KR102117894B1 - 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유도신경줄기세포의 생산과정에서 만능성 상태를 경유하였는지 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 신경계에 관련된 질환 모델링, 신경줄기세포 분화 및 발달 메커니즘 연구 등에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 유도신경줄기세포를 이용한 세포치료제를 개발하는데 있어 만능성 상태를 거치지 않는 유도신경줄기세포 확립 기술로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법{METHOD OF CONFIRMING THAT DIRECT REPROGRAMMING CELL IS IN SATE PLURIPOTENT STEM CELL}

본 발명은 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유도신경줄기세포의 생산과정에서 만능성 상태를 경유하였는지 여부를 확인하는 방법에 관한 것이다.

최근 계통 특이적인 전사인자를 체세포에 도입하여, 세포의 형질을 전환시키는 기술(이하 교차분화)의 연구가 활발히 진행되고 있다. 기존 환자 특이적 치료용 세포를 생성하기 위해 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell) 상태를 거쳐 원하는 타겟 세포로 분화시키던 방법과 달리, 교차분화 기술은 만능성 상태를 경유하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 임상적 측면에서 미분화 잔류 세포의 혼입으로 인한 종양형성 문제를 배제할 수 있다는 점, 특정 세포 생산에 걸리는 시간이 짧고 그 과정이 단순하다는 점 등이 교차분화 기술의 장점으로 평가받고 있다. 이에 환자 특이적 섬유아세포나 소변세포를 이용해 다른 계통의 체세포, 혹은 전구세포로 유도하는 연구가 진행된 바 있다.

신경줄기세포는 뇌를 구성하는 대표적인 3가지 세포인 신경(neuron), 교세포(glial cell), 회돌기세포(Oligodendrocyte)로 분화할 수 있는 전구세포의 일종으로, 자가 복제와 분화를 통해 세 종류의 세포를 지속적으로 생성할 수 있다. 상기 언급한 교차분화 기술을 이용하여 체세포에서 직접 신경줄기세포를 생산하고 이를 바탕으로 전임상 및 질환기전연구 등이 활발하게 진행되고 있다.

본 연구진은 일련의 연구를 통해 유도만능줄기세포의 생산에 사용되는 유전자 중 하나인 Oct4를 Brn4로 대체하고 Klf4, Sox2, cMyc 유전자를 레트로 바이러스를 이용하여 체세포에 개별도입함으로써 체세포를 신경줄기세포로 교차분화시키는 기술을 개발하였고, 개발된 유도신경줄기세포는 형태, 유전자발현양상, 후생유전적 양상, 전기생리학적 특성, 체외 및 체내 분화능 등 다양한 측면에서 체내유래 신경줄기세포와 매우 유사한 양상과 기능성을 보였다.

2015년 타 연구진이 계통 추적 시스템을 적용하여, 교차분화를 통해 생성된 유도신경줄기세포가 만능성 상태를 경유하여 만들어졌음을 확인하였다. 해당 연구에서는 폴리시스트로닉 벡터(polycistronic vector)를 사용하여 본 연구진에서 사용했던 신경줄기세포 특이적 전사인자인 Brn4와 Klf4, Sox2, cMyc(이하 BKSM)을 형질도입하여 유도신경줄기세포를 생산하였고 그 과정에서 모든 유도신경줄기세포가 만능성 상태를 경유하였다고 보고하였다.

이에 본 연구진은 폴리시스트로닉 벡터와 개별 벡터를 통해 도입된 BKSM이 체세포를 유도신경줄기세포로 전환을 유도하는 과정을 관찰하였고, 두 가지 계통 추적 시스템을 적용하여 유도신경줄기세포 생산과정에서 만능성 상태 경유 여부를 검증하였다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점들을 해결하기 위해 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법을 확립하고 이에 대하여 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명은 유도신경줄기세포의 생산과정에서 만능성 상태를 경유하였는지 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 의해 보다 분명하게 알게 될 것이다. 또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 청구범위에 나타낸 수단 및 그 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.

본 발명의 일 양태는 다음 단계를 포함하는 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법이다:

Oct4 프로모터에 작동가능하게 연결된 CRE(Cre-recombinase) 유전자 코딩 핵산서열, 상기 CRE 유전자 활성화에 의해 제거되는 loxP 코딩 핵산서열, 및 loxP 제거 시 발현되는 형광 단백질 코딩 핵산서열을 포함하는 체세포를 준비하는 체세포 준비 단계;

상기 체세포에 Brn4, Klf4, Sox2 및 cMyc를 코딩하는 핵산 서열을 개별적으로 코딩하는 각각의 벡터를 도입하는 형질 도입 단계; 및

상기 체세포를 배양하여 형광이 발현되면 교차분화세포가 만능성 상태를 경유하여 생성되었다고 판단하는 판단 단계.

상기 형광 단백질은 EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)일 수 있다.

상기 체세포는 섬유아세포인 것일 수 있다.

