JP2012520660A - 再プログラム化多能性細胞の作製 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)Oct4、
(ii)Oct4とSox2との組み合わせ、
(iii)Oct4、Sox2と、NanogおよびLin28のうちの少なくとも1つとの組み合わせ、
(iv)Oct4、Klf4およびc−Mycの組み合わせ、
(v)Oct4、Sox2およびKlf4の組み合わせ、
(vi)Oct4、Sox2、Klf4およびc−Mycの組み合わせ、
(vii)Oct4、Sox2、NanogおよびLin28の組み合わせ、
(viii)Oct4、Sox2、Klf4、c−Myc、NanogおよびLin28の組み合わせ、ならびに
(ix)(i)から(x)のうちのいずれか1つと、さらに化学物質、ペプチド、siRNA、shRNAまたはマイクロRNAとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される。
i)本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団を被験化合物と接触させ、それから分化した細胞の量を決定するステップ、
ii)この化合物の不在下で、本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団から分化した細胞の量を決定するステップ
を含み、(ii)と比較して(i)において分化細胞の量が増加することが、化合物が多能性細胞の分化を導くことを示す。
(i)任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施して、病態を患う対象から多能性細胞またはその集団を作製するステップ、および
(ii)細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の1種または複数の症状に対するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
(a)多能性細胞またはその集団を病態に侵された細胞に分化させるステップ、および
(b)(a)の細胞を被験化合物と接触させ、病態の1種または複数の症状に対するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
本明細書を通して、特に明示しない限り、または文脈上別の解釈を要する場合を除き、単一のステップ、組成物、ステップの群または組成物の群への言及は、それらのステップ、組成物、ステップの群または組成物の群の1つまたは複数(すなわち、1つ以上)を包含すると解釈されるべきである。
「集約的」(collectively)は、本発明が、任意の数または組み合わせの列挙されたタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を包含することを意味し、しかも、このような数または組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群が本明細書に具体的に記載されていないにもかかわらず、添付の特許請求の範囲が、任意の他の組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群から単独におよび分割可能にこのような組み合わせまたは小型の組み合わせ(sub-combinations)を定義し得ることを意味する。
STRO−1+多分化能細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋、真皮および骨膜において発見された細胞であり、中胚葉および/または内胚葉および/または外胚葉などの生殖細胞系に分化できる。好ましくは、STRO−1+細胞は骨髄、歯髄または脂肪組織由来であり、より好ましくは歯髄または脂肪組織由来である。したがって、STRO−1+多分化能細胞は、限定するものではないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維性結合組織を含む多数の細胞型に分化できる。これらの細胞が進入する特定の分化系列決定および分化経路は、機序的な影響ならびに/または内因性生物活性因子、例えば成長因子、サイトカインおよび/もしくは宿主組織によって確立された局所的微小環境条件からのさまざまな影響に依存する。したがって、STRO−1+多分化能細胞は、分裂し、時がたてば不可逆的に分化し表現型細胞をもたらすであろう、幹細胞または前駆体細胞のいずれかである娘細胞をもたらす非造血性前駆細胞である。
一実施形態において、STRO−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞は、例えば、能力決定因子またはその複数を発現するように遺伝子改変される。
一例において、本発明に有用なウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクターを利用する。36kBの線状および二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成の知見は、8kBまでの外来配列を有する大きなアデノウイルスDNA片の置換を可能にする。アデノウイルスDNAは、遺伝毒性の可能性なしにエピソーム性様式で複製できるので、アデノウイルスDNAの宿主細胞への感染は染色体への組み込みをもたらさない。さらに、アデノウイルスは構造的に安定であり、ゲノムの再構成が、広大な増幅後に検出されている。アデノウイルスは、その細胞周期の段階にかかわらず、事実上すべての上皮細胞に感染できる。組み換えアデノウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入できる。非分裂細胞を有効に形質導入する能力は、アデノウイルスを、遺伝子を筋肉細胞または脂肪細胞に移入するための優れた候補にさせる。
