JP2018068307A

JP2018068307A - 再プログラム化多能性細胞の作製

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Publication number: JP2018068307A
Application number: JP2017235872A
Authority: JP
Inventors: イテシュ，シルビウ; Itescu Silviu
Original assignee: Mesoblast Inc
Current assignee: Mesoblast Inc
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2018-05-10
Anticipated expiration: 2030-03-22
Also published as: CA2755870C; US9487756B2; JP6342115B2; CN102405280A; HK1252414A1; CN102405280B; EP2408904A4; KR20120000079A; JP6603529B2; EP2408904A1; WO2010105311A1; JP2012520660A; JP2016073274A; JP6708617B2; AU2010225469B2; US20120121548A1; KR101764437B1; EP3293257A1; ES2900277T3; US20170037377A1

Abstract

【課題】再プログラム化細胞を作製する方法の提供。【解決手段】再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞及び／又はその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。前記曝露された細胞を培養するステップ、及び再プログラム化された細胞を単離するステップを更に含む方法。このような方法によって作製された細胞及びその細胞のさまざまな使用に加えて、それから分化した細胞をさらに提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、多能性細胞およびその作製方法に関する。

胚性幹（ＥＳ）細胞は、多能性を維持している間は不確定に成長でき、３種の胚葉、す
なわち中胚葉、内胚葉および外肺葉すべての細胞に分化できると信じられている（Ｅｖａ
ｎｓ＆Ｋａｕｆｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４〜１５６（１９８１））。ヒ
トＥＳ細胞およびそれに由来する細胞は、パーキンソン病、脊髄損傷および糖尿病などの
疾患の宿主の治療用に現在評価されている。しかし、ヒトＥＳ細胞はヒトの胚から得られ
るという事実が、多数の非常に議論の余地がある倫理規定を提起し、多くの国において、
これらの細胞の誘導が法律によって禁止されている。さらに、ＥＳ細胞およびそれに由来
する細胞は、それが由来する対象から抗原を発現するので、不適合な（例えば同じＨＬＡ
型（複数可）を発現しない）対象に投与された場合、それらの細胞が拒絶される危険性が
ある。したがって、科学者らはＥＳ細胞の現在の作製方法を避けるための技術的解決法を
探求した。これらの解決法を達成するための１つの望ましい方法は、出生後の個体、例え
ば、治療される対象もしくは関連する対象または他の適合する対象の体細胞から直接多能
性細胞を作製することであった。

体細胞を再プログラミングするための一方法は、細胞の核内容物を卵母細胞に移入する
ステップ（Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０〜８１３（１９９７年））ま
たはＥＳ細胞と融合させるステップ（Ｃｏｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０９：１３６９
〜１３７３（２００５年））を含み、未受精卵およびＥＳ細胞は体細胞において全能性ま
たは多能性をもたらす因子を含有することを示している。これらの方法に付随する問題は
卵子および／または胚の破壊の必要性を含み、このことは一部の国において倫理規定を提
起し得る。

多能性の転写決定は完全に理解されてはいないが、Ｏｃｔ３／４（Ｎｉｃｈｏｌｓら、
Ｃｅｌｌ９５：３７９〜３９１（１９９８年））、Ｓｏｘ２（Ａｖｉｌｉｏｎら、Ｇｅ
ｎｅｓＤｅｖ．１７：１２６〜１４０（２００３年））およびＮａｎｏｇ（Ｃｈａｍｂ
ｅｒｓら、Ｃｅｌｌ１１３：６４３〜６５５（２００３年））を含むいくつかの転写因
子は、ＥＳ細胞の多能性の維持に関与しており、しかし、ＥＳ細胞の特定だけでは十分で
ない。

最近、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａは、４つの因子（すなわち、Ｏｃｔ
４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４）を、マウスのＥＳ細胞培養に適切な条件下で
培養されたマウスのＥＳ細胞および成体マウスの線維芽細胞に導入した。どちらかの細胞
型に形質導入後、著者らは、マウスＥＳ細胞の形態および成長特性を示し、マウスＥＳ細
胞のマーカー遺伝子を発現した、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を得た（Ｔａｋａｈａｓｈ
ｉ＆Ｙａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ１２６：６６３〜６７６（２００６年））。ヌードマ
ウスへのｉＰＳ細胞の皮下移植は、３種すべての胚葉に由来するさまざまな組織を含有す
る腫瘍をもたらした。胚盤胞への注射後、ｉＰＳ細胞はマウスの胚発生に寄与した。これ
らのデータは、レトロウイルス形質導入を使用して、わずか数種の確定された因子を加え
ることによって、多能性細胞が直接マウス線維芽細胞培養物から作製され得ることを実証
している。しかし、この技術は、再プログラミングの率の低さ（処置された細胞の１％よ
りかなり低い）ならびにゲノムへの組み込みおよび発がん遺伝子ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ
４の連続発現の必要性を含む、いくつかの重要な不利益に非常に悩まされる。これらの遺
伝子の発現は、細胞およびこの細胞に由来する細胞のレシピエントにおいて腫瘍の発生を
もたらし得る。この点で、おそらくこれらの発がん遺伝子の連続発現の結果として、これ
らの方法を用いて作製されたｉＰＳ細胞を使用して作製されたキメラマウスは腫瘍を発生
する。結果的に、この分野の調査の主要な目的は、これらの因子をコードする核酸のゲノ
ムへの組み込みを必要としないか、またはこれらの再プログラミング因子もしくは他の再
プログラミング因子の発現の数もしくは期間を最小化するかのいずれかの再プログラミン
グの方法を開発することである。

融合に基づく再プログラミング研究において線維芽細胞は誘導および大量使用の容易さ
の可能性が最も高いため、ｉＰＳ細胞に基づく研究の大部分は線維芽細胞を使用するが、
繊維芽細胞以外のさまざまな細胞集団がマウスにおけるｉＰＳ細胞の誘導に使用されてき
た。これらの研究からの重要な観察は、選択された体細胞の型が、ｉＰＳ細胞作製の効率
および再プログラミングのレベルに有意な効果を有することである。この点において、神
経幹細胞、胃細胞および肝細胞などのいくつかの細胞型は、線維芽細胞と比較して比較的
高い効率で再プログラムすると思われる。しかし、ヒト由来のこれらの細胞の単離は、組
織採取の侵襲性および／または利用可能なドナー試料が限られていることにより困難また
は実現不可能である。いくつかのより入手しやすい細胞型（例えば、筋肉細胞または分化
した造血細胞）はｉＰＳ研究の基盤として使用されているが、再プログラミングの成功は
限られている。

したがって、当分野において、容易に入手でき、効率的な再プログラミングが確実に可
能な最適な細胞型の特定の必要がある。効率的な再プログラミング特性を有するこのよう
な細胞型の特定は、ゲノムへの組み込みを必要とせず、かつ／または再プログラミング因
子の数を最小化もしくは減少させる再プログラミング方法の使用を容易にすると思われる
。このことは、腫瘍性形質転換の危険性が減少した、より安全な多能性ｉＰＳ細胞集団を
もたらすであろう。再プログラミングの効率が高く、胚組織に頼らずに得られるこのよう
な細胞型は、存在がすでに企図されている適用である多能性ＥＳ細胞への使用に適してい
ると思われる。

本発明につながる研究において、本発明者は、多くの組織供給源が効率的にｉＰＳ細胞
を作製するために適切な供給源ではないという従来の見識にもかかわらず、さまざまな供
給源由来の細胞を使用してｉＰＳ細胞の作製を試みた。驚くべきことに、本発明者は、Ｓ
ｔｒｏ−１^＋多分化能細胞またはその子孫細胞（特に、脂肪組織または歯髄組織由来のも
の）が、高い効率、例えば線維芽細胞より高い効率を有するｉＰＳ細胞作製のための有用
な供給源であったことを発見した。

本発明者はまた、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞またはその子孫細胞が、線維芽細胞を再
プログラムし、ｉＰＳ細胞を作製するために、外から(exogenously)加えられることが普
通は必要とされる内因性因子、例えばＫｌｆ４および／またはｃ−ｍｙｃを発現すること
も決定した。このような内因性（endocgenous）遺伝子の発現は、これらのタンパク質を
高レベルで導入することなく、またはこれらの非内因性型タンパク質を全く導入すること
なくｉＰＳ細胞を作製することを可能にできる。ｃ−ｍｙｃの内因性発現は、この発がん
遺伝子の構成的発現および／または強度の発現を必要としないので、ｃ−ｍｙｃの内因性
発現は、腫瘍形成の危険性が減少したｉＰＳ細胞の作製もまた容易にすると思われる。

本発明の一例は、再プログラム化細胞を作製する方法を提供し、前記方法は、Ｓｔｒｏ
−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分
な条件下で１種または複数の能力決定因子（potency-determining factors）に曝露する
ステップおよび曝露された細胞を培養し、再プログラム化細胞を得るステップを含む。こ
の方法は、同様に、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を作製する方法に適用される。

本発明の別の例は、再プログラム化細胞を作製する方法を提供し、前記方法は、Ｓｔｒ
ｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再
プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップ
を含む。

Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞の供給源は、これらの細胞がｉｎｓｉｔｕで位置する任
意の組織であってよい。好ましくは、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞の供給源は脂肪組織ま
たは歯髄組織である。Ｓｔｒｏ−１^＋細胞の別の供給源は骨髄である。

一例において、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞またはその子孫細胞は、１種または複数の
能力決定因子に曝露する前の脂肪組織、歯髄組織、骨髄または他の部位から濃縮される。

一例において、本発明の方法は、曝露された細胞を培養し、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細
胞および／またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する、すなわち、Ｓｔｒｏ−１^＋多
分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広範囲の細胞系列（cell lineage）および
／または細胞型に分化できる、再プログラム化細胞を得るステップを含む。

例示的な能力決定因子は、限定するものではないが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、
Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ
抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１
５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、
Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴ
Ｆ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、ＦｏｘＤ３、ＺＮＦ２０６、Ｍｙｂｌ２、ＤＰＰＡ
２、Ｏｔｘ２およびＧｒｂ２または１種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似の活
性を有する化合物、例えばその活性断片または小分子からなる群から個別にまたは集約的
に選択される因子を含む。別の例示的な能力決定因子は、例えば本明細書に記載された、
化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである。例えば、１
種または複数の能力決定因子は、
（ｉ）Ｏｃｔ４、
（ｉｉ）Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つ
との組み合わせ、
（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、
（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、
（ｖｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８
の組み合わせ、ならびに
（ｉｘ）（ｉ）から（ｘ）のうちのいずれか１つと、さらに化学物質、ペプチド、ｓｉＲ
ＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される。

好ましくは、能力決定因子はＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃである。

本発明の方法の一例において、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細
胞は、出生後の対象から得られる。この実施形態によれば、本方法は、対照からＳｔｒｏ
−１^＋多分化能細胞および／または子孫細胞を得る、または単離するステップをさらに含
み得る。

好ましくは、対象は、哺乳動物および／または哺乳動物の細胞である。例示的な哺乳動
物対象は、限定するものではないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ
、ロバ、ブタ）、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、
マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕らわれた野生動物（例えば、キ
ツネ、シカ）を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましい哺
乳動物はヒトである。

本発明の一例示形態において、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細
胞を１種または複数の能力決定因子に曝露するステップは、プロモーターに作動可能に連
結された１種または複数の能力決定因子をコードする配列を含む核酸をＳｔｒｏ−１^＋多
分化能細胞および／またはその子孫細胞に導入するステップを含む。核酸をコードする複
数の能力因子は互いに異なっていても、または単一の核酸において、例えば、別々のプロ
モーターにそれぞれが連結した複数の核酸、もしくは単一のプロモーターにそれぞれが連
結した複数の核酸を含む単一の発現ベクター、例えばマルチシストロン性ベクター中にあ
ってもよい。好ましくは、核酸はベクター、より好ましくはウイルスベクター、例えばレ
トロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター内に含有される。

本発明の一例において、核酸は、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫
細胞のゲノム中に組み込まれない。例えば、核酸（複数可）は、細胞（複数可）内で１つ
または複数のエピソームとして残存し、および／または最終的に細胞（複数可）から排出
される。

好ましくは、本発明の方法は、多分化能細胞または多能性細胞または全能細胞、より好
ましくは多能性細胞の作製をもたらす。一例において、再プログラム化細胞は、（ｉ）Ｏ
ｃｔ−４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１からなる
群から選択される細胞マーカーを発現し、（ｉｉ）多能性細胞に特徴的な形態を示し、（
ｉｉｉ）免疫不全動物に導入されると奇形腫を形成する。

別の例において、本発明の方法は、再プログラム化細胞を、所望の細胞型を含む細胞集
団、または所望の細胞型が濃縮された細胞集団に分化させるステップをさらに含む。本発
明の方法は、所望の細胞型を単離、濃縮または選択するステップをさらに含み得る。この
ような細胞は、例えば本明細書に記載された療法またはスクリーニングにおいて有用であ
る。または、例えば多能性細胞が病態を患っている対象から作製された場合、このような
分化細胞は疾患状態または病態の研究に有用である。

別の例において、本発明の方法は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法によ
って作製された細胞の有効量を、薬学的に許容される担体または賦形剤を有する医薬組成
物に製剤化するステップを含む。

別の例において、本発明は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法によって作
製された細胞またはその集団または再プログラム化細胞が濃縮された集団を提供する。同
様に、本発明の例示形態は、任意の実施形態に従って本明細書に記載の細胞または集団か
ら分化した細胞または細胞の集団を提供する。

本発明の別の例は、異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードす
る核酸を含む、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を提供する。こ
のような細胞は、再プログラム化細胞の作製に有用である。

任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された細胞
は、薬物療法、例えば疾患または障害を治療または予防する方法において有用であり、こ
の方法は、この細胞またはその集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む
。

任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された細胞
は、スクリーニングにもまた有用である。例えば、本発明は、疾患または障害の治療また
は予防において有用な化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、本発明に
よる細胞または集団を前記化合物に曝露するステップを含む。

例えば、本発明は、多能性細胞の分化を導く化合物を特定する方法をさらに提供し、こ
の方法は、
ｉ）本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団を被験化合物と接触させ、それ
から分化した細胞の量を決定するステップ、
ｉｉ）この化合物の不在下で、本発明に従って作製された多能性細胞またはその集団から
分化した細胞の量を決定するステップ
を含み、（ｉｉ）と比較して（ｉ）において分化細胞の量が増加することが、化合物が多
能性細胞の分化を導くことを示す。

好ましくは、本方法は、１種または複数の異なる分化細胞型の量を決定するステップを
含む。このようにして、特定の細胞系列または細胞型への分化を導く化合物が決定される
。

前述により、本発明が、多能性細胞の分化を低減し、または阻止する化合物を特定する
方法をさらに提供することが、当業者には明らかであると思われる。

本発明はさらに、病態の治療に有用な化合物を特定または単離する方法を提供し、この
方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施して、病態を患う対象から多
能性細胞またはその集団を作製するステップ、および
（ｉｉ）細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に対する
その効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。

一例において、本方法は、
（ａ）多能性細胞またはその集団を病態に侵された細胞に分化させるステップ、および
（ｂ）（ａ）の細胞を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に対するその
効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。

このような方法は、病態を治療するための新規な化合物の特定および単離に有用である
だけではなく、対象が、既存の治療化合物／予防化合物を用いた治療に応答する可能性が
あるかどうかを特定するためにも有用である。

このような方法は、化合物を、再プログラム化Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／ま
たはその子孫細胞から成熟および分化および由来した１種または複数の標的組織に曝露し
た場合、化合物の任意の特定の毒性効果を特定するためにもさらに有用である。

概要
本明細書を通して、特に明示しない限り、または文脈上別の解釈を要する場合を除き、
単一のステップ、組成物、ステップの群または組成物の群への言及は、それらのステップ
、組成物、ステップの群または組成物の群の１つまたは複数（すなわち、１つ以上）を包
含すると解釈されるべきである。

本明細書に記載の個々の実施形態は、特に明記されない限り、１つ１つの他の実施形態
に変更すべきところは変更して適用される。

当業者は、本明細書に記載の発明が、具体的に述べられた以外の変更および改良を受け
入れ可能であることが明らかであろう。本発明が、このような変更および改良をすべて含
むことは理解されるべきである。本発明は、本明細書に言及された、または示されたすべ
てのステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに前記ステップまたは特徴のあらゆる
組み合わせまたは任意の２つ以上を個別にまたは集約的にさらに含む。

