CN103301154A - 脐带间充质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了脐带间充质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的应用，特别是治疗复发性系统性红斑狼疮的制剂的应用。本发明还提供了制备能够用于治疗红斑狼疮的制剂的脐带间质干细胞的方法以及具有所述干细胞的制剂组合物。利用本发明制备的脐带间质干细胞具有低免疫反应风险，活性高、残留低等优点，并且制备成本低廉。

Description

脐带间充质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的用途

技术领域

本发明涉及干细胞制备治疗疾病的制剂领域。具体的，本发明提供了一种脐带间充质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的用途。

背景技术

自身免疫疾病（autoimmune diseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。自身免疫性疾病可分为器官特异性自身免疫疾病和系统性自身免疫疾病。器官特异性自身免疫疾病中，组织器官的病理损害和功能障碍仅限于抗体或致敏淋巴细胞所针对的某一器官，主要有慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等。系统性自身免疫疾病中，由于抗原抗体复合物广泛沉积于血管壁等原因导致全身多器官损害，免疫损伤导致血管壁及间质的纤维素样坏死性炎及随后产生多器官的胶原纤维增生。

红斑狼疮，例如系统性红斑狼疮（SLE）是一种多因素参与的，以自身反应性T、B细胞异常活化、产生致病性自身抗体和免疫复合物为主要特征的一种慢性炎症性自身免疫病，主要损害肾脏、皮肤、关节、中枢神经系统、血液系统等，可累及全身各个器官，病情严重时危及生命。50%～70%的SLE患者病程中会出现临床肾脏受累，肾活检显示几乎所有SLE均有肾脏病理学改变。我国SLE患者超过100万，为全球之最，同时每年还以0.4%～0.6%的发病速度递增，女性的患病率接近1/1000人。目前SLE高危患者1年的死亡率为20%，5年的死亡率为35%，10年的死亡率为45%。

传统治疗包括糖皮质激素、免疫抑制剂等，部分患者虽可暂时缓解，但少数患者对传统治疗反应较差，且这些药物长期应用会引起严重副作用，近年来，新的SLE治疗药物包括一些针对细胞因子、B细胞和T细胞的靶向治疗药物，如：嵌合性抗CD20单克隆抗体美罗华(Rituximab)和B淋巴细胞刺激因子抑制剂贝利单抗（Belimumab）在部分系统性红斑狼疮患者的应用上取得了一定的疗效，但由于适应症人群相对较窄，且治疗费用昂贵，目前临床应用受到一定限制。

干细胞(stem cell)是具有自我更新并可分化形成一种以上类型细胞的多潜能细胞，这种潜能使它在临床应用方面有非常广泛的前景。

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESCs，简称ES或EK细胞）是早期胚胎或原始性腺种分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。然而，胚胎干细胞研究因为伦理学的问题一直是一个颇具争议的领域，其来源受到伦理、道德的限制，取材较为困难。

成体干细胞是指存在于已经分化组织中的未分化细胞，具有自我复制和分化产生一种或一种以上子代组织未成熟细胞的能力，可分布在成体组织或器官中。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。研究人员已经在多种组织和器官内发现有成体干细胞的存在。关于成体干细胞。已经报道的含有干细胞的成体组织包括血液、骨髓、皮肤、神经等不同组织中，分别称造血干细胞、皮肤干细胞、神经干细胞及生殖干细胞。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是成体干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。研究发现，间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。

干细胞被认为是治疗自身免疫性疾病的潜在方法。一些研究已证实干细胞分化后替代修复损坏的细胞以治疗身免疫性疾病是可行的。SLE是外来抗原引起人体B细胞活化，易感者因免疫耐受性减弱，B细胞通过交叉反应与模拟外来抗原的自身抗原相结合，并将抗原递呈给T细胞，使之活化，在T细胞活化刺激下，B细胞产生大量不同类型的自身抗体，造成大量组织损伤。由于参与病态免疫的T、B淋巴细胞来源于共同的淋巴系干/祖细胞，因此被认为是一组异常干/祖细胞增殖分化的多克隆T、B淋巴细胞病，通过干细胞移植重建免疫系统，有可能使SLE达到长期缓解甚至治愈。