ある実施形態において、レトロウイルスベクターは、本明細書に記載の方法および組成物に従って使用され得る。このようなウイルスは、再プログラム化細胞の作製にすでに使用されているがStro−1+細胞においては使用されていない。レトロウイルスは、逆転写の過程によって感染細胞においてそれらのRNAを二本鎖DNAに転換する能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である(Coffin(1990年)「Retroviriae and their Replication」In Fields、Knipe編Virology.New York:Raven Press)。次いで、得られたDNAはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質を調節合成する。組み込まれると、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保有される。レトロウイルスゲノムは、それぞれカプシドタンパク質ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする3種の遺伝子、gag、polおよびenvを含有する。gag遺伝子の上流で発見された配列はpsiと呼ばれ、ビリオンにゲノムをパッケージングするためのシグナルとして機能する。2つの長い末端反復(LTR)配列は、ウイルスゲノムの5’末端および3’末端に存在する。これらは、強いプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みにもまた必要とされる(Coffin(1990年)、上記)。
本発明の核酸の送達に有用な例示的ウイルスベクター系はアデノ随伴ウイルス(AAV)である。ヒトアデノウイルスは、受容体媒介エンドサイト−シスによって細胞に進入する二本鎖DNAウイルスである。これらのウイルスは成長および操作しやすく、in vivoおよびin vitroで広い宿主範囲を示すので、これらのウイルスは、遺伝子移入に非常に適していると考えられている。アデノウイルスは、感染休止および標的細胞の複製ができ、宿主ゲノム中に組み込まれるのではなく染色体外で生存できる。AAVは、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存性DNAパルボウイルスである。AAVは、病理が公知ではなく、有効な複製および生産的なライフサイクルのために、別のウイルス、例えば、アデノウイルス、ワクチニアまたはヘルペスウイルスによって提供されるさらなるヘルパー機能がなくては複製できない。
核酸の送達に使用され得る他のウイルスベクター系は、例えばヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス(Wooら、IJ St特許第5,631,236号、1997年5月20日発行およびNeurovexによるWO00/08191)ワクチニアウイルス(Ridgeway(1988年)Ridgeway、「Mammalian expression vectors」、Rodriguez R L、Denhardt D T編 Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses.Stoneham:Butterworth,;BaichwalおよびSugden(1986年)「Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses:Transient and stable expression of transferred genes」、Kucherlapati R編 Gene transfer.New York:Plenum Press;Couparら、(1988年)Gene、68:1〜10ページ)およびいくつかのRNAウイルスに由来し得る。例示的ウイルスは、例えば、アルファウイルス、ポックスウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルスなどを含む。それらは、さまざまな哺乳動物細胞にとって魅力的な特徴をいくつかの提示する(Friedmann(1989年)Science、244:1275〜1281ページ;Ridgeway、1988年、上記;BaichwalおよびSugden、1986年、上記、;Couparら、1988年;Horwichら、(1990年)J.Virol.、64:642〜650ページ)。
「自己切断型2Aペプチド」を組み込んだ、ポリシストロン性発現カセットからのすべての遺伝的能力決定因子の同時発現は、「リボソームスキッピング」を起こし、単一プロモーターから個々の因子が同程度に発現できる(Sommerら、Stem Cells.27:543〜549ページ、2008年;Careyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:157〜162ページ、2009年)。因子のペアを分離する配列内リボソーム進入配列(IRES)を用いて、感染細胞はすべての能力決定因子またはそのサブセットを発現できる。Careyら、(2009年、上記)は、IRES技術を用いずに、自己切断型2Aペプチドによって分離されたドキシサイクリン誘導因子を構築した。
