、neurofilament免疫染色よる神経軸索を説明する図である。
図29は、I型及びIII型コラーゲンにSDF1及びCD105+細胞を注入した14日後を説明する図であり、根管内のほぼ全部が歯髄組織で再生されている。
図30は、3代目ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞のフローサイトメトリーを説明する図である。
図31は、3代目ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞の血管誘導を説明する図である。
図32は、3代目ヒト歯髄CD105+細胞の血管誘導を説明する図である。
図33は、3代目ヒト歯髄CD150+細胞の血管誘導を説明する図である。
図34は、3代目ヒトtotal歯髄細胞の場合を説明する図であり、血管はほとんど誘導されない。
図35は、ヒト歯髄CD24+細胞の神経誘導を説明する図である。
図36は、3代目ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞移植のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復がみられる。
図37は、3代目ヒト歯髄CD105+細胞移植の場合のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復がみられる。
図38は、PBS注入コントロールの場合のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復がみられない。
図39は、ヒト歯髄total歯髄細胞移植のレーザードップラー解析を説明する図であり、血流の回復はあまりみられない。
図40は、ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞、ヒト歯髄CD105細胞、ヒト歯髄total歯髄細胞移植のレーザードップラー測定結果の統計学的解析を説明する図である。
図41は、ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞移植14日後の、BS−1 lectinにて血管内皮細胞を染色した結果を説明する図である。
図42は、PBS注入コントロール14日後の、BS−1 lectinにて血管内皮細胞を染色した結果を説明する図である。
110:根尖性歯周炎
200:根管充填材
210:細胞外基質
220:歯髄幹細胞を含む細胞
230:遊走因子
300:抜歯窩
400:血管
500:象牙質
610:スポンゼル(ゼラチン)
620:レジン
630:形態形成因子
(実施形態1)
本実施形態に係る発明は、根管内の歯組織を再生する歯組織再生方法において、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞と、歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有する根管充填材を注入することを特徴とする。再生する歯組織は、例えば根管内の血管、神経、歯髄、象牙質等である。本実施形態に係る発明は、抜歯後又は感染根管の根管拡大清掃後、抜髄及び消毒し、根尖部を切断して開口して根管充填材を移植する。本実施形態に係る発明では、無菌化され空洞となった根管内に、人工の充填材又は血餅を移植するのではなく、歯髄組織を模倣した、生体親和性に優れ、為害性及び免疫原性のないscaffoldに歯髄幹細胞を含有する細胞を付着させて充填する。根管充填材は、根尖部の1/4〜2/5に充填するのが望ましく、より望ましくは根尖部の1/3に充填する。
以下、図1A〜図1Kを参照しながら、実施形態1に係る歯組織再生方法を説明する。図1Aに示すように、細胞外基質210を用意する。細胞外基質210とは、いわゆる(scaffold)スキャフォールドであり、細胞を定着させる足場である。細胞外基質210の形状は、根管に充填されやすいように、円柱形状又は略円錐形状が望ましい。なお細胞外基質210がゲル状の場合は形状は不定形である。
細胞外基質210は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、PLA(ポリ乳酸)、PLGA(乳酸グリコール酸共重合体)、PEG(ポリエチレングリコール)、PGA(ポリグリコール酸)、PDLLA(ポリ−DL−乳酸)、PCL(ポリカプロラクトン)、ハイドロキシアパタイト、β−TCP、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。なお、プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖(グリコサミノグリカン)が共有結合した複合糖質の一種である。また、細胞外基質210は、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が1nm〜1000nmのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は80%〜99.99%とすることが好ましい。
