CN110314172A - 一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂及制备方法，所述制剂的制备方法包括以下步骤：(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得TrkB+CD271+的细胞亚群；(4)对获得的细胞亚群进行处理，制成制剂。本发明在现有的BMSC提取技术的基础上，发明了一种利用细胞表面抗原标记，阶梯式特异性分离具有较强促神经生长能力的细胞亚群的方法，获得新型治疗脊髓损伤的TrkB+CD271+的BMSC亚群制剂，克服现阶段BMSC治疗脊髓损伤促神经生长的细胞占比较少，疗效不佳等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有特异性促神经生长作用治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法。本发明也涉及将通过本发明富集的细胞制剂用于制备脊髓损伤治疗药物中的应用。
背景技术
骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)是存在于骨髓中的除造血干细胞以外的另一类具有“无限”增殖和多向分化潜能的干细胞。在一定的诱导条件下，这类细胞可定向分化为各胚层来源组织，特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、腱细胞、肌肉细胞和神经细胞等。BMSC具有贴壁易生长，体外易分离、扩增，外源性基因的易转入和表达的特性，被生物医学专家认为是干细胞治疗的一种理想细胞类型。
脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。由于脊髓损伤所导致的社会经济损失，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。恢复肢体神经功能是脊髓损伤临床治疗的关键。目前脊髓损伤的治疗主要包括手术治疗、药物治疗、物理治疗及并发症治疗，但临床改善有限。脊髓损伤后，受损神经再生是根本上治疗脊髓损伤的关键。
脊髓损伤间充质干细胞治疗具有较好的临床应用前景，目前开展多项临床试验，取得一定的疗效，近期已有截瘫患者在接受干细胞治疗两年后恢复站立，但真正能够发挥促神经生长的BMSC占比较少，这也导致了干细胞治疗过程时间长，恢复慢，花费高等特点。针对上述问题，本发明人研究证实了BMSC中存在更为精细的功能分群，具有神经生长功能的是特定的细胞亚群，因此，富集有效的细胞亚群用以治疗脊髓损伤将明显提高BMSC治疗脊髓损伤的疗效。
发明内容
针对现有技术存在BMSC治疗脊髓损伤，能够发挥促神经生长的BMSC含量较低的问题，发明人选用前期首次发现BMSC具有促神经再生能力的细胞亚群高特异性表达的表面抗原TrkB(神经营养因子受体酪氨酸激酶2)，通过联合BMSC的特征表面抗原CD271，提供了一种简单高效的全新方法，可成功分离提纯这种具有较强促神经生长功能的细胞亚群(TrkB+CD271+)，将其处理为细胞制剂用以治疗脊髓损伤。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，所述制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；
(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；
(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得TrkB+CD271+的细胞亚群；
(4)对获得的细胞亚群进行处理，制成制剂。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法中，步骤(1)所述的健康人骨髓来源于自体或异体，获得途径可以是直接骨穿抽取骨髓或由骨髓库直接购买的健康人骨髓样本。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法中，步骤(1)所述的密度梯度离心以获取单个核细胞的操作为：
①将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5ml PE buffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；
②在新的15ml离心管底部加4.5ml Ficoll-Pague分离液，倾斜离心管，再将滤过的骨髓，缓慢加到Ficoll-Pague分离液面上，使其呈清晰的界面，尽量避免出现骨髓侵入到分离液面之下，在离心力为500g、温度为20度的条件下离心35分钟；
③离心后液面将分为4层，从底部向上分别为红细胞、Ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加PE buffer 12ml，混匀洗涤，在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；
④离心后弃上清，细胞沉淀先用15ml PE buffer重悬，混匀，在离心力为200g、温度为20度的条件下离心12分钟；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀用10ml PE buffer重悬，得到单个核细胞的细胞悬液。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法中，所述PE buffer为免疫磁珠分选所用的洗涤缓冲液(Washing buffer)，可直接从MiltenyiBiotec公司购买或根据官网配方表的比例用PBS和EDTA混合配置。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法中，步骤(2)所述的获得BMSC的操作为：
①将步骤(1)获取的单个核细胞的细胞悬液进行细胞计数，并在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；
②根据细胞计数的结果，以每107个细胞60μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞；