상기 교차분화세포는 유도신경줄기세포인 것일 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 신경계에 관련된 질환 모델링, 신경줄기세포 분화 및 발달 메커니즘 연구 등에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 유도신경줄기세포를 이용한 세포치료제를 개발하는데 있어 만능성 상태를 거치지 않는 유도신경줄기세포 확립 기술로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1a는 Oct4-CreER를 사용하여 섬유아세포로부터 iNSCs로 직접 교차분화하는 과정의 추적 시스템을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 pcOKSM 및 pcBKSM으로 형질전환된 MEF로부터 최초의 iNSC 클러스터 및 생성된 iNSC의 형태를 나타낸 사진이다.
도 1c는 pcOKSM 및 pcBKSM으로 형질전환되어 파생된 iNSC 라인에서 NSC 및 섬유아세포 특이적 마커 발현을 qPCR 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 1d는 pcOKSM 및 pcBKSM으로 형질전환되어 파생된 iNSC 라인의 면역형광염색 결과 사진이다.
도 1e는 pcOKSM 및 pcBKSM으로 형질전환되어 파생된 iNSC 라인에 대한 직접적(Olig2 + / EYFP-) 또는 간접적(Olig2 + / EYFP +)으로 생성된 iNSC의 수를 확인하기 위한 FACS 분석 결과이다.
도 1f는 pcOKSM 및 pcBKSM으로 형질전환되어 파생된 iNSC 라인의 유전자 발현 패턴을 보여주는 히트 맵 분석 결과이다. 유전자 발현 프로파일을 기반으로 한 계층적 클러스터링 분석이 상단에 표시됩니다. MEFs와 cNSC 대조군 사이에서 FC = 4 인 차별적으로 발현 된 유전자와 적어도 하나의 표본에서 FPKM = 1이 그려졌다.
도 1g는 EYFP-pcOKSM 및 pcBKSM iNSC의 면역형광염색 결과 사진이다.
도 1h는 EYFP-iNSCs의 qPCR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 클로날 mcBKSM에 의해 생성된 iNSC 라인에 대한 면역형광염색 결과 사진이다.
도 2b는 두 클로날 mcBKSM iNSC 라인에 대하여, 섬유아세포 및 NSC 대조군에 대한 글로벌 유전자 발현 패턴의 계층적 클러스터링 히트 맵을 나타낸 결과이다.
도 2c는 섬유아세포, NSC 대조군 및 4개의 mcBKSM 매개 iNSC 클론에서 Nestin의 두 번째 인트론 및 Col1a1의 프로모터 영역의 DNA 메틸화 상태를 바이설파이트 시퀀싱 PCR로 확인한 결과이다.
도 2d는 확립된 클로날 mcBKSM 매개 iNSC 라인(passage 5)에서 개별 레트로 바이러스 전이 유전자의 발현 수준을 qPCR에 의해 분석한 결과 그래프이다.
도 2e는 클로날 mcBKSM iNSC 라인의 직접적 (Olig2 + / EYFP-) 및 간접적으로 (Olig2 + / EYFP +) 생성된 iNSC의 수를 나타낸 FAC분석 결과이다.
도 2f는 클로날 mcBKSM iNSC 라인의 mcOKSM- 또는 mcBKSM- 전달된 MEF의 대량 개체수를 결정하기 위한 감염 25일 후의 FACS 분석 결과이다.
도 3a는 pcOKSM, pcBKSM, mcOKSM 또는 mcBKSM으로 형질도입된 MEF에서의 다능성 마커의 시간 경과 qPCR 분석 결과 그래프이다.
도 3b는 pcOKSM, pcBKSM, mcOKSM 또는 mcBKSM으로 형질도입된 MEF에서의 NSC- 마커의 시간 경과 qPCR 분석 결과 그래프이다.
도 3c는 도메인 교환에 의한 일련의 상호 Oct4-Brn4 키메라의 생성을 나타낸 모식도이다.
도 3d는 Oct4, Brn4 또는 Oct4-Brn4 키메라 단백질로 MEF를 리프로그래밍한 효율을 측정하기 위하여 GFP + 콜로니 수를 계수한 결과 그래프이다.
도 3e는 mcOKSM 또는 mcBKSM으로 MEF에 형질도입 3주 후 전체 세포 집단의 FACS 분석 결과이다.
도 3f는 레트로 바이러스 전이 유전자 Oct4, Brn4 및 키메라 컨스트럭트를 발현하는 레트로 바이러스 벡터의 qPCR 적정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3g는 tet-유도성 pcOKSM, pcBKSM 또는 pOct1-KSM으로 유도 후 8일 또는 14일 후 리프로그래밍된 Oct4-GFP MEF의 대표 이미지를 나타낸 사진이다.
도 3h는 dox-유도된 높은(H), 중간(M) 및 낮은(L) 수준을 사용하여 tet-유도성 pPOU-KSM 컨스트럭트와 Oct4-GFP MEFs의 리프로그래밍 결과 그래프이다.
도 3i는 폴리 및 모노시스트로닉 전달 시스템으로 리프로그래밍함으로써 달성되는 iNSC로의 체세포의 분기 경로를 설명하는 모식도이다.
도 4a는 STEMCCA 구조 내에서 POU 인자와 Klf4 사이의 F2A자가 절단 펩타이드를 보다 효율적인 자체 절단 인자 P2A, 절단 불가능한 돌연변이 F2A(F2Am) 또는 합성 글리신 링커(GL)로 대체하였음을 나타낸 모식도이다.
도 4b는 3xFLAG로 N 말단에 표지된 POU 인자가 야생형 P2A, F2A 또는 절단 불가능한 F2Am 펩타이드에 의해 Klf4로부터 분리된 Oct4 및 Brn4-Klf4 카세트로 형질도입된 MEF에 대하여 FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 4c는 5 passages 후 POU3-F2Am-KSM 카세트로 생성된 클로날 iPSC 라인을 확인한 사진이다..
도 4d는 POU3-F2Am-KSM 카세트로 생성된 클로날 iPSC 라인의 PCR 확인 결과 사진이다.
도 4e는 KSM과 함께 다른 펩타이드에 의해 연결된 POU-Klf4 컨스트럭트를 갖는 Oct4-GFP MEF의 리프로그래밍 효율은 유도 1 및 2 주 후에 GFP + 콜로니 수를 계수함으로써 측정하였다.
도 4f는 완전히 절단 가능한 Oct4 및 Brn4-P2A-KSM 폴리시 스템 카세트를 갖는 Oct4-GFP MEF의 리프로그래밍 및 리프로그래밍이 결핍된 Brn4-P2A-KSM 복원을 시도하는 추가 컨스트럭트와의 조합을 나타낸 그래프이다.
도 4g는 KSM과 함께 3xFlag-POU-Klf4로 유도된 4일째에 리프로그래밍된 MEF의 항-FLAG 항체를 이용한 크로마토그래피 면역침전(ChIP)-qPCR 분석한 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 선형 추적 시스템으로 확인한 섬유 아세포의 iNSCs로의 직접적인 전환

직접적인 분화 과정을 통해 iNSC를 얻을 수 있는지 여부는 의문의 여지가 있다. 공지된 연구에서 유전적인 계통 추적을 사용하지 않았기 때문에, 리프로그래밍 실험 과정에서 나타나는 다능성 상태를 놓칠 수 있었다. 또한, 널리 사용되는 STEMCCA 리프로그래밍 카세트에 기초한 폴리시스트로닉 렌티 바이러스 벡터를 사용하였다. 따라서 다능성의 결정적인 지표인 내인성 Oct4의 발현을 위해 유전적 계통 추적을 사용하여 두 가지 유전자 전달 시스템을 비교하기로 결정하였다. 실험의 첫 번째 세트에서는 Rosa26-loxSTOPlox- 디프테리아 독소 A 단편 대립 유전자(R26-ls1-DTA)와 함께 타목시펜 유도성 Oct4-CreER 대립 유전자를 보유한 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 사용하였다.