細胞外基質210として使用されるコラーゲンは、I型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合である混合コラーゲンを用いることが好ましい。I型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。III型コラーゲンは、コラーゲン線維とは別の、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞等の足場を作る。
上述の混合コラーゲンにおける、III型コラーゲンの割合は30重量%以上50重量%以下とすることが好ましい。III型コラーゲンの割合が50重量%よりも多くなると、混合コラーゲンが固化できないおそれがあるからである。一方、III型コラーゲンの割合が30重量%よりも少なくなると、I型コラーゲンの割合が多くなり、後述するような血管新生が起こるのではなく、象牙質が再生される可能性があるからである。特に好ましくはI型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合割合は1:1である。
図1Bに示すように、根管充填材200は、細胞外基質210に歯髄幹細胞を含む細胞220を付着させて形成される。歯髄幹細胞を含む細胞220は、根管充填材200の根管の根尖側に、付着される。根管充填材200の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで60μリットルとし、ピペットマンのチップ等に30μリットル〜40μリットルの混合コラーゲン(I型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合割合は1:1)を吸い込み、次に歯髄幹細胞を含む細胞を混合させた混合コラーゲンを20μリットル〜30μリットル吸い込む。ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。根管充填材200内部に気泡が発生すると、発生した気泡が細胞の遊走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましく、例えばチップの下内径が0.5〜0.7mmのものが使用でき、例えばQSP社のH−010−96RSマイクロキャピラリーチップを使用できる。
本実施形態に係る歯組織再生方法では、図1Cに示すように例えば歯髄炎が発生している対象となる歯100について、抜歯を行う。そして、図1Dに示されるように、対象となる歯100に対して抜髄を行う。対象となる歯100とは、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯をいう。抜髄とは、歯牙の内部に存在する歯髄を取り去る行為である。
抜髄後は、対象となる歯100の根管を拡大することで、根尖部の根管の大きさを所定の太さにすることが望ましい。なぜならば、後述するように、抜髄した根管に根管充填材を充填する際に、根管を拡大しておくほうが根管充填材を充填しやすいからであり、また根尖歯周組織から血管及び神経が進入しやすいからである。
例えば、図1Dに示されるように、根尖部の根管の太さdは、根管の直径において0.7mm以上1.5mm以下とすることが望ましい。根管の太さdが0.7mmよりも小さいと、血管及び神経が根尖歯周組織から進入しにくく、また根管充填材の充填が難しいおそれがあるからであり、一方、根管の太さdが1.5mmよりも大きいと、対象となる歯100に対して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。
対象となる歯100を抜髄した後は、図1Eに示されるように、根管の根尖側にピンセット等により根管充填材200を注入する。根管充填材200は、例えば歯髄SP細胞のように生物学的材質を含有するので、生物学的根管充填材とすることもできる。なお、細胞外基質210がゲル状の場合はピンセット等でつまむことができないので、ピペットマン、注射等により注入することになる。
歯髄幹細胞を含む細胞は、歯組織再生の処置を受ける対象動物自身から抽出した自家細胞でもよいし、また、歯組織再生の処置を受ける対象動物以外の動物から抽出した同種細胞でもよい。
歯髄幹細胞は、永久歯又は乳歯由来の歯髄幹細胞である。特に、ヒト乳歯由来の歯髄細胞には、CD105+が約50%と多く含まれ、(ヒト永久歯由来CD31−SP細胞ではCD105+は約20%)、永久歯CD105+細胞又はSP細胞とほぼ同様に、乳歯由来の歯髄細胞は試験管内血管誘導、下肢虚血部位での血流回復、血管新生促進効果を示す。また、CD150+は乳歯歯髄細胞に0.2%含まれ、永久歯CD31−SP細胞の含有量0.1%より多い。さらには、乳歯歯髄細胞は分取せずとも、そのまま抜髄後血管新生及び歯髄再生に使うことも可能である。そして、例えば、下肢虚血部位における血管新生では、ヒト乳歯由来の歯髄細胞は、ヒト永久歯由来の歯髄細胞と比較して、2.2倍の血管新生能を有する。