本発明は、本明細書に記載の具体的実施形態によって範囲を限定されるものではなく、
これらは単なる例示を目的とする意図である。機能的に同等である生成物、組成物および
方法が本発明の範囲内であることは、本明細書に記載のように明らかである。

本発明は、特に明記しない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組み換えＤＮＡ
技術、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成および免疫学の従来技術を使用して、必
要以上の実験をせずに実施される。このような手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、第２版（１９８９年）、ＶｏｌｓＩ、ＩＩおよびＤ
Ｉ全体；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌ
ｓ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５年）、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘ
ｆｏｒｄ、テキスト全体；ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ
ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）ＩＲＬＰ
ｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体および特にテキスト中のＧａｉｔによる１〜２２
ページ；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、３５〜８１ページ；Ｓｐｒｏａｔら、８３〜１１５；およ
びＷｕら、１３５〜１５１ページの論文；４．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆
Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキス
ト全体；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ：ＡＰｒａｃ
ｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９８６年）ＩＲＬＰｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、テキ
スト全体；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．）、シリーズ全体；Ｊ．Ｆ．ＲａｍａｌｈｏＯｒｔｉｇａｏ、「ＴｈｅＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」：Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ
ｄａｔａｂａｓｅｏｆＡｃｃｅｓｓｔｏＶｉｒｔｕａｌＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙｗｅｂｓｉｔｅ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓａｋａｋｉｂａ
ｒａ，Ｄ．、Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．、Ｌｉｅｎ，Ｅ．ＬａｎｄＦｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ
．Ｌ．（１９７６年）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３
３３６〜３４２ページ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３年）．Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９〜２１５４年；Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．およびＭｅｒｒｉ
ｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９年）、ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．お
よびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編）ｖｏｌ．２、１〜２８４ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ．１２．Ｗｕｕｎｓｃｈ，Ｅ．編（１９７４年）Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｅｖｏｎＰｅｐｔｉｄｅｎｉｎＨｏｕｂｅｎ−ＷｅｙｌｓＭｅｔｏｄ
ｅｎｄｅｒＯｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ（Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．編）、ｖｏｌ
．１５、第４版、パート１および２、Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓ
ｚｋｙ，Ｍ．（１９８４年）ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋ
ｙ，Ｍ．＆Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４年）ＴｈｅＰｒａｃｔｉｃｅｏｆ
ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５年）Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰ
ｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．２５、４４９〜４７４ページ；ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ
．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ：
ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、第３版（ＪｏｈｎＲ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ編
、２０００年）、ＩＳＢＮ０１９９６３７９７０、テキスト全体に記載されている。

選択された定義
「集約的」（collectively）は、本発明が、任意の数または組み合わせの列挙されたタ
ンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群を包含することを意味
し、しかも、このような数または組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパ
ク質もしくはマーカーの群が本明細書に具体的に記載されていないにもかかわらず、添付
の特許請求の範囲が、任意の他の組み合わせのタンパク質もしくはマーカーまたはタンパ
ク質もしくはマーカーの群から単独におよび分割可能にこのような組み合わせまたは小型
の組み合わせ(sub-combinations)を定義し得ることを意味する。

本明細書を通して、文脈上別の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）
」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉ
ｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられたステップもしくは要素もしくは整数（integer）
またはステップもしくは要素もしくは整数の群を包含するが、他の任意のステップもしく
は要素もしくは整数またはステップもしくは要素もしくは整数の群を排除しないことを暗
示すると理解されるべきであろう。

本明細書において使用する場合、「に由来する」という用語は、指定された整数が特定
の供給源から得ることができるが、必ずしも直接その供給源からである必要はないことを
示すと解釈されるべきである。

本明細書において使用する場合、「有効量」という用語は、投与前の同じ過程または状
態と比較して、および／または細胞を投与されない対象と比較して、生理的過程もしくは
疾患状態を改善するため、または対象における疾患状態の発症を予防するための、再プロ
グラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子孫細胞の十分量を意味す
ると解釈されるべきである。

本明細書において使用する場合、細胞集団の文脈における「濃縮された」という用語は
、再プログラム化細胞または多能性細胞の数またはパーセントが天然の細胞集団における
数またはパーセントを超えることを意味すると解釈されるべきである。例えば、再プログ
ラム化細胞または多能性細胞が濃縮された集団は、少なくとも約０．０２％の前記細胞ま
たは少なくとも約０．０５％の前記細胞または少なくとも約０．１％の前記細胞または少
なくとも約０．２％の前記細胞または少なくとも約０．５％の前記細胞または少なくとも
約０．５％の前記細胞または少なくとも約０．８％の前記細胞または少なくとも約１％の
前記細胞または少なくとも約２％の前記細胞または少なくとも約３％の前記細胞または少
なくとも約４％の前記細胞または少なくとも約５％の前記細胞または少なくとも約１０％
の前記細胞または少なくとも約１５％の前記細胞または少なくとも約２０％の前記細胞ま
たは少なくとも約２５％の前記細胞または少なくとも約３０％の前記細胞または少なくと
も約４０％の前記細胞または少なくとも約５０％の前記細胞または少なくとも約６０％の
前記細胞または少なくとも約７０％の前記細胞または少なくとも約８０％の前記細胞また
は少なくとも約８５％の前記細胞または少なくとも約９０％の前記細胞または少なくとも
約９５％の前記細胞または少なくとも約９７％の前記細胞または少なくとも約９８％の前
記細胞または少なくとも約９９％の前記細胞で構成されている。

「曝露する（ｅｘｐｏｓｅ）」および文法的に同等の用語、例えば「曝露すること（ｅ
ｘｐｏｓｉｎｇ）」は、能力決定因子が細胞に生物学的効果を発揮するほど、細胞を能力
決定因子の十分近くに運ぶ任意の過程を意味すると解釈されるべきである。この用語は、
限定するものではないが、細胞をこの因子と接触させるステップおよび／または細胞をこ
の因子をコードする核酸と接触させるステップおよび／または細胞においてこの因子を発
現させるステップを含むと理解されるべきである。

「個別に」は、本発明が、列挙されたタンパク質もしくはマーカーまたはタンパク質も
しくはマーカーの群を単独に包含することを意味し、しかも、個別のタンパク質もしくは
マーカーまたはタンパク質もしくはマーカーの群が本明細書に単独で記載されていないと
しても、添付の特許請求の範囲が、このようなタンパク質もしくはマーカーまたはタンパ
ク質もしくはマーカーの群を、互いに単独におよび分割可能に定義し得ることを意味する
。

本明細書において使用する場合、「ｉＰＳ細胞」という用語は、起源であるその各分化
体細胞（例えば、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞またはその子孫細胞）と実質的に、遺伝学
的に同一であり、ＥＳ細胞などの能力のより高い細胞と同様の特徴を示す細胞を指す。ｉ
ＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と類似の形態学的特性（すなわち、円形、大型の核小体およびわず
かな細胞質）および成長特性（すなわち、倍加時間；ＥＳ細胞は約１７から１８時間の倍
加時間を有する）を示す。さらに、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、
Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、しか
しＳＳＥＡ−Ｉは発現しない）を発現することが好ましい。しかし、ｉＰＳ細胞は、胚に
直接由来するものではなく、少なくともそれらが多能性になるまで、選択された能力決定
因子の１つまたは複数のコピーを一時的にまたは安定して発現できる。本明細書において
使用する場合、「胚に直接由来しない」は、ｉＰＳ細胞を作製するための出発細胞型が、
出生後の個体から得た非多能性Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能（mutilpotential）細胞またはそ
の非多能性子孫であることを意味する。

本明細書において使用する場合、「多分化能」(multipotent)という用語は、細胞が、
３種の胚葉（中胚葉、内胚葉および外胚葉）の１種または２種または３種、好ましくは１
種または２種の胚葉の複数の異なる型の細胞に分化できることを意味すると解釈されるべ
きである。

本明細書において使用する場合、「多能性」(pluripotent)という用語は、細胞が、３
種の胚葉、すなわち内胚葉、外胚葉および中胚葉のそれぞれの細胞に分化できることを意
味すると解釈されるべきである。多能性細胞は、さまざまな多能性細胞特異的マーカー（
例えば、以下の多能性細胞特異的マーカー：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−
６０またはＴＲＡ１−８１の１種または複数）を発現し、未分化細胞に特徴的な細胞形態
（すなわち、コンパクトなコロニー、核細胞質比の高さおよび顕著な核小体）を有し、Ｓ
ＣＩＤマウスなどの免疫不全動物に導入された場合、奇形腫を形成する。奇形腫は、通常
３種の胚葉すべての特徴を示す細胞または組織を含有する。当業者は、当分野において一
般的に使用される技術を使用することによってこれらの特徴を評価でき、例えば、Ｔｈｏ
ｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５〜１１４７（１９９８年）を参照された
い。多能性細胞は、細胞培養における増殖、および多分化能特性を示す、系列が限定され
たさまざまな細胞集団への分化の両方ができる。多分化能体細胞は、多能性細胞と比較し
てより分化しているが、最終分化はしていない。したがって、多能性細胞は、多分化能細
胞より高い能力を有している。

本明細書において使用する場合、「能力決定因子」という用語は、遺伝子または他の核
酸、それらの機能的断片などの因子およびコードされた因子、例えばタンパク質もしくは
その機能的断片、または体細胞の能力を増加し、それにより多分化能、多能性または全能
になるために使用される小分子もしくは抗体を指す。能力決定因子は、場合により、再プ
ログラム化細胞中に一時的にだけ存在し得る、または核酸の場合、再プログラム化細胞の
ゲノム中に転写的に活性または不活性な状態で維持され得る。同様に、核酸の能力決定因
子は、再プログラム化細胞中に複数のコピーが存在でき、能力決定因子が細胞のゲノム中
に組み込まれ得る場合、染色体外または両方に存在し得る。例示的能力決定因子は、Ｏｃ
ｔ４（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ１１７４
３５．１またはＮＣＢＩ受託番号ＮＭ００２７０１で提示される）、Ｓｏｘ２（例示的ヌ
クレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００３１０６．２で提示され
る）、Ｋｌｆ４（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０
０４２３５．４で提示される）、Ｎａｎｏｇ（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は
、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２４８６５．２で提示される）、Ｌｉｎ２８（例示的ヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２４６７４．４で提示される）
、ｃ−Ｍｙｃ（例示的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１
６７８５．１）、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６
、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β
−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５
、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１（例示的配列は、ＮＣＢＩ受
託番号ＮＭ１７４９００で提示される）、ＵＴＦ１（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号Ｎ
Ｍ００３５７７で提示される）、Ｓｔｅｌｌａ（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ１
９９２８６で提示される）、Ｓｔａｔ３、ＦｏｘＤ３（例示的配列は、ＮＣＢＩ受託番号
ＮＭ０１２１８３で提示される）、ＺＮＦ２０６、Ｍｙｂｌ２、ＤＰＰＡ２、Ｏｔｘ２
およびＧｒｂ２を含む。本明細書に提供されたすべての受託番号は、２００９年２月２０
日現在のものである。当業者は、本明細書に記載の他の能力決定因子の構造を、例えばＮ
ＣＢＩまたはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースを使用して容易に決定できるであろう。
前記因子と同じまたは同様の活性を有する化合物もまた含まれる。このような化合物は、
再プログラミングを強化または誘導できる抗体および小分子、例えば、ヒストンデアセチ
ラーゼ阻害剤またはＤＮＡメチラーゼまたはその阻害剤を含む。当業者は、適切な化合物
を、例えば、１種または複数の能力決定因子が除外された本明細書に記載の方法および評
価された被験化合物のパネルを使用して、ならびに／または細胞および／もしくはＭａｒ
ｋｏｕｌａｋｉら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２７、１６９〜１７１
ページ（２００９年）に記載の方法を使用して決定できるであろう。

本明細書において使用する場合、「能力」という用語は、複数の細胞型に分化する細胞
の能力を意味すると解釈されるべきである。したがって、優れた能力を有する細胞は、能
力のより低い細胞より多くの細胞型に分化できる。

本明細書において使用する場合、「予防有効量」という用語は、臨床症状の１種または
複数の検出可能な症状を予防する、またはその発症を阻害する、または発症を遅延させる
ために十分な量の再プログラム化細胞またはそれから分化した細胞および／またはその子
孫細胞を意味すると解釈されるべきである。

本明細書において使用する場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防するこ
と（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、
予防有効量の細胞を投与し、臨床症状の少なくとも１種の症状の発生を停止する、妨げる
、または遅延させるまたは減少させることを意味すると解釈されるべきである。

本明細書において使用する場合、「再プログラミング」という用語は、体細胞を脱分化
および／または多分化能／多能性／全能細胞に転換させ、したがってそれが由来した細胞
より優れた能力の可能性を有する過程を指す。好ましくは、再プログラム化細胞は多分化
能、多能性または全能であり、より好ましくは多能性である。「再プログラム化」という
用語は、体細胞を多分化能／多能性／全能にさせるために脱分化されている体細胞を指す
。

本明細書において使用する場合、「ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞」という語句は、多分
化能細胞コロニーを形成できる非造血性ＳＴＲＯ−１^＋および／またはＴＮＡＰ^＋の前駆
細胞を意味すると解釈されるべきである。好ましいＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞は、本明
細書においてより詳細に考察される。

本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、Ｓｔｒｏ−１^＋細胞を含む任
意の対象、好ましくは哺乳動物を意味すると解釈されるべきである。例示的対象は、限定
するものではないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）
、コンパニオン・アニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ
、ラット、モルモット、ハムスター）、捕らわれた野生動物（例えば、キツネ、シカ）を
含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは霊長類である。最も好ましい哺乳動物はヒトで
ある。

本明細書において使用する場合、「全能」という用語は、ある細胞が、３種の胚葉のそ
れぞれの細胞および胚外組織に分化できることを意味すると解釈されるべきである。

本明細書において使用する場合、「治療有効量」という用語は、１種または複数の臨床
症状を減少する、または阻害するために十分な量の再プログラム化細胞またはそれから分
化した細胞および／またはその子孫細胞を意味すると解釈されるべきである。

本明細書において使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、治療有効量
の細胞を投与し、臨床症状の少なくとも１種の症状を減少させる、または阻害することを
意味すると理解されるべきである

ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞または子孫細胞
ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓
、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨
格筋、真皮および骨膜において発見された細胞であり、中胚葉および／または内胚葉およ
び／または外胚葉などの生殖細胞系に分化できる。好ましくは、ＳＴＲＯ−１^＋細胞は骨
髄、歯髄または脂肪組織由来であり、より好ましくは歯髄または脂肪組織由来である。し
たがって、ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞は、限定するものではないが、脂肪組織、骨組織
、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織および線維性結合組織を含む多数の細胞型に分化できる
。これらの細胞が進入する特定の分化系列決定および分化経路は、機序的な影響ならびに
／または内因性生物活性因子、例えば成長因子、サイトカインおよび／もしくは宿主組織
によって確立された局所的微小環境条件からのさまざまな影響に依存する。したがって、
ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞は、分裂し、時がたてば不可逆的に分化し表現型細胞をもた
らすであろう、幹細胞または前駆体細胞のいずれかである娘細胞をもたらす非造血性前駆
細胞である。

好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞は、対象、例えば治療される
べき対象または関連する対象または関連のない対象（同じ種または異なる種のどちらでも
）から得られた試料から濃縮される。このような濃縮は、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖ
ｉｔｒｏで実施され得る。「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」、「濃縮（ｅｎｒｉｃｈ
ｍｅｎｔ）」という用語またはそれらの変形は、本明細書において、未処理の集団と比較
した場合、１種の特定の細胞型の割合または多数の特定の細胞型の割合が増加した細胞の
集団を表すために使用される。

好ましい実施形態において、本発明において使用される細胞は、ＴＮＡＰ^＋、ＶＣＡＭ
−１^＋、ＴＨＹ−１^＋、ＳＴＲＯ−２^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ１４６^＋、３Ｇ５^＋またはそ
れらの任意の組み合わせからなる群から個別にまたは集約的に選択される、１種または複
数のマーカーを発現する。

好ましくは、ＳＴＲＯ−１^＋細胞は、ＳＴＲＯ−１^{ｂｒｉｇｈｔ}（同義語ＳＴＲＯ−１
^ｂｒｉ）である。好ましくは、ＳＴＲＯ−１^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞は、さらにＴＮＡＰ^＋、Ｖ
ＣＡＭ−１^＋、ＴＨＹ−１^＋、ＳＴＲＯ−２^＋および／またはＣＤ１４６^＋の１つまたは
複数である。