사용된 모든 마우스는 건국 대학교(KU)의 마우스 시설에서 사육되고 보관되었으며, 동물 취급은 KU 동물 보호 지침에 따라 수행되었다. Oct4-CreER 마우스(스톡 넘버: 016829, Jackson Laboratory)를 Rosa26-lox-STOP-lox-EYFP 마우스(스톡넘버 : 006148)와 교배시켰다. MEFs는 주의 깊게 머리와 척수를 포함한 모든 내부 기관을 제거한 후 수정 후 13.5 일에 Oct4-CreER X Rosa26-loxSTOPlox-EYFP 마우스 배아에서 얻었다. 10% FBS(Biowest), 5 ml의 페니실린/스트렙토마이신/글루타민 (Invitrogen), 5 ml의 MEM NEAA 용액(Invitrogen)을 포함하는 DMEM(Biowest)에서 MEF 배지 500 ml로 정확한 유전자형을 유지하였다. Oct4-CreER x Rosa26-loxSTOPlox-DTA 마우스의 MEF는 Konrad Hochedlinger 교수(Harvard Stem Cell Institute)의 연구실에서 받았다.

추출한 체세포는 Oct4를 발현할때, Oct4 프로모터에 의해 Cre-recombinase를 발현한다. 생산된 Cre-recombinase는 4-OHT가 처리된 조건 하에서 활성화 되어 loxP를 인지 및 제거한다. 최종적으로 loxP와 함께 stop 코돈이 함께 제거되어, Diphtheria toxin A(DTA) 유전자가 발현하게 되고, DTA는 리보솜의 단백질 합성 과정을 억제, 세포을 유도한다. 즉, 본 이중 유전자 조작 계통 추적 시스템에서는 Oct4를 한번이라도 발현할 경우 세포 사멸에 이르게 된다.

폴리시스트로닉 벡터를 사용하여 iNSC를 생성하기 위해 5 x 10⁴ MEFs는 pcOKSM 또는 pcBKSM에 대한 렌티바이러스 인코딩으로 감염되었다. 배양 24시간 후, 배지를 3 ug/ml의 dox를 함유하는 NSC 배지로 대체하였다. pcOKSM 또는 pcBKSM으로 유도한 지 7-8일 후, 세포를 dox 처리하지 않은 NSC 배지에서 23 내지 24일 동안 배양하여 초기 iNSC 클러스터를 팽창시켰다. 4-하이드록시타목시펜(4-OHT) 1 uM을 배양 배지에 연속적으로 첨가하였다.

개별 레트로 바이러스 벡터 매개 iNSC를 생성하기 위해, MEFs는 mcOKSM 또는 mcBKSM을 암호화하는 개별 레트로 바이러스 입자로 형질 도입되고 통상적으로 배양되었다. 간단히 말해, 5 Х 10⁴ 섬유아세포를 젤라틴 코팅 35 mm 접시 위에 도말하고, 친환경 레트로 바이러스로 배양하였다. 배양 48시간 후, 레트로 바이러스 입자를 함유하는 배지를 NSC 배지로 대체하였다. iNSC를 풍부하게 하기 위해, 리프로그래밍되지 않은 섬유아세포 또는 부적절한 세포는 제거하였다.

클론 iNSC 라인을 확립하기 위해 iNSC 벌크 배양물을 SSEA1에 대해 염색하고, SSEA1 + 단일 세포를 BD FACSAriaTM(BD Biosciences)를 사용하여 분류하여 라미닌/폴리-D-라이신-코팅된 96-웰 플레이트 상에 플레이팅 하였다. 2% B27(Gibco), 10 ng/ml EGF(Peprotech), 10 ng/ml bFGF(Peprotech) 및 1% BFGF가 첨가된 DMEM/F-12를 NSC 배양 배지에서 유지시켰다.

뉴런으로의 분화를 위해, iNSCs는 NSC 배지에서 2.5 Х 10⁴ 세포 / cm²의 라미닌/폴리라이신-코팅된 접시 위에 도말되었다. 다음날, 배지를 신경 분화 배지: 2% B27(Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민(Invitrogen) 및 10 ng/ml bFGF(Peprotech)가 보충된 DMEM/F-12로 대체하였다. 분화 4일째, 배지는 성장 인자가 없는 200 mM 아스코르빈산(Sigma)을 함유하는 신경 분화 배지로 8-10일 동안 더 배양되었다. 성상 세포로의 분화를 위해, iNSCs를 젤라틴 코팅 배양 접시에서 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민이 보충된 DMEM/F-12에서 5일 동안 배양하였다.

마지막으로, oligodendrocytes로 차별화하여, iNSCs은 NSC 매체 2.5 Х 10⁴ 세포/cm²에서 laminin/polylysine-코팅 접시에 도금하였다. 다음날, 희석 돌기 세포 분화 배지: 2% B27, 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 10 ng/ml bFGF 및 10 ng/ml PDGF(Sigma)가 첨가된 DMEM/F-12로 배지를 교체하였다. 분화 4일째에, 배지를 30 ng/ml의 T3(시그마) 및 200 mM 아스코르빈산을 포함하는 희소 돌기 아교 세포 분화 배지로 4일 더 배양 하였다. 차별화 배지는 격일로 교체되었다.

대조군 MEF에서는 어떠한 형태학적 변화도 관찰하지 못했다. 이 전 세포를 NSC 마커(이하 DTA-iNSCs, 그림 S1C-S1D)를 발현하는 안정한 iNSC 라인으로 확장시켰다. 이 계통을 유전자형으로 분석하면 pcBKSM, Oct4-CreER 및 R26-lsl-DTA가 통합되어 드물게 생존한 DTA-iNSC가 다능성 상태를 통과하지 않았음을 알 수 있었다.

전체 게놈 전사 프로파일링 결과, DTA-iNSCs의 유전자 발현 양상은 대조군 NSC와 유사하지만 MEF를 시작한 유전자 발현 양상과는 다르다는 것을 보여 주었다. Tuj1, GFAP 및 MBP 각각에 대한 면역 염색에 의해 입증된 바와 같이, 뉴런, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성하기 위한 DTA-iNSC의 시험관내 분화능을 확인하였다.

마지막으로, 생성된 세포의 생체 내 기능을 검사하기 위해 1 Х 10⁶ GFP로 표지 된 DTA-iNSC를 쥐의 두뇌 피질 영역에 이식했다. 이식 4주 후, 이식 된 DTA-iNSCs는 뉴런 (GFP + / DCX1 +), 성상 교세포 (GFP + / GFAP +) 및 희소 돌기 아교 세포 (GFP + / NG2 +)의 세 가지 신경 세포 유형으로 분화되었다. 선행 연구에서처럼 이식된 쥐의 어떤 세포에서도 종양 형성의 증거를 발견하지 못했다.