歯髄幹細胞を含む細胞は、歯髄SP細胞、CD31陰性かつCD146陰性細胞、CD24陽性細胞、CD105陽性細胞、及び、CD150陽性細胞のうち少なくとも何れか一つを含むことが好ましい。例えばヒト歯髄SP細胞は、血管新生能等の組織再生能力が高い。具体的には、下肢虚血部位における血管新生では、ヒト歯髄SP細胞はヒト乳歯歯髄細胞と比較して1.2倍の血管新生能を有する。また、ヒト歯髄SP細胞はヒト永久歯歯髄細胞と比較して2.6倍の血管新生能を有する。さらに、PBSコントロールと比較して5.7倍の血管新生能を有する。
ここで、根尖とは、対象となる歯100の歯槽骨に結合される端部(歯根の先端部分)をいう。
また、SP細胞とは、Goodelら(J.Exp.Med.vol.183,1996年)によって発見された未分化細胞であり、フローサイトメトリーでの解析でHoechst33342という蛍光色素を細胞に取り込ませてUVで励起すると405nm及び600nmに蛍光を発する通常の細胞(未分化細胞以外の細胞)からサイトグラム上は異なった位置(“Hoechst Blue弱陽性かつHoechst Red弱陽性”)に出現する細胞集団のことである。
歯髄SP細胞は、CD31陰性かつCD146陰性、CD24陽性、CD105陽性、又は、CD150陽性の何れかとすることが好ましい。
根管充填材における歯髄幹細胞の含有率は、1×103セル/μl以上1×106セル/μl以下とすることが好ましい。歯髄幹細胞の含有率が、1×103セル/μlよりも少ないと、根管内の歯組織の再生が不十分なものとなる可能性があるからである。一方、歯髄幹細胞の含有率が、1×106セル/μlよりも多いと、対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があるからである。
根管の根尖側に根管充填材を注入した後は、図1Fに示されるように、根管充填材200の上部にゼラチン610を注入し、レジン620により蓋をする。その後は図1Gに示されるように、抜歯をした歯を抜歯窩300に再移植する。
これにより、根管内の歯組織が再生される。再生される歯組織は、図1Hに示されるように、例えば根管内の血管400及び歯髄組織である。その後は、レジン620を一度除去して、BMPs等の形態形成因子630又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、図1Iに示すように、レジン620により蓋をする。形態形成因子630又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布したことにより、図1Jに示されるように象牙質500も再生される。もっともこれに限定されず神経再生も促進される。
なお、上述の実施形態1では、対象となる歯100は、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であったが、これに限定されず、対象となる歯100には神経機能が低下して咬合感覚が弱くなっている歯も含まれる。係る場合は、抜髄後に、根管充填材を注入することにより、歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることができる。また、図1Kに示すように、対象となる歯100には、細菌感染が根尖歯周組織まで波及している歯(細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる歯)も含まれる。このような歯は根尖性歯周炎110を伴うことが多い。感染根管の根管拡大清掃後に根管充填材200を注入する。ここで感染根管とは、細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質に及んでいる場合の根管をいい、根管拡大清掃後とは、感染根管における細菌を除去した後をいう。
(実施形態2)
以下、図2A〜図2Cを参照しながら、実施形態2に係る歯組織再生方法を説明する。実施形態2に係る根管充填材200の製造方法の一具体例としては、まず、トータルで60μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させた混合コラーゲン(I型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合割合は1:1)を30μリットル〜40μリットルを吸い込み、次に歯髄幹細胞を含む細胞を混合させた混合コラーゲンを20μリットル〜30μリットル吸い込む。実施形態2においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図2Aに示す根管充填材200が製造される。このように、根管充填材200は、歯髄幹細胞を含む細胞220を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側(例えば根管の上部1/2〜2/3)に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくとも何れか一つを含む遊走因子230を付着させている。歯髄幹細胞を含む細胞220を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子230を付着させる理由は、歯髄幹細胞を含む細胞220を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している歯髄幹細胞を含む細胞が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図2Aに示すように、根管充填材200の根管の歯冠側に細胞外基質210を残しておくことも可能である。