一実施形態において、間葉前駆体細胞は、ＷＯ２００４／８５６３０に定義されるよう
に血管周囲の間葉前駆体細胞である。

所与のマーカーに対して「陽性」であると称される細胞は、この用語が細胞の選別過程
において使用される蛍光または他のマーカーの強度に関連する場合、マーカーが細胞表面
に存在する程度に依存して、低レベル（ｌｏもしくはｄｉｍ）または高レベル（ｂｒｉｇ
ｈｔ、ｂｒｉ）のいずれかでそのマーカーを発現できる。ｌｏ（もしくはｄｉｍもしくは
ｄｕｌｌ）とｂｒｉとの区別は、選別された特定の細胞集団に関して使用されるマーカー
との関連で理解されるであろう。所与のマーカーに対して「陰性」であると称される細胞
は、その細胞が必ずしも完全に不在ではない。この用語は、その細胞によって発現される
マーカーが比較的非常に低いレベルであることを意味し、検出可能に標識された場合、非
常に低いシグナルを発生するまたはバックグラウンドのレベルを上回って検出できないこ
とを意味する。

本明細書において使用する場合、「ｂｒｉｇｈｔ」という用語は、検出可能に標識され
た場合、比較的高いシグナルを発生する細胞表面のマーカーを指す。理論に縛られること
を好むわけではないが、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞が、試料中の他の細胞より多くの標的マー
カータンパク質（例えば、ＳＴＲＯ−１により認識される抗原）を発現することが提唱さ
れる。例えば、ＳＴＲＯ−１^ｂｒｉ細胞は、ＦＩＴＣ標識ＳＴＲＯ−１抗体を用いて標識
された場合、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析による決定で非ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＳＴ
ＲＯ−１^ｄｕｌｌ／^ｄｉｍ）より多くの蛍光シグナルを発生する。好ましくは、「ｂｒｉ
ｇｈｔ」細胞は出発試料中に含有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも
約０．１％を構成する。他の実施形態において、「ｂｒｉｇｈｔ」細胞は出発試料中に含
有される最も明るく標識された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．
５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％または少なくとも約２％を構成する。好
ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞は、「バックグラウンド」、す
なわちＳＴＲＯ−１⁻である細胞と比較してＳＴＲＯ−１の表面発現の２ｌｏｇ量の発現
増加を有する。比較すると、ＳＴＲＯ−１^ｄｉｍおよび／またはＳＴＲＯ−１^{ｉｎｔｅｒ}
^{ｍｅｄｉａｔｅ}細胞は、２ｌｏｇ量未満の発現増加、通常約１ｌｏｇまたは「バックグラ
ウンド」より低いＳＴＲＯ−１の表面発現を有する。

本明細書において使用する場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的アルカリホ
スファターゼのすべてのアイソフォームを包含することを意図する。例えばこの用語は、
肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎臓アイソフォーム
（ＫＡＰ）を包含する。好ましい実施形態において、ＴＮＡＰはＢＡＰである。特に好ま
しい実施形態において、本明細書において使用する場合、ＴＮＡＰは、ブダペスト条約の
規定の下に、２００５年１２月１９日に受託番号ＰＴＡ−７２８２でＡＴＣＣに寄託され
た、ハイブリドーマ細胞系によって作製されたＳＴＲＯ−３抗体に結合できる分子を指す
。

さらに、好ましい実施形態において、ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞は、コロニー形成Ｃ
ＦＵ−Ｆを生じさせることができる。

かなりの割合の多分化能細胞が、少なくとも２種の異なる生殖細胞系に分化できること
が好ましい。多分化能細胞が決定（committed）され得る系列の限定されない例は、骨前
駆体細胞；胆管上皮細胞および肝細胞に関して多分化能である肝細胞前駆細胞；乏突起膠
細胞および星状細胞に進行するグリア細胞前駆体を発生できる神経制限細胞；ニューロン
に進行するニューロン前駆体；心筋および心筋細胞、グルコース反応性、インスリン分泌
膵臓β細胞系に関する前駆体を含む。他の系列は、限定するものではないが、象牙芽細胞
、象牙質産生細胞および軟骨細胞ならびに以下：細胞網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケ
ラチノサイトなどの皮膚細胞、樹状細胞、毛嚢細胞、尿細管上皮細胞、平滑筋細胞および
骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱、靭帯、軟骨、含脂肪細胞、線維芽細胞、
骨髄基質、心筋、平滑筋、骨格筋、周皮細胞、血管、上皮、グリア、ニューロン、星状細
胞および乏突起膠細胞の各細胞の前駆体細胞を含む。

別の実施形態において、ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞は、培養において造血性細胞を発
生できない。

一実施形態において、細胞は治療される対象から採取される、または例えば、任意の実
施形態に従って本明細書に記載の方法に使用する前に、標準的技術を使用してｉｎｖｉ
ｔｒｏで培養される。このような細胞またはそれらから分化した細胞は、自己または同種
の組成物において対象に投与するために有用である。別の実施形態において、確立された
ヒト細胞系の１種または複数の細胞が使用される。本発明の別の有用な実施形態において
、非ヒト動物（または対象がヒトではない場合、別の種由来）の細胞が使用される。

子孫細胞は、任意の適切な培地において培養することによって得ることができる。細胞
培養に関して使用される場合、「培地」という用語は、細胞周囲の環境構成要素を含む。
培地は、固体、液体、気体または相と材料の混合物であってよい。培地は、液体成長培地
および細胞成長を維持しない液体培地を含む。培地は、ゼラチン培地、例えば寒天、アガ
ロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質をさらに含む。例示的ガス状培地は、ペトリ皿ま
たは他の固体もしくは半固体支持体上で成長する細胞が曝露されるガス相を含む。「培地
」という用語は、たとえ細胞に接触していなくても、細胞培養において使用するための材
料を指す。言い換えれば、細胞培養のために調製された栄養豊富な液体は培地である。水
または他の液体と混合した場合細胞培養に適切になる粉末混合物は、「粉末培地」と呼ぶ
ことができる。

ある実施形態において、本発明の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体を用いて
標識された磁気ビーズを使用して骨髄からＴＮＡＰ^＋ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞を単離
し、次いで培養して単離細胞を増殖させる（expand）ことによって得られる（適切な培養
条件の例に関してはＧｒｏｎｔｈｏｓら、Ｂｌｏｏｄ８５：９２９〜９４０ページ、１
９９５年を参照されたい）。

一実施形態において、このように増殖させた細胞（子孫）（好ましくは、少なくとも５
継代後）は、ＴＮＡＰ⁻、ＣＣ９⁻、ＨＬＡクラスＩ^＋、ＨＬＡクラスＩＩ⁻、ＣＤ１４
⁻、ＣＤ１９⁻、ＣＤ３⁻、ＣＤ１１ａ⁻ｃ⁻、ＣＤ３１⁻、ＣＤ８６⁻、ＣＤ３４⁻お
よび／またはＣＤ８０⁻であり得る。しかし、本明細書に記載の培養条件と異なる培養条
件下では、さまざまなマーカーの発現は変動し得る可能性がある。さらに、これらの表現
型の細胞は増殖させた細胞集団において優勢であり得るが、この表現型（複数可）を有さ
ない細胞の少数の集団が存在することを意味するものではない（例えば、増殖させた細胞
は、少ない割合でＣＣ９⁻であり得る。）。好ましい一実施形態において、増殖させた細
胞は、さまざまな細胞型に分化する能力を未だに有している。

さらなる実施形態において、増殖させた細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−
１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４
９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０
、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ ６−１９、トロンボモジュリン、Ｃ
Ｄ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、Ｆ
ＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１^ｂ
^{ｒｉｇｈｔ}およびＣＤ１４６またはこれらのマーカーの任意の組み合わせからなる群から
選択される、１種または複数のマーカーを集約的に、または個別に発現し得る。

一実施形態において、子孫細胞は、ＷＯ２００６／０３２０９２において定義され、お
よび／または記載された、多分化能性増殖ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞子孫（Ｍｕｌｔｉ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌＥｘｐａｎｄｅｄＳＴＲＯ−１^＋Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａ
ｌｃｅｌｌｓＰｒｏｇｅｎｙ）（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１
^＋多分化能細胞が濃縮された集団を調製する方法は、ＷＯ０１／０４２６８およびＷＯ２
００４／０８５６３０に記載される。ｉｎｖｉｔｒｏの関連において、ＳＴＲＯ−１^＋
多分化能細胞は、完全に純粋な調製品として存在することは稀であり、一般的には組織特
異的分化系列決定細胞（ｔｉｓｓｕｅｓｐｅｃｉｆｉｃｃｏｍｍｉｔｔｅｄｃｅｌ
ｌｓ）（ＴＳＣＣ）である他の細胞と一緒に存在すると思われる。ＷＯ０１／０４２６８
は、約０．１％から９０％の純度レベルで骨髄からこのような細胞を収穫するステップに
ついて言及している。子孫が由来する多分化能（mutilpotential）細胞を含む集団は、組
織供給源から直接収穫でき、またはｅｘｖｉｖｏですでに増殖させた集団であってもよ
い。

例えば、子孫は、それが存在する集団の合計細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０
、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、収穫され、増殖しな
い実質的に精製されたＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞の集団から得ることができる。このレ
ベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１^{ｂｒｉｇｈｔ}、３Ｇ５^＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨ
Ｙ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から個別にまたは集約的に選択される
、少なくとも１種のマーカーに陽性である細胞を選択することによって達成され得る。

ＭＥＭＰは、マーカーのＳＴＲＯ−１^ｂｒｉに対して陽性であり、マーカーのアルカリ
ホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陰性であるという点から、新鮮に収穫されたＳＴＲＯ
−１^＋多分化能細胞とは識別され得る。対照的に、新鮮に単離されたＳＴＲＯ−１^＋多分
化能細胞は、ＳＴＲＯ−１^ｂｒｉおよびＡＬＰの両方に対して陽性である。本発明の好ま
しい実施形態において、投与された細胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、
５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％はＳＴＲＯ−１^ｂｒｉ、ＡＬＰ⁻
の表現型を有する。さらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰは、マーカーのＫｉ６
７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１の１種または
複数に対して陽性である。その上さらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰはＴＥＲ
Ｔ活性を示さない、および／またはマーカーのＣＤ１８に対して陰性である。

ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞出発集団は、ＷＯ０１／０４２６８またはＷＯ２００４／
０８５６３０において示される任意の１種もしくは複数の組織型、すなわち骨髄、歯髄細
胞、脂肪組織および皮膚に由来し、または、おそらくより広範囲には、脂肪組織、歯、歯
髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、
骨、靭帯、骨髄、腱および骨格筋に由来し得る。

本発明の実施において、任意の所与の細胞表面マーカーを担持する細胞の分離は、多数
のさまざまな方法によってもたらされ得るが、好ましい方法は、結合剤（例えば、抗体ま
たはその抗原結合断片）と関与するマーカーとの結合、その後の、高レベルの結合または
低レベルの結合または結合を示さないかのいずれかである、結合を示す細胞の分離に頼る
と理解されると思われる。最も都合の良い結合剤は、抗体または抗体に基づく分子であり
、好ましくは、これらの後者の薬剤の特異性のためモノクローナル抗体であり、またはモ
ノクローナル抗体に基づく。抗体は、両方のステップに使用できるが、他の薬剤もまた使
用でき、したがって、これらのマーカーに対するリガンドもまた、これらのマーカーを担
持する細胞またはそれを欠いた細胞の濃縮に用いることができる。

抗体またはリガンドは固体支持体と結合し、粗分離を可能にする。分離技術は、好まし
くは回収される分画の生存能力の保有を最大にする。異なる効率のさまざまな技術を用い
、比較的粗い分離を得ることができる。用いる特定の技術は、分離の効率、関連する細胞
毒性、実施の簡便さおよび速さならびに高性能の機器および／または技術的熟練の必要性
に依存すると思われる。分離の手順は、限定するものではないが、抗体コーティング磁気
ビーズを使用する磁気分離、アフィニティクロマトグラフィーおよび固体マトリックスに
結合した抗体を用いた「パニング」を含み得る。正確な分離を提供する技術は、限定する
ものではないが、ＦＡＣＳを含む。ＦＡＣＳを実施する方法は、当業者には明らかである
と思われる。

本明細書に記載の個々のマーカーに対する抗体は、市販されており（例えば、ＳＴＲＯ
−１に対するモノクローナル抗体は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡから市販されてい
る）、ＡＴＣＣまたは他の寄託組織から利用でき、および／または当分野において認識さ
れている技術を使用して作製できる。

ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞を単離する方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベルの発
現を認識する磁気活性化細胞分取法（ＭＡＣＳ）を利用する固体相選別ステップである第
１のステップを含むことが好ましい。所望であれば、次いで、特許明細書ＷＯ０１／１４
２６８に記載の高レベルの前駆体細胞発現をもたらす第２の選別ステップを続けることが
できる。この第２の選別ステップは、複数のマーカーの使用を含み得る。

ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞を得る方法は、公知の技術を使用する第１の濃縮ステップ
の前に、細胞供給源の収穫をさらに含み得る。したがって、組織は外科的に摘出される。
次いで、供給源組織を含む細胞は、いわゆる単一細胞懸濁液に分離されるであろう。この
分離は、物理的および／または酵素的方法によって達成され得る。

ひとたび適切なＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞集団が得られたら、ＳＴＲＯ−１^＋多分化
能細胞集団は、ＭＥＭＰを得るための任意の適切な手段によって培養または増殖させ得る
。

本発明は、限定するものではないが、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物、イヌ、ネコ、ウサ
ギ、げっ歯類、鳥類および魚類の細胞を含む任意の非ヒト動物種由来の細胞を使用して実
行できる。本発明を実施できる霊長類細胞は、限定するものではないが、チンパンジー、
ヒヒ、カニクイザルならびに他の任意の新世界ザルおよび旧世界ザル（New or Old World
monkeys）の細胞を含む。本発明を実施できる有蹄動物細胞は、限定するものではないが
、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、バッファローおよびバイソンの細胞を含む。本発明
を実施できるげっ歯類細胞は、限定するものではないが、マウス、ラット、モルモット、
ハムスターおよびスナネズミの細胞を含む。本発明を実施できるウサギ種の例は、家畜化
されたウサギ、ジャックラビット、野ウサギ、ワタオウサギ、カンジキウサギおよびナキ
ウサギを含む。ニワトリ（Gallus gallus）は、本発明を実施できる鳥類の例である。

本発明の方法に有用な細胞は、使用前、または上清もしくは可溶性因子を得る前に保管
できる。真核細胞および特に哺乳動物細胞の保管および保存の方法およびプロトコルは当
分野において公知である（例えば、Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．
Ｍ．（１９９７年）ＢａｓｉｃＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２
版、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．
（２０００年）ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ、第４版、Ｗｉｌｅｙ
−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい）。単離された幹細胞、例えば間
葉幹細胞／前駆細胞またはその子孫の生物活性を維持する任意の方法は、本発明に関連し
て利用され得る。好ましい一実施形態において、細胞は、凍結保存を使用して維持および
保管される。

能力決定因子を発現するように遺伝子改変された細胞
一実施形態において、ＳＴＲＯ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞は、例
えば、能力決定因子またはその複数を発現するように遺伝子改変される。

細胞を遺伝子改変する方法は、当業者には明らかであると思われる。例えば、細胞にお
いて発現される核酸は、細胞、好ましくは多能性（plurlipotent）細胞における発現を誘
導するためのプロモーターに作動可能に連結される。例えば、核酸は、対象のさまざまな
細胞において作動可能であるプロモーター、例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣＭ
Ｖプロモーター（例えばＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーターまた
は延長因子プロモーターまたは誘導プロモーター、例えばｔｅｔ誘導プロモーターに作動
可能に連結される。さらなる適切なプロモーターは当分野において公知であり、本発明の
本実施形態に、必要な変更を加えて適用すると解釈されるべきである。本発明は、単一の
プロモーター、例えばＯｃｔ４およびＳｏｘ２から複数の能力決定因子の発現を可能にす
る、マルチシストロン性ベクターの使用をさらに包含する。このようなベクターは、一般
的に、さまざまな能力決定因子を個々にコードする２つの核酸を分離する配列内リボソー
ム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

