CN105331578A - 促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用 - Google Patents

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陈莉莉
伍妍
黄芳
周鑫
余少玲
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Abstract

本发明公开了促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用，包括采集健康的牙齿、牙髓分离、牙髓干细胞DPSC培养、传代培养、缺氧处理，缺氧处理后进行RealTime-PCR和Western？Blot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。本发明通过对原代培养DPSC进行缺氧预处理，有效提高其成骨及成血管基因的表达效应，能够显著提高成体干细胞移植修复根尖周炎骨缺损的疗效。

Description

促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用。
背景技术
干细胞(StemCells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，是原始且未特化的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括骨髓、脐带、脐带血、牙齿与脂肪。
2000年首次发现了牙髓干细胞，Gronthos等发现在离体的乳牙和智齿中都存在牙髓干细胞。这是一类具有高增殖能力、高度自我更新能力、多项分化能力的细胞。已有研究利用该细胞成功地构建牙髓、牙本质以及牙齿组织。牙髓干细胞(dentalpulpstemcell，DPSC)与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。Gronthos等对牙髓干细胞的克隆形成率进行了研究，与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)比较后发现：牙齿来源的DPSC的克隆形成率明显高于骨髓来源的BMSC，这就表明DPSC具有较BMSC更高的增生能力和自我更新能力。Miura等发现：从1颗脱落前牙取材的每12-20个细胞就可以形成黏附克隆集落，这是间质干细胞增殖的典型表现。进一步的实验结果表明：与BMSC和DPSC相比较，SHED有更高的增殖能力。DPSC在不同诱导剂的作用下，可分化为成牙本质细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经样细胞等多种细胞。研究人员主要集中研究牙髓干细胞的体内外成骨的潜能，如Cordeiro等利用牙髓干细胞与生物可降解支架和人牙齿切片复合移植于免疫缺陷小鼠，14～28d后将移植物进行免疫组织化学的检查，结果发现牙本质涎蛋白表达阳性，推断牙髓干细胞在体内能分化为成牙本质样细胞。在成脂、成软骨和成神经诱导方面均有研究证实牙髓干细胞具有多向分化的潜能，为其在体内植入牙髓干细胞使受损或衰退的组织、器官改善或恢复功能提供了理论依据。
目前公开的各类牙髓干细胞制备方法虽均能获得牙髓干细胞，但都不符合临床应用的标准，本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现牙髓干细胞的临床标准产品。
发明内容
针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用。
为实现上述目的，本发明提供促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，该方法包括：
步骤一、选取临床上8～14岁因正畸治疗需要拔除的健康、完整的前磨牙，拔出后立即放入预冷的α-MEM培养液中保存30分钟，α-MEM培养液含2％双抗；
步骤二、在无菌条件下劈开牙冠及牙根，用无菌镊子和探针取出牙髓组织，放在事先准备好的无菌EP管中，用含2％双抗的PBS润洗牙髓组织3遍后，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成0.5～1.0mm3的小块；
步骤三、往处理后的牙髓组织块中加入配好的含1％Ⅰ型胶原酶的消化液，来回颠倒EP管，使组织块充分浸到消化液中，将EP管放37℃恒温箱中消化3小时，其中每隔半小时颠倒EP管一次；
步骤四、用同等体积的含10％胎牛血清的α-MEM培养液终止消化，低速离心，弃上清；用含30％胎牛血清的完全培养液重悬沉淀，转移至温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的常规培养箱中培养；
步骤五、培养7-10天后，观察到贴壁细胞形成多个克隆，用胰酶消化收集细胞克隆，继续DPSC传代培养，选用传代培养的第三代DPSC，第三代DPSC为纺锤状细胞，流式鉴定检测结果显示DPSC高表达间充质干细胞标志物STRO-1、CD90、CD105和CD146，低表达或不表达造血干细胞标志物CD34、CD45和CD14；
步骤六、在常规培养箱中培养第三代DPSC，待细胞密度达到80％-90％后，放入O2浓度为3％的缺氧培养箱培养，缺氧时间为12-24小时；用胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗后重悬细胞，即得缺氧DPSC；缺氧处理后进行RealTime-PCR和WesternBlot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。
