JP2011519546A - 核初期化方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
これらのうち、特に好ましい組み合わせは、Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ;Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ;Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4種の遺伝子の組み合わせ;Oct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせ;並びにOct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28、及びNanogからなる6種の遺伝子の組み合わせである。これらの組み合わせにTERT遺伝子及び/又はSV40 Large T antigen遺伝子を含めることも好ましい。場合によりKlf4を除くことが好ましい場合もある。
特に好ましい態様によれば、本発明により、Oct3/4、Klf4、及びSox2を含む第一の非ウイルス発現ベクター、及びc-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する上記の方法;Oct3/4、Klf4、及びSox2を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、及びc-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する上記の方法;Oct3/4、Klf4、及びSox2が5'から3'方向にこの順番にポリシストロニック発現を可能にする介在配列で連結され、第一の非ウイルス発現ベクターに挿入されている上記の方法;第一の非ウイルス発現ベクター及び第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入する上記の方法;並びに導入を2回以上繰り返して行う上記の方法が提供される。また、導入された少なくとも1の非ウイルス発現ベクターの全部又は一部が実質的に染色体に組み込まれない上記の方法も提供される。
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子については国際公開WO2007/69666に具体例が示されている。同じく、Linファミリー遺伝子についても当業者は同様にファミリー遺伝子を抽出することが可能である。例えば、Linファミリー遺伝子の具体例として、Lin28及びLin28Bが含まれ得る。
(a)Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子からなる2種の遺伝子の組み合わせ;
(b)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ;
(c)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(d)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(e)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる6種の遺伝子の組み合わせ;
などを含めることができるが、これらに限定されることはない。
これらの遺伝子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する。本発明において、任意に選択された哺乳類動物(例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サル)由来の遺伝子を用いることが可能である。また、野生型の遺伝子のほか、その翻訳産物が数個(例えば1〜10個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1又は2個)のアミノ酸の置換、挿入、及び/又は欠失を有し、且つ野生型の遺伝子産物と同様の機能を有する変異遺伝子も利用可能である。例えば、c-Mycの遺伝子としては野生型のほか安定型変異体(T58A)コードする遺伝子などを用いてもよい。他の遺伝子産物についても同様である。
好ましい組み合わせとして、例えば、
(f)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、及びTERT遺伝子からなる5種の遺伝子の組み合わせ;
(g)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、及びSV40 Large T antigen遺伝子からなる5種の遺伝子の組み合わせ;
(h)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、TERT遺伝子、及びSV40 Large T antigen遺伝子からなる6種の遺伝子の組み合わせ;並びに、
(i)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、Nanog遺伝子、及びTERT遺伝子又はSV40 Large T antigen遺伝子からなる7種の遺伝子の組み合わせを含めることができる。
必要に応じて、上記の組み合わせからKlfファミリー遺伝子を除くことができる場合もある。
(1)Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ;
(2)Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ;
(3)Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(4)Oct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(5)Oct3/4、Sox2、c-Myc、TERT、及びSV40 Large T antigenからなる5種の遺伝子の組み合わせ;
(6)Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、TERT、及びSV40 Large T antigenからなる6種の遺伝子の組み合わせ;
(7)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Lin28、及びNanogからなる6種の遺伝子の組み合わせ;
(8) Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Lin28、Nanog、及びTERT又はSV40 Large T antigenからなる7種の遺伝子の組み合わせ、
などである。
上記の遺伝子に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をコードする遺伝子をさらに組み合わせてもよい。国際公開WO2007/69666に開示されているように、例えば、TERT遺伝子、及び下記の遺伝子:HPV16 E6、HPV16 E7、及びBmilからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
内在性にSox2及びc-Mycを発現している神経幹細胞などを体細胞ソースに用いて初期化を行う場合は、Oct3/4およびKlf4からなる2種の遺伝子の組み合わせ、又はOct3/4およびc-Mycからなる2種の遺伝子の組み合わせ(Nature, Published online, 29 June 2008,p1-5 (doi:10.1038/nature07061)を参照)も例示することができる。