在对狼疮鼠模型的MSC应用中，Ishida等发现MLR lpr自发狼疮模型鼠给予C57BL/6鼠骨髓MSC移植后，其存活期可延长，并超过12个月。免疫组织学研究结果发现自身免疫性疾病如：狼疮性肾炎、类风湿关节炎以及淋巴结病变全部缓解，血清学检查结果提示循环免疫复合物和类风湿因子均下降至正常。但预先去除MSC后，75%的狼疮鼠在90天内死亡。国内课题组研究结果发现SLE骨髓MSCs和正常人MSCs表面标志无差别，P2代后细胞均一性达到97%。然而SLE患者骨髓MSCs体外生长存在缺陷，表现在生长较正常人缓慢，易衰老，传代过程(10代)中活力会逐渐丧失。正常人和SLE患者骨髓MSCs均表达IL-6、IL-7、IL-11、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和干细胞生长因子(SCF)等细胞因子，与文献报道相一致。SLE患者骨髓MSCsIL-6、IL-7mRNA表达和正常对照组相比明显降低(P<0.01)，作者将细胞因子水平和患者SLEDAI评分、24h尿蛋白、血细胞等进行了相关分析，发现IL-7表达水平和SLEDA I评分负相关。IL-7是T细胞发育和成熟后活化中必需的因子之一，它既能诱导T淋巴细胞增殖，又能刺激内源性IL-2产生和IL-2R的表达，IL-6主要由活化的单核细胞产生，T细胞、B细胞、骨髓MSC和其它间质细胞也都能产生，IL-6的主要功能包括调节造血系统、免疫应答、肿瘤生长、神经内分泌系统等。这项研究提示细胞因子分泌异常可能是造成SLE造血系统受损和免疫系统紊乱的原因之一，但SLE患者骨髓MSCs细胞因子分泌缺陷的具体机制还有待进一步研究。

本领域仍需要获得能够控制干细胞增殖的关键分子，避免控制神经干细胞的过度生长，以及如何更好地实现分化细胞与已存在的细胞的功能整合，从而能够达到治疗自身免疫性疾病例如红斑狼疮的干细胞制剂。

发明内容

本发明提供了脐带间质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的应用，特别是治疗复发性系统性红斑狼疮的制剂。本发明还提供了一种用干细胞治疗红斑狼疮，例如复发性系统性红斑狼疮的方法。在另一个方面，本发明提供了制备能够用于治疗红斑狼疮的制剂的脐带间质干细胞的方法。利用本发明制备的脐带间质干细胞具有低免疫反应风险，活性高、残留低等优点，并且制备成本低廉。本发明提供的脐带间质干细胞能够有效地治疗红斑狼疮，例如复发性系统性红斑狼疮。

本发明提供了一种脐带间质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的应用，特别是在制备治疗系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）的制剂中的应用。在本发明的一个方面，所述系统性红斑狼疮为复发性系统性红斑狼疮。复发性系统性红斑狼疮符合1997年美国风湿病学院（ACR）的SLE的诊断标准，疾病活动度为中、重度（SLEDAI≥9分或BILAG为A级或者B级），以及糖皮质激素≥0.5mg/kg/d+环磷酰胺0.5～0.75/m²,治疗6个月无效；或糖皮质激素≥0.5mg/kg/d+其他免疫抑制剂，治疗3个月无效；或糖皮质激素维持治疗量≥20mg/d，治疗3个月无效。

在本发明的一个方面，上述应用中的所述脐带间质干细胞通过以下方法制备：

步骤1：获得脐带华通氏胶；例如，可通过用氯化钠冲洗获得的脐带，用乙醇消毒灭菌，剔除脐带的血管，然后取出华通氏胶，用氯化钠洗涤胶体；

步骤2：组织块制备和接种，其中将所述胶体剪切成约1～4mm³的组织匀浆块，用无血清培养基定容组织匀浆浓度为约0.4～0.7g/ml，吹打匀浆均匀后接种于培养瓶中，加入无血清培养基培养；

步骤3：P0代细胞培养，其中将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，培养至第5～7天进行全量换液；培养至第10～13天进行半量换液；培养至第14～18天，细胞融合度达到70%～80%时，用消化酶消化收获得到P0代细胞；

步骤4：P1代细胞培养，其中将所述P0代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到80%～90%后，用消化酶消化收获得到P1代细胞；

步骤5：P2代细胞培养，其中将所述P1代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到85%～90%，用消化酶消化收获得到P2代细胞；

步骤6：P3代细胞培养，其中将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到>95%后，用消化酶消化收获得到P3代细胞；

步骤7：P4代细胞培养，其中将所述P3代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到85%～90%后，用消化酶消化收获得到P4代细胞。此P4代即可以用于前述在制备治疗系统性红斑狼疮例如复发性系统性红斑狼疮的制剂中的应用的脐带间质干细胞。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤5还包括将消化酶消化收获得到的所述P2代细胞冻存，其中将所述P2代细胞按照要求冻存密度悬浮在冻存液中，放置于程序性降温仪中降至-80℃以下冻存。在本发明的其中一个方面，所述冻存密度为1～5×10⁷/mL。冻存液可包括基础液、渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂。所述基础液通常包括培养液、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水等。所述渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种的组合。所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤5还包括将冻存的P2代细胞复苏，其中将所述冻存的P2代细胞在温度约40.0℃下水浴，快速晃动复温，细胞悬液由固态变为液态时，接种至细胞培养瓶中，复苏即完成。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤3中，当细胞培养至第14～16天时，如果细胞融合度未达到70%～80%，再进行一次半量换液。