作为本发明的进一步改进，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液为5％Ⅰ型胶原酶200ul与α-MEM培养液800ul混合制得。
作为本发明的进一步改进，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液的加入量为3～5ml。
作为本发明的进一步改进，在步骤四中，所述含30％胎牛血清的完全培养液为胎牛血清：α-MEM：双抗的体积比为30：69：1。
作为本发明的进一步改进，在步骤四中，所述含30％胎牛血清的完全培养液的加入量为3～5ml。
作为本发明的进一步改进，在步骤六中，所述缺氧时间为12小时。
本发明还公开了促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法所培养的干细胞在促进根尖周炎骨愈合中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明公开的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用，通过对原代培养DPSC进行缺氧预处理，有效提高其成骨及成血管基因的表达效应，能够显著提高成体干细胞移植修复根尖周炎骨缺损的疗效。
附图说明
图1为本发明培养方法所得的缺氧DPSC与对照组在成血管相关基因VEGF(vascularendothelialgrowthfactor，血管内皮生长因子)的mRNA表达量的对比图；
图2为本发明培养方法所得的缺氧DPSC与对照组在成血管相关基因CD45的mRNA表达量的对比图；
图3为本发明培养方法所得的缺氧DPSC与对照组在成骨转录因子Runx2的mRNA表达量的对比图；
图4为本发明培养方法所得的缺氧DPSC与对照组在成骨转录因子Sp-7的mRNA表达量的对比图；
图5为本发明培养方法所得的缺氧DPSC与对照组在成骨标志性基因ALP的mRNA表达量的对比图；
图6为本发明培养方法所得的缺氧DPSC与GAPDH(对照组)在成骨标志性蛋白Runx2和Sp-7的表达量的对比图；
图7为本发明方法培养所得的缺氧DPSC与空白注射组、对照注射组在促进小鼠根尖周炎骨愈合进程对比图。
图中：对照组：常规培养的DPSC；缺氧组：缺氧培养的DPSC；空白注射组：经尾静脉注射PBS；对照注射组：经尾静脉注射常规培养的DPSC悬液；缺氧注射组：经尾静脉注射缺氧培养的DPSC悬液；*：P<0.05；**：P<0.01。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图1-7对本发明做进一步的详细描述：
本发明公开了促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，该方法包括：
步骤一、选取临床上8～14岁因正畸治疗需要拔除的健康、完整的前磨牙，拔出后立即放入预冷的α-MEM培养液中保存30分钟，α-MEM培养液含2％双抗；此处健康、完整的前磨牙即不含有任何牙病，且形状完整、无缺损的前磨牙。
步骤二、在无菌条件下劈开牙冠及牙根，用无菌镊子和探针取出牙髓组织，放在事先准备好的无菌EP管中，用含2％体积的双抗的PBS润洗牙髓组织3遍后，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成0.5～1.0mm3的小块；
步骤三、往处理后的牙髓组织块中加入配好的含1％质量的Ⅰ型胶原酶的消化液，来回颠倒EP管，使组织块充分浸到消化液中，将EP管放37℃恒温箱中消化3小时，其中每隔半小时颠倒EP管一次；
步骤四、用同等体积的含10％体积的胎牛血清的α-MEM培养液终止消化，低速离心，弃上清；用含30％体积的胎牛血清的完全培养液重悬沉淀，转移至温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的常规培养箱中培养；
步骤五、培养7-10天后，观察到贴壁细胞形成多个克隆，用胰酶消化收集细胞克隆，继续牙髓干细胞DPSC传代培养，选用传代培养的第三代牙髓干细胞DPSC，第三代牙髓干细胞DPSC为纺锤状细胞，流式鉴定检测结果显示DPSC高表达间充质干细胞标志物STRO-1、CD90、CD105和CD146，低表达或不表达造血干细胞标志物CD34、CD45和CD14；
步骤六、在常规培养箱中培养第三代牙髓干细胞DPSC，待细胞密度达到80％-90％后，放入O2浓度为3％的缺氧培养箱培养，缺氧时间为12-24小时；用胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗后重悬细胞，即得缺氧牙髓干细胞DPSC；缺氧处理后进行RealTime-PCR和WesternBlot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。
在上述方案中，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液为5％Ⅰ型胶原酶200ul与α-MEM培养液800ul混合制得。
在上述方案中，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液的加入量为3～5ml。
在上述方案中，在步骤四中，所述含30％体积的胎牛血清的完全培养液为胎牛血清：α-MEM：双抗的体积比为30：69：1。
在上述方案中，在步骤四中，所述含30％胎牛血清的完全培养液的加入量为3～5ml。