종합하면, MEFs가 반드시 Oct4 + iPSC 유사 상태를 통과하지 않고 기능적으로 성숙한 iNSC로 직접 변환될 수 있음을 시사한다. 그러나 직접 변환 과정의 전환 효율 (10 개의 개별 감염에서 2 iNSC 라인)이 상대적으로 낮다는 것을 고려할 때, DTA가 불완전한 Cre 재조합으로 인해 활성화되지 않은 소수의 Oct4 + 세포가 iNSC에 기여했을 가능성을 배제할 수 없다.

실시예 2: 폴리시스트로닉 BKSM으로 유도된 iPSC 유사 상태

직접 또는 간접 리프로그래밍에 의해 생성된 iNSC(induced neural stem cells)의 수를 정량화하기 위해, 도 1a와 같이 DTA 대신에 R26-IL-EYFP를 운반하는 계통 추적 시스템을 사용하였다. 이 시스템은 EYFP 리포터의 활성화를 조사하여 직접 및 간접적으로 생성된 iNSC를 구별 가능하게 하였다.

구체적으로, Oct4-CreER 대립유전자를 가지고 있는 유전자 조작 생쥐(이하 Oct4-CreER)와 Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP 유전자를 가지고 있는 유전자 조작 생쥐(이하 R26-lsl-EYFP)의 교배를 통해, Oct4-CreER 대립유전자와 Rosa26-lsl-EYFP 유전자를 함께 가지고 있는 이중 유전자 조작 생쥐를 생성한다. 생성된 이중 유전자 조작 생쥐는 수정된 뒤 13.5일 이후 모체로부터 분리되어 일반체세포를 추출한다. 추출된 체세포는 위에서 서술한 바와 같이, 4-OHT 처리 조건 하에서 Oct4를 발현할 경우 EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)를 발현한다. 즉, 본 이중 유전자 조작 계통 추적 시스템에서는 Oct4를 한번이라도 발현할 경우, EYFP를 발현하게 된다.

레트로바이러스 개별 벡터를 매개로, 혹은 폴리시스트로닉 벡터를 이용하여 BKSM(Brn4 + Klf4 + Sox2 + cMyc)을 이중 유전자 조작 체세포(MEFs, mouse embryonic fibroblats)에 48시간 동안 도입한 뒤, 신경줄기세포 특이적인 배양액(Neural stem cell culture medium; NSC)에서 배양하였다. 약 3주 후 신경세포 형태를 가진 유도신경줄기세포가 생성되는 것을 확인하였고, 5 - 7주 사이 유세포분석을 통해 EYFP는 발현하지 않으면서, SSEA1만 발현하는 세포만을 선택적으로 분리해 유도신경줄기세포 세포주를 확립하였다.

도 1b에서 확인할 수 있듯이, 2주 간의 pcOKSM(polyclonal, Oct4 + Klf4 + Sox2 + cMyc) 및 pcBKSM 유도 후 전형적인 NSC 형태가 나타났다(스케일 바, 50 um).

면역형광염색을 위하여 세포를 실온에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드 (Sigma)로 고정시킨 후, 실온에서 2시간 동안 0.3% Triton X-100(Sigma) 및 5% FBS(Biowest)를 함유한 Dulbecco 's PBS(Biowest)에 처리하였다. 그 다음 세포를 4℃에서 16시간 동안 1차 항체와 함께 배양하고, PBS로 3회 세척한 다음, 암실에서 실온에서 2시간 동안 적절한 형광-접합된 2차 항체로 배양하였다. 핵은 Hoechst 33342(Sigma)로 염색되었다(마우스 anti-Nestin(Millipore, 1:200), 염소 anti-Sox2(Santa Cruz Biotechnology, 1:200), 마우스 anti-SSEA1(Santa Cruz Biotechnology, 1:100), 토끼 마우스 anti-Tuj1(Covance, 1:500), 토끼 항-GFAP(DAKO, 1:500), 래트 항-MBP(Abcam, 1:100) 및 래트 안티-Nanog(eBioscience, eBioMLC-51, 1:1000)).

도 1c 및 1d에서 확인할 수 있듯이, 첫 번째 세포 클러스터(개별 감염 당 6-8 군데)를 관찰하여 전형적인 NSC 유전자 발현 프로파일을 나타내는 안정한 iNSC 라인을 생성하였다(스케일 바, 50 um).

형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 사용하여 pcOKSM 또는 pcBKSM 생성 iNSCs에 대한 EYFP transgene과 Olig2 표현의 활성화를 계량하였다.

구체적으로, 세포를 트립신으로 해리시키고, PBS로 한번 세척하고, FACS 완충액(5% FBS를 함유하는 PBS)에 재현탁시켰다. 1 Х 10⁶ 세포를 항 SSEA1(Santa Cruz Biotechnology, 1:10)에 대해 4℃에서 15분간 항온처리한 FITC-접합 항체와 함께 배양하였다. 세포를 FACS 완충액으로 1회 세척하고 BD FACSAriaTM(BD Biosciences)을 사용하여 분석을 위해 PBS에 재현탁시켰다.

도 1e에서 확인할 수 있듯이, 두 경우 모두에서 iNSC의 대다수가 EYFP(각각 96.1과 97.9 %)와 Olig2(둘 다 99 % 이상의 Olig2 +)에 양성인 것으로 밝혀졌다. 특히, 작은 재조합 EYFP-iNSC 집단 (Olig2 + / EYFP-)은 리프로그래밍 조건 모두에서 일관되게 관찰되었으며, 직접 변환된 세포를 나타낼 수 있음을 나타내었다.

도 1f에서 확인할 수 있듯이, pcOKSM 및 pcBKSM으로 형질전환되어 파생된 iNSC 라인을 섬유아세포 및 NSC 대조군에 대하여 히트 맵으로 분석한 결과 iNSC의 정체성은 전체 게놈 전사 프로파일링에 의해 NSC에 가까운 것으로 확인되었다. MEFs와 cNSCs 사이에서는 FC = 4, 그리고 표본 중 적어도 하나에서 FPKM = 1 인 차별적으로 발현된 유전자가 나타났다.

도 1g 및 1h에서 확인할 수 있듯이, pcOKSM 또는 pcBKSM으로 얻은 EYFP-iNSC 세포는 EYFP + iNSC와 마찬가지로 NSC 마커 유전자를 발현하였다. 그러므로 소수의 pcOKSM 및 pcBKSM-iNSC는 다능성 상태를 거치지 않고 MEF에서 직접 전이 분화되었을 수 있다(스케일 바, 50 um).