在本发明的其中一个方面，其中上述制备方法的步骤3-7的细胞培养中，都采用无血清培养基进行细胞培养。在本发明的制备方法中，优选采用无血清培养基对P0、P1、P2、P3、P4代细胞进行培养。在本发明的其中一个方面，P0、P1、P2、P3、P4代细胞的培养都采用无血清培养基。

在本发明中，无血清培养基是指不含有血清的细胞培养基。可采用本领域已知的各种用于细胞培养的无血清培养基。可商购的无血清培养基包括，例如LONZA公司的Ultraculture^TM、GIBCO公司的

MSC SFMXenoFree、Invitrogen公司的STEMPRO MSC SFM等。不受任何理论限制的，发明人认为，本发明制备得到的脐带间质干细胞的其中一个重要优点在于免疫原性弱，不诱导免疫排斥反应；具有类似“免疫豁免”的特性，可抑制同种异体免疫反应，抑制移植物抗宿主病。这对有效治疗系统性红斑狼疮具有一定意义。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中所述消化酶为胰蛋白酶。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中还包括步骤8，其中对所述P4代的脐带间质干细胞进行表面抗原检验和筛选。在本发明的其中一个方面，筛选表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%的脐带间质干细胞。在本发明的其中一个方面，筛选表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%的脐带间质干细胞。在本发明的其中又一个方面，筛选表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%，而且表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%的脐带间质干细胞。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中的步骤8是对所述P4代的脐带间质干细胞进行成骨转化率和成脂转化率检测和筛选。在本发明的其中一个方面，筛选成脂转化率为约20-30%的脐带间质干细胞。在本发明的其中一个方面，筛选所述脐带间质干细胞的成骨转化率大于70%的脐带间质干细胞。在本发明的其中又一个方面，筛选成脂转化率为约20-30%，而且成骨转化率大于70%的脐带间质干细胞。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中的步骤8是对所述P4代的脐带间质干细胞进行表面抗原检验和筛选，以及进行成骨转化率和成脂转化率检测和筛选。在本发明的其中又一个方面，筛选表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%，并且表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%，以及成骨转化率大于70%，并且成脂转化率为约20-30%的脐带间质干细胞。

在本发明的其中一个方面，在本发明的脐带间质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的应用中，所述制剂含有的脐带间质干细胞的量为1×10⁶细胞/kg～9×10⁶细胞。

在本发明的其中一个方面，在本发明的脐带间质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的应用中，所述制剂含有的脐带间质干细胞的剂量为1×10⁶细胞/kg～9×10⁶细胞/kg。所述剂量是指给予每千克（kg）重量的需要治疗的病人或其它动物的干细胞的个数。

本发明还提供了一种制备用于治疗系统性红斑狼疮例如复发性系统性红斑狼疮的制剂中的脐带间质干细胞的方法，包括：

步骤1：获得脐带华通氏胶；例如，可通过用氯化钠冲洗获得的脐带，用乙醇消毒灭菌，剔除脐带的血管，然后取出华通氏胶，用氯化钠洗涤胶体；

步骤2：组织块制备和接种，其中将所述胶体剪切成约1～4mm³的组织匀浆块，用无血清培养基定容组织匀浆浓度为约0.4～0.7g/ml，吹打匀浆均匀后接种于培养瓶中，加入无血清培养基培养；

步骤3：P0代细胞培养，其中将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，培养至第5～7天进行全量换液；培养至第10～13天进行半量换液；培养至第14～18天，细胞融合度达到70%～80%时，用消化酶消化收获得到P0代细胞；

步骤4：P1代细胞培养，其中将所述P0代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到80%～90%后，用消化酶消化收获得到P1代细胞；

步骤5：P2代细胞培养，其中将所述P1代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到85%～90%，用消化酶消化收获得到P2代细胞；

步骤6：P3代细胞培养，其中将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到>95%后，用消化酶消化收获得到P3代细胞；

步骤7：P4代细胞培养，其中将所述P3代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到85%～90%后，用消化酶消化收获得到P4代细胞。此P4代即可以用于前述在制备治疗系统性红斑狼疮例如复发性系统性红斑狼疮的制剂中的应用的脐带间质干细胞。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤5还包括将消化酶消化收获得到的所述P2代细胞冻存，其中将所述P2代细胞按照要求冻存密度悬浮在冻存液中，放置于程序性降温仪中降至-80℃以下冻存。在本发明的其中一个方面，所述冻存密度为1～5×10⁷/mL。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤5还包括将冻存的P2代细胞复苏，其中将所述冻存的P2代细胞在温度约40.0℃下水浴，快速晃动复温，细胞悬液由固态变为液态时，接种至细胞培养瓶中，复苏即完成。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法的步骤3中，当细胞培养至第14～16天时，如果细胞融合度未达到70%～80%，再进行一次半量换液。