本明細書において使用する場合、「プロモーター」という用語は最も広い文脈で解釈さ
れるべきであり、転写の開始に必要とされるＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターエレ
メントを含むゲノム遺伝子の転写制御配列を、例えば、発生刺激および／または外部刺激
に対する応答において、または組織特異的様式で遺伝子発現を改変するさらなる制御エレ
メント（すなわち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサーおよびサイレンサ
ー）と一緒に含む、またはそれを伴わずに含む。本文脈において、「プロモーター」とい
う用語は、組み換え、合成もしくは融合分子または作動可能に連結された核酸の発現をも
たらす、活性化する、または強化する、かつ好ましくはペプチドまたはタンパク質をコー
ドする誘導体を表すためにもまた使用される。好ましいプロモーターは、１種または複数
の特異的制御エレメントのさらなるコピーを含有し、前記核酸分子の発現をさらに強化す
る、ならびに／または空間的発現および／もしくは時間的発現を改変することができる。

本文脈において、核酸の発現がプロモーターによって調節されるように位置付けられる
場合、核酸は、プロモーターと一緒に、またはプロモーターに「作動可能に連結される」
（すなわち、プロモーターの制御管理下にある）。プロモーターは、一般的に核酸の発現
５’（上流）に位置付けられ、プロモーターが核酸の発現を調節する。異種プロモーター
／核酸の組み合わせを構築するために、プロモーターは、そのプロモーターと遺伝子との
間の距離とおよそ同じ距離で遺伝子転写開始部位から離れて位置付けられ、プロモーター
がその自然の設定、すなわちプロモーターが由来する遺伝子において調節することが、一
般的に好ましい。当分野において公知であるように、この距離のいくつかの変更はプロモ
ーター機能を失うことなく調整され得る。同様に、その調節下で配置される異種核酸に対
する制御配列エレメントの好ましい位置付けは、その自然の設定、すなわちそれが由来す
る遺伝子において要素を位置付けることによって画定される。この場合も先と同様に、当
分野において公知であるように、この距離のいくつかの変更がまた起こり得る。

好ましくは、核酸は発現構築体の形態で提供される。本明細書において使用する場合、
「発現構築体」という用語は、細胞において作動可能に連結される核酸に発現をもたらす
能力を有する核酸を指す。本発明の文脈において、発現構築体は、プラスミド、バクテリ
オファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスのサブゲノムもしくはゲノム断片または
異種ＤＮＡに発現をもたらすことのできる他の核酸であってもよく、それを含んでいても
よいことが理解されよう。発現構築体は、細胞のゲノム中に組み込まれても、エピソーム
として残存してもよい。

好ましい発現構築体は、エピソーム性、例えば、プラスミドおよびファージミドのまま
であり得る。このような発現構築体は、例えば発現構築体がゲノムに組み込まれていない
再プログラム化細胞の作製に有用である。さらに、これらの発現構築体は多くの場合細胞
分裂の間に失われるので、組み換え発現構築体を含まない再プログラム化細胞の作製を可
能にする（例えば、Ｏｋｉｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２２：９４９〜５３ページ、２０
０８年を参照されたい）。

本発明の実施のための適切な発現構築体の構築の方法は、当業者には明らかであると思
われ、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ．ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ
０４７１５０３３８、１９８７年）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ、第３版、２００１年）に記載されている。例えば、発現構築体の個々の要
素は、適切な鋳型核酸から、例えばＰＣＲを使用して増幅され、その後、適切な発現構築
体、例えばプラスミドまたはファージミドなどの内部にクローン化される。

このような発現構築体に適切なベクターは、当分野において公知であり、および／また
は本明細書に記載される。例えば、哺乳動物細胞中の本発明の方法に適切な発現ベクター
は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるｐｃＤＮＡベクタースイート（vect
or suite）のベクター、ｐＣＩベクタースイート（Ｐｒｏｍｅｇａ）のベクター、ｐＣＭ
Ｖベクタースイート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のベクター、ｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
）、ｐＳＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＶＰ１６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）または
ｐｃＤＮＡベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のベクターである。

当業者は、さらなるベクターおよびこのようなベクターの供給源、例えば、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＰｒｏｍｅｇａを承知し
ているであろう。

単離核酸分子またはそれを含む遺伝子構築体を細胞に導入する方法は当業者には公知で
ある。所与の生物に使用される技術は、公知の成功する技術に依存する。組み換えＤＮＡ
を細胞に導入する方法は、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎＤｅｒ
Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６〜４６７ページ、１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯ
ｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、７：２７４５〜２７５２ページ、１９８
７年；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１０：６８９〜６９５ページ、１
９９０年）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、５
：１１８８〜１１９０ページ、１９８５年）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓ
ｐａら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、６：７１６〜７１８ページ、１９８６年；Ｐｏ
ｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７１６１〜７１６
５ページ、１９８４年）、直接微量注入、ＤＮＡ負荷リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕおよび
Ｓｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７２１：１８５〜１９０ページ
、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６
：３３４８〜３３５２ページ、１９７９年）、細胞の超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：８４６３〜８４６７ページ
、１９８７年）、高速微粒子銃を使用する遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏ
ｃ．ＮａｔｌＡｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ、８７：９５６８〜９５７２ページ、１９９０
年）、レセプター媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．、２６２：４４２９〜４４３２ページ、１９８７７年；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、２７：８８７〜８９２ページ、１９８８年）を含む。他の実施形態において、核酸
の細胞への移入は、ナノキャップ（nanocaps）（例えばナノ粒子ＣａＰ０４）、コロイド
金、ナノ粒子合成ポリマーおよび／またはリポソームと一緒に製剤化することによって達
成され得る。

好ましい一実施形態において、エピソーム性のままである発現構築体、または発現構築
体が細胞のゲノムに組み込まれていない限り、例えば上記、またはＯｋｉｔａら、２００
８年、上記に記載の方法を使用してトランスフェクトされる。好ましくは、プラスミドは
、前期細胞が再プログラムされるまで、前期細胞に繰り返しトランスフェクトされる。こ
の様式において、細胞のゲノムに組み込まれた異種ＤＮＡを有さない細胞が作製され、治
療的観点からこのことはより魅力的である。

または、本発明の発現構築体はウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当
分野において公知であり、市販されている。核酸の送達およびその核酸を宿主細胞のゲノ
ムに組み込まれるための従来のウイルスに基づく系は、例えば、レトロウイルスベクター
、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含む。または、アデノウ
イルスベクターはエピソーム性のままである核酸を宿主細胞に導入し、例えば、そのゲノ
ムに組み込まれた異種ＤＮＡを含まない再プログラム化細胞を作製するために有用である
。ウイルスベクターは、標的細胞および組織における有効かつ用途の広い遺伝子移入方法
である。さらに、高効率の形質導入が、多数のさまざまな細胞型および標的組織において
観察されている。例示的ウイルスベクターを以下に述べる。

ａ）アデノウイルスベクター
一例において、本発明に有用なウイルス遺伝子送達系は、アデノウイルス由来のベクタ
ーを利用する。３６ｋＢの線状および二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝
子構成の知見は、８ｋＢまでの外来配列を有する大きなアデノウイルスＤＮＡ片の置換を
可能にする。アデノウイルスＤＮＡは、遺伝毒性の可能性なしにエピソーム性様式で複製
できるので、アデノウイルスＤＮＡの宿主細胞への感染は染色体への組み込みをもたらさ
ない。さらに、アデノウイルスは構造的に安定であり、ゲノムの再構成が、広大な増幅後
に検出されている。アデノウイルスは、その細胞周期の段階にかかわらず、事実上すべて
の上皮細胞に感染できる。組み換えアデノウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方
を形質導入できる。非分裂細胞を有効に形質導入する能力は、アデノウイルスを、遺伝子
を筋肉細胞または脂肪細胞に移入するための優れた候補にさせる。

アデノウイルスは、その中型のゲノム、操作の容易さ、高力価、標的細胞の範囲の広さ
および高い感染性のため、遺伝子移入ベクターとして特に適切である。ウイルスゲノムの
両方の末端は、１００〜２００塩基対（ｂｐ）の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含有し、これ
らはウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。

ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡの複製の開始によっ
て分裂するさまざまな転写ユニットを含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウ
イルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写制御に関与するタンパク質をコードする。Ｅ
２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成
をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡの複製、後期遺伝子発現および宿主細胞の遮
断に関与する（Ｒｅｎａｎ（１９９０年）Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐ．Ｏｎｃｏｌ．１９：
１９７）。ウイルスカプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の生成物は、主要な後
期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる単一の一次転写産物の重要なプロセシングの後
にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８μに位置する）は、感染後期において特に有効であ
り、このプロモーターから生じたすべてのｍＲＮＡは、それを翻訳のための例示的ｍＲＮ
Ａにさせる５’トリパータイトリーダー（ＴＬ）配列を保有する。

アデノウイルスゲノムは、対象となる遺伝子産物をコードするように操作することがで
きるが、正常なウイルスの溶菌ライフサイクルにおいて複製するその能力に関しては不活
性化される（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、（１９８８年）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
６：６１６ページ；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４
３１〜４３４ページおよびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年）Ｃｅｌｌ６８：１４
３〜１５５ページを参照されたい）。アデノウイルスＡｄ株５ｄｌ３２４型またはアデ
ノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウ
イルスベクター−は、当業者には公知である。

組み換えアデノウイルスは、組み換えアデノウイルスが非分裂細胞を感染させることが
でき、気道上皮（上に引用されたＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２年））、内皮細胞（
Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、（１９９２年）ＰＮＡＳＵＳＡ８９：６４８２〜６４８６
ページ）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、（１９９３年）ＰＮＡＳＵＳＡ９
０：２８１２〜２８１６ページ）および筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、（１９９２年）Ｐ
ＮＡＳＵＳＡ８９：２５８１〜２５８４ページ；Ｒａｇｏｔら、（１９９３年）Ｎａ
ｔｕｒｅ３６１：６４７ページ）を含む広範囲の細胞型を感染させるために使用され得
る、特定の状況において有利であり得る。

さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮しやすく、感染性の範囲に
影響を及ぼすように改変され得る。

さらに、他の遺伝子送達ベクターと比較して、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスゲノ
ムの担持能力は大きい（最大８キロベースまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記；Ｈａｊ−Ａ
ｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７ページ）。
現在使用され、したがって本発明によって支持される、大部分の複製欠損アデノウイルス
ベクターは、ウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が削除されているが、ア
デノウイルスの遺伝物質の８０％程度を保有している（例えば、Ｊｏｎｅｓら、（１９７
９年）Ｃｅｌｌ１６：６８３ページ；Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記およびＧｒａｈａｍら、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編（
Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９９１年）７巻、１０９〜１２７ページを参照
されたい）。本発明の挿入ポリヌクレオチドの発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主
要後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連リーダー配列、ウイルスのＥ３プロモーターま
たは外から加えられたプロモーター配列の調節下であり得る。

ある実施形態において、アデノウイルスベクターは複製欠損であっても、または条件付
き欠損であってもよい。アデノウイルスは、４２種の公知の異なる血清型またはサブグル
ープＡ〜Ｆのいずれであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本明細書
に記載の方法および組成物に従った使用のための、条件付き複製欠損アデノウイルスベク
ターを得るための例示的出発物質である。アデノウイルス５型は、大量の生化学的情報お
よび遺伝的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとし
て用いる大部分の構築に歴史的に使用されてきたからである。上記のように、本発明に従
った典型的なベクターは複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さないであろう。
したがって、対象となる核酸を、Ｅ１をコードする配列が除去された場所に導入するため
に最も都合がよいと思われる。しかし、アデノウイルス配列内の領域中のポリヌクレオチ
ドの挿入位置は、本発明にとって重要ではない。例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、（１９８
６年）によって以前に記載されたように、Ｅ３置換ベクター中の欠失Ｅ３領域の代わりに
、またはＥ４を欠失したヘルパー細胞系またはヘルパーウイルス補体のＥ４領域にも挿入
され得る。

例示的ヘルパー細胞系は２９３（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３）である。「パッケ
ージング細胞系」とも称されるこのヘルパー細胞系は、ＦｒａｎｋＧｒａｈａｍ（Ｇｒ
ａｈａｍら、（１９８７年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２ページおよびＧ
ｒａｈａｍ（１９７７年）Ｊ．ＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ６８：９３７〜９４
０）によって開発され、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂをトランスで供給する。しかし、ヘルパー細
胞系は、ヒト細胞、例えばヒト胎児の腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胎児
の間葉細胞もしくは上皮細胞にもまた由来し得る。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノ
ウイルスに対して許容である他の哺乳動物種の細胞にも由来し得る。このような細胞は、
例えば、ベロ細胞または他のサル胎児の間葉細胞もしくは上皮細胞を含む。

アデノウイルスはさらに細胞型特異的である、すなわち、限定された細胞型だけに感染
する、および／または限定された細胞型においてのみ所望のヌクレオチド配列を発現する
ことができる。例えば、ウイルスは、例えば米国特許第５，６９８，４４３号に記載のよ
うに、標的宿主細胞によって特異的に制御される転写開始領域の転写調節下で遺伝子を含
み得る。したがって、複製可能なアデノウイルスからの発現は、複製に必要なタンパク質
の合成を制御する細胞特異的応答エレメント、例えば、Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂを挿入するこ
とによって、特定の細胞に制限され得る。

核酸の組み込み、核酸を含有する組み換えウイルスの増殖および精製ならびに細胞およ
び哺乳動物のトランスフェクトへのその使用のための方法および材料を含む、本発明の実
施に有用であると思われるアデノウイルス技術に関するさらなる詳細なガイダンスに関し
ては、Ｗｉｌｓｏｎら、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９６／１３５９７およびＷＯ９６／
２６２８ならびにそれらの引用された参考文献を参照されたい。

ｂ）レトロウイルス
ある実施形態において、レトロウイルスベクターは、本明細書に記載の方法および組成
物に従って使用され得る。このようなウイルスは、再プログラム化細胞の作製にすでに使
用されているがＳｔｒｏ−１^＋細胞においては使用されていない。レトロウイルスは、逆
転写の過程によって感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転換する能力を特
徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０年）「Ｒｅｔｒｏｖ
ｉｒｉａｅａｎｄｔｈｅｉｒＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」ＩｎＦｉｅｌｄｓ、Ｋｎ
ｉｐｅ編Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ）。次いで、得
られたＤＮＡはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質
を調節合成する。組み込まれると、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺
伝子配列が保有される。レトロウイルスゲノムは、それぞれカプシドタンパク質ポリメラ
ーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする３種の遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎ
ｖを含有する。ｇａｇ遺伝子の上流で発見された配列はｐｓｉと呼ばれ、ビリオンにゲノ
ムをパッケージングするためのシグナルとして機能する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）
配列は、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強いプロモー
ター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みにもまた必要と
される（Ｃｏｆｆｉｎ（１９９０年）、上記）。

レトロウイルスベクターを構築するために、複製欠損であるウイルスを作製するための
特定のウイルス配列に代わって、対象となる核酸がウイルスゲノムに挿入される。ビリオ
ンを作製するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびｐ
ｓｉ成分を含有しないパッケージング細胞系が構築される（Ｍａｎｎら、（１９８３年）
Ｃｅｌｌ３３：１５３ページ）。本発明の核酸を含有する組み換えプラスミドと、レト
ロウイルスのＬＴＲおよびｐｓｉ配列とを一緒に、（例えばリン酸カルシウム沈殿によっ
て）この細胞系に導入する場合、ｐｓｉ配列は組み換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウ
イルス粒子にパッケージング可能にし、その後培養培地に分泌する（Ｎｉｃｏｌａｓおよ
びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ（１９８８年）「ＲｅｔｒｏｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ」、Ｒ
ｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編Ｖｅｃｔｏｒｓ：ＡＳｕｒｖｅｙｏｆ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒＵｓｅ
ｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＢｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈおよびＴｅｍｉｎ（１９８６年）「Ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ：Ｅｆｆｉｃ
ｉｅｎｔＩｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｉｎｔｏａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＥｘｏｇｅｎｏｕｓＤＮＡｉｎＶｅｒｔｅｂｒａｔｅＣｅｌｌＧｅｎｏｍｅ」
、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ編ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｐｌ
ｅｎｕｍＰｒｅｓｓ；Ｍａｎｎら、１９８３年、上記）。その後、組み換えレトロウイ
ルスを含有する培地が回収され、場合により濃縮され、遺伝子移入に使用される。レトロ
ウイルスベクターは、広範囲の細胞型に感染できる。