a)化学的取組み
一例において、能力決定因子は、ヒストンメチルトランスフェラーゼG9aの阻害剤であり、Oct4の代わりに、またはOct4に対する補完(例えば、Oct4の発現レベルを減少させる)として使用される。G9aの化学的阻害は、例えばEnzo Lifesciences社によるBIX−01294(BIX)を用いて達成でき、ヒストン3、リジン9のメチル化(H3K9me)により媒介されるOct4発現に対する拮抗作用を軽減しており、いくつかの細胞において、iPS細胞の誘導のためにウイルスにより送達されたOct4が完全に置換され得るShiら、Cell Stem Cell.2:525〜528ページ、2008年)。
低分子化合物の使用と同様に、タンパク質の送達は、その可逆性のため、iPS細胞作製のための魅力的な取組みである。
一例において、能力決定因子は、内因性遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させる核酸に基づく化合物である。
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、任意の実施形態において本明細書に記載のポリペプチドをコードする特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的であり、mRNA翻訳などの転写後事象に干渉できるDNAもしくはRNAまたはそれらの組み合わせを意味すると解釈されるべきである。アンチセンス法の使用は当分野において公知である(例えば、HartmannおよびEndres、Manual of Antisense Methodology、Kluwer(1999年)を参照されたい)。
「触媒ポリヌクレオチド/核酸」という用語は、異なる基質を特異的に認識し、この基質の化学的改変を触媒するDNA分子もしくはDNA含有分子(「デオキシリボザイム」または「DNAザイム」としても当分野において公知である)またはRNAもしくはRNA含有分子(「リボザイム」または「RNAザイム」としても公知である)を指す。触媒核酸中の核酸塩基は、A、C、G、T(RNAに関してはU)の塩基であり得る。
RNA干渉(RNAi)は、特定のタンパク質の作製を特異的に阻害するために有用である。理論に縛られることを好むわけではないが、Waterhouseら(1998年)は、dsRNA(二本鎖RNA)がタンパク質作製を減少させるために使用され得る機序のためのモデルを提供している。この技術は、対象となる遺伝子のmRNAと本質的に同一である配列またはその一部を含有するdsRNA分子の存在に頼る。好都合なことに、dsRNAは組み換えベクターまたは宿主細胞において単一プロモーターから作製され得、センス配列およびアンチセンス配列は、センス配列とアンチセンス配列とをハイブリダイズできる関連のない配列に隣接し、ループ構造を形成する関連のない配列とともにdsRNA分子を形成する。本発明にとって適切なdsRNA分子の設計および作製は、当業者の能力の十分範囲内であり、特にWO99/32619、WO99/53050、WO99/49029およびWO01/34815を考慮されたい。
多能性細胞および/または再プログラム化細胞および/または再プログラミングを受けた細胞は、多能性細胞の成長を支えるのに使用される任意の培地において培養され得る。典型的な培養培地は、限定するものではないが、TeSR(商標)(StemCell Technologies, Inc.; Vancouver、Canada)、mTeSR(商標)(StemCell Technologies,Inc.)およびStemLine(登録商標)無血清培地(Sigma;St.Louis、MO)などの合成培地、ならびにマウス胎児線維芽細胞(MEF)馴化培地などの馴化培地を含む。さらなる培地は、塩基性培地、例えば、KoSR(Invitrogen Corporation)を補充したDMEMまたはDMEM−F12を含む。または、Silvaら、PLOS Biology、6:e253、2008年は、例えば、MAPKシグナル伝達およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−3のシグナル伝達の阻害剤ならびに白血病阻止因子(LIF)を含む、再プログラム化細胞の作製および未分化状態の再プログラム化細胞の維持に有用な培地を記載している。本明細書において使用する場合、「規定培地」は、単に生物化学的構成成分だけからなる生物化学的に規定された製剤を指す。規定培地はまた、既知の化学組成を有する構成成分だけを含み得る。規定培地は、既知の供給源に由来する構成成分をさらに含み得る。本明細書において使用する場合、「馴化培地」は、この培地において培養された細胞由来の可溶性因子をさらに補充した成長培地を指す。または、細胞は培養培地においてMEF上で維持されてもよい。
下記の方法は、例えば、本明細書に記載のマーカーまたは当分野において公知のマーカーを検出することによる、Stro−1+細胞および/または再プログラム化細胞/多能性細胞の単離または濃縮にとって有用である。