在本发明的其中一个方面，其中上述制备方法的步骤3-7的细胞培养中，都采用无血清培养基进行细胞培养。在本发明的制备方法中，优选采用无血清培养基对P0、P1、P2、P3、P4代细胞进行培养。在本发明的其中一个方面，P0、P1、P2、P3、P4代细胞的培养都采用无血清培养基。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中所述消化酶为胰蛋白酶。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中还包括步骤8，其中对所述P4代的脐带间质干细胞进行表面抗原检验和筛选。在本发明的其中又一个方面，筛选表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%，而且表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%的脐带间质干细胞。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中的步骤8是对所述P4代的脐带间质干细胞进行成骨转化率和成脂转化率检测和筛选。在本发明的其中又一个方面，筛选成脂转化率为约20-30%，而且成骨转化率大于70%的脐带间质干细胞。

在本发明的其中一个方面，上述制备方法中的步骤8是对所述P4代的脐带间质干细胞进行表面抗原检验和筛选，以及进行成骨转化率和成脂转化率检测和筛选。在本发明的其中又一个方面，筛选表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%，并且表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%，以及成骨转化率大于70%，并且成脂转化率为约20-30%的脐带间质干细胞。

本发明还提供了一种用于治疗红斑狼疮的制剂组合物，特别是用于治疗系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）例如复发性系统性红斑狼疮的制剂组合物。上述制剂组合物含有脐带间质干细胞。其中所述脐带间质干细胞通过采用前述的方法制备。所述制剂含有的脐带间质干细胞的剂量可为1×10⁶细胞/kg～9×10⁶细胞/kg。所述剂量是指给予每千克（kg）重量的需要治疗的病人或其它动物的干细胞的个数。

在本发明的用于治疗红斑狼疮的制剂组合物中，所述脐带间质干细胞的表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%。在本发明的其中一个方面，所述脐带间质干细胞的表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%。在本发明的其中又一个方面，所述脐带间质干细胞的表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%，而且表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%。

在本发明的其中一个方面，在本发明的用于治疗红斑狼疮的制剂组合物中，所述脐带间质干细胞具有成骨和成脂分化能力。在本发明的其中一个方面，所述脐带间质干细胞的成脂转化率为约20-30%。在本发明的其中一个方面，所述脐带间质干细胞的成骨转化率大于70%。在本发明的其中又一个方面，所述脐带间质干细胞的成脂转化率为约20-30%，而且成骨转化率大于70%。

在本发明的其中又一个方面，上述制剂组合物中还包括细胞培养基，优选为无血清细胞培养基。

本发明人意外地发现，利用本发明制备的脐带间质干细胞具有不同于现有技术的优点：免疫原性弱，不诱导免疫排斥反应；具有类似“免疫豁免”的特性，可抑制同种异体免疫反应，抑制移植物抗宿主病（GVHD）。本发明制备脐带间质干细胞的方法简单，细胞活力很强，容易大量扩增，这可能与其具有更长的端粒有关。例如，根据本发明的上述工艺，每1瓶P0代细胞（3×10³），传代至P4代，可获得625瓶，3×10⁶细胞/瓶。这是本发明的细胞培养体系、培养工艺能够取得的优良效果。更重要的是，本发明人意外地发现，用本发明的方法制备的脐带间质干细胞，能够有效地治疗系统性红斑狼疮例如复发性系统性红斑狼疮。这是与本发明制备和采用的脐带间质干细胞的性质，包括脐带间质干细胞的特定表面标记阳性指标和阴性指标以及其成脂成骨分化能力等带来的优点。在未公开的实验室和临床实验中发现，脐带间质干细胞的生长阶段可能对治疗有关键性影响，没有达到特定表面标记阳性指标和阴性指标和/或具有特定成脂成骨分化能力的干细胞不能取得满意的疗效。

在本申请中，表述“约”表示本领域技术人员能理解的误差范围。例如，“约”可表示±10%，优选±5%，更优选±1%，最优选±0.5%。

附图说明

图1a为脐带间质干细胞成脂分化测试结果。

图1b为脐带间质干细胞成骨分化测试结果。

图2a为MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型血清ds-DNA抗体数据图。

图2b为MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型尿蛋白数据图。

图2c为MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型CD₄ ⁺和CD₈ ⁺T淋巴细胞数据图。

图2d为MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型CD₄ ⁺和CD₈ ⁺T淋巴细胞数据图。

图2e为MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型肺脏HE染色图。

图2f为MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型肾脏HE染色图。

图2g为MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型肺脏股骨染色图。

图3a为临床试验SLEDAI评分数据图。

图3b为临床试验尿蛋白数据图。

图3c为临床试验补体C3数据图。

具体实施方式

为了更好地理解和阐释本发明，下面将参照附图对本发明作进一步的详细描述。

实施例1

1、脐带华通氏胶的剥离

胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存液中2-8℃恒温保存。

用0.9%氯化钠注射液冲洗获得的脐带，重复2～3次，去除血渍。75%乙醇浸没整根脐带消毒灭菌。氯化钠注射液重复洗涤去除残留乙醇。用无菌手术剪将脐带剪成约2～5cm数段，清除脐带小段血管中淤血和凝块。剔除脐带的两条动脉，一条静脉。位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华通氏胶，用有齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入适量0.9%氯化钠注射液，洗涤胶体。