③根据细胞计数的结果，以每107个细胞20μl的比例分别加入CD271磁珠和FcR阻断剂，充分混匀后，于4度下冷却15分钟；
④根据细胞计数的结果，以每107个细胞1.5ml PBE buffer的比例加入缓冲液洗涤经过冷却后的细胞，混匀后在离心力为300g、温度为4度的条件下离心10分钟；
⑤根据细胞计数的结果，以每108个细胞500μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞，若细胞数低于108个，至少添加500μl PBE buffer重悬；将细胞悬液转移至专用的分选管中，使用全自动磁珠分选仪(由德国MiltenyiBiotec公司生产)进行细胞分选，筛选得到CD271阳性的BMSC细胞。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，所述PBE buffer为免疫磁珠分选所用的运行缓冲液(Running buffer)，可直接从MiltenyiBiotec公司购买或根据官网配方表的比例用PBS、BSA和EDTA混合配置。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，步骤(3)所述的获得TrkB+CD271+的细胞亚群的操作为：
①将步骤(2)中获得的BMSC单细胞悬液在转速为900rpm、室温条件下离心5分钟，用PBS洗涤重悬后，重复一次该离心过程；
②用适量PBS重悬细胞，加入TrkB单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；
③加入PBS洗涤两遍，在转速为900rpm、室温条件下离心5min，再用PBS重悬细胞；
④通过流式细胞仪分选，分别获取TrkB阳性细胞。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，步骤(4)所述的制备用于治疗脊髓损伤的制剂的操作为：将步骤(3)得到的TrkB+CD271+细胞置于hBMSC无血清培养液中培养3-5天，直至细胞贴壁，将细胞吹打脱落，在转速为1000rpm、温度为4度的条件下离心5分钟，再用2ml的hBMSC无血清培养液重悬后保存，得到制剂。
本发明所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，所述hBMSC无血清培养液的组分为：基础培养基(05-200-1A，BI)500ml、培养添加物(05-201-1U，BI)3ml、贴壁试剂(05-752-105，BI)0.5ml、重组胰酶(03-079-1B，BI)100ml、大豆胰酶抑制剂(03-048-1C，BI)20ml、冷冻液(05-712-1B，BI)100ml。
本发明还提供了按照上述方法制备获得的制剂以及该制剂在制备脊髓损伤治疗药物中的应用。
本发明具有以下有益的效果：
本发明在现有的BMSC提取技术的基础上，发明了一种利用细胞表面抗原标记，阶梯式特异性分离具有促神经生长功能的细胞亚群的方法，处理后获得了用于治疗脊髓损伤的TrkB+CD271+的细胞亚群制剂，克服了现阶段BMSC治疗脊髓损伤促神经生长的细胞占比较少，疗效不佳等问题。
附图说明
图1为TrkB在BMSC中的表达分布图；
图2为TrkB在TrkB+CD271+中的表达分布图。
具体实施方式
以下通过具体的实例对本发明的内容作进一步的阐述说明，本发明包括但不限于下述步骤和内容。
实施例1：从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞
①通过骨穿抽取健康成人骨髓于采血管中，将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5mlPE buffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；
②在新的15ml离心管底部加4.5ml Ficoll-Pague分离液，倾斜离心管，再将滤过的骨髓，缓慢加到Ficoll-Pague分离液面上，使其呈清晰的界面，尽量避免出现骨髓侵入到分离液面之下，在离心力为500g、温度为20度的条件下离心35分钟；
③离心后液面将分为4层，从底部向上分别为红细胞、Ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加PE buffer 12ml，混匀洗涤，在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；
④离心后弃上清，细胞沉淀先用15ml PE buffer重悬，混匀，在离心力为200g、温度为20度的条件下离心12分钟；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀用10ml PE buffer重悬，得到单个核细胞的细胞悬液。
实施例2：免疫磁珠筛选单个核细胞以获得BMSC
①将实施例1获取的单个核细胞的细胞悬液进行细胞计数，并在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；
②根据细胞计数的结果，以每107个细胞60μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞；
③根据细胞计数的结果，以每107个细胞20μl的比例分别加入CD271磁珠和FcR阻断剂，充分混匀后，于4度下冷却15分钟；
④根据细胞计数的结果，以每107个细胞1.5ml PBE buffer的比例加入缓冲液洗涤经过冷却后的细胞，混匀后在离心力为300g、温度为4度的条件下离心10分钟；
⑤根据细胞计数的结果，以每108个细胞500μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞，若细胞数低于108个，至少添加500μl PBE buffer重悬；将细胞悬液转移至专用的分选管中，使用全自动磁珠分选仪(由德国MiltenyiBiotec公司生产)进行细胞分选，筛选得到CD271阳性的BMSC细胞。
实施例3：流式分选TrkB+CD271+的细胞亚群
①将实施例2中获得的BMSC单细胞悬液在转速为900rpm、室温条件下离心5分钟，用PBS洗涤重悬后，重复一次该离心过程；