本発明の再プログラム化細胞または多能性細胞は、さまざまな商業的および治療的に重要な組織型の集団を調製するために使用できる。一般に、このことは、細胞を所望の数に増殖させることによって達成される。その後、任意のさまざまな分化戦略に従って分化が引き起こされる。例えば、神経系列の細胞の高度に濃縮された集団は、細胞を、1種もしくは複数のニュートロフィン(ニュートロフィン3または脳由来の神経栄養因子など)、1種もしくは複数のマイトジェン(上皮成長因子、bFGF、PDGF、IGF1およびエリスロポエチンなど)または1種もしくは複数のビタミン(レチノイン酸、アスコルビン酸など)を含有する培養培地に変えることによって作製できる。または、多分化能神経幹細胞は、胚様体段階を介して作製でき、bFGFを含有する化学的規定培地において維持できる。培養された細胞は、場合により、それらが神経前駆体細胞マーカー、例えば、ネスチン、Musashi、ビメンチン、A2B5、nurr1またはNCAMを発現するかどうかに基づいて分離される。このような方法を使用して、(成熟ニューロンを含む)神経細胞および(星状細胞および乏突起膠細胞を含む)グリア細胞の両方を作製する能力を有する神経前駆細胞/幹細胞を得ることができる。または、分化細胞集団を形成する能力を有する複製ニューロン前駆体を得ることができる。
本発明の一例において、再プログラム化細胞または多能性細胞および/またはそれから分化した細胞は、組成物の形態で投与され、またはこのような組成物に製剤化される。好ましくは、このような組成物は、薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含む。
本発明は、Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞の再プログラミングを誘導または強化する化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、前記方法は、Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞と化合物とを、一時の間、および化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プログラミングが起こるために十分な条件下で接触させるステップ、および細胞が再プログラム化されるかどうかを決定するステップを含む。
(i)Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞が濃縮された集団と化合物とを、一時の間、および化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プログラミングが起こるために十分な条件下で接触させ、再プログラム化細胞の数を決定するステップ;ならびに
(ii)化合物と接触させられたことのないStro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞が濃縮された集団中の再プログラム化細胞の数を決定するステップ
を含み、
(ii)と比較して(i)において再プログラム化細胞の数が増加することが、化合物がStro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞の再プログラミングを誘導または強化したことを示す。
(i)任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞が濃縮された集団と化合物とを、一時の間、および細胞の分化が起こるために十分な条件下で接触させ、所望の細胞型の細胞数を決定するステップ、ならびに
(ii)同じ条件であるが化合物が不在の下で、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞を培養することによって作製された所望の細胞型の数を決定するステップ
を含み、
(ii)と比較して(i)において所望の細胞型の細胞数が増加することが、化合物が所望の細胞型への分化を誘導または強化したことを示す。
(i)任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、病態を患う対象から多能性細胞またはその集団を作製するステップ、
(ii)細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の1種または複数の症状に関するその効果を決定するステップ
を含み、
病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
(a)多能性細胞またはその集団を、病態の影響を受ける細胞に分化させるステップ、および
(b)(a)細胞と被験化合物を接触させ、病態の1種または複数の症状に関するその効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。
(i)任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、多能性細胞またはその集団を作製するステップ、
(ii)多能性細胞またはその集団を、1種または複数の特定の系列の細胞および/または組織に分化させるステップ、
(iii)この細胞と被験化合物とを接触させるステップ、ならびに
(iv)細胞の生存能力および/または増殖に対する化合物の効果を決定するステップ
を含み、
細胞または細胞集団の有意な割合を殺さない、または増殖を減少させない化合物が、毒性が減少していると考えられる方法を提供する。
(i)場合により、化合物の構造を決定するステップ、ならびに
(ii)化合物または化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ
によりさらに改変される。
(i)場合により、化合物の構造を決定するステップ、