上記の(3)、(5)、(6)、及び(7)の組み合わせにおいて、c-Mycに替えてL-Mycを用いることもできる。
本発明の方法では、上記の4種、3種、又は2種の遺伝子を同時に体細胞に導入することが好ましい。上記の4種、3種、又は2種の遺伝子を導入するために、これらの遺伝子の全てを組み込んだ1種の非ウイルス発現ベクターを用いてもよい。あるいは、これらの遺伝子の組み合わせを網羅するように数種類の非ウイルス発現ベクターを適宜組み合わせて用いてもよい。数種類の非ウイルス発現ベクターを用いる場合には、好ましくは2又は3種類、さらに好ましくは2種類の非ウイルス発現ベクターを用いることが好ましい。これらの非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましい。
(a1) Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycを含む1種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(b1) Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる残りの2種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(c1) Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる3種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(d1) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子及びc-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(e1) Oct3/4、Klf4、及びSox2を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、c-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(f1) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、c-Myc及び第一の非ウイルス発現ベクターには含まれないOct3/4、Klf4、又はSox2のいずれか一つの遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。より具体的には、5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、又は(iii)Oct3/4及びSox2をこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、好ましくはプラスミドベクターを用いることができ、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(g1) Oct3/4、Klf4、及びSox2を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、c-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
体細胞がマウス由来である場合、好ましくは(f1)又は(g1)の方法を使用することができる。
(a2) Oct3/4、Klf4、及びSox2を含む1種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(b2) Oct3/4、Klf4、及びSox2を5'から3'方向にこの順番で含む1種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(c2) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(d2) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、第一の非ウイルス発現ベクターには含まれないOct3/4、Klf4、又はSox2のいずれか一つの遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。より具体的には、5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、又は(iii)Oct3/4及びSox2をこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、好ましくはプラスミドベクターを用いることができ、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
体細胞がマウス由来である場合、好ましくは(b2)又は(d2)の方法を使用することができる。
(a3) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む1種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(b3) 5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、又は(iii)Oct3/4及びSox2をこの順番で含む1種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(c3) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる1種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、第一の非ウイルス発現ベクターには含まれないOct3/4、Klf4、及びSox2のいずれか一つの遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
体細胞がマウス由来である場合、好ましくは(b3)の方法を使用することができる。
(a4) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、並びにc-Myc、Lin28及びNanog遺伝子を含む第三の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一、第二及び第三の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(b4) 5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、(iii)Oct3/4及びSox2又は(iv)Sox2及びKlf4をこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、Oct3/4、Klf4及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、並びにc-Myc、Lin28及びNanog遺伝子を5'から3'方向にこの順番で含む第三の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
トランスフェクションを2回以上繰り返す場合の間隔は特に限定されないが、例えば12時間から1週間、好ましくは12時間から4日、例えば、1日から3日とすることができる。