그러나, 이러한 EYFP-iNSC 세포가 Cre에 의한 불완전한 절제와 같은 경우를 나타내는 것을 확실하게 배제할 수 없었다.

실시예 3: 개별적으로 형질 도입된 BKSM은 다분화능을 유도할 수 없음

폴리시스트로닉 유전자 전달 시스템의 결과를 참고하여, Brn4, Klf4, Sox2 및 cMyc(mcBKSM)를 암호화하는 모노시스트로닉 레트로 바이러스 벡터를 사용하여 계통 추적 실험을 반복하기로 결정하였다.

2 ~ 3 주간의 감염 후 첫 번째 iNSC 클러스터를 관찰하였다(개인 감염 당 ~ 10 개 클러스터). mcBKSM- 형질 전환 된 MEFs로부터 SSEA1 + 세포를 분류함으로써, 우리는 네 가지 독립적인 실험으로부터 네 개의 클론 iNSC 라인을 확립했다.

도 2a에서 확인할 수 있듯이, iNSCs는 NSC와 유사한 형태를 나타냈으나 섬유아세포와는 상이하였다(스케일 바, 50 um).

도 2b에서 확인할 수 있듯이, MEFs와 cNSCs 사이에서는 FC = 4, 그리고 표본 중 적어도 하나에서 FPKM = 1 인 차별적으로 발현된 유전자가 나타났다. iNSCs는 NSC와 유사한 유전자 발현을 나타냈으나 섬유아세포와는 상이하였다.

iNSCs의 DNA 메틸화 상태를 결정하기 위해 게놈 DNA를 sodium bisulfite로 처리하여 제조자의 지침에 따라 EpiTect Bisulfite Kit(QIAGEN)을 사용하여 모든 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 우라실 잔기로 전환시켰다. 간단히 말하면, PCR 증폭은 총 25 ul의 총 부피에서 SuperTaq polymerase(Ambion)를 사용하여 수행되었고 94℃에서 30초 동안 각 표적 부위에 대해 적절한 온도에서 어닐링된 변성 40 사이클의 프로토콜, 94℃에서 5분 동안 1차 변성시키고, 72℃에서 10분간 최종 변성시켜 72℃에서 30초간 연장하였다. 각 프라이머 세트에 대해, PCR의 제1 라운드로부터의 3 ul의 생성물을 주형으로서 PCR의 제2 라운드에서 사용 하였다. 증폭된 생성물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 확인하였다. PCR 산물을 PCR 2.1-TOPO 벡터(Invitrogen)를 사용하여 서브 클로닝 하였다. 재구성된 플라스미드를 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)을 사용하여 정제하고 개별 클론을 서열분석하였다(Macrogen, 대한민국). 클론을 QUMA 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

도 2c에서 확인할 수 있듯이, 유전자 발현 및 NSC와 유사한 Nestin 및 Col1a1의 프로모터 메틸화를 나타냈지만, 섬유 아세포와는 상이하였다. 개방되거나 채워진 원은 각각 메틸화되지 않거나 메틸화 된 CpG를 나타내었다.

도 2d에서 확인할 수 있듯이, 레트로 바이러스 전이 유전자는 완전히 리프로그래밍된 iPSCs 및 pcOKSM 또는 pcBKSM에 의한 리프로그래밍에 의해 생성된 iNSC에서 침묵하는 것으로 나타났으나, 초기 mcBKSM iNSC에는 크게 활동적인 retroviral transgenes가 있었다. 이 결과는 레트로 바이러스 도입 유전자가 오로지 2개월 간의 배양 후에 확립된 iNSC 계통에서 확률적으로 침묵한다는 것을 보여주는 선행 연구 결과와도 일치한다. 이 수준은 형질 도입 5일 후 MEF의 수준으로 정상화되었다. 데이터는 평균 ± SD, n = 3으로 나타내었다.

mcBKSM에 의해 유도된 MEF가 직접적으로 또는 Oct4 + 중간 단계를 통해 iNSC로 전환되는지 여부를 결정하기 위해, FACS에 의해 생성된 iNSC를 분석하였다.

도 2e에서 확인할 수 있듯이, 놀랍게도 mcBKSM에서 추출한 iNSC 클론에서는 EYFP + 세포를 검출하지 못했지만 대부분의 세포에서 Olig2 +를 발견하였다. 이것은 mcBKSM에 의해 유도된 모든 iNSC가 직접 프로그래밍으로 인한 결과임을 나타낸다.

Olig2 + / EYFP- 클론 mcBKSM iNSC 라인이 직접 및 간접적으로 생성된 iNSC의 혼합물로부터 선택적으로 농축된 가능성을 배제하기 위해, mcBKSM으로 리프로그래밍하는 25일 후에 벌크 세포 집단을 분석하였다.

도 2f에서 확인할 수 있듯이, 다시 모든 세포는 EYFP- 인 것으로 나타났다. 종합하면, iNSC가 mcBKSM에 의해 직접적으로 또는 pcBKSM에 의한 다능화 상태를 통해 간접적으로 얻어질 수 있음을 보여준다.

오염된 신경 crest 세포 또는 다른 잔류 신경 세포 인구가 우리의 외인성 리프로그래밍 인자로 인해 농축되어 iNSC 생성에 기여할 가능성을 배제하기 위해 다음으로 Thy1 + (섬유 아세포)와 Thy1- (비 섬유 아세포 잔여 신경 세포 인구) 세포를 도입하고 mcBKSM을 도입 하였다. 3주간의 감염 후, Thy1 + 모집단이 iNSC 클러스터 수를 약간 감소시켰지만, Thy1 + 및 Thy1- 집단 모두에서 Olig2를 발현하는 iNSC 클러스터를 찾을 수 있었다. 이는 iNSC가 직접적인 전환 전략을 통해 순수 섬유아세포에서 생성될 수 있음을 나타냅니다.

실시예 4: iNSC 로의 리프로그래밍 경로

lentiviral pcBKSM 대 레트로 바이러스 mcBKSM 리프로그래밍을 매개로하는 분자 반응을 해명하기 위해 각 시스템의 리프로그래밍 동역학을 탐구하기로 결정했습니다. 두 시스템 모두에서 전사 인자의 최대 유도 수준을 달성하기 위해 pcBKSM 또는 pcOKSM으로 형질도입된 MEF와 mcBKSM 또는 mcOKSM을 암호화하는 집중적인 레트로 바이러스의 다른 부피의 dox를 사용하여 발현을 적정하였다. polycistronic 벡터로 형질도입된 MEFs의 lentiviral 발현 수준은 용량 의존적인 방식으로 증가하였고 dox의 3 ug/ml에서 정체되었다. 반면, dox의 농도가 높을수록 강한 과발현에 의해 유발된 광범위한 세포 사멸을 초래하였다. retroviral transgenes의 유도 수준은 10 ul의 부피에서 포화되었다. 형질도입 유전자의 유도 수준과 형질도입된 MEF의 생존을 고려하여 polycistronic lentiviral vector(pcBKSM 및 pcOKSM)에 3 ug/ml의 dox를 사용하고 운동 분석을 위해 각 retrovirus(mcBKSM 또는 mcOKSM) 10 ul를 사용하기로 결정하였다. 또한 단백질 수준에서 polycistronic lentiviral과 monocistronic retrovial vector 모두에서 유도된 Brn4와 Oct4의 유사한 유도 수준을 확인하였다.