(ii)場合により、化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ、ならびに
(iii)化合物を提供するステップ
によりさらに改変され得る。
1.1 Stro−1+多分化能前駆細胞を濃縮した集団
Stro−1+多分化能前駆細胞は、骨髄、脂肪組織および歯髄組織を含むさまざまな組織から得られる。異なる部位に由来するStro−1+多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、本質的にGronthosおよびZannettino Methods Mol Biol.449:45〜57ページ(2008年)に記載のように、これらの組織それぞれに由来する細胞を、STRO3 mAbを使用する免疫選択によってStro−1Bright細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、ProFreezeTM−CDM(Lonza、USA)において凍結保存する。異なる免疫選択法を使用して、同じ部位に由来するStro−1+多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、STRO3またはSTRO1mAbのいずれかを使用する免疫選択によってStro−1Bright細胞を濃縮し、培養により増殖し、ProFreezeTM−CDM(Lonza、USA)において凍結保存する。すべての研究に関して、第4継代の細胞を解凍し、即時使用のためにビヒクルにおいて構成する。
導入遺伝子発現レンチウイルスベクターを、293FT細胞系(Invitrogen)において作製する。293Tは、形質転換された293胎児腎細胞に由来する、成長が速く、高度に移入可能なクローンの変異体であり、より高いウイルス価に寄与するパッケージングタンパク質の高レベル発現のために、ラージT抗原を含有する。常法としての維持および増殖のために、これらの細胞を、293FT培地(DMEM/10%FBS、2mMのL−グルタミンおよび0.1mMのMEM非必須アミノ酸)において500μg/mlのジェネテシンの存在下で培養する。パッケージングのために、293FT細胞を、トリプシン処理によって収集する。遠心分離によりトリプシンを除去後、これらの細胞を、ジェネテシンを含まない293FT培地において、T75フラスコにアリコートに分ける(15×106細胞/フラスコおよび6フラスコ/構築物)。
1種または複数の能力決定因子(例えば、Oct4;またはOct4とSox2の組み合わせ;またはOct4、Sox2と、NanogおよびLin28のうちの少なくとも1つとの組み合わせ;またはOct4、Klf4およびc−Mycの組み合わせ;またはOct4、Sox2およびKlf4の組み合わせ;またはOCT4、Sox2、Klf4およびc−Mycの組み合わせ;またはOct4、Sox2、NanogおよびLin28の組み合わせ;またはOct4、Sox2、Klf4、c−Myc、NanogおよびLin28の組み合わせ)をコードするレンチウイルスを、最終濃度約6μg/ml(Sigma)でポリブレン担体を加えた後、細胞培養液に加える。
2.1 材料および方法
Stro−1+多分化能細胞を濃縮した集団
Stro−1+多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団を、骨髄、脂肪組織および歯髄組織から得た。異なる部位に由来するStro−1+多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、本質的にGronthosおよびZannettino Methods Mol Biol.449:45〜57ページ(2008年)に記載のように、これらの組織それぞれに由来する細胞を、STRO3 mAbを使用する免疫選択によってStro−1Bright細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、ProFreezeTM−CDM(Lonza、USA)において凍結保存した。異なる免疫選択法を使用して、同じ部位に由来するStro−1+多分化能前駆細胞の再プログラミング効率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、STRO3またはSTRO1mAbのいずれかを使用する免疫選択によってStro−1Bright細胞を濃縮し、培養により増殖し、ProFreezeTM−CDM(Lonza、USA)において凍結保存した。すべての研究に関して、第4継代の細胞を解凍し、即時使用のためにビヒクルにおいて構成した。
ウイルスパッケージング細胞である、プラチナ−A(Plat−A)細胞を、Cell Biolabs,Inc.Detroit 551から得、線維芽細胞は実験のための陽性対照であった。
OCT4、SOX2、KLF4およびcMYCのヒトcDNAを含有する、モロニーに基づくレトロウイルスベクター(pMX)を、Addgeneから得た。9μgの各プラスミドを、Fugene6(Roche)を使用して、ウイルスパッケージングPlat−A細胞にトランスフェクトした。ウイルス含有上清を、トランスフェクトの48時間後及び72時間後に収集し、孔径0.45μmのフィルターを通してろ過し、4μg/mlのポリブレン(Sigma)を補充した。標的細胞を、感染24時間前に1×103から5×103細胞/cm2の密度で播種した。4種の転写因子のレトロウイルス上清を等量で混合し、二重感染を24時間および48時間において標的細胞に加えた。感染細胞のための培養培地を、感染後4日目にhES細胞培地に変えた。細胞は培地において維持し、培地は、3週間まで、または細胞が集密に達するまで毎日新しくした。