2、组织块制备

胶体转移至离心管，称量记录。用无菌组织剪将称重后的华通氏胶体剪切成1～4mm³的组织匀浆块，加入0.9%氯化钠注射液，离心800～900g,5min。收集末次洗涤液送检无菌。

3、接种

根据胶体重量，加入适量培养基，定容组织匀浆浓度约为04～0.7g/ml，移液器吹打组织匀浆块均匀后，将组织匀浆块接种于T75培养瓶中，加入培养基混合培养。

4、华通氏胶的P0代培养

平置培养瓶使组织匀浆块尽量均匀分布于整个底面，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2%。

第一次换液：组织块培养至第5～7天进行全量换液。将培养瓶中的未贴壁的组织块和旧的培养基一起合并转移到离心管，800～900g，离心5min，去掉上清液，将离心后的残余组织块，加入适量新鲜培养基，移液管吹打均匀，等量均分到原来的培养瓶，然后加培养基。平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面，放置CO₂恒温恒湿培养箱继续培养。

第二次换液：培养第10～13天换液。稍稍倾斜培养瓶，移液管轻轻吸掉半量旧的培养基，加入等量新鲜培养基。放置CO₂培养箱继续培养。

第三次换液：培养第14～16天时，如果细胞融合度未达到70%～80%时，增加一次半量换液。用移液管轻轻吸掉半量旧的培养基，再加入等量新鲜培养基，放置CO₂培养箱继续培养。

5、细胞收获

组织块培养的第14～18天，细胞克隆团的面积百分比到达70%～80%时，消化收获。去除培养基上清液，0.9%氯化钠注射液洗涤细胞。培养瓶中加入适量消化酶，直至浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶，倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，大部分贴壁组织块和细胞脱落，终止消化（消化时间不超过5min）。细胞悬液移入离心管中，少量0.9%氯化钠注射液冲洗瓶壁，洗涤液转入离心管中，移液管吹打悬浮后静置30秒，100μm无菌滤网过滤，滤液离心，300g，10min。弃去洗涤上清液，0.9%氯化钠注射液重悬细胞，得到P0代细胞。

实施例2

1、P0代细胞传代与培养

将细胞悬液，离心，300g，10min。弃去上清，用新鲜培养基轻轻吹打重悬浮细胞，按照5×10³个/cm²密度接种传代。每个T175瓶接种细胞悬液，补加新鲜培养基。放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2%。

2、细胞传代

细胞培养至72±24小时，倒置显微镜镜下观察细胞融合度达80%～90%后，即可进行消化收获，得到P1代细胞。

2.1消化

转移旧培养液至无菌容器中（如T175培养瓶）备用。适量0.9%氯化钠注射液轻轻冲洗培养瓶，洗涤液弃去。培养瓶按比例加入消化酶例如胰蛋白酶消化细胞，使之浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶，倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，大部分细胞脱落，终止消化（消化时间不超过5min）。收集细胞悬液，适量0.9%氯化钠注射液洗涤培养瓶，洗液转移到离心管中，离心，300g，10min。

2.2细胞计数

弃去洗涤上清，适量0.9%氯化钠注射液重悬细胞，重悬液送样检测细胞计数和细胞活率，细胞悬液离心，300g，10min。

2.3传代与培养

弃去洗涤上清，用新鲜培养基轻轻吹打重悬细胞，将重悬细胞液定容到一定体积后分装。根据规定的传代细胞密度接种传代，每个T175瓶接种细胞悬液，补加新鲜培养基。置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。条件：37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2%。

3、细胞的收获和冻存

细胞培养至72±24小时，倒置显微镜镜下观察细胞融合度达85%～90%后，即可进行消化收获，得到P2代细胞。

3.1消化收获：

将培养瓶内旧培养液转移至无菌容器中（如T175培养瓶）备用。0.9%氯化钠注射液洗涤细胞培养瓶，弃去洗涤液。培养容器加入胰蛋白酶消化细胞，使消化液浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶至倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，大部分细胞脱落，终止消化（消化时间不超过5min）。收集细胞悬液，0.9%氯化钠注射液洗涤培养瓶，洗涤后的细胞悬液转移到离心管中，离心，300g，10min。

3.2洗涤：

弃去洗涤上清液，0.9%氯化钠注射液重悬细胞沉淀，细胞重悬液合并到离心管中，离心，300g，10min。

3.3过滤和细胞计数：

弃去洗涤上清液，0.9%氯化钠注射液重悬细胞沉淀。细胞重悬液过100μm细胞筛网，滤去絮状物或细胞团块。滤液全部移入离心管中，定容，移液管轻轻吹打均匀，送样检测细胞计数和细胞活率，滤液等量分装到离心管中，加入0.9%氯化钠注射液定容后，离心，300g，10min。