そして、実施形態1において図1Dに示したように、対象となる歯100に対して抜髄及び抜髄後の根管拡大処置を行う。その後は、図2Bに示すように、根管の根尖側に根管充填材200を注入する。
細胞遊走因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。そして、神経栄養因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。
細胞遊走因子は、SDF1、VEGF、GCSF、MMP3、Slit及びGMCSFのうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。特に、MMP3は、細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
細胞増殖因子は、bFGF及びPDGFの少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
神経栄養因子は、GDNF、BDNF及びNGFのうち少なくとも何れか一つを用いることが好ましい。
遊走因子を付着させた細胞外基質における、遊走因子の含有率は、0.1ng/μl以上500ng/μl以下とすることが好ましい。遊走因子の含有率が0.1ng/μlよりも少ないと、遊走の程度が少なくなる可能性がありうるからである。一方、遊走因子の含有率が500ng/μlよりも多いと、対象となる歯100に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があり得るからである。
実施形態1と同様に、細胞外基質は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、PLA、PLGA、PEG、PGA、PDLLA、PCL、ハイドロキシアパタイト、β−TCP、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくとも何れか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。
コラーゲンは、I型コラーゲンとIII型コラーゲンとの混合である混合コラーゲンであることが好ましい。さらに、混合コラーゲンにおけるIII型コラーゲンの割合は30重量%以上50重量%以下とすることが好ましい。
その後は、実施形態1における図1Fと同様にゼラチン610を注入してレジン620にて蓋をして、図2Cに示すように、抜歯をした歯を抜歯窩300に再移植する。その後は、図1Hに示したように根管内の血管400及び歯髄組織が再生するが、実施形態1よりも再生率が向上している。そして、図1Iに示したようにBMPs等の形態形成因子630又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、図1Jに示したように象牙質再生を行うが、実施形態1よりも再生率が向上している。
なお、上述の実施形態2においても、対象となる歯100に対して感染根管の根管拡大清掃後に根管充填材200を注入することもできる。
ブタ歯胚を摘出後、37℃で1時間半、コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離した後、2%血清を含むDMEM中に1×106cells/mlで細胞を分散させ、5μg/ml Hoechst33342でラベルした。ついで、CD31及びCD146の抗体を用いて4℃で30分ラベル後、フローサイトメトリーを行った。図3に、SP細胞のフローサイトメトリーの分析結果を示す。ブタ歯髄由来のSP細胞は全体の0.2%を占めた。
図4に示されるように、歯髄由来CD31−;CD146−,CD31+;CD146−及びCD31+;CD146+ SP細胞の3分画を得た。CD31及びCD146抗体でラベルしてSP細胞をさらに分画すると、CD31−;CD146−SP細胞,CD31+;CD146−SP細胞,CD31+;CD146+SP細胞は、それぞれ、50%、48%、2%を占めた。EGF及びIGF−Iが添加された10%ウシ胎児血清を含むEBM2培地中で培養した。