複製欠損レトロウイルスだけを産生する特殊化した細胞系（「パッケージング細胞」と
呼ばれる）の開発は、遺伝子療法のためのレトロウイルスの有用性を増加させ、欠損レト
ロウイルスは遺伝子療法目的のための遺伝子移入への使用を特徴とする（再考察として、
Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０年）Ｂｌｏｏｄ７６：２７１ページを参照されたい
）。したがって、レトロウイルスコーディング配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の一部が
、ペプチドまたは本発明の類似体、例えばレトロウイルスに複製欠損をもたらす転写活性
化因子をコードする核酸によって置換されている組み換えレトロウイルスが構築され得る
。その後、複製欠損レトロウイルスはビリオンにパッケージングされ、このビリオンは、
標準的技術によってヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染させるために使用で
きる。組み換えレトロウイルスの作製およびこのようなウイルスをｉｎｖｉｔｒｏまた
はｉｎｖｉｖｏで細胞に感染させるためのプロトコルは、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏ
ｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（
編）ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９年）、Ｓ
ｅｃｔｉｏｎｓ９．１０〜９．１４および他の標準的実験室マニュアルにおいて見出すこ
とができる。

適切なレトロウイルスの例は、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含み、これら
は当業者には公知である。例示的レトロウイルスベクターは、ｐＳＲＭＳＶｔｋＮｅｏ
（Ｍｕｌｌｅｒら、（１９９１年）Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１：１７８５ページ
およびｐＳＲＭＳＶ（ＸｂａＩ）（Ｓａｗｙｅｒｓら、（１９９５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１８１：３０７ページ）およびそれらの誘導体である。例えば、これらのベクター
両方中の特有のＢａｍＨＩ部位は、ＣｌａｃｋｓｏｎらによるＷＯ９６／４１８６５に記
載のように、ベクターをＢａｍＨＩを用いて消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて埋め、それぞ
れ、ｐＳＭＴＮ２およびｐＳＭＴＸ２を作製するために再接合することによって除去でき
る。同種指向性および両種指向性両方のレトロウイルス系を調製するための適切なパッケ
ージングウイルス系の例は、ＣｒｉｐおよびＣｒｅを含む。

レンチウイルスを含むレトロウイルスは、さまざまな遺伝子を、神経細胞、上皮細胞、
網膜細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む多数の異なる細胞型
にｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏで導入するために使用されてきた（例
えば、Ｆｅｄｅｒｉｃｏ（１９９９年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１
０：４４８ページ；Ｅｇｌｉｔｉｓら、（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１３９
５〜１３９８ページ；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、（１９８８年）ＰＮＡＳＵ
ＳＡ８５：６４６０〜６４６４ページ；Ｗｉｌｓｏｎら、（１９８８年）ＰＮＡＳＵ
ＳＡ８５：３０１４〜３０１８ページ；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、（１９９０年）ＰＮＡ
ＳＵＳＡ８７：６１４１〜６１４５ページ；Ｈｕｂｅｒら、（１９９１年）ＰＮＡＳ
ＵＳＡ８８：８０３９〜８０４３ページ；Ｆｅｒｒｙら、（１９９１年）ＰＮＡＳ
ＵＳＡ８８：８３７７〜８３８１ページ；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、（１９９１年）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２５４：１８０２〜１８０５ページ；Ｋａｙら、（１９９２年）Ｈｕｍａｎ
ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３：６４１〜６４７ページ；Ｄａｉら、（１９９２年）Ｐ
ＮＡＳＵＳＡ８９：１０８９２〜１０８９５ページ；Ｈｗｕら、（１９９３年）Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜４１１５ページ；米国特許第４，８６８，１１６号
；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ
８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７
５７３による再考察を参照されたい）。

さらに、レトロウイルスの感染範囲およびその結果としてレトロウイルスに基づくベク
ターの感染範囲を、ウイルス粒子の表面上のウイルスパッケージングタンパク質を改変す
ることによって、制限できることが示されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５２
３４、ＷＯ９４／０６９２０およびＷＯ９４／１１５２４を参照されたい）。例えば、レ
トロウイルスベクターの感染範囲の改変のための戦略は、細胞表面抗原に特異的な抗体と
、ウイルスｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｒｏｕｘら、（１９８９年）ＰＮＡＳ
ＵＳＡ８６：９０７９〜９０８３ページ；Ｊｕｌａｎら、（１９９２年）Ｊ．Ｇｅｎ
Ｖｉｒｏｌ７３：３２５１〜３２５５ページ；およびＧｏｕｄら、（１９８３年）Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ１６３：２５１〜２５４ページ）；または細胞表面リガンドと、ウイルス
ｅｎｖタンパク質とのカップリング（Ｎｅｄａら、（１９９１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６６：１４１４３〜１４１４６ページ）を含む。カップリングは、タンパク質また
は他の種類との化学的架橋（例えば、ｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質に転換す
るためのラクトース）の形態で、および融合タンパク質の作製（例えば、一本鎖抗体／ｅ
ｎｖ融合タンパク質）によって可能である。

ｃ）アデノ随伴ベクター
本発明の核酸の送達に有用な例示的ウイルスベクター系はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ
）である。ヒトアデノウイルスは、受容体媒介エンドサイト−シスによって細胞に進入す
る二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは成長および操作しやすく、ｉｎｖ
ｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏで広い宿主範囲を示すので、これらのウイルスは、遺伝子
移入に非常に適していると考えられている。アデノウイルスは、感染休止および標的細胞
の複製ができ、宿主ゲノム中に組み込まれるのではなく染色体外で生存できる。ＡＡＶは
、ディペンドウイルス属に属するヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは
、病理が公知ではなく、有効な複製および生産的なライフサイクルのために、別のウイル
ス、例えば、アデノウイルス、ワクチニアまたはヘルペスウイルスによって提供されるさ
らなるヘルパー機能がなくては複製できない。

ヘルパーウイルスの不在下では、ＡＡＶはそのゲノムの宿主細胞染色体への挿入によっ
て潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染は、その後、感染性のウイ
ルスの子孫を産生するために複製できる、組み込まれたコピーを救出する。野生型ＡＡＶ
ウイルスとアデノウイルスまたはヘルペスウイルスのいずれかに由来するヘルパー機能と
の組み合わせは、複製可能な組み換えＡＶＶ（ｒＡＶＶ）を発生する。この系の１つの有
利性は、その相対的な安全性である（再考察のために、Ｘｉａｏら、（１９９７年）Ｅｘ
ｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１１３〜１２４ページを参照されたい。

ＡＡＶのゲノムは、およそ４６８１塩基を含有する線状の一本鎖ＤＮＡ分子で構成され
る（ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ、（１９８７年）ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＶｉ
ｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）３２：２４３〜
３０７ページ）。このゲノムは、各末端に、ＤＮＡ複製の起点として、またウイルスのパ
ッケージングシグナルとしてｃｉｓに機能する逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。ゲノムの
内部非反復部分は、それぞれＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ領域として知られる、２つの大き
なオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、複製およびビリオンのパッケ
ージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。ＡＡＶゲノムの詳細な説明のため
に、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２年）ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉ
ｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９ページを参
照されたい。

３００塩基対ほどの小さなＡＡＶを含有するベクターは、パッケージングされ得、組み
込まれ得る。外来ＤＮＡの空間は約４．７ｋｂに制限され、これは、本発明のペプチドま
たは類似体をコードする核酸の組み込みに十分である。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８
５年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０ページに記載のようなＡＡ
Ｖベクターは、ＤＮＡを細胞に導入するために使用できる。さまざまな核酸が、ＡＡＶベ
クターを使用して異なる細胞型に導入されてきた（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、（１９
８４年）ＰＮＡＳＵＳＡ８１：６４６６〜６４７０ページ；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、
（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１ページ；Ｗｏｎｄ
ｉｓｆｏｒｄら、（１９８８年）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９ページ
；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、（１９８４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９ページ
；およびＦｌｏｔｔｅら、（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜
３７９０ページを参照されたい）。

ｒＡＡＶ構築体の構築および送達のための一般的方法は、当分野において公知であり、
例えば、Ｂａｒｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．ら、（１９９６年）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒ
ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒｉｎＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＴｏｗａｒｄｓＧ
ｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌＤｉｓｏｒｄｅｒｓ、１１
５〜１２７ページに記載されている。

通常使用されるＡＡＶに基づく発現ベクターは、利用可能な制限部位を直接使用するか
、または制限酵素を用いる所望のヌクレオチド配列の除去、その後の末端の平滑化、適切
なＤＮＡリンカーのライゲーション、制限消化およびＩＴＲとの間の部位へのライゲーシ
ョンによるかのどちらかで所望のヌクレオチド配列のサブクローニングに使用され得る、
制限部位に隣接する１４５ヌクレオチドのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む。

ヌクレオチド配列の組み込み、ヌクレオチド配列を含有する組み換えＡＡＶベクターの
増殖および精製ならびに細胞および哺乳動物のトランスフェクトへのその使用のための方
法および材料を含む、本発明の実施に有用であると思われるＡＡＶ技術に関するさらなる
詳細なガイダンスに関しては、例えば、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第４，７９７，３６８
号（１９８９年１月１０日）；Ｍｕｚｙｃｚｋａら、米国特許第５，１３９，９４１号（
１９９２年８月１８日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，１７３，４１４号（１
９９２年１２月２２日）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，米国特許第５，２５２，４７９号（１
９９３年１０月１２日）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、米国特許第５，３５４，６７８号（１
９９４年、１０月１１日）；Ｓｈｅｎｋら、米国特許第５，４３６，１４６号（１９９５
年７月２５日）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、米国特許第５，４５４，９３５号（１９９５
年１２月１２日）、Ｃａｒｔｅｒら、ＷＯ９３／２４６４１（１９９３年１２月９日公開
）およびＮａｔｓｏｕｌｉｓ、米国特許第５，６２２，８５６号（１９９７年４月２２日
）を参照されたい。

ｄ）他のウイルス系
核酸の送達に使用され得る他のウイルスベクター系は、例えばヘルペスウイルス、例え
ば単純ヘルペスウイルス（Ｗｏｏら、ＩＪＳｔ特許第５，６３１，２３６号、１９９７
年５月２０日発行およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）ワクチニアウイ
ルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８年）Ｒｉｄｇｅｗａｙ、「Ｍａｍｍａｌｉａｎｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ」、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＲＬ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ
ＤＴ編Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｓｕｒｖｅｙｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔ
ｅｒｗｏｒｔｈ，；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ（１９８６年）「Ｖｅｃｔｏｒ
ｓｆｏｒｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍａｎｉｍａｌ
ＤＮＡｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｇｅｎｅｓ」、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉＲ
編Ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ；Ｃｏ
ｕｐａｒら、（１９８８年）Ｇｅｎｅ、６８：１〜１０ページ）およびいくつかのＲＮＡ
ウイルスに由来し得る。例示的ウイルスは、例えば、アルファウイルス、ポックスウイル
ス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルスなどを含む。それらは、さまざまな哺乳動物細
胞にとって魅力的な特徴をいくつかの提示する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５〜１２８１ページ；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年、上記
；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年、上記、；Ｃｏｕｐａｒら、１９８
８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら、（１９９０年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４：６４２〜６５０ペー
ジ）。

ｅ）非組み込みウイルス、自己切断型／切り出し可能構築体およびプラスミドの標的体細
胞への直接トランスフェクション
「自己切断型２Ａペプチド」を組み込んだ、ポリシストロン性発現カセットからのすべ
ての遺伝的能力決定因子の同時発現は、「リボソームスキッピング」を起こし、単一プロ
モーターから個々の因子が同程度に発現できる（Ｓｏｍｍｅｒら、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ
．２７：５４３〜５４９ページ、２００８年；Ｃａｒｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０６：１５７〜１６２ページ、２００９年）。因子のペアを分
離する配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）を用いて、感染細胞はすべての能力決定因
子またはそのサブセットを発現できる。Ｃａｒｅｙら、（２００９年、上記）は、ＩＲＥ
Ｓ技術を用いずに、自己切断型２Ａペプチドによって分離されたドキシサイクリン誘導因
子を構築した。

別の実施形態において、１種または複数の能力決定因子は、ＤＮＡトランスポゾンを使
用して送達される。ＤＮＡトランスポゾンは、特異的「トランスポザーゼ」酵素によって
切り出され、ゲノムの至る所に再組み込みされる、転移と呼ばれる現象の遺伝要素である
。ｐｉｇｇｙＢａｃは、ＴＴＡＡ配列を抱える転写ＤＮＡユニット中に優先的に挿入され
る、同義遺伝子ペイロードを抱えることができる、このようなトランスポゾンの１つであ
る。個別またはポリシストロン性のドキシサイクリン誘導構築体の誘導は、トランスポザ
ーゼを介した組み込みおよびその後の切り出しによって、ネズミおよびヒト線維芽細胞に
送達され、四倍体胚補完法による妊娠中期胚への貢献を含む、多能性のすべての特質を示
すｉＰＳ細胞を発生する（Ｗｏｌｔｊｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．４５８：７６６〜７７０ペ
ージ、２００９年）。

さらに、ｌｏｘＰが導入されたプロウイルス構築体は、その後のアデノウイルスを発現
する一時的Ｃｒｅリコンビナーゼの感染を介して切り出され得る（Ｋａｊｉら、Ｎａｔｕ
ｒｅ．４５８：７７１〜７７５ページ、２００９年）。

ＤＮＡに基づかないｉＰＳ作出方法
ａ）化学的取組み
一例において、能力決定因子は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＧ９ａの阻害剤で
あり、Ｏｃｔ４の代わりに、またはＯｃｔ４に対する補完（例えば、Ｏｃｔ４の発現レベ
ルを減少させる）として使用される。Ｇ９ａの化学的阻害は、例えばＥｎｚｏＬｉｆｅ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ社によるＢＩＸ−０１２９４（ＢＩＸ）を用いて達成でき、ヒストン３
、リジン９のメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ）により媒介されるＯｃｔ４発現に対する拮抗作用
を軽減しており、いくつかの細胞において、ｉＰＳ細胞の誘導のためにウイルスにより送
達されたＯｃｔ４が完全に置換され得るＳｈｉら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２：
５２５〜５２８ページ、２００８年）。

または、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用し、Ｇ９ａの発現をノックダウンす
る。このようなｓｈＲＮＡは、Ｏｃｔ４プロモーターの脱メチル化およびＯｃｔ４発現の
部分的再活性化をもたらすことが示されている（Ｍａら、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．２６：
２１３１〜２１４１ページ、２００８年）。

別の例において、Ｌ−チャネルカルシウムアゴニスト（例えば、ＴｏｃｒｉｓＢｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅによるＢａｙｋ８６４４）は、Ｇ９ａアンタゴニスト（例えば、ＢＩＸ）
と組み合わせて使用され、Ｓｏｘ２およびｃＭｙｃの代わりをする、または補完する（Ｓ
ｈｉら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．３：５６８〜５７４ページ、２００８年）。

別の例において、能力決定因子はＭＥＫ阻害剤である。Ｏｃｔ４／Ｋｌｆ４感染後７か
ら９日および数日の間（例えば５日間）連続する、体細胞周期の進行に関与するＭＥＫの
化学的阻害（例えば、ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌによるＰＤ０３２５９０１を使用
する）は、Ｏｃｔ４の発現が高い再プログラム化ｉＰＳコロニーの成長の強化をもたらす
（Ｓｈｉら、２００８年、上記）。

さらなる例において、能力決定因子はＷｎｔ３ａである。細胞外Ｗｎｔ３ａは標的細胞
における内因性ｃＭｙｃの発現のβ−カテニン媒介誘導を刺激でき、再プログラミング効
率の劇的な改善をもたらす（Ｍａｒｓｏｎら、２００８年）。

別の例において、能力決定因子はオカダ酸である。オカダ酸（ＯＡ）は、タンパク質セ
リン／トレオニンホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）の強力な阻害剤である。ＰＰ２Ａはｃ
Ｍｙｃ中の特定のセリン残基を脱リン酸化し、ユビキチンにより制御された迅速な分解の
ためにそれを標的とし、さらにＫｌｆ４の増加を誘発し、順に、ｃＭｙｃ遺伝子発現の上
方制御を誘発するｃＭｙｃプロモーター中のＯＡ応答性エレメントと結合する。ＥＩＦα
の抑制を介した、翻訳に関するＯＡのさらなる阻害効果は、ｍＲＮＡ転写産物の初期蓄積
およびその後のＯＡ離脱に関するボーラス量の翻訳タンパク質の送達をもたらし得る。