3.4细胞的冻存分装：

弃去上清液，根据计数结果，在离心管中加入适量的培养基，重悬细胞沉淀，并将悬液体积定容到冻存终体积的1/2，浓度为冻存终浓度的两倍，取样进行种子细胞质量检定。从4℃冰箱中取出配制好的冻存液，沿管壁缓缓加入到细胞悬液中，移液管轻轻吹打均匀，使细胞密度与要求冻存密度一致。按每支冻存管1.0ml细胞悬液的标准分装。

3.5程序性降温：

使用程序降温仪进行程序性降温。

将需冻存的细胞放置于程序性降温仪中按照标准冻存程序降至-80℃以下。

3.6细胞入库：

冻存结束后，将冻存盒取出转移到液氮罐中贮存。

实施例3

1、细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存的细胞，放入电热恒温水槽中的复苏架上（水温保持在40.0℃左右），快速晃动复温。细胞悬液由固态变为液态时，复苏即完成。

1.1细胞的洗涤：

细胞悬液合并到离心管中。加入预冷0.9%氯化钠注射液，移液管吹打洗涤，定容，混匀，离心，300g，10min。

1.2取样计数和洗涤：

弃去洗涤上清液，适量预冷0.9%氯化钠注射液重悬细胞沉淀,合并至离心管中，送样检测细胞总数和细胞活率，细胞悬液离心，300g，10min，弃去上清，得到P3代细胞。

1.3传代与培养：

按照5×10³个/cm²的传代细胞密度接种传代。每个T175瓶接种细胞悬液后，补加新鲜培养基。放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2%。

2、种子细胞的传代

细胞培养至72±24小时，倒置显微镜镜下观察细胞融合度达85%～90%后，即可进行消化收获，得到P4代细胞。

2.1消化：

去除培养基上清液，0.9%氯化钠注射液洗涤细胞，洗涤液弃去。培养瓶中加入适量胰酶，直至浸润培养瓶底面。静置1min后，取培养瓶，倒置显微镜下观察，细胞呈圆形，大部分贴壁细胞脱落，终止消化（消化时间不超过5min）。细胞悬液移入离心管中，0.9%氯化钠注射液冲洗瓶壁，洗涤液并入离心管中，离心，300g，10min。

2.2细胞计数：

弃去洗涤上清，适量0.9%氯化钠注射液重悬细胞，将重悬液合并至一个离心管中，送样检测细胞计数和细胞活率，细胞悬液离心，300g，10min。

2.3传代与培养：

弃去洗涤上清，用新鲜培养基轻轻吹打重悬细胞，将重悬细胞液定容到一定体积后分装至离心管中。根据5×10³个/cm²的传代细胞密度接种传代，每个T175瓶接种细胞悬液后，补加新鲜培养基。置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱，37.0±0.5℃，二氧化碳体积分数为5.0±0.2%。

根据本发明的上述工艺，每1瓶P0代细胞（3×10³），传代至P4代，可获得625瓶，3×10⁶的细胞/瓶。这是本发明的细胞培养体系、培养工艺能够取得的优良效果。

实施例4脐带间充质干细胞的鉴定

1、细胞表面抗原鉴定

将实施例3制备得到的P4代脐带间质干细胞样品移入相应流式管内，加入1ml PBS充分混匀，500g离心5分钟，弃上清，重复洗涤2次；加入适量PBS混悬细胞，过滤，计数，将细胞浓度调整为(2.0～6.0)×10⁶个/ml待用；取出若干支流式管，加入各组抗体及同型对照试剂（避光操作）；然后将准备好的细胞样品加入已加入抗体试剂的流式管内，每管100μl，充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30分钟；孵育完成后每管加入1ml PBS，充分混匀，500g离心5分钟，弃上清液，重复此洗涤过程1次，调整细胞悬液体积至200μl左右，上机检测。

结果如下表1所显示。

标记物	CD105	CD90	CD73	CD44	CD29	CD45	CD34	CD19	HLA-DR	CD14
											含量	99.8%	99.9%	99.2%	99.3%	99.9%	1.4%	0.7%	1.0%	0.7%	1.0%

结果显示：获得的脐带间质干细胞的CD90、CD29、CD73、CD105表达全部大于99%，同时，CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达全部小于2%。

2、成骨成脂诱导分化潜能鉴定

2.1成脂分化鉴定

将P4代细胞样品调整细胞密度为l×10⁵ml，接种于24孔板内，1～2天后细胞融合达70％～80％，此时以成脂细胞诱导培养液培养，每3天全量换液1次，第21天油红0染色。