表1に示すように、フローサイトメトリーにて、CD31−;CD146−SP細胞はCD34+、VEGFR2/FLK1+が70〜90%ぐらいをしめており、CD11b、CD14は0%であった。Real−time RT−PCRでは、CD11b、CD14、CD45mRNAは発現しておらず、造血系の幹細胞とは異なることが明らかとなった。
Matrigel上で血管誘導を行うとCD31−;CD146−SP細胞は24時間後には網目状の管腔構造を呈した。CD31+SP細胞は明らかな管腔構造を形成しなかった。さらに10日後にCD31−;CD146−SP細胞はMatrigel内部に血管様構造を形成し、血管様構造物周囲の細胞はCEACAM1、CD146及びoccludin mRNAの内皮細胞の分化マーカーを発現していた。またVEGF、bFGF存在下で培養すると10日目にはCD31、vWF、VE−cadherinの内皮細胞の分化マーカーを発現するようになった。さらにCD31−;CD146−SP細胞は、内皮細胞の機能的な性質であるヒスタミンによるvWFの放出やac−LDLの取り込み能を示した。また、CD31−;CD146−SP細胞は、多分化能を有し、試験管内で軟骨、脂肪、神経、象牙芽細胞に分化誘導された。
〈遊走能、増殖能〉
試験管内で、CD31−;CD146−SP細胞は他の2画分と比較してbFGF及びEGF刺激により高い増殖能を示した。また、CD31−;CD146−SP細胞は他の2画分と比較してVEGF及びSDF1により誘導され2倍高い遊走能を示した。
図5Aは0.2%BSAのコントロールであり、図5Bは50ng/mlVEGFであり、図5Cは50ng/ml bFGFであり、図5Dは50ng/ml EGFであり、図5Eは50ng/ml SDF1であり、図5Fは50ng/ml IGF1である。Tetra−color one(登録商標)を添加して、0、12、24、36、48、72時間後、細胞数を450nmで測定した。CD31−;CD146−SP細胞は他の画分と比較して、72時間ではbFGFあるいはEGFで高い増殖活性があった。データは4サンプルの平均値プラスマイナスSDで示す(*P<0.01)。実験は3回繰り返し、典型例を示した。
図6に示すように、24wellの培地にVEGF−A、0、5、10、100ng/mlを添加し、5×104個の細胞をPET−membraneインサートに播種し、膜を通過した細胞を24時間後にカウントした。CD31−;CD146−SP細胞は遊走能が高く、濃度依存性に遊走能が増加した。4サンプルの平均値プラスマイナスSDで示す(*P<0.01)。実験は3回繰り返し、典型例を示した。
図7に示すように、VEGF−A、SDF1及びGCSF添加による遊走能の変化を観察した。SDF1及びVEGF−AはCD31−;CD146−SP細胞の遊走を促進させることが判明した。データは4サンプルの平均値プラスマイナスSDで示す(*P<0.01、**P<0.001)。実験は3回繰り返し、典型例を示した。
このように、血管内皮細胞(HUVEC)に対して、CD31−;CD146−SP細胞の上清画分を試験管内で48時間作用させるとMMP3あるいはVEGFを50ng/mlで作用させた場合とほぼ同様の増殖活性がみられた。
また、CD31−;CD146−SP細胞の上清画分は血管内皮細胞に対してMMP3あるいはGM−CSFに相当するぐらいのアポトーシス抑制効果がみられた。
図8は、HUVECに対する歯髄CD31−;CD146−SP細胞の培養上清の増殖活性を示すものである。2、12、24、36、48時間後における、MMP3、VEGF−A、G−CSF、GM−CSF及びCD31+;CD146−SP細胞上清との比較が示される。36及び48時間ではCD31−;CD146−SP細胞上清では他のサイトカインと同様に増殖活性があり、CD31+;CD146−SP細胞の上清に比べて有意に高い活性が見られた(#P<0.01) **P<0.01、*P<0.05 vs control。
図9は、100nM staurosporineによりアポトーシスを生じさせたHUVECを用いたフローサイトメトリーによる壊死細胞及びアポトーシス細胞の割合の測定したものである。歯髄CD31−;CD146−SP細胞の培養上清は、MMP3、VEGF−A、G−CSF、GM−CSFと同様に高い抗アポトーシス効果を有することが理解され、CD31+;CD146−SP細胞上清と比較して有意に高い抗アポトーシス効果を有することがわかった(#P<0.01)。これらの結果より、CD31−;CD146−SP細胞は血管新生を促進するのに適した細胞であることが明らかとなった。
〈マウス下肢虚血モデルでの血管新生〉
SCID(Sevefe Combined ImmunoDeficiency)マウスの下肢虚血モデルを作製し、CD31−;CD146−SP細胞を下肢虚血部位に移植すると、1週間後には血流が回復し、CD31+;CD146−SP細胞移植群と比較して、新生血管形成が約13倍に促進された。
〈イヌ生活歯髄切断モデルでの血管新生、神経再生、歯髄再生〉