プロモーターとしては体細胞において転写活性を示すDNA配列を用いることができるが、プロモーターは動物種や体細胞の種類に応じて適宜選択することができる。哺乳類動物細胞中で発現可能な有用なプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE (immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等が含まれる。ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。有用なプロモーターは、CAGプロモーター(サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーターとβ-グロビン遺伝子のポリAシグナル部位を含む)である。
容易に入手可能な非ウイルス発現ベクターとしては、例えば、pCMV6-XL3(OriGene Technologies Inc.社製)、EGFP-C1(Clontech社製)、pGBT-9(Clontech社製)、pcDNAI(フナコシ社製)、pcDM8(フナコシ社製)、pAGE107(Cytotechnology, 3,133, 1990)、pCDM8(Nature, 329, 840, 1987)、pcDNAI/AmP(Invitrogen社製)、pREP4(Invitrogen社製)、pAGE103(J.Blochem., 101, 1307,1987)、pAGE210等を例示することができるが、これらに限定されることはない。
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が、好ましくは、5'から3'方向にこの順番で組み込まれている非ウイルス発現ベクターが例示される。より好ましくは、これらの遺伝子がポリシストロニック発現を可能にする介在配列で組み込まれている非ウイルス発現ベクターが例示され、特に好ましくは、Oct3/4、Klf4およびSox2が、ポリシストロニック発現を可能にする介在配列(好ましくはFMDV 2A-self-processing sequence)で5'から3'方向にこの順番で組み込まれている非ウイルス発現ベクターが例示される。
実験開始から第1、3、5、及び7日目に、pCX-2A-mOKS及びpCX-c-Mycを一緒にトランスフェクトした(図3のExp440)。その結果、多数のGFP陽性コロニーが得られ、形態学的にES細胞と区別し得ない細胞が生じた(図4の440A-3)。得られた細胞は、ES細胞の場合と同等のレベルでES細胞マーカーを発現した(図5のiPS-440A)。プラスミドDNAのゲノムへの組み込みを調べるために、プラスミドの各部分を増幅し得る16セットのPCRプライマーを設計した(図2、13及び14)。修正したプロトコールによって得られた11個のGFP陽性クローンのうちの9クローンでは、外来性DNAの増幅は観察されなかった(図6)。さらに、サザンブロット解析では、これらのクローンでは外来遺伝子の組み込みは検出されなかった(図11)。小さなプラスミド断片の存在の可能性を厳密に除外することはできないが、以上の結果から、これらのiPS細胞は、宿主ゲノム内へ組み込まれたpCX-2A-mOKS及びpCX-c-Mycプラスミドを有していないことが示された。
得られたキメラマウス71匹およびその子孫を長期観察した結果、4遺伝子(Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc)をレトロウイルスで導入して作製したiPS細胞由来のキメラマウスおよびその子孫では正常マウスと比較して早期から死亡率が上昇していくのに対し、4遺伝子の組み込みのないiPS細胞由来のキメラマウスおよびその子孫は正常マウスと同様の生存曲線を示すことが分かった。
得られたキメラマウスと野生型マウスとを交配させるとF1マウスが得られた。従って、組み込みのないiPS細胞が生殖系列に寄与すること(germline-transmission)が確認された。
初期化に用いるプラスミドはpCX-EGFP(大阪大学、岡部勝博士より提供された。FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)から、実施例1と同様にして作製した。具体的には、pCX-EGFPをEcoRIで処理し、EGFPの代わりに、SOX2およびKLF4の翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列を介して連結したコンストラクトを挿入することによりプラスミドpCX-hSKを作製した。同様にc-Myc、LIN28、Nanogを2A配列を介して連結したプラスミド(pCX-hMLN)、OCT3/4翻訳領域を挿入したプラスミド(pCX-hOCT3/4)、およびSV40 Large T antigenを挿入したプラスミド(pCX-SV40LT)を作製した。
これらの細胞について、Genomic-PCR解析を行い、導入遺伝子がゲノム上に挿入されているか検討した。結果を図18に示す。いずれのクローンについてもOct3/4(pCX-hOCT3/4)、c-Myc(pCX-hMLN)の組み込みが検出された。203A-4以外のクローンにおいてKlf4(pCX-hSK)の組み込みが検出された。いずれのクローンにおいてもSV40LT(pCX-SV40LT)の組み込みは検出されなかった。
これら樹立したヒトiPS細胞クローン(217A-1〜217A-4、217A-6)について、Genomic-PCR解析を行った。結果を図21に示す。いずれのクローンについても導入遺伝子の組み込みが実証された。
pCX-hOCT3/4(0.5μg)、pCX-hSK(1.0μg)、pCX-hMLN-shp53(1.5μg)のそれぞれをMicroporator (100μL tip、1600V、10ms、3 times)で6.0x105個のHDF-120-Slcに電気的に導入した。10日後、もう一度同じ条件で各ベクターを電気的に導入し、細胞をMSTO上に播いた(100mmディッシュ)。これらの細胞を、10日目まではDMEM/10% FCSを用いて培養し、その後は霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL社製)に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF(WAKO社製)を加えた培地を用いて培養した。最初のエレクトロポーレーションから35日目の細胞の写真を図22に、また継代培養後の細胞の写真を図23に示す。典型的なES細胞様の形態を示し、ヒトiPS細胞の樹立が確認された。Genomic-PCR解析の結果、導入遺伝子の組み込みが実証された(図24のレーン279A-2)。
まず、NanogレポーターMEF細胞をゼラチンコートした6ウェルプレート上に播き(1.3x105個/ウェル)、pCX-Oct4(0.37μg)、pCX-Sox2(0.36μg)、pCX-Klf4(0.39μg)、pCX-c-Myc(0.38μg)のそれぞれをFuGene6を用いて1、3、5、および7日目にトランスフェクトした。9日目に、1x106個(1.0)または0.2x106個(0.2)の細胞をMSTO-PH上またはゼラチン上に播き(100mmディッシュ)、25日目にコロニーを選択した。選択後の細胞の写真を図25に示す。マウスiPS細胞に特徴的なコロニーの形状並びにGFP陽性の結果が得られ、マウスiPS細胞の樹立が確認された。樹立したマウスiPS細胞クローン(497A-1〜A-5)について、Genomic-PCR解析を行った。結果を図26に示す。497A-2および497A-5はいずれも、いずれの外来遺伝子の組み込みもないiPS細胞であることが示された。