別の例において、能力決定因子はケンパウロンである。Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／ｃＭｙｃ
レトロウイルス発現ＭＥＦがＯｃｔ４選択可能なｉＰＳ細胞を発生するための、Ｋｌｆ４
と広範囲のタンパク質キナーゼ阻害剤であるケンパウロンとの置換は、生殖細胞系コンピ
テントキメラに寄与できる（Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ１０６：８９１２〜８９１７ページ、２００９年）。

さらなる例において、能力決定因子はヒストン（histine）脱アセチル化酵素阻害剤で
ある。ｉＰＳ細胞に対する、ネズミ線維芽細胞のｉＰＳ再プログラミング効率が１００倍
改善されることが、ヒストン脱アセチル化酵素活性の化学的阻害を介して観察されている
（Ｈｕａｎｇｆｕら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ．２６：７９５〜７９７ページ、２００８
年；Ｈｕａｎｇｆｕら、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ．２６：１２６９〜１２７５ページ、２
００８年）。例えば、バルプロ酸は、遺伝的再プログラミングの再プログラミング効率を
改善する。

さらなる例において、能力決定因子はＤＮＡメチラーゼ阻害剤である。

ｂ）タンパク質の送達
低分子化合物の使用と同様に、タンパク質の送達は、その可逆性のため、ｉＰＳ細胞作
製のための魅力的な取組みである。

一例において、タンパク質の能力決定因子は、細胞内（好ましくは核内）進入が容易に
なるように、タンパク質の形質導入ドメインに接合される。タンパク質の形質導入ドメイ
ンは当分野において公知であり、例えばポリアルギニン、ＨＩＶＴａｔ基本的ドメイン
、アンテナペディア（antannapedia）を含む（例えば、Ｊｏｎｅｓら、ＢｒＪＰｈａ
ｒｍａｃｏｌ．、１４５：１０９３〜１０２ページ、２００５年に記載されている）。例
えば、能力決定因子に連結されたポリアルギニン標的化配列を組み込む大腸菌（E .coli
）により発現された組み換えタンパク質は、ＭＥＦをｉＰＳ細胞に転換できる。

タンパク質を作製する方法は当分野において公知であり、および／またはＳａｍｂｒｏ
ｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ
ｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１
９８９年）またはＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＧｒｅｅｎｅＰｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
ａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年、現在までのすべての改
定を含む）に記載されている。

ｃ）遺伝子サイレンシング戦略
一例において、能力決定因子は、内因性遺伝子の発現をサイレンシングまたは減少させ
る核酸に基づく化合物である。

一例において、能力決定因子はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ｍｉＲＮＡは、
主に配列特異的様式で標的転写産物との結合を介して多数の生物学的過程を制御する、一
本鎖、非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、まず一次転写産物として発現され、
次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と複合する活性ｍｉＲＮＡを放出す
るめに切断され、翻訳の抑制を開始する。０日目のｍｉＲ−２９４のトランスフェクショ
ンおよび６日目のレトロウイルス感染後、ｃＭｙｃを７５％の効率まで置換できる（Ｊｕ
ｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２７：４５９〜４６１ページ、２００９年）。

Ｄｎｍｔ１のｓｉＲＮＡノックダウンは、細胞が部分的再プログラム化から完全な再プ
ログラム化へ超える援助ができ、再プログラミング効率は４倍に増加する（Ｍｉｋｋｅｌ
ｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ．４５４：４９〜５５ページ、２００８年）。同様に、Ｇ９ａの
短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）によるノックダウン、着床後の胚におけるＯｃｔ４の
脱活性化に関与するヒストンメチルトランスフェラーゼは、ｖｉｖｏでのＯｃｔ４プロモ
ーターの脱メチル化および部分的再活性化をもたらす（上記を参照されたい）。Ｏｃｔ４
／Ｓｏｘ２／Ｋｌｆ４感染と呼応したｐ５３ｓｉＲＮＡの成人包皮線維芽細胞への添加
は、単独またはさらなる処置と組み合わせて、効率を増加する（Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ
ＳｔｅｍＣｅｌｌ．３：４７５〜４７９ページ、２００８年）。

当業者は、適切なＲＮＡに基づく化合物を承知しているであろう。例示的化合物は、ア
ンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘア
ピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡを含む。

アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、任意の実施形態において本明細書に
記載のポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であり、
ｍＲＮＡ翻訳などの転写後事象に干渉できるＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの組み合
わせを意味すると解釈されるべきである。アンチセンス法の使用は当分野において公知で
ある（例えば、ＨａｒｔｍａｎｎおよびＥｎｄｒｅｓ、ＭａｎｕａｌｏｆＡｎｔｉｓ
ｅｎｓｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９年）を参照されたい）。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生理学的条件下で標的ポリヌクレオチドと
ハイブリダイズするであろう。アンチセンスポリヌクレオチドは構造遺伝子に一致する配
列または遺伝子発現またはスプライシングの調節をもたらす配列を含む。例えば、アンチ
センスポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子の標的コーディング領域または５’非翻訳領
域（ＵＴＲ）もしくは３’−ＵＴＲまたはこれらの組み合わせに一致し得る。アンチセン
スポリヌクレオチドは、イントロン配列と一部相補的であり得、これは転写の間または転
写後、好ましくは標的遺伝子のエクソン配列だけにスプライシングされ得る。アンチセン
ス配列の長さは、標的核酸またはそれをコードする構造遺伝子の、少なくとも１９の連続
するヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドおよびより好ましくは少なく
とも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドでなくてはならない。全遺伝子
転写産物に相補的な完全長配列を使用できる。この長さは、最も好ましくは１００〜２０
００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少
なくとも９０％およびより好ましくは９５〜１００％でなくてはならない。

触媒ポリヌクレオチド
「触媒ポリヌクレオチド／核酸」という用語は、異なる基質を特異的に認識し、この基
質の化学的改変を触媒するＤＮＡ分子もしくはＤＮＡ含有分子（「デオキシリボザイム」
または「ＤＮＡザイム」としても当分野において公知である）またはＲＮＡもしくはＲＮ
Ａ含有分子（「リボザイム」または「ＲＮＡザイム」としても公知である）を指す。触媒
核酸中の核酸塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（ＲＮＡに関してはＵ）の塩基であり得る。

通常、触媒核酸は、標的核酸および酵素活性を切断する核酸の特異的認識のためにアン
チセンス配列（本明細書において「触媒ドメイン」とも称される）を含有する。本発明に
特に有用であるリボザイムの型は、ハンマーヘッドリボザイムおよびヘアピンリボザイム
である。

ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のタンパク質の作製を特異的に阻害するために有用で
ある。理論に縛られることを好むわけではないが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９８年
）は、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）がタンパク質作製を減少させるために使用され得る機
序のためのモデルを提供している。この技術は、対象となる遺伝子のｍＲＮＡと本質的に
同一である配列またはその一部を含有するｄｓＲＮＡ分子の存在に頼る。好都合なことに
、ｄｓＲＮＡは組み換えベクターまたは宿主細胞において単一プロモーターから作製され
得、センス配列およびアンチセンス配列は、センス配列とアンチセンス配列とをハイブリ
ダイズできる関連のない配列に隣接し、ループ構造を形成する関連のない配列とともにｄ
ｓＲＮＡ分子を形成する。本発明にとって適切なｄｓＲＮＡ分子の設計および作製は、当
業者の能力の十分範囲内であり、特にＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、Ｗ
Ｏ９９／４９０２９およびＷＯ０１／３４８１５を考慮されたい。

ハイブリダイズするセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、個々に、少なくとも
１９の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０または５０ヌクレオチドおよび
より好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドでなくて
はならない。全遺伝子転写産物に一致する完全長配列を使用できる。この長さは、最も好
ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するセンス配列および
アンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％お
よびより好ましくは９５〜１００％でなくてはならない。

好ましい低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２３の
連続するヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配
列ジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０〜７０％（好ましくは３０〜６０％、より好まし
くは４０〜６０％およびより好ましくは約４５％〜５５％）のＧＣ含有量を含み、例えば
標準的ＢＬＡＳＴ検索によって決定して、導入される哺乳動物ゲノム中の標的以外の任意
のヌクレオチド配列に対して高い割合の同一性を有さない。

培養条件
多能性細胞および／または再プログラム化細胞および／または再プログラミングを受け
た細胞は、多能性細胞の成長を支えるのに使用される任意の培地において培養され得る。
典型的な培養培地は、限定するものではないが、ＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）、ｍＴ
ｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＳｔ
ｅｍＬｉｎｅ（登録商標）無血清培地（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの合
成培地、ならびにマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地などの馴化培地を含む。さら
なる培地は、塩基性培地、例えば、ＫｏＳＲ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）を補充したＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ−Ｆ１２を含む。または、Ｓｉｌｖａら、Ｐ
ＬＯＳＢｉｏｌｏｇｙ、６：ｅ２５３、２００８年は、例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達
およびグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３のシグナル伝達の阻害剤ならびに白血病阻止因
子（ＬＩＦ）を含む、再プログラム化細胞の作製および未分化状態の再プログラム化細胞
の維持に有用な培地を記載している。本明細書において使用する場合、「規定培地」は、
単に生物化学的構成成分だけからなる生物化学的に規定された製剤を指す。規定培地はま
た、既知の化学組成を有する構成成分だけを含み得る。規定培地は、既知の供給源に由来
する構成成分をさらに含み得る。本明細書において使用する場合、「馴化培地」は、この
培地において培養された細胞由来の可溶性因子をさらに補充した成長培地を指す。または
、細胞は培養培地においてＭＥＦ上で維持されてもよい。

細胞培養は、好ましくは加湿インキュベータにおいて約３７℃でインキュベートされる
。細胞培養条件は、本発明の細胞のために大幅に変動し得るが、いくつかの実施形態にお
いて、細胞は、細胞成長に適切な、例えば空気中に５％Ｏ_２、１０％ＣＯ_２、８５％Ｎ_２
を含む、または１０％ＣＯ_２を含む環境において維持される。

別の実施形態において、細胞は、マトリックス、例えば細胞外マトリックス、例えばＭ
ａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ラミニン、コラーゲン、Ｃｕｌｔｕｒｅｘ（登録商標）などの
上または内部で培養される。他の実施形態において、細胞は、細胞外マトリックスの存在
下で培養され得る。このようなマトリックスの存在下で細胞を増殖させる適切な手順は、
例えば米国特許第７，２９７，５３９号に記載されている。

細胞の単離または濃縮
下記の方法は、例えば、本明細書に記載のマーカーまたは当分野において公知のマーカ
ーを検出することによる、Ｓｔｒｏ−１^＋細胞および／または再プログラム化細胞／多能
性細胞の単離または濃縮にとって有用である。

所望の細胞を濃縮する例示的一手法は、磁気ビーズ細胞分取法（ＭＡＣＳ）または他の
任意の磁気を利用する細胞分取法、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）である。従来
のＭＡＣＳ手順は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１１：２３１〜２３８ペー
ジ、１９９０年）に記載されている。この手順において、細胞は抗体または細胞表面マー
カーもしくはタンパク質と結合する他の化合物に結合された磁気ビーズで標識され、細胞
は、常磁性分離カラムを通される、または磁場の別の形態に曝露される。分離カラムは強
力な磁石内に配置され、その結果、カラム内に磁場が発生する。磁気的に標識された細胞
は、カラム内に捕捉され、通過しない。捕捉された細胞は、その後カラムから溶出される
。

本発明の細胞は、上記のように、例えば適切な肉体的保有宿主から、適切なタンパク質
を発現する細胞を分離するためのＭＡＣＳを使用して濃縮され得る。試料はタンパク質と
結合する免疫磁性ビーズと一緒にインキュベートされる。インキュベーション後、試料は
洗浄され、再懸濁され、磁場を通過させられ、免疫磁性ビーズに結合された細胞が取り除
かれ、ビーズに結合された細胞が回収される。これらの技術は陰性選択、例えば、望まし
くないマーカー、すなわち望ましくない細胞を発現する細胞の除去に同様に適用できる。
このような方法は、細胞集団を、望ましくない細胞型（複数可）において検出可能なレベ
ルで発現された細胞表面マーカーと結合する化合物で標識された磁性粒子と接触させるス
テップを含む。インキュベーション後、試料は洗浄され、再懸濁され、磁場を通過させら
れ、免疫磁性ビーズに結合された細胞が取り除かれる。ビーズに結合された細胞が回収さ
れる。望ましくない細胞型（複数可）を失った残存細胞が、その後回収される。

別の実施形態において、タンパク質または細胞表面マーカーと結合する化合物は、固体
表面に固定され、細胞集団をそれと接触させる。未結合細胞を除去するための洗浄後、こ
の化合物と結合した細胞は回収、例えば溶出され得、その結果化合物が結合するタンパク
質を発現する細胞が単離または濃縮される。または所望であれば、化合物と結合しない細
胞を回収できる。

好ましい実施形態において、細胞は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して単離ま
たは濃縮される。ＦＡＣＳは、粒子の蛍光特性に基づく、細胞を含む粒子を分離するため
の公知の方法であり、例えばＫａｍａｒｃｈ，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ，１５１
：１５０〜１６５ページ、１９８７年に記載されている。一般的に、この方法は、細胞集
団を、１種または複数のタンパク質または細胞表面マーカーと結合できる化合物と接触さ
せるステップを含み、異なるマーカーと結合する化合物は、さまざまな蛍光部分、例えば
、蛍光色素分子を用いて標識される。細胞は、液体の狭く、速い流れの中心に同調される
。この流れは、それらの直径に関連して細胞間を分離するように構成される。振動機序は
、細胞の流れを引き起こし、個別の液滴に分ける。この系は、液滴中に複数の細胞が存在
する可能性が低いように調節される。流れが液滴に分かれる直前に、流れは、個々の細胞
の対象となる蛍光特徴、例えば、標識化合物が結合されているかどうかが測定される蛍光
測定ステーションを通過する。帯電リングは、流れが液滴に分かれるポイントに配置され
る。蛍光強度測定の直前に基づく電荷はリング上に配置され、液滴は流れから分離するの
で、対立する電荷は液滴上に捕捉されている。帯電した液滴は、その後液滴を迂回させる
静電偏向方式を介して、それらの電荷に基づいて容器に落とされる、例えば、標識化合物
が細胞に結合されている場合１つの容器に、そうでない場合は別の容器に落とされる。い
くつかの系において、電荷は、流れに直接印加され、分かれる液滴は流れと同じ符号の電
荷を保有する。この流れは、その後、液滴の分離後中性に戻る。

細胞の分化
本発明の再プログラム化細胞または多能性細胞は、さまざまな商業的および治療的に重
要な組織型の集団を調製するために使用できる。一般に、このことは、細胞を所望の数に
増殖させることによって達成される。その後、任意のさまざまな分化戦略に従って分化が
引き起こされる。例えば、神経系列の細胞の高度に濃縮された集団は、細胞を、１種もし
くは複数のニュートロフィン（ニュートロフィン３または脳由来の神経栄養因子など）、
１種もしくは複数のマイトジェン（上皮成長因子、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ１および
エリスロポエチンなど）または１種もしくは複数のビタミン（レチノイン酸、アスコルビ
ン酸など）を含有する培養培地に変えることによって作製できる。または、多分化能神経
幹細胞は、胚様体段階を介して作製でき、ｂＦＧＦを含有する化学的規定培地において維
持できる。培養された細胞は、場合により、それらが神経前駆体細胞マーカー、例えば、
ネスチン、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチン、Ａ２Ｂ５、ｎｕｒｒ１またはＮＣＡＭを発現す
るかどうかに基づいて分離される。このような方法を使用して、（成熟ニューロンを含む
）神経細胞および（星状細胞および乏突起膠細胞を含む）グリア細胞の両方を作製する能
力を有する神経前駆細胞／幹細胞を得ることができる。または、分化細胞集団を形成する
能力を有する複製ニューロン前駆体を得ることができる。