结果如图1a所显示。

细胞样品成脂诱导第21天油红O染色后脂滴呈红色，对照组则未出现脂滴。脐带间质干细胞中约30-40%转化为脂肪细胞。

2.2成骨分化鉴定

将实施例3制备得到的P4代细胞样品调整细胞密度为l×10⁵／ml，接种于24孔板内，1～2d后细胞融合达70％～80％，此时以成骨细胞诱导培养液培养，每3天全量换液1次，第28天茜素红染色。

结果如图1b所显示。

结果显示：成骨诱导第28天茜素红染色后钙化结节呈红色，对照组则未出现。经观察，脐带间质干细胞中超过70%转化为成骨细胞。

实施例5动物模型研究

以MRL/lpr小鼠红斑狼疮模型研究了本发明的人脐带间充质干细胞对治疗红斑狼疮的有效性和有效剂量范围。

取MRL/lpr雌性红斑狼疮小鼠75只，随机分为5个组，分别尾静脉注射给予实施例3制备得到的P4代脐带间质干细胞按1×10⁶细胞/kg(组1)、3×10⁶细胞/kg(组2)、9×10⁶细胞/kg(组3)，阳性对照组给予环磷酰胺100mg/kg(组4)，阴性对照组给予同体积生理盐水(组5)，每周给药1次，连续给药2周。给药前及给药后每4周球后采血，采用ELISA法检测血清ds-DNA抗体；每4周收集24h尿样，采用考马斯亮蓝法检测尿蛋白；给药16周实验结束，断头采血，使用流式细胞仪进行CD₄ ⁺和CD₈ ⁺T淋巴细胞检测。取动物肺脏和肾脏及股骨进行HE染色并进行病理评级。

结果如图2a-g所显示。其中图2a是人脐带间充质干细胞给药对小鼠血清dsDNA抗体的影响。图2b是人脐带间充质干细胞给药对小鼠24小时尿蛋白的影响。图2c是人脐带间充质干细胞治疗16周对小鼠外周血CD4、CD8细胞的影响。图2d是人脐带间充质干细胞治疗16周对小鼠外周血CD4、CD8细胞的影响。图2e-g分别是对处理后小鼠的肺脏和肾脏及股骨进行HE染色的结果图。

结果显示，与阴性对照组相比，各剂量组在给药后4周、8周、12周和16周ds-DNA抗体和24h尿蛋白均显著降低；实验结束时各剂量组CD₄ ⁺显著降低，CD₈ ⁺细胞略微升高，CD₄ ⁺/CD₈ ⁺明显降低；治疗组肺脏和肾脏及股骨病变明显减轻。脐带间质干细胞1×10⁶细胞/kg～9×10⁶细胞/kg显示出了较好的量效关系，而9×10⁶细胞/kg显示出了最佳治疗效果。

实施例6临床实验

在病人中研究了本发明的人脐带间充质干细胞对治疗红斑狼疮的有效性和有效剂量范围。

40例复发性SLE受试者符合1997年美国风湿病学院（ACR）的SLE的诊断标准，且疾病活动度为中、重度（SLEDAI≥9分或BILAG为A级或者B级），以及糖皮质激素≥0.5mg/kg/d+环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）0.5～0.75/m²,治疗6个月无效；或糖皮质激素≥0.5mg/kg/d+其他免疫抑制剂，治疗3个月无效；或糖皮质激素维持治疗量≥20mg/d），治疗3个月无效，并签署知情同意书。

治疗方案：经静脉途径输注实施例3制备得到的P4代脐带间充质干细胞2次（间隔7天），每次输注剂量为1×10⁶/kg，30分钟内滴注完成。

观察点及疗效评价：受试者分别在第1次脐带间充质干细胞治疗后1周、1月、3月、6月、9月及12月进行随访。主要疗效指标包括SLEDAI评分，BILAG评分，24小时尿蛋白，血液系统指标，抗ds-DNA、抗ANA，补体（C3、C4）等。

结果：

1）患者疾病活动度（SLEDAI评分、BILAG评级（British Isles lupusassessment group index，英岛狼疮评定组指数））：治疗后明显改善，各随访点与治疗前比较均有不同程度的下降，SLEDAI评分（systemic lupuserythematosus disease activity index，系统性红斑狼疮疾病活动性指数）的均值由基线的10.83下降到12个月随访的6.48，差异均具有统计学意义（p<0.05）；

2）24小时尿蛋白：治疗后患者24小时尿蛋白逐步下降，到治疗后9个月、12个月时与治疗前比较，差异具有统计学意义（p<0.05）；

3）血清补体C3：由治疗前的0.74±0.40mg/L上升到12个月随访的0.95±0.28mg/L（p<0.05）

4）其他：患者血清总蛋白、白蛋白治疗后不同程度上升，部分顽固性血小板降低患者血液系统指标得到改善；抗双链DNA抗体、抗核抗体（ANA）：患者抗双链DNA抗体和ANA分析，干细胞治疗后均有不同程度的下降。