섬유아세포 마커는 사용된 시스템에 관계없이 이미 유도 1-2 주 후에 MEFs에서 빠르게 억제되었다.

도 3a에서 확인할 수 있듯이, Oct4-CreER를 사용하여 이미 확인된 바와 같이 R26-IL-EYFP 계통 추적 시스템에서 mcBKSM이 형질도입된 MEF는 pcBKSM-, mcOKSM- 및 pcOKSM- 형질 도입된 MEF와는 달리 내인성 다능성 마커를 활성화시키지 않았다. 이 수준은 각각 비 형질도입성 ESCs의 수준으로 표준화되었으며 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다.

도 3b에서 확인할 수 있듯이, mcBKSM- 형질도입된 MEFs는 2주 후에 Blbp 및 Olig2와 같은 NSC 마커를 강하게 활성화하였지만, pcBKSM, pcOKSM 또는 mcOKSM으로 형질도입된 MEF는 1주일 후에 활성화시켰다. 이 수준은 각각 비 형질도입성 NSCs 대조군의 수준으로 표준화되었으며 평균 ± SD, n = 3으로 표시되었다.

유사한 경향이 lentiviral mcBKSM- 형질도입된 MEFs에서 관찰되었고 lentiviral mcBKSM 형질도입된 MEFs의 결과 iNSCs도 역시 EYFP-이었다. 따라서 mcBKSM은 MEF에서 NSC 마커를 pcBKSM 또는 OKSM보다 빠르고 더 높은 수준으로 활성화 할 수 있지만 Oct4와 같은 내인성 다능성 마커를 상향 조절할 수는 없다.

실시예 5: Oct4 및 Brn4의 구조적 해부는 Brn4가 다능성을 유도할 수 없음을 나타냄

iPSC 기술의 발명 직후, Oct4는 동일한 전사 인자 계열의 다른 구성원으로 대체 할 수 없는 리프로그래밍 칵테일의 유일한 리프로그래밍 인자로 나타났다. 반대로, 폴리시스트로닉 Brn4를 섬유아세포에 도입하면 내인성 Oct4가 활성화되고 키메라 등급 iPSC가 생성될 수 있음을 보여주었다. Oct4 (Pou5f1)와 Brn4 (Pou3f4)는 모두 POU 전사인자 군 (각각 IV 군과 III 군)에 속하며, N- 및 C- 말단 트랜스 액티브 영역(NTD와 CTD). POU 도메인 그 자체는 비보존 링커에 의해 접속된 POU 고유 (POUsp)와 POU 홈 도메인 (POUhd)으로 구성된다.

두 가지 POU 인자는 NTD(N-terminal transactivation domain), POU 특이 도메인(POUsp), 링커, POU homeodomain(POUhd) 및 C-terminal transactivation domain(CTD)의 5개 도메인으로 구성된다. O 또는 B는 도메인이 각각 Oct4 또는 Brn4임을 나타낸다.

도 3c와 같이, Oct4와 Brn4의 어떤 부분이 체세포를 다분화능으로 리프로그래밍하는 역할을 하는지를 결정하기 위해, 그들의 도메인을 교환함으로써 일련의 상호 Oct4-Brn4 키메라를 생성하였다.

구체적으로, Oct4-Brn4 키메라 라이브러리는 이전에 설명한대로 약 20 bp 길이의 중복 말단이 있는 2개 또는 3개의 PCR 단편의 오버랩 확장 어셈블리를 사용하여 생성되었다. 최종 키메라 PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI 제한 효소 부위를 사용하여 pMX 백본에 삽입하고 서열을 결정하였다.

pHAGE2-tetO-OKSM(STEMCCA) 및 pHAGE-tetO-BKSM 렌티 바이러스 벡터를 준비하였다. 이 연구에서 사용된 다른 모든 렌티 바이러스 발현 카세트는 동일한 백본에 클로닝되었다. F2A 펩타이드의 자가 절단 능력을 완전히 무력화시키기 위해자가 절단 Pro-Gly 부위를 구성하는 마지막 두 잔기를 Ala-Ala로 돌연변이시켰다. 다음과 같은 P2A자가 절단 펩타이드 및 폴리-글리신 링커의 서열을 사용하였다: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP 및 GSGGGSGGGSGGGGSGGGGSG.

이후 키메라가 Oct4-GFP 리포터 MEFs와 개별 레트로 바이러스를 사용하여 SKM과 함께 iPSCs를 생성하는 능력을 시험하였다. 구체적으로, Oct4, Brn4 또는 Oct4-Brn4 키메라 단백질을 SKM과 함께 사용하여 iPSCs에 Oct4-GFP MEF를 리프로그래밍하였다. 그 효율을 2주 및 3주 후에 GFP + 콜로니 수를 계수함으로써 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 3으로 나타내었다.

iPSC 생성을 위해 3 내지 4회의 계대 후 Oct4-GFP(OG2 MEFs 또는 heterozygous ROSA26-rtTA / GOF18) MEF를 사용하였다. MEFs는 신선한 MEF 배지 1 ml에 웰 당 2.5-3x10⁴의 밀도로 12-웰 플레이트 상에 플레이팅되었다. 같은 날에, 60 ul의 비농축 tetO-OKSM과 rtTA(OG2 MEFs의 경우) 30 ul의 6 ug/ml 황산 프로타민(Sigma-Aldrich)을 첨가한 바이러스 상층액을 같은 날에 세포에 도입하였다. 나머지 구조물의 체적은 Q-PCR 적정에 따라 조절되었다. 48시간 후 배지를 dox(1 ug/ml)가 첨가된 배아 줄기 세포 배지(고 포도당 DMEM, 15 % KSR, LIF)로 대체하였다. 유도 1 및 2주 후에 GFP + 콜로니의 수를 세었다. Dox는 유도 12일 후에 제거되었다(두 번째 계산의 2 일전).