在上述方案中，在步骤六中，所述缺氧时间为12小时。
本发明制得的缺氧DPSC进行RealTime-PCR和WesternBlot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况，其具体情况如图1～图6所示：图中对照组为采用步骤一到步骤五常规培养得到的DPSC；缺氧组为缺氧培养的DPSC。
如图1所示：本发明方法所得的缺氧DPSC与对照组相比在成血管相关基因VEGF的mRNA表达量明显增高，P<0.01，结果具有显著的统计学差异。
如图2所示：本发明方法所得的缺氧DPSC与对照组相比在成血管相关基因CD45的mRNA表达量也明显增高，P<0.01，结果具有显著的统计学差异。
如图3所示：本发明方法所得的缺氧DPSC与对照组相比在成骨转录因子Runx2的mRNA表达量明显增高，P<0.01，结果具有显著的统计学差异。
如图4所示：本发明方法所得的缺氧DPSC与对照组相比在成骨转录因子Sp-7的mRNA表达量也明显增高，P<0.05，结果具有显著的统计学差异。
如图5所示：本发明方法所得的缺氧DPSC与对照组相比在成骨标志性基因ALP的mRNA表达量明显增高，P<0.05，结果具有显著的统计学差异。
如图6所示：本发明方法所得的缺氧DPSC与对照组相比在成骨标志性蛋白Runx2和Sp-7的表达量明显增高，结果具有显著的统计学差异。
本发明方法制得的缺氧DPSC在促进根尖周炎骨愈合中的应用实施例如下：
(1)小鼠根尖周炎动物模型建立步骤如下，取6—8周雄性Balb/c小鼠30只，经腹腔注射4％水合氯醛0.1ml/10g全身麻醉，台式电机及1/4号球钻行双侧下颌第一磨牙近中窝开髓术，开髓深度为球钻直径并能探及穿髓点，将髓腔直接暴露于口腔环境中，常规饲养。
(2)在开髓后14天，用胰岛素针头抽取缺氧DPSC混悬液200ul(细胞浓度为((2～2.5)×107/ml)，进行小鼠尾静脉推注。观察小鼠的生理情况，均未见不良反应。小鼠静脉注射2周后被处死，收集小鼠根尖周组织标本，制成石蜡切片，进行HE染色，如图7所示，发现注射缺氧DPSC与空白注射组、对照注射组相比在小鼠根尖周炎症反应明显减少，新生骨形成，根尖周骨愈合速度显著加快。
本发明公开的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法及干细胞应用，通过对原代培养的牙髓干细胞DPSC进行传代培养，对传代培养的第三代牙髓干细胞DPSC进行缺氧预处理，有效提高其成骨及成血管基因的表达效应，能够显著提高成体干细胞移植修复根尖周炎骨缺损的疗效。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，该方法包括：
步骤一、选取临床上8～14岁因正畸治疗需要拔除的健康、完整的前磨牙，拔出后立即放入预冷的α-MEM培养液中保存30分钟，α-MEM培养液含2％双抗；
步骤二、在无菌条件下劈开牙冠及牙根，用无菌镊子和探针取出牙髓组织，放在事先准备好的无菌EP管中，用含2％双抗的PBS润洗牙髓组织3遍后，用无菌眼科剪将牙髓组织剪成0.5～1.0mm3的小块；
步骤三、往处理后的牙髓组织块中加入配好的含1％Ⅰ型胶原酶的消化液，来回颠倒EP管，使组织块充分浸到消化液中，将EP管放37℃恒温箱中消化3小时，其中每隔半小时颠倒EP管一次；
步骤四、用同等体积的含10％胎牛血清的α-MEM培养液终止消化，低速离心，弃上清；用含30％胎牛血清的完全培养液重悬沉淀，转移至温度为37℃，二氧化碳浓度为5％的常规培养箱中培养；
步骤五、培养7-10天后，观察到贴壁细胞形成多个克隆，用胰酶消化收集细胞克隆，继续DPSC传代培养，选用传代培养的第三代DPSC，第三代DPSC为纺锤状细胞，流式鉴定检测结果显示DPSC高表达间充质干细胞标志物STRO-1、CD90、CD105和CD146，低表达或不表达造血干细胞标志物CD34、CD45和CD14；
步骤六、在常规培养箱中培养第三代DPSC，待细胞密度达到80％-90％后，放入O2浓度为3％的缺氧培养箱培养，缺氧时间为12-24小时；用胰蛋白酶消化细胞，PBS漂洗后重悬细胞，即得缺氧DPSC；缺氧处理后进行RealTime-PCR和WesternBlot法检测缺氧DPSC细胞的成血管及成骨的相关基因和蛋白表达情况。
2.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液为5％Ⅰ型胶原酶200ul与α-MEM培养液800ul混合制得。
3.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤三中，所述含1％Ⅰ型胶原酶的消化液的加入量为3～5ml。
4.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤四中，所述含30％胎牛血清的完全培养液为胎牛血清：α-MEM：双抗的体积比为30：69：1。
5.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤四中，所述含30％胎牛血清的完全培养液的加入量为3～5ml。
6.根据权利要求1所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法，其特征在于，在步骤六中，所述缺氧时间为12小时。
7.根据权利要求1-6中任一权利要求所述的促进根尖周炎骨愈合的干细胞培养方法所培养的干细胞的应用，其特征在于，所述干细胞在促进根尖周炎骨愈合中的应用。
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