肝細胞系列のマーカーが高度に濃縮された細胞は、ｎ−ブチレートなどのヒストンデア
セチラーゼ阻害剤の存在下で幹細胞を培養することによって再プログラム化細胞または多
能性細胞から分化され得る。培養された細胞は、場合により、ＥＧＦ、インスリンまたは
ＦＧＦなどの肝細胞成熟因子と一緒に同時にまたは連続して培養される。

再プログラム化細胞または多能性細胞はまた、心筋細胞の特徴的マーカーおよび自然発
生的周期的収縮活性を有する細胞を作製するために使用され得る。この方法における分化
は、（５−アザ−デオキシ−シチジンなどの）ＤＮＡのメチル化をもたらすヌクレオチド
類似体、成長因子および骨形態形成タンパク質によって容易になる。細胞は、密度に基づ
く細胞分離によってさらに濃縮され得、クレアチン、カルニチンおよびタウリンを含有す
る培地において維持され得る。

再プログラム化細胞または多能性細胞は、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヒトＴＧ
Ｆ−ベータ受容体に対するリガンド、またはヒトビタミンＤ受容体に対するリガンドを含
有する培地において、間葉細胞または軟骨形成細胞への分化を対象とし得る。培地は、デ
キサメタゾン、アスコルビン酸−２−リン酸ならびにカルシウムおよびリン酸塩の供給源
をさらに含み得る。好ましい実施形態において、誘導細胞は、骨芽細胞系列の細胞の表現
型特徴を有する。

以上から理解されるように、再プログラム化細胞または多能性細胞に由来する分化細胞
は、それを必要とするヒト患者において組織再構成または再生のために使用することもで
きる。この細胞は、それを意図される組織部位に接合し、機能的に欠損した領域を再構成
または再生できる様式で投与される。例えば、神経前駆体細胞は、治療される疾患に従っ
て、中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に直接移植できる。神経細胞移植の有効性は
、ＭｃＤｏｎａｌｄら、（（１９９９年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５巻：１４１０ページ）お
よびＫｉｍら、（（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻：５０ページ）に記載されるよ
うに、激しく損傷した脊髄に関してラットモデルにおいて評価され得る。移植の成功によ
り、２〜５週間後に病変に存在する、星状細胞、乏突起膠細胞および／またはニューロン
に分化し病変の終わりから脊髄に沿って遊走する、移植由来細胞および歩き方、協調およ
び体重支持における改善が示される。

同様に、本出願の代理人は、骨折または軟骨損傷の治療のために間葉幹細胞を投与する
有用性を実証している。

同様に、心筋細胞の有効性は、心外傷または機能不全の適切な動物モデル、例えば、治
療をしなければ左心室壁組織の約５５％が瘢痕組織になる心臓の低温傷害（ｃｒｙｏｉｎ
ｊｕｒｙ）に関する動物モデルにおいて評価され得る（Ｌｉら、（１９９６年）、Ａｎｎ
．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、６２巻：６５４ページ；Ｓａｋａｉら、（１９９９年）、
Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、８巻：２０７４ページ；Ｓａｋａｉら、（１９９９
年）、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１１８巻：７１５ページ
）。治療の成功により、瘢痕範囲が減少し、瘢痕の拡大が制限され、収縮、拡張および発
生圧力によって決定される心機能が改善されると思われる（Ｋｅｈａｔら、（２００４年
））。心外傷は、例えば、左下行前動脈の遠位部において塞栓コイルを使用しても（Ｗａ
ｔａｎａｂｅら、（１９９８年）、ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ．、７巻：２３９ペ
ージ）、または左冠動脈前下行枝の結紮（Ｍｉｎら、（２００２年）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．、９２巻：２８８ページ）によってもまたモデル化できる。治療の有効性
は、組織構造および心機能により評価し得る。本発明に具体化される心筋細胞調製品は、
心筋の再生のための療法および心機能不足の治療に使用され得る。

肝機能もまた、例えば本発明に従って成長させた霊長類多能性幹細胞から分化した、肝
細胞および肝細胞前駆体を投与することによって回復できる。これらの分化細胞は、肝損
傷の修復能力に関して動物モデルにおいて評価され得る。このような一例は、Ｄ−ガラク
トサミンの腹腔内注射によって引き起こされる損傷である（Ｄａｂｅｖａら、（１９９３
年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１４３巻：１６０６ページ）。治療の有効性は、肝細
胞マーカーに関する免疫組織化学的染色、細管構造が成長組織において形成されるかどう
かの顕微鏡的決定および肝臓特異的タンパク質の合成を回復するための治療能力によって
決定され得る。肝細胞は、直接投与によって、または例えば劇症肝不全の後に対象の肝組
織がそれ自体を再生する間に一時的に肝機能を提供する生物補助（bioassist）デバイス
の一部として、療法に使用され得る。

細胞組成物
本発明の一例において、再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから
分化した細胞は、組成物の形態で投与され、またはこのような組成物に製剤化される。好
ましくは、このような組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む。

「担体」および「賦形剤」という用語は、保管、投与および／または活性化合物の生物
活性を容易にするために当分野において従来から使用される組成物を指す（例えば、Ｒｅ
ｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｍａ
ｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ（１９８０年を参照されたい）。担体は、活
性化合物の任意の望ましくない副作用を減少することもできる。適切な担体は安定である
、例えば担体中の他の原料と反応できない。一例において、担体は、治療に用いた投与量
および濃度で、レシピエントにおいて有意な局所的または全身性の有害な影響を起こさな
い。

本発明にとって適切な担体は、従来から使用されている担体を含み、例えば、水、生理
食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンガー液、緩衝化溶液、ヒアルロン酸およ
びグリコールが、（等張の場合）特に溶液のために好ましい液体担体である。適切な医薬
担体および賦形剤は、デンプン、セルロース、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽
、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム
、グリセロールモノステアレート（glycerol monostearate）、塩化ナトリウム、グリセ
ロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。

別の例において、担体は、例えば、細胞が成長する、または懸濁される培地組成物であ
る。好ましくは、このような培地組成物は投与された対象において任意の有害な影響を誘
導しない。

好ましい担体および賦形剤は、細胞の生存能力および／または生物学的効果および好ま
しくは有利な影響を発揮する細胞の能力に有害に影響を及ぼさない。

一例において、担体または賦形剤は緩衝活性を提供し、細胞および／または可溶性因子
を適切なｐＨで維持し、その結果生物活性を発揮する、例えば、担体または賦形剤はリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは細胞および因子との相互作用が最小であり
、細胞および因子の迅速な放出を可能にし、このような場合本発明の組成物は、血流また
は組織または組織周囲の領域もしくは組織に隣接する領域に、例えば、注射により直接適
用するための液体として作製できるので、ＰＢＳは魅力的な担体および賦形剤を代表する
。

再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞は、レシピ
エント適合性であり、レシピエントに対して害がない生成物に分解する足場内に組み込む
、または埋め込むこともできる。これらの足場は、レシピエント対象に移植された細胞に
支持および保護を提供する。天然および／または合成の生分解性足場はこのような足場の
例である。

さまざまな異なる足場が本発明の実施に成功して使用され得る。好ましい足場は、限定
するものではないが、生物学的に分解可能な足場である。天然の生分解性足場は、コラー
ゲン、フィブロネクチンおよびラミニンの足場を含む。細胞移植の足場に適切な合成材料
は、大規模な細胞成長および細胞機能を支持できなければならない。このような足場は、
さらに再吸収され得る。適切な足場は、例えば、Ｖａｃａｎｔｉら、Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒ
ｇ．２３：３〜９ページ１９８８年；Ｃｉｍａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎ
ｇ．３８：１４５ページ１９９１年；Ｖａｃａｎｔｉら、Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ
．Ｓｕｒｇ．８８：７５３〜９ページ１９９１年により記載されたポリグリコール酸足
場またはポリ酸無水物、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの合成ポリマーを含む。

別の例において、細胞は、（ＵｐｊｏｈｎＣｏｍｐａｎｙによるＧｅｌｆｏａｍなど
の）ゲル足場において投与され得る。

本発明に有用な細胞組成物は、単独または他の細胞との混合物として投与され得る。本
発明の組成物と併せて投与され得る細胞は、限定するものではないが、他の多分化能細胞
もしくは多能性細胞または幹細胞または骨髄細胞を含む。異なる型の細胞は、投与直前ま
たは少し前に本発明の組成物と混合され得る、または投与前の期間一緒に共培養され得る
。

好ましくは、組成物は、有効量または治療もしくは予防有効量の細胞を含む。例えば、
組成物は、約１×１０^５の再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれから
分化した細胞／ｋｇから約１×１０^７の再プログラム化細胞または多能性細胞および／ま
たはそれから分化した細胞／ｋｇ、あるいは、約１×１０^６再プログラム化細胞または多
能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇから約５×１０^６の再プログラム化
細胞または多能性細胞および／またはそれから分化した細胞／ｋｇを含む。投与される細
胞の正確な量は、患者の年齢、体重および性別を含むさまざまな因子および治療される障
害の程度および重症度に依存する。

いくつかの実施形態において、細胞は、細胞が対象の循環に出ることができないが、細
胞によって分泌される因子は循環に進入できるチャンバー内に含有される。この様式にお
いて、細胞が、対象の循環内に因子を分泌可能にすることによって可溶性因子は対象に投
与され得る。このようなチャンバーは、可溶性因子の局所レベルを増加するために対象中
の部位に同様に埋め込まれ得る。

本発明のいくつかの実施形態において、細胞組成物による療法の開始前に、必ずしも患
者を免疫抑制する必要はなく、または望ましいとも思われない。したがって、同種間また
は異種間の移植であっても、再プログラム化細胞または多能性細胞および／またはそれか
ら分化した細胞は、ある場合においては容認され得る。

しかし、他の場合において、細胞療法の開始前に患者を薬理学的に免疫抑制することが
望ましいまたは適切であると思われる。このことは、免疫抑制剤の全身性または局所的使
用を介して達成され得る、または細胞をカプセル化デバイスにおいて送達することによっ
て達成され得る。細胞は、細胞および治療因子によって必要とされる栄養および酸素に対
して浸透性であるカプセルにカプセル化され得るが、細胞は、免疫液性の因子および細胞
に対して未だ不浸透性である。好ましくは、カプセルの材料は低アレルギー性であり、標
的組織中に容易かつ安定に位置し、埋め込み構造に追加の保護を提供する。移植細胞に対
する免疫反応を減少させる、または除去するこれらおよび他の手段は、当分野において公
知である。別の方法として、細胞は、その免疫原性を減少するように遺伝子改変され得る
。

スクリーニング方法
本発明は、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞の再プログラミン
グを誘導または強化する化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、前記方法は、
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞と化合物とを、一時の間、およ
び化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プログラミングが起こるため
に十分な条件下で接触させるステップ、および細胞が再プログラム化されるかどうかを決
定するステップを含む。

一例において、本方法は、
（ｉ）Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された集団と化
合物とを、一時の間、および化合物が再プログラミングを誘導または強化する場合に再プ
ログラミングが起こるために十分な条件下で接触させ、再プログラム化細胞の数を決定す
るステップ；ならびに
（ｉｉ）化合物と接触させられたことのないＳｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／また
はその子孫細胞が濃縮された集団中の再プログラム化細胞の数を決定するステップ
を含み、
（ｉｉ）と比較して（ｉ）において再プログラム化細胞の数が増加することが、化合物が
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞の再プログラミングを誘導また
は強化したことを示す。

一例において、本方法は、例えば本明細書に記載された１種または複数の能力決定因子
の存在下で実施される。

本発明は、再プログラム化細胞または多能性細胞の所望の細胞型への分化を誘導または
強化する化合物を特定または単離する方法をさらに提供し、前記方法は、任意の実施形態
に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞ま
たは多能性細胞を接触させるステップ、および細胞が所望の細胞型に分化しているかどう
かを決定するステップを含む。

好ましくは、本方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施することによって作製され
た再プログラム化細胞または多能性細胞が濃縮された集団と化合物とを、一時の間、およ
び細胞の分化が起こるために十分な条件下で接触させ、所望の細胞型の細胞数を決定する
ステップ、ならびに
（ｉｉ）同じ条件であるが化合物が不在の下で、任意の実施形態に従って本明細書に記
載の方法を実施することによって作製された再プログラム化細胞または多能性細胞を培養
することによって作製された所望の細胞型の数を決定するステップ
を含み、
（ｉｉ）と比較して（ｉ）において所望の細胞型の細胞数が増加することが、化合物が所
望の細胞型への分化を誘導または強化したことを示す。

本発明は、病態を治療するために有用な化合物を特定または単離する方法をさらに提供
し、本方法は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、病態を患う対象から多
能性細胞またはその集団を作製するステップ、
（ｉｉ）細胞または集団を被験化合物と接触させ、病態の１種または複数の症状に関す
るその効果を決定するステップ
を含み、
病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。

一例において、本方法は、
（ａ）多能性細胞またはその集団を、病態の影響を受ける細胞に分化させるステップ、
および
（ｂ）（ａ）細胞と被験化合物を接触させ、病態の１種または複数の症状に関するその
効果を決定するステップ
を含み、病態の症状を改善または緩和する化合物が病態の治療に有用である。

このような方法は、病態の治療のための新規な化合物を特定または単離するためだけに
有用ではなく、さらに、対象が既存の治療用／予防用化合物を用いた治療に応答する可能
性があるかないかを特定するためにも有用である。

当業者は、例えば、本明細書の開示および／または適切な病態および／またはその病態
の症状に基づく、細胞を分化させる適切な方法を承知していると思われる。例えば、病態
は、嚢胞性線維症であり、症状は肺細胞からの分泌であるか、または神経変性病態（例え
ば、アルツハイマー病またはハンチントン病）および症状は神経変性またはプラーク／細
胞内凝集体の形成であるか、または心臓の病態および症状は心筋細胞の収縮である。

本発明は、細胞または組織型に対して毒性が減少した化合物を特定する方法、例えば、
毒性の危険性が減少した治療用化合物を決定する方法をさらに企図する。例えば、本発明
は、
（ｉ）任意の実施形態に従って本明細書に記載の方法を実施し、多能性細胞またはその
集団を作製するステップ、
（ｉｉ）多能性細胞またはその集団を、１種または複数の特定の系列の細胞および／ま
たは組織に分化させるステップ、
（ｉｉｉ）この細胞と被験化合物とを接触させるステップ、ならびに
（ｉｖ）細胞の生存能力および／または増殖に対する化合物の効果を決定するステップ
を含み、
細胞または細胞集団の有意な割合を殺さない、または増殖を減少させない化合物が、毒性
が減少していると考えられる方法を提供する。

例示的分化細胞は、血液細胞、肝細胞、腎細胞および心臓細胞である。

細胞の生存能力および／または増殖に対する化合物の効果を決定する方法は、当分野に
おいて公知であり、ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ媒介ビオ
チン化ＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ、トリパンブルー色素排除アッセイ
、ＭＴＴアッセイ、チミジン取り込みアッセイまたはＢｒｄＵ取り込みアッセイを含む。

当業者は、本発明が、任意の実施形態に従って本明細書に記載の細胞を使用して化合物
を特定および／または単離するさまざまな方法を包含することを、前述より承知している
と思われる。スクリーニングに適切な化合物は、例えば、抗体、ペプチドまたは小分子を
含む。

本発明は、特定または単離された化合物に関する情報の供給を、さらに提供する。した
がって、スクリーニング方法は、
（ｉ）場合により、化合物の構造を決定するステップ、ならびに
（ｉｉ）化合物または化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読
み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ
によりさらに改変される。

必然的に、公知であるが本発明により提供されたスクリーニングを使用してその機能を
いままでに試験されていない化合物については、化合物の構造の決定は黙示的（implicit
）である。当業者は、スクリーニングの実施時に、化合物の名称および／または構造を承
知していると思われるからである。

本明細書において使用する場合、「化合物を提供する」という用語は、前記化合物を作
製するための任意の化学的または組み換えの合成手段、または任意の人または手段により
今までに合成されている化合物の供給を含むと解釈されるべきである。これは、化合物の
単離を明らかに含む。

好ましい実施形態において、化合物または化合物の名称もしくは構造は、例えば、本明
細書に記載のスクリーニングにより決定されたその使用に関する指示と一緒に提供される
。

スクリーニングアッセイは、
（ｉ）場合により、化合物の構造を決定するステップ、
（ｉｉ）場合により、化合物の名称もしくは構造を、例えば文書の形態、機械による読
み込み可能な形態またはコンピューターに読み込み可能な形態などで提供するステップ、
ならびに
（ｉｉｉ）化合物を提供するステップ
によりさらに改変され得る。