イヌ歯髄組織よりCD31−;CD146−SP細胞をブタと同様に分取すると、SP細胞の約10%を占めていた。この歯髄由来CD31−;CD146−SP細胞1×106個をI型コラーゲン及びIII型コラーゲンを添加して三次元培養を行った。24時間後にイヌの生活歯髄切断面上に自家移植し、上部はスポンゼル及び燐酸セメントで充填し、さらに化学重合レジンで封鎖した。コントロールとしてCD31+SP細胞あるいはI型コラーゲン及びIII型コラーゲンのみを用いた。14日後、CD31−;CD146−SP細胞移植群では生活歯髄切断面上に歯髄が再生され、新生血管が連続して、図10及び図13に示すように、再生歯髄中にみられた。図10及び図13は、I型及びIII型コラーゲン中に1日三次元培養して自家移植後14日目のもので、CD31−;CD146−SP細胞を移植したものである。染色はH−E染色を使用した。図中において矢印は歯髄切断面を示す。図10及び図13に示すように、歯髄切断面上の窩洞内は再生歯髄組織に満たされており、リン酸セメントを充填した部位近くまで毛細血管が伸張していることが理解される。
さらに、図15及び図17に示されるように、移植細胞は新生血管周囲に遊走、定着していた。図15では、CD31−;CD146−SP細胞は再生歯髄の底部に見られることが理解される。また、図17は、血管内皮細胞をCD146で染色したものであり、DiIラベルされたCD31−;CD146−SP細胞は再生歯髄組織の新生血管周囲に存在することが理解される。なお、図17において矢印はCD31−;CD146−SP細胞の位置を示し、記号vは、新生血管を示す。図中において点線は新生組織境界部を示す。
一方、図11、図14、図16は、CD31+;CD146−SP細胞を移植したものである。図11、図14及び図16に示されるように、CD31+;CD146−SP細胞移植群では移植細胞の定着は見られたが、新生血管形成がみられず、細胞の遊走もみられなかった。図11及び図14では、窩洞内に移植組織の定着は見られるが、毛細血管はほとんど見られないことが示される。図16では、CD31+;CD146−SP細胞は窩洞全体に分散して存在することが示されている。矢印は歯髄切断面である。白線は象牙質壁を示す。点線は新生組織境界部を示す。
次に、図12は、I型コラーゲン及びIII型コラーゲンのみを移植した標本である。図12に示されるように、生活歯髄切断面上に全く組織はみられなかった。
図18に示すように、28日後では、歯冠部上部のリン酸セメントに接する部分で、象牙芽細胞の分化及び細管象牙質形成がみられた。図18において、矢印は分化した象牙芽細胞の突起を示す。
図19に示されるように、切断された歯根部歯髄の神経から伸びる神経軸索がみられた。図20に示されるように、残存した歯根部歯髄中に存在する、切断され修復された神経が示された。なお、図19及び図20はneurofilament免疫染色したものである。
イヌ歯髄組織よりCD31−;CD146−SP細胞をブタと同様に分取した。また、CD105+細胞を分取した。イヌ上顎前歯を抜去後、歯髄を除去して、培地中で#80まで拡大し、根尖部の根管の太さを0.8mm以上にした。抜去後30分以内に1×106個のCD31−;CD146−SP細胞をI型コラーゲン及びIII型コラーゲン10μlに混合し、根管の根尖側1/3に注入した。さらに、根管の歯冠部2/3にSDF1(200ng)を添加したI型コラーゲン及びIII型コラーゲンを20μl充填した。30分以内にイヌの抜歯窩300に再移植し、上部は燐酸セメントならびに化学重合レジンで封鎖した。14日後、抜歯し、パラフィン標本を作製した。
図21、図25、図26、図27、図28は、I型及びIII型コラーゲンにSDF1(200ng)及びCD31−;CD146−SP細胞を注入したものである。CD31−;CD146−SP細胞及びSDF1両方を根管充填材として用いた場合、図21に示されるように、14日後に根管内すべてが新生歯髄組織で満たされていた。図21はH−E染色したものである。その新生歯髄組織には、図25に示されるように根尖側、及び、図26に示されるように歯冠側とも新生毛細血管がみられ、図28に示されるように再生された神経が見られた。図25及び図26において、記号vは毛細血管を示す。図27はBS−1 lectinによる血管内皮細胞染色を示すものである。図28はneurofilament免疫染色したものである。
一方、SDF1あるいはCD31−;CD146−SP細胞のどちらか一方では、根管内は根尖部1/5〜1/4しか新生歯髄組織はみられなかった。図22は、I型及びIII型コラーゲンにSDF1(200ng)を注入したものである。図23は、I型及びIII型コラーゲンにCD31−;CD146−SP細胞を注入したものである。さらに、図24に示す場合のように、I型コラーゲン及びIII型コラーゲンのみでは、ほとんど新生歯髄組織はみられなかった。
CD105+細胞及びSDF1両方を根管充填材として用いた場合、図29に示されるように、14日後に根管内が新生歯髄組織で満たされていた。