②用适量PBS重悬细胞，加入TrkB单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；
③加入PBS洗涤两遍，在转速为900rpm、室温条件下离心5min，再用PBS重悬细胞；
④通过流式细胞仪分选，分别获取TrkB阳性细胞。
实施例4：制备用于治疗脊髓损伤的制剂的操作为：
将实施例3得到的TrkB+CD271+细胞置于hBMSC无血清培养液中培养3-5天，直至细胞贴壁，将细胞吹打脱落，在转速为1000rpm、温度为4度的条件下离心5分钟，再用2ml的hBMSC无血清培养液重悬后保存，得到制剂。
实施例5：对获得的细胞进行单细胞测序，检测有关基因的表达
①将实施例2得到的17899个BMSC细胞进行10x单细胞转录组测序，检测TrkB(神经营养因子受体酪氨酸激酶2)在BMSC中的表达确定促神经生长的细胞亚群分布(图1)；
②将实施例3得到的2493个TrkB+CD271+细胞进行10x单细胞转录组测序，检测TrkB在该细胞亚群的表达分布(图2)，由于TrkB编码的是神经营养因子受体酪氨酸激酶2，是神经生长过程中最重要的细胞因子，可促进神经的有效再生，而其表达量在我们提取的特定细胞亚群中是均值的7.39倍，证明该细胞亚群具有强大的促神经生长功能。且TrkB自身编码的是一种跨膜糖蛋白，具有细胞表面抗原的特性，可被特异性的识别和结合，并可进一步被用以分离提纯。
Claims (10)
1.一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)从健康成人骨髓中通过密度梯度离心的方法获得单个核细胞；
(2)免疫磁珠筛选骨髓单个核细胞以获得BMSC；
(3)对步骤(2)中获得BMSC进行流式分选，获得TrkB+CD271+的细胞亚群；
(4)对获得的细胞亚群进行处理，制成制剂。
2.按照权利要求1所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的健康人骨髓来源于自体或异体，获得途径可以是直接骨穿抽取骨髓或由骨髓库直接购买的健康人骨髓样本。
3.按照权利要求1所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的密度梯度离心以获取单个核细胞的操作为：
①将采血管经酒精浸润的无尘纸擦拭后放入生物安全柜，抽取采血管中的骨髓分装到15ml的离心管中，每管骨髓9ml，加入1.5ml PE buffer稀释，并通过提前双面润湿的100μm筛网过滤；
②在新的15ml离心管底部加4.5ml Ficoll-Pague分离液，倾斜离心管，再将滤过的骨髓，缓慢加到Ficoll-Pague分离液面上，使其呈清晰的界面，尽量避免出现骨髓侵入到分离液面之下，在离心力为500g、温度为20度的条件下离心35分钟；
③离心后液面将分为4层，从底部向上分别为红细胞、Ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加PE buffer 12ml，混匀洗涤，在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；
④离心后弃上清，细胞沉淀先用15ml PE buffer重悬，混匀，在离心力为200g、温度为20度的条件下离心12分钟；
⑤离心后弃上清，细胞沉淀用10ml PE buffer重悬，得到单个核细胞的细胞悬液。
4.按照权利要求3所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述PE buffer为免疫磁珠分选所用的洗涤缓冲液。
5.按照权利要求1所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的获得BMSC的操作为：
①将步骤(1)获取的单个核细胞的细胞悬液进行细胞计数，并在离心力为300g、温度为20度的条件下离心10分钟；
②根据细胞计数的结果，以每107个细胞60μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞；
③根据细胞计数的结果，以每107个细胞20μl的比例分别加入CD271磁珠和FcR阻断剂，充分混匀后，于4度下冷却15分钟；
④根据细胞计数的结果，以每107个细胞1.5ml PBE buffer的比例加入缓冲液洗涤经过冷却后的细胞，混匀后在离心力为300g、温度为4度的条件下离心10分钟；
⑤根据细胞计数的结果，以每108个细胞500μl PBE buffer的比例加入缓冲液重悬细胞，若细胞数低于108个，至少添加500μl PBE buffer重悬；将细胞悬液转移至专用的分选管中，使用全自动磁珠分选仪进行细胞分选，筛选得到CD271阳性的BMSC细胞。
6.按照权利要求5所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述PBE buffer为免疫磁珠分选所用的运行缓冲液。
7.按照权利要求1所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的获得TrkB+CD271+的细胞亚群的操作为：
①将步骤(2)中获得的BMSC单细胞悬液在转速为900rpm、室温条件下离心5分钟，用PBS洗涤重悬后，重复一次该离心过程；
②用适量PBS重悬细胞，加入TrkB单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；
③加入PBS洗涤两遍，在转速为900rpm、室温条件下离心5min，再用PBS重悬细胞；
④通过流式细胞仪分选，分别获取TrkB阳性细胞。
8.按照权利要求1所述的一种用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的制备用于治疗脊髓损伤的细胞制剂的操作为：将步骤(3)得到的TrkB+CD271+细胞置于hBMSC无血清培养液中培养3-5天，直至细胞贴壁，将细胞吹打脱落，在转速为1000rpm、温度为4度的条件下离心5分钟，再用2ml的hBMSC无血清培养液重悬后保存，得到制剂。
9.一种由权利要求1-8任一所述的方法制备获得的制剂。
10.权利要求9所述的制剂在制备脊髓损伤治疗药物中的应用。
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