好ましい実施形態において、合成化合物またはこの化合物の名称もしくは構造は、例え
ば、本明細書に記載のスクリーニングにより決定されたその使用に関する指示と一緒に提
供される。

一実施形態において、化合物は化合物のライブラリーで提供され、ライブラリーの１つ
１つ、またはライブラリーのサブセットは他のメンバーから分離され得る（すなわち、物
理的に単離される）。このような場合、化合物はその同定によりライブラリーから単離さ
れ、その同定により、その後、例えばライブラリーの他のメンバーの不在下で、当業者が
、例えばその化合物を単離して作製することが可能になる。

本発明を、以下の限定されない実施例においてさらに説明する。

Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からの再プログラム化細胞の作製
１．１Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞を濃縮した集団
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞は、骨髄、脂肪組織および歯髄組織を含むさまざまな
組織から得られる。異なる部位に由来するＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞の再プログラ
ミング効率を比較するために、本質的にＧｒｏｎｔｈｏｓおよびＺａｎｎｅｔｔｉｎｏ
ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．４４９：４５〜５７ページ（２００８年）に記載の
ように、これらの組織それぞれに由来する細胞を、ＳＴＲＯ３ｍＡｂを使用する免疫選
択によってＳｔｒｏ−１^{Ｂｒｉｇｈｔ}細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、Ｐｒｏ
ＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存する。異なる免疫選
択法を使用して、同じ部位に由来するＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞の再プログラミン
グ効率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、ＳＴＲＯ３またはＳＴ
ＲＯ１ｍＡｂのいずれかを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１^{Ｂｒｉｇｈｔ}細胞を濃
縮し、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）にお
いて凍結保存する。すべての研究に関して、第４継代の細胞を解凍し、即時使用のために
ビヒクルにおいて構成する。

１．２レンチウイルスベクターのパッケージングおよび作製
導入遺伝子発現レンチウイルスベクターを、２９３ＦＴ細胞系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）において作製する。２９３Ｔは、形質転換された２９３胎児腎細胞に由来する、成長が
速く、高度に移入可能なクローンの変異体であり、より高いウイルス価に寄与するパッケ
ージングタンパク質の高レベル発現のために、ラージＴ抗原を含有する。常法としての維
持および増殖のために、これらの細胞を、２９３ＦＴ培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ、２
ｍＭのＬ−グルタミンおよび０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸）において５００μｇ／
ｍｌのジェネテシンの存在下で培養する。パッケージングのために、２９３ＦＴ細胞を、
トリプシン処理によって収集する。遠心分離によりトリプシンを除去後、これらの細胞を
、ジェネテシンを含まない２９３ＦＴ培地において、Ｔ７５フラスコにアリコートに分け
る（１５×１０^６細胞／フラスコおよび６フラスコ／構築物）。

レンチウイルスベクターおよび２つのヘルパープラスミドの共トランスフェクションを
、細胞をアリコートに分けた直後にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）トランスフェクショ
ン試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて実施する。翌日、トランスフェクション混合物を含有す
る培養培地を、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（８ｍｌ／フラスコ）を補充した新鮮な２
９３ＦＴ培地に取り換える。レンチウイルス含有上清を形質導入の約４８から７２時間後
に収集する。２９３ＦＴ細胞の残渣（debris）を、４℃において１５分間の遠心分離によ
って上清から除去する。レンチウイルスを濃縮するために、０．４μＭの酢酸セルロース
（ＣＡ）膜（Ｃｏｒｎｉｎｇｔｏｎ、１１５ｍｌ低タンパク質結合）を通して上清をろ
過し、７０ｍｌの滅菌ボトル（Ｂｅｃｋｍａｎ、カタログ番号３５５６２２、４５Ｔｉロ
ーターだけのためのポリカーボネート）において、４０℃において２．５時間超遠心分離
にかける。上清の除去後、ＰＢＳ（各構築物に関して約３００μｌ）を加え、４０℃にお
いて８から１４時間、または室温において２時間、遠心管を振動させることによってペレ
ットを再懸濁する。残存する細胞残渣を遠心分離により除去し、再懸濁したレンチウイル
スをアリコートに分け、−８０℃において保管した。レンチウイルスは、１種または複数
の能力決定因子をコードする配列を担持する。

１．３レンチウイルス形質導入後の細胞の再プログラミングおよび能力決定因子の発現
１種または複数の能力決定因子（例えば、Ｏｃｔ４；またはＯｃｔ４とＳｏｘ２の組み
合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも
１つとの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ；または
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ；またはＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４
およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２
８の組み合わせ；またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇおよび
Ｌｉｎ２８の組み合わせ）をコードするレンチウイルスを、最終濃度約６μｇ／ｍｌ（Ｓ
ｉｇｍａ）でポリブレン担体を加えた後、細胞培養液に加える。

翌日レンチウイルス含有培地を新鮮な培地に取り換え、細胞を適切な培地においてさら
に培養する。必要に応じて、形質導入の３日後に薬剤選択を開始する。

体細胞を因子に曝露した前後に、細胞分取法を使用して細胞を分析する。接着細胞を、
トリプシン処理（０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）により解離させ、２％のパラホルムアルデヒド中で室温において２０分間固定する。
細胞を、４０μｍのメッシュを通してろ過し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳおよび０．
１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）に再懸濁する。懸濁液において成長した細胞
を、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１％の正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ）を補充したＦＡＣＳ緩
衝液において染色した。細胞内ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色を、Ｆｉｘ＆
Ｐｅｒｍ（登録商標）試薬（ＣａｌｔａｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇ
ａｍｅ、ＣＡ）を使用して実施する。５×１０^５細胞を含有する約１００μｌの細胞懸濁
液を、個々の標識に使用する。（必要に応じて）一次抗体および二次抗体の両方のインキ
ュベーションを室温において約３０分間実施する。対照試料を、アイソタイプ一致対照抗
体を用いて染色する。洗浄後、細胞を約３００〜５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し
、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤＩＳ；ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）
において、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎおよび分析ソフトウェ
ア（ＢＤＩＳ）を使用して分析する。合計で２０，０００事象（event）が得られる。検
出されたマーカーは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、
Ｔｒａ−１−８１、ＣＤ２９、Ｔｒａ−１−８５、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、Ｃ
Ｄ３１またはＣＤ３４から選択される。

いくつかの形質導入およびその後の培養において、細胞はバルプロ酸の存在下（in the
presence or valproic acid）で維持する。

ＥＢおよび奇形腫の形成をさらに使用して、再プログラム化細胞が３種すべての一次胚
葉の分化誘導体を生じるための発生能を有することを実証する。

Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞からの再プログラム化細胞の作製
２．１材料および方法
Ｓｔｒｏ−１＋多分化能細胞を濃縮した集団
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団を、骨髄、脂肪組織および歯髄
組織から得た。異なる部位に由来するＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞の再プログラミン
グ効率を比較するために、本質的にＧｒｏｎｔｈｏｓおよびＺａｎｎｅｔｔｉｎｏＭｅ
ｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．４４９：４５〜５７ページ（２００８年）に記載のよう
に、これらの組織それぞれに由来する細胞を、ＳＴＲＯ３ｍＡｂを使用する免疫選択に
よってＳｔｒｏ−１^{Ｂｒｉｇｈｔ}細胞を濃縮し、その後、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒ
ｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において凍結保存した。異なる免疫選択法
を使用して、同じ部位に由来するＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞の再プログラミング効
率を比較するために、同じドナー由来の対を成す骨髄試料を、ＳＴＲＯ３またはＳＴＲＯ
１ｍＡｂのいずれかを使用する免疫選択によってＳｔｒｏ−１^{Ｂｒｉｇｈｔ}細胞を濃縮し
、培養により増殖し、ＰｒｏＦｒｅｅｚｅＴＭ−ＣＤＭ（Ｌｏｎｚａ、ＵＳＡ）において
凍結保存した。すべての研究に関して、第４継代の細胞を解凍し、即時使用のためにビヒ
クルにおいて構成した。

細胞系
ウイルスパッケージング細胞である、プラチナ−Ａ（Ｐｌａｔ−Ａ）細胞を、Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１から得、線維芽細胞は実験のための
陽性対照であった。

レトロウイルスの作製およびｉＰＳ細胞の発生
ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃＭＹＣのヒトｃＤＮＡを含有する、モロニーに
基づくレトロウイルスベクター（ｐＭＸ）を、Ａｄｄｇｅｎｅから得た。９μｇの各プラ
スミドを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ウイルスパッケージングＰｌａｔ
−Ａ細胞にトランスフェクトした。ウイルス含有上清を、トランスフェクトの４８時間後
及び７２時間後に収集し、孔径０．４５μｍのフィルターを通してろ過し、４μｇ／ｍｌ
のポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を補充した。標的細胞を、感染２４時間前に１×１０^３から
５×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。４種の転写因子のレトロウイルス上清を等量
で混合し、二重感染を２４時間および４８時間において標的細胞に加えた。感染細胞のた
めの培養培地を、感染後４日目にｈＥＳ細胞培地に変えた。細胞は培地において維持し、
培地は、３週間まで、または細胞が集密に達するまで毎日新しくした。

ｉＰＳ細胞の増殖
ｉＰＳ細胞系を確立するために、感染後約３週間目にｈＥＳ細胞様コロニー形態に基づ
いてｉＰＳ細胞のコロニーを取り上げた。取り上げたコロニーを、ｈＥＳ細胞培地におい
て新鮮な、有糸分裂的に不活性化されたＭＥＦ上で増殖した。

ｉＰＳ細胞の維持
ヒトｉＰＳ細胞を、２０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭのＬ−Ｇｌｕｔａｍａ
ｘ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％のＩＴ
Ｓおよび１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充したＤＭ
ＥＭにおいて培養した。ヒトｉＰＳ細胞を、培養培地で毎日再生（refresh）した。機械
的解離を、２９Ｇの針を付けた１ｍｌのインスリン注射器を使用して、ｉＰＳ細胞コロニ
ーをより小さい細胞の塊に解体することによって実施した。感染後８から１０日後に、新
鮮な有糸分裂的に不活性化したＭＥＦ上にコロニーを移した。ｉＰＳコロニーを、７から
１０日ごとに継代し、その後機械的解離を実施した。

ＦＡＣＳ分析
細胞のトランスフェクション効率を推定するために、上記と同じ方法を使用して、ｐＭ
Ｘｓ−ＧＦＰレトロウイルスベクターをＰｌａｔ−Ａ細胞にさらにトランスフェクトした
。ＧＦＰｃＤＮＡを含有するｐＭＸレトロウイルスは、追加の細胞であった。ＧＦＰを
発現する細胞の数を、フローサイトメトリーによって感染４８時間後に評価した。細胞を
、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５分間解離させ
、フローサイトメーター（ＭｏＦＬＯ）を使用して分析した。

再プログラミング効率のアッセイ
脂肪細胞、歯髄細胞およびＭＰＣを、上記の「ＲｅｔｒｏｖｉｒａｌＰｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎａｎｄｉＰＳＣｅｌｌＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ」に記載の４種の因子に感染
させた。細胞を、１７日間維持し、毎日培地を変えた。次いで細胞を、トリプシンを用い
て解離させ、４％のパラホルムアルデヒドを用いて固定した。細胞を、２．５％（ｗ／ｖ
）のスキムミルクパウダー、ＰＢＳ中２％（ｖ／ｖ）のヤギ血清を用いてブロックした。
細胞を、一次抗体を用いて４℃において一晩標識し、次いで、一次抗体（マウス抗Ｏｃｔ
４、抗Ｎａｎｏｇまたは抗ＳＳＥＡ４）を用いて４℃において一晩標識し、その後、ヤギ
抗マウスＡｌｅｘａ４８８二次抗体を用いて室温において１時間標識した。試料を、上記
のＦＡＣＳによって分析し、陽性に染色された細胞の数を決定した。

２．２結果
すべてのＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された集団は、それが歯髄、脂肪組織
または骨髄から供給されたかどうかにかかわらず、また、ＳＴＲＯ−３またはＳＴＲＯ−
１ｍＡｂｓを用いて免疫選択されたかどうかにかかわらず、再プログラムでき、ｉＰＳ細
胞系を作製できる。

さまざまな細胞の再プログラミングのための結果の要約を、表１に示す。

ＧＦＰレポーター構築体によって決定したすべての細胞型のトランスフェクション効率
は同様であり、７１．２〜９８．３％の範囲であった。プレート当たりに成長するｉＰＳ
コロニーの数を測定する研究の結果は、Ｄ５５１胎児線維芽細胞に由来する系と比較して
、歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集
団に由来する系に関する有意により高い推定ｉＰＳ細胞コロニーの形成を示す。さらに、
歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団
に由来する系に関するｉＰＳ細胞のコロニー形成は、骨髄由来のＳｔｒｏ−１＋多分化能
前駆細胞に由来する系より有意に高かった。歯髄および脂肪組織（それぞれ５６および２
２）に関する平均コロニー数（／播種された５０，０００細胞）は、Ｄ５５１線維芽細胞
（７）または骨髄（０．５）に関して観察されるより優位に高かった（ｐ＜０．０５、カ
イ二乗検定）。

Ｄ５５１線維芽細胞と比較してＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞からのｉＰＳ発生の効
率の増加が、外からトランスフェクトされた遺伝子または誘導性外来遺伝子の持続発現と
関係があったかどうかを調べるために、本発明者らは、次にすべての培養されたトランス
フェクト細胞集団においてＯｃｔ４およびＮａｎｏｇの発現を測定した。表１に示すよう
に、トランスフェクトされたＤ５５１線維芽細胞は、最も高いレベルのＯｃｔ４の持続発
現（６９％）を明示し、歯髄または脂肪組織を起源とするトランスフェクトされたＳｔｒ
ｏ−１＋多分化能前駆細胞は中間レベルのＯｃｔ４発現（それぞれ５７％および５６％）
を有し、トランスフェクトされた骨髄Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞は最も低いレベル
のＯｃｔ４発現（３６％）を有した。

歯髄または脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞のトランスフェクト
された集団は、Ｎａｎｏｇを発現する細胞の合計数がトランスフェクトされたＤ５５１線
維芽細胞（２８％）より低い（それぞれ、５％および１０％）。骨髄Ｓｔｒｏ−１^＋多分
化能前駆細胞に関しては、対を成す同じ骨髄試料からＳＴＲＯ−３またはＳＴＲＯ−１ｍ
Ａｂを用いて免疫選択されたかどうかにかかわらず、同様のパターンのＯｃｔ４およびＮ
ａｎｏｇの発現が一貫して見られる（Ｏｃｔ４に関してはそれぞれ３０％および３７％な
らびにＮａｎｏｇに関してはそれぞれ１７％および２１％）。

Ｎａｎｏｇ発現の誘導が、中間段階にあるが、必ずしも決定的なｉＰＳ段階には進まな
いｉＰＳ様コロニーと関連し得ることを示す以前に公開されたデータ（Ｃｈａｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．２７（１１）：１０３３〜１０３７ページ（２００９年））
と併せて、歯髄または脂肪組織を起源とするトランスフェクトされたＳｔｒｏ−１＋多分
化能前駆細胞が、Ｄ５５１線維芽細胞より低いＮａｎｏｇ発現を有するが、有意に高いｉ
ＰＳコロニー数を有するという本発明者らの発見は、Ｓｔｒｏ−１＋多分化能前駆細胞が
、能力因子への曝露後の決定的なｉＰＳコロニー形成へ進行するためのより許容状態の細
胞型を代表することを示す。

総合して、これらの結果は、
１）トランスフェクション後の同様のＯｃｔ４発現にもかかわらず、歯髄および脂肪組
織を起源とするＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、ｉＰＳ細胞コ
ロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製し、
２）トランスフェクション後にＮａｎｏｇ発現の誘導が低下したにもかかわらず、歯髄
および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団は、
決定的なｉＰＳ細胞コロニーを、対照の線維芽細胞より、より効率的にかつより多数作製
し、
３）歯髄および脂肪組織を起源とするＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された細
胞集団は、骨髄由来のＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞が濃縮された細胞集団より、ｉＰ
Ｓ細胞コロニーをより効率的に作製したので、組織の起源は、ｉＰＳ細胞コロニーの形成
の効率に影響を及ぼし得る、
ことを示す。

免疫蛍光
歯