ヒト歯髄を摘出後、37℃で1時間コラーゲナーゼで酵素消化して歯髄細胞を分離後、2%血清を含むDMEM中に1×106cells/mlで細胞を分散させ、5μg/ml Hoechst33342でラベルしてさらにCD31抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、歯髄CD31−;CD146−SP細胞を分取した。一方、歯髄細胞を分離後、CD105抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、歯髄CD105+細胞を分取した。これらの細胞をEGF及びIGF−Iが添加された10%ウシ胎児血清を含むEBM2培地中で培養するとブタ歯髄由来のものと同等(約10%)の頻度で細胞はdishに付着し増幅した。この3代目のCD31−;CD146−SP細胞及び歯髄CD105+細胞をさらに細胞表面マーカーを用いてフローサイトメトリーを行い細胞の特徴を調べたところ、幹細胞のマーカーCD44はどちらもほぼ陽性であり、CD90はそれぞれほぼ陽性及び30%陽性であった。図30に、ヒトCD31−;CD146−SP細胞のフローサイトメトリーを示す。表4は、ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞とヒト歯髄CD105+SP細胞、ヒトtotal歯髄細胞、ヒトtotal乳歯細胞及びブタ歯髄CD31−;CD146−SP細胞の比較を示すものである。血管内皮細胞あるいは血管平滑筋細胞のマーカーCD146はヒトCD31−SP細胞は陰性、ヒトCD105+細胞はほぼ陰性であった。骨髄由来のangioblast及び末梢血中の血管内皮前駆細胞で陽性といわれるCD133は陰性であり、ブタ歯髄由来のCD31−;CD146−SP細胞と同様であったが、CD134はブタと異なり陰性であった。
また、同様にヒト歯髄CD105+細胞でも実験を行った結果、図32に示すようにヒト歯髄CD105+細胞でも管腔構造を形成した。
また、同様にヒト歯髄CD150+細胞でも実験を行った結果、図33に示すようにヒト歯髄CD150+細胞でも管腔構造を形成した。
同様に分取していない3代目のヒトtotal歯髄細胞でも実験を行った結果、図34に示すように、分取していない3代目のヒトtotal歯髄細胞では明らかな管腔構造を形成しなかった。
一方、ヒト歯髄CD24+細胞で実験を行った結果、図35に示すように、ヒト歯髄CD24+細胞は試験管内で容易に神経に分化した。
図36は、下肢虚血部位に3代目ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞を移植したものである。図37は、下肢虚血部位に3代目ヒト歯髄CD105+細胞を移植したものである。図38は、下肢虚血部位にPBSコントロールを注入したものである。図39は、下肢虚血部位に3代目のヒト歯髄total歯髄細胞を移植したものである。図36、図37、図38、図39はレーザードップラー解析の結果であり、図40はレーザードップラー解析の統計学的有意差を示すものである。図36、図37、図38に示すように、下肢虚血部位にヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞若しくはヒト歯髄CD105+細胞を移植すると、PBSを注入したコントロールと比べ、劇的な血流回復がみられた。図39に示すように、3代目のヒトtotal歯髄細胞ではやや血流回復がみられた。
下肢虚血部位の連続凍結切片を作製し、BS−1 lectinにて血管内皮細胞を染色し、新生血管密度を測定した。図41は、ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞移植の場合のBS−1 lectinにて血管内皮細胞を染色した結果である。図42は、PBS注入コントロールの場合のBS−1 lectinにて血管内皮細胞を染色した結果である。図41及び図42に示すように、ヒト歯髄CD31−;CD146−SP細胞では、PBS注入コントロールに比べて大幅に血管新生を促進していることが明らかとなった。
以上の結果より、ヒト歯髄由来のCD31−;CD146−SP細胞及びCD105+細胞は、イヌ及びブタと同様に、血管再生及び歯髄再生に有効である。
Claims (2)
- 歯髄幹細胞を含む細胞と、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有して、抜髄後の根管内に充填される根管充填材であって、
前記歯髄幹細胞は、CD31陰性かつCD146陰性SP細胞、又は、CD105陽性細胞であり、
前記細胞外基質が、コラーゲン、又は、ゼラチンであり、
かつ、SDF1が前記細胞外基質の少なくとも歯冠側に付着させてあることを特徴とする根管充填材。 - 前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質における、前記歯髄幹細胞の含有率は、1×103セル/μl以上1×106セル/μl以下であることを特徴とする請求項1記載の根管充填材。
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