렌티 바이러스 스톡은 dox 유도 24 시간 후 MEFs에서 cDNA 샘플 WPRE에 대한 Q - PCR을 사용하여 정량되었다.

도 3d에서 확인할 수 있듯이, Oct4와는 달리 야생형 Brn4는 GFP + iPSC 콜로니를 생성할 수 없었다. 흥미롭게도, Brn4(NTD, POUsp, 링커, POUhd 또는 CTD)로부터의 단일 도메인 치환을 함유한 Oct4-Brn4 키메라는 POUsp, POUhd 및 CTD에 대한 효율 감소에도 불구하고 여전히 리프로그래밍 기능을 유지하였다. 주목할 것은, POUsp 도메인은 Brn4 대응물(O-BOO-O 키메라)로의 대체가 키메라의 리프로그래밍 능력을 극적으로(30 배) 감소시킴에 따라 Oct4의 리프로그래밍 기능에 가장 중요한 것으로 나타났다. 그러나 Oct4의 단일 도메인만으로는 Brn4에 리프로그래밍 기능을 부여할 수 없었으므로 Oct4의 다중 도메인 협력이 리프로그래밍 기능에 필요하다는 것을 암시한다.

도 3e에서 확인할 수 있듯이, 형질도입 3주 후 벌크 세포 집단의 FACS 분석은 야생형 Brn4가 iPSC를 생성할 수 없음을 나타내었다.

도 3f에서 확인할 수 있듯이, 리프로그래밍 효율의 차이는 레트로 바이러스 벡터의 qPCR 적정에 의해 확인된 것과 같은 불균형적인 도입 유전자 발현에 의한 것은 아니다.

종합하면, 결과는 Brn4가 3가지 영역의 목적을 위한 기능 부적합성으로 인해 다능성을 유도하지 못함을 보여 주며, 그 중 POUsp 도메인이 가장 중요하다.

mcBKSM과 달리 pcBKSM은 Oct4-CreER로부터 EYFP + iNSC를 생성하는 내인성 Oct4를 활성화 시켰으며(R26-IL-EYFP MEF), 이에 pcBKSM이 완전히 리프로그래밍된 iPSCs를 생성할 수 있는지 확인하기 위해 Oct4-GFP MEF에 pcBKSM을 도입하고 ESC 배지에서 세포를 배양하였다. 리프로그래밍 효율은 유도 1 및 2주 후에 GFP + 콜로니 수를 계수함으로써 측정하였다.

도 3g 및 3h에서 확인할 수 있듯이, dox 처리 후 8 일 만에 pcOKSM과 pcBKSM 모두에 대해 GFP + 콜로니가 관찰되었으며 놀라울 정도로 유사한 리프로그래밍 효율이 나타났다(스케일 바, 250 um). Oct1과 Oct6 같은 동일한 폴리시스트로닉 카세트에 복제된 다른 POU 인자는 매우 적은 GFP + 콜로니를 유도할 수 있는 Brn2를 제외하고는 iPSC를 생성할 수 없었다(평균 ± SD, n = 3).

도 3i에서 나타내는 바와 같이, 폴리시스트로닉 벡터가 섬유아세포를 다능성 상태로 유도할 수는 있지만, 개별적으로 발현된 인자는 MEFs를 다능성 상태로 유도하지 않고 iNSCs로 직접 분화시킨다.

실시예 6: Brn4-Klf4 융합 단백질의 리프로그래밍 시 다능성 유도

Bar-Nur 등의 연구에서 사용된 polycistronic reprogramming cassette (STEMCCA로 알려짐). 본 발명에서 두 개의 자기 분해 2A 펩타이드와 내부 리보솜 진입 부위(IRES)(POU-F2A-KIf4-IRES-Sox2-E2A-cMyc)로 분리 된 전사 인자를 가지고있다. 폴리시스트로닉 카세트의 재 프로그램 인자의 순서는 화학량 론을 결정하고 다른 2A 펩타이드는 명확한 자가 절단 효율을 가지는 것으로 알려져 있다. 실제로 원래의 STEMCCA 카세트 및 pcBKSM 카세트의 Brn4와 Klf4를 연결하는 데 사용된 F2 펩타이드 F2A는 가장 낮은 자가 분해 효율을 나타낸다. 이것은 Brn4-F2A-Klf4가 세포 반응을 변화시키고 리프로그래밍 결과를 변화시킬 수 있는 미처리 고 분자량 폴리 프로테인을 생산할 수 있음을 시사한다.

도 4a에서 확인할 수 있듯이, 이 아이디어를 시험하기 위해 F2A 펩티드를 자체 절단 부위(GP->AA)의 두 잔기를 대체함으로써 P2A(가장 효율적인 자가 절단 펩타이드) 또는 절단 불가능한 돌연변이 F2A(F2Am)로 대체한 일련의 POU-KSM 벡터를 생성하였다. 또한 합성 폴리글리신(GL) 링커를 사용하여 F2A 서열 특유의 영향을 배제하였다.

도 4b에서 확인할 수 있듯이, 웨스턴 블롯 분석을 통해 P2A에 의해 연결된 POU 및 Klf4의 완전한 분열, F2A에 의한 부분 분열 및 F2Am에 의한 분열의 부재를 확인하였다.

그런 다음 우리는 Oct4-GFP MEFs를 iPSCs로 리프로그래밍하기 위한 컨스트럭트의 기능을 시험하였다. 우리가 예상했듯이, P2A 구조물 중 Oct4만이 다른 POU 인자가 아니라면 GFP + 콜로니를 생성할 수 있었다. 놀랍게도, 비절단 리간드인 F2Am과 GL은 Brn4뿐만 아니라 Oct6과 Brn2에서도 리프로그래밍이 가능했다. 이전에 iPSC를 생성할 수 없거나 심지어 클로저 크로마틴을 이용할 수 없다고 보고된 두 개의 신경 특이 POU3 인자가 있다.

도 4c에서 확인할 수 있듯이, 섬유아세포. Brn2-, Oct6- 및 Brn4-F2Am-KSM- 생성 된 iPSC 라인은 통과 가능한 클론 세포주를 생성할 수 있다(스케일 바, 250 um).

도 4d에서 확인할 수 있듯이, 각 형질도입 유전자의 게놈 통합은 PCR 유전자형 분석에 의해 확인되었다. 생성된 iPSCs는 다능성 마커인 Nanog와 SSEA-1을 발현하고 기형종 분석에서 세 가지 모든 세균층으로 분화할 수 있었고 키메라 마우스의 생식 세포계의 발달에 효과적으로 기여할 수 있었다.