iPS細胞系を確立するために、感染後約3週間目にhES細胞様コロニー形態に基づいてiPS細胞のコロニーを取り上げた。取り上げたコロニーを、hES細胞培地において新鮮な、有糸分裂的に不活性化されたMEF上で増殖した。
ヒトiPS細胞を、20%のFBS(Hyclone)、1mMのL−Glutamax、0.1mMの非必須アミノ酸、0.1mMのβ−メルカプトエタノール、1%のITSおよび10ng/mlのbFGF(すべてInvitrogenから)を補充したDMEMにおいて培養した。ヒトiPS細胞を、培養培地で毎日再生(refresh)した。機械的解離を、29Gの針を付けた1mlのインスリン注射器を使用して、iPS細胞コロニーをより小さい細胞の塊に解体することによって実施した。感染後8から10日後に、新鮮な有糸分裂的に不活性化したMEF上にコロニーを移した。iPSコロニーを、7から10日ごとに継代し、その後機械的解離を実施した。
細胞のトランスフェクション効率を推定するために、上記と同じ方法を使用して、pMXs−GFPレトロウイルスベクターをPlat−A細胞にさらにトランスフェクトした。GFP cDNAを含有するpMXレトロウイルスは、追加の細胞であった。GFPを発現する細胞の数を、フローサイトメトリーによって感染48時間後に評価した。細胞を、0.25%のトリプシン−EDTA(Invitrogen)を用いて5分間解離させ、フローサイトメーター(MoFLO)を使用して分析した。
脂肪細胞、歯髄細胞およびMPCを、上記の「Retroviral Production and iPS Cell Generation」に記載の4種の因子に感染させた。細胞を、17日間維持し、毎日培地を変えた。次いで細胞を、トリプシンを用いて解離させ、4%のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。細胞を、2.5%(w/v)のスキムミルクパウダー、PBS中2%(v/v)のヤギ血清を用いてブロックした。細胞を、一次抗体を用いて4℃において一晩標識し、次いで、一次抗体(マウス抗Oct4、抗Nanogまたは抗SSEA4)を用いて4℃において一晩標識し、その後、ヤギ抗マウスAlexa488二次抗体を用いて室温において1時間標識した。試料を、上記のFACSによって分析し、陽性に染色された細胞の数を決定した。
すべてのStro−1+多分化能前駆細胞が濃縮された集団は、それが歯髄、脂肪組織または骨髄から供給されたかどうかにかかわらず、また、STRO−3またはSTRO−1mAbsを用いて免疫選択されたかどうかにかかわらず、再プログラムでき、iPS細胞系を作製できる。
1)トランスフェクション後の同様のOct4発現にもかかわらず、歯髄および脂肪組織を起源とするStro−1+多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、iPS細胞コロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製し、
2)トランスフェクション後にNanog発現の誘導が低下したにもかかわらず、歯髄および脂肪組織を起源とするStro−1+多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、決定的なiPS細胞コロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製し、
3)歯髄および脂肪組織を起源とするStro−1+多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、骨髄由来のStro−1+多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団より、iPS細胞コロニーをより効率的に作製したので、組織の起源は、iPS細胞コロニーの形成の効率に影響を及ぼし得る、
ことを示す。
歯髄由来のiPS細胞コロニーは、Oct4、Nanog、SSEA4、TRA1−60およびTRA1−81を発現することが免疫蛍光により示された。これらの細胞は、アルカリホスファターゼを発現することがさらに示された。
遺伝子発現研究の結果を表2に提示する。
Claims (26)
- 再プログラム化細胞を作製する方法であって、Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で1種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
- 再プログラム化細胞を作製する方法であって、Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で1種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
- Stro−1+多分化能細胞および/もしくはその子孫細胞、またはStro−1+多分化能細胞および/もしくはその子孫細胞が濃縮された細胞集団が脂肪組織、歯髄組織または骨髄に由来するものである、請求項1または2に記載の方法。