本明細書中に引用される任意の刊行物(特許および特許出願を含む)中に開示される内容は、それらが本明細書中で開示された程度まで、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国仮特許出願番号61/071,508、61/136,246、61/136,615および61/193,363を基礎とし、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (26)
- 人工多能性幹細胞の製造方法であって、少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクターの少なくとも1種類を体細胞に導入する工程を含む方法。
- 該ベクターが染色体外で自律複製できる非ウイルス発現ベクターである請求項1に記載の方法。
- 該ベクターがプラスミドベクターである請求項1又は2に記載の方法。
- 初期化因子をコードする遺伝子が国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法により陽性を示す遺伝子から選ばれる単一の又は複数の遺伝子である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 初期化因子をコードする遺伝子がOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 初期化因子をコードする遺伝子が下記の組み合わせ:
(a)Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子からなる2種の遺伝子の組み合わせ;
(b)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ;
(c)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(d)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ;及び
(e)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる6種の遺伝子の組み合わせ、
のいずれかの組合わせ、又はこれらの組み合わせのいずれかにおいてTERT遺伝子及び/又はSV40 Large T antigen遺伝子をさらに含む組合わせである請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 初期化因子をコードする遺伝子が下記の組み合わせ:
(a)Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ;
(b)Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ;
(c)Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(d)Oct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせ;及び
(e)Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、及びNanogからなる6種の遺伝子の組み合わせ、
のいずれかの組合わせ、又はこれらの組合わせのいずれかにおいてTERT遺伝子及び/又はSV40 Large T antigen遺伝子をさらに含む組み合わせである請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 体細胞に導入される非ウイルス発現ベクターの種類の数が1種、2種、3種、又は4種である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 初期化因子をコードする遺伝子が、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ、又はOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせであり、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている請求項8に記載の方法。
- Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が5'から3'方向にこの順番で1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている請求項9に記載の方法。
- Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子がポリシストロニック発現を可能にする介在配列で1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている請求項9又は10に記載の方法。
- Octファミリー遺伝子がOct3/4であり、Klfファミリー遺伝子がKlf4であり、Soxファミリー遺伝子がSox2であり、Mycファミリー遺伝子がc-Mycである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 第一の非ウイルス発現ベクター及び第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入する請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 上記導入を2回以上繰り返して行う請求項13に記載の方法。
- 体細胞がヒトを含む哺乳類動物の体細胞である請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法により得ることができる人工多能性幹細胞。
- 少なくとも1の導入された非ウイルス発現ベクターの一部又は全部が実質的に染色体に組み込まれていない請求項16に記載の人工多能性幹細胞。
- 少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクター。
- 該ベクターがプラスミドベクターである請求項18記載のベクター。
- Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が組み込まれている、請求項18又は19に記載のベクター。
- Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が5'から3'方向にこの順番で組み込まれている、請求項20記載のベクター。
- Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子がポリシストロニック発現を可能にする介在配列を介して組み込まれている、請求項21記載のベクター。
- Octファミリー遺伝子がOct3/4であり、Klfファミリー遺伝子がKlf4であり、Soxファミリー遺伝子がSox2である、請求項20〜22のいずれか1項に記載のベクター。
- 初期化因子をコードする1以上の導入遺伝子がプラスミドの形態で細胞のゲノムに組み込まれている人工多能性幹細胞。
- 誘導される外来性遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていない人工多能性幹細胞。
- 2種類以上の初期化因子を含む人工多能性幹細胞の誘導用の非ウイルス発現ベクターを調製するための、口蹄疫ウイルス由来の2A配列の使用。
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