특히, Brn4-F2Am-KSM 및 Brn4-GL-KSM은 본래의 F2A 작제물보다 악화되어, 절단 및 절단되지 않은 Brn4-Klf4의 혼합물이 효율적인 리프로그래밍에 유리함을 시사한다. 따라서 융합 단백질 내에서 POU와 Klf4의 기능을 조사하기로 결정했다. ZHBTc4 ESC 라인을 사용하여 pluripotency rescuing assay를 수행하였는데 Oct4는 dox 치료로 조건적으로 제거할 수 있다. 예기치 않게, P2A-, F2A-, F2Am- 또는 GL- 연결된 Oct4-Klf4 구조물에 의해 구제된 Oct4- 결핍 ESC는 그 형태, 생존 또는 증식 능력에서 차이가 없었으며, POU TF 기능이 POU-Klf4 폴리 프로테인. 우리는 다음으로 Goff18 마우스 상피줄기세포를 사용하여 융합 단백질 내에서 Klf4의 기능을 시험하기 위해 프라이밍된 순수 ESC 변환 분석을 사용했다. F2Am과 GL 구조 모두는 FACS 분석에 의해 결정된 절단 가능한 펩타이드를 함유하는 벡터와 비교하여 Gof18 + 줄기 세포의 Gof18 + 줄기 세포로의 전환율이 유의하게 손상된 것으로 나타났다.

따라서 기능적으로 손상된 Klf4를 보상하기 위해 KSM과 함께 POU-Klf4 바이시스트론 구조를 사용하여 리프로그래밍 실험을 반복하였다. 리프로그래밍 효율은 유도 1 및 2 주 후에 GFP + 콜로니 수를 계수함으로써 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD, n = 3으로 나타내었다.

도 4e에서 확인할 수 있듯이, F2A를 보다 효율적으로 절단하는 P2A로 대체하는 것은 Oct4 이외의 POU 인자를 갖는 iPSC로의 리프로그래밍을 막았지만, 절단 불가능한 펩타이드는 리프로그래밍 효율을 구제하고, 원래 부분적으로 절단하는 F2A보다 우수한 모든 경우에 수행되었다. 이는 Brn4가 Klf4와 함께 폴리프로테인을 형성함으로써 STEMCCA 카세트에서 리프로그래밍 기능을 얻는다는 것을 의미한다.

도 4f에서 확인할 수 있듯이, Brn4-Klf4 폴리프로테인의 리프로그래밍 기능을 추가로 확인하기 위해, 절단 불가능한 Brn4-Klf4 구조물의 첨가가 완전히 절단 가능한 Brn4-P2A-KSM 카세트의 리프로그래밍 능력을 Oct4 운반과 유사한 수준으로 복원할 수 있음을 보여 주었다.

Brn4-Klf4 융합 단백질이 어떻게 리프로그래밍 활성을 얻었는지 이해하기 위해, POU 및 Klf4 표적에 대해 염색질 면역 침전(ChIP)-qPCR을 수행하였다. Brn4 또는 Oct4의 N 말단을 3xFLAG로 표지하고, 4일간의 dox 유도 후 대량 리프로그래밍된 세포 집단에 대해 ChIP를 수행하였다.

구체적으로, 2 Х 10⁷ 세포를 4℃에서 20분 동안 1%의 최종 농도로 포름알데히드와 가교합시키고 글리신(최종 농도 0.1375 M)으로 켄칭시켰다. 가교결합된 세포를 Bioruptor(Diagenode)로 30초 펄스/30초 휴식주기 45회로 초음파 처리하였다. 각 샘플의 초음파 크로마틴 25 ug을 항-FLAG 항체(Sigma, F1804)로 면역침전시켰다. 프라이머는 공지된 ChIP-Seq 데이터에 기초하여 설계되었다. 면역침전된 DNA는 Oct4 샘플에 비해 fold enrichment로 표현된다. 데이터는 생물학적 복제물의 평균 ± 표준 편차로 나타내었다.

도 4g에서 확인할 수 있듯이, 융합된 Brn4-Klf4 폴리 단백질이 다능성 관련 Sox-Oct 모티프 함유 유전자좌(Pou5f1, Nanog 및 Sox2)에서 유의하게 증가한 반면, 융합으로 인하여 POU3 인자 특이적 MORE-함유 표적(Slitrk6 , Lingo1, Foxo1)에서는 감소하였다.

epiblast-to-naive ESC 변환 결과와 동일하게, 현저한 Klf4 표적은 손상된 분열에 영향을 받지 않았다. Jerabek et al. 이 연구에서 Oct6의 돌연변이가 Oct6을 다능성 유도 물질로 전환시킨 MORE 모티프에 대한 동종이량체화를 감소시켰다. MORE 모티프인 POU3 요소의 homodimerization을 담당하는 잔여물인 methionine 151은 POUhd의 맨 끝에 위치한다. 비교적 큰 Klf4와 POU3 인자의 상대적으로 짧은 CTD의 융합은 POU TF 영역의 영역에 의존하는 Sox2와의 이종이량체화에 영향을 미치지 않으면서 POU TF의 동종이량체화능을 잠재적으로 방해할 수 있다.

종합하면, pcBKSM의 예기치 않은 iPSC 생성 능력은 BrN4-F2A-Klf4의 불완전한 절단으로 인해 발생한다. 이 기능은 다른 신경 관련 POU 인자로 다분화능을 리프로그래밍 할 수 있게 한다.

Claims (4)

1. 다음 단계를 포함하는 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법:
   Oct4 프로모터에 작동가능하게 연결된 CRE(Cre-recombinase) 유전자 코딩 핵산서열, 상기 CRE 유전자 활성화에 의해 제거되는 loxP 코딩 핵산서열, 및 loxP 제거 시 발현되는 형광 단백질 코딩 핵산서열을 포함하는 체세포를 준비하는 체세포 준비 단계;
   상기 체세포에 Brn4, Klf4, Sox2 및 cMyc를 코딩하는 핵산 서열을 개별적으로 코딩하는 각각의 벡터를 통해 개별적으로 형질 도입하는 형질 도입 단계; 및
   상기 체세포를 배양하여 형광이 발현되면 교차분화세포가 만능성 상태를 경유하여 생성되었다고 판단하는 판단 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 형광 단백질은 EYFP(Enhanced yellow fluorescent protein)인 것인, 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 체세포는 섬유아세포인 것인, 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 교차분화세포는 유도신경줄기세포인 것인, 교차분화세포의 만능성 상태 경유 확인방법.

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