结果如图3a-c所显示。

结果显示，与阴性对照组相比，各剂量组在给药后4周、8周、12周和16周ds-DNA抗体和24h尿蛋白均显著降低；实验结束时各剂量组CD₄ ⁺显著降低，CD₈ ⁺细胞略微升高，CD₄ ⁺/CD₈ ⁺明显降低；治疗组肺脏和肾脏及股骨病变明显减轻。hUCMSCs1×10⁶细胞/kg～9×10⁶细胞/kg显示出了较好的量效关系，而9×10⁶细胞/kg显示出了最佳治疗效果。

本发明的发明人出乎意料地发现用本发明的方法制备的脐带间质干细胞能够有效地治疗系统性红斑狼疮例如复发性系统性红斑狼疮。利用本发明制备的脐带间质干细胞具有不同于现有技术的优点：（1）免疫原性弱，不诱导免疫排斥反应；（2）具有类似“免疫豁免”的特性，可抑制同种异体免疫反应，抑制移植物抗宿主病（GVHD）；（3）不涉及社会、伦理、法律方面的更多争论；（4）来源充足，对患者体质无很高要求，普通患者容易接受；（5）分离方法简单，细胞活力很强，容易大量扩增，可能与其具有更长的端粒有关；（6）脐带间质干细胞是一种更原始的干细胞群。本发明提供的脐带间质干细胞能够有效地治疗红斑狼疮，例如复发性系统性红斑狼疮。

除非另外指出，本发明的实践将使用生物技术、有机化学、无机化学等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。本文所提到的所有专利、专利申请与科技论文均据此通过引用结合到本文。

Claims (10)

1.脐带间质干细胞在制备治疗红斑狼疮的制剂中的应用，所述脐带间质干细胞通过以下方法制备：

步骤1：获得脐带华通氏胶；

步骤2：组织块制备和接种，其中将所述胶体剪切成约1～4mm³的组织匀浆块，用无血清培养基定容组织匀浆浓度为约0.4～0.7g/ml，吹打匀浆均匀后接种于培养瓶中，加入无血清培养基培养；

步骤3：P0代细胞培养，其中将上述培养瓶放置于二氧化碳培养箱培养，培养至第5～7天进行全量换液；培养至第10～13天进行半量换液；培养至第14～18天，细胞融合度达到70%～80%时，用消化酶消化收获得到P0代细胞；

步骤4：P1代细胞培养，其中将所述P0代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到80%～90%后，用消化酶消化收获得到P1代细胞；

步骤5：P2代细胞培养，其中将所述P1代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到85%～90%，用消化酶消化收获得到P2代细胞；

步骤6：P3代细胞培养，其中将所述P2代细胞接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养至细胞融合度达到>95%后，用消化酶消化收获得到P3代细胞；

步骤7：P4代细胞培养，其中将所述P3代细胞按照约5×10³个/cm²密度接种于培养瓶中，放置于二氧化碳培养箱培养，细胞培养至第2～4天，细胞融合度达到85%～90%后，用消化酶消化收获得到P4代的脐带间质干细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其中步骤5还包括将消化酶消化收获得到的所述P2代细胞冻存，其中将所述P2代细胞悬浮在冻存液中，放置于程序性降温仪中降至-80℃以下冻存。

3.根据权利要求2所述的应用，其中步骤5还包括将冻存的P2代细胞复苏，其中将所述冻存的P2代细胞在温度约40.0℃下水浴，快速晃动复温，细胞悬液由固态变为液态时，接种至细胞培养瓶中。

4.根据权利要求1所述的应用，其中步骤3中细胞培养至第14～16天时，如果细胞融合度未达到70%～80%，再进行一次半量换液。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述消化酶为胰蛋白酶。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其中在步骤3-7的细胞培养中，都采用无血清培养基进行细胞培养。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其中还包括步骤8，其中对所述P4代的脐带间质干细胞进行表面抗原检验，筛选表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%，并且表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%的脐带间质干细胞，和/或，

对所述P4代的脐带间质干细胞进行成骨转化率和成脂转化率检测，筛选成骨转化率大于70%，并且成脂转化率为约20-30%的脐带间质干细胞。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其中所述红斑狼疮为复发性系统性红斑狼疮。

9.一种用于治疗红斑狼疮的制剂组合物，其中含有脐带间质干细胞，所述脐带间质干细胞如权利要求1-8中所定义，优选的，所述脐带间质干细胞的剂量为1×10⁶细胞/kg～9×10⁶细胞/kg，或者优选的，所述脐带间质干细胞的量为1×10⁶细胞～9×10⁶细胞。

10.根据权利要求9的制剂组合物，其中所述脐带间质干细胞的表面抗原CD90、CD29、CD73、CD105表达都大于99%，并且表面抗原CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR表达都小于2%，

和/或，

其中所述脐带间质干细胞的成骨转化率大于70%，并且成脂转化率为约20-30%。

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