- 再プログラム化細胞を作製するために、曝露された細胞を培養するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 再プログラム化細胞を単離するステップをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する再プログラム化細胞を得るために、曝露された細胞を培養するステップを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または複数の能力決定因子が、Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、Lin28、c−Myc、bFGF、SCF、TERT、SV40ラージT抗原、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Fbx15、Eras、ECAT15−2、Tcl1、β−カテニン、ECAT1、ESG1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15−1、Fthl17、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、およびGrb2または1種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似の活性を有する化合物からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または複数の能力決定因子が化学物質、ペプチド、siRNA、短鎖ヘアピンRNAまたはマイクロRNAである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 1種または複数の能力決定因子が、
(i)Oct4、
(ii)Oct4とSox2との組み合わせ、
(iii)Oct4、Sox2と、NanogおよびLin28のうちの少なくとも1つとの組み合わせ、
(iv)Oct4、Klf4およびc−Mycの組み合わせ、
(v)Oct4、Sox2およびKlf4の組み合わせ、
(vi)Oct4、Sox2、Klf4およびc−Mycの組み合わせ、
(vii)Oct4、Sox2、NanogおよびLin28の組み合わせ、
(viii)Oct4、Sox2、Klf4、c−Myc、NanogおよびLin28の組み合わせ、ならびに
(ix)(i)から(x)のうちのいずれか1つと、さらに化学物質、ペプチド、siRNA、shRNAまたはマイクロRNAとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。 - Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞が、出生後の哺乳動物から得られる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項10に記載の方法。
- Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞を1種または複数の能力決定因子に曝露するステップが、プロモーターに作動可能に連結された1種または複数の能力決定因子をコードする配列を含む核酸をStro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞に導入するステップを含む、請求項1または2に記載の方法。
- プロモーターに作動可能に連結した異なる能力決定因子をコードする配列をそれぞれが含む複数の核酸を投与するステップを含む、請求項12に記載の方法。
- 核酸が1種または複数のベクターの内部にある、請求項12または13に記載の方法。
- ベクターがウイルスベクターである、請求項14に記載の方法。
- 核酸が、Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞のゲノム中に組み込まれない、請求項12に記載の方法。
- 再プログラム化細胞が多能性である、請求項1または2に記載の方法。
- 再プログラム化細胞が、(i)Oct−4、Nanog、SSEA3、SSEA4、Tra−1−60およびTra−1−81からなる群から選択される細胞マーカーを発現し、(ii)多能性細胞に特徴的な形態を示し、および/または(iii)免疫不全動物に導入されると奇形腫を形成する、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される細胞。
- 請求項1から18のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される、多能性細胞が濃縮された細胞集団。
- 多能性細胞が集団の少なくとも60%を占める、請求項20に記載の細胞の濃縮集団。
- 請求項18から21のいずれか一項に記載の細胞または集団から分化した細胞または細胞集団。
- 異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードする核酸を含む、Stro−1+多分化能細胞および/またはその子孫細胞。
- 医薬における請求項19から23のいずれか一項に記載の細胞または集団の使用。
- 疾患または障害を治療または予防する方法であって、請求項19から23のいずれか一項に記載の細胞または集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
- 疾患または障害の治療または予防において有用な化合物をスクリーニングする方法であって、請求項19から23のいずれか一項に記載の細胞または集団を前記化合物に曝露するステップを含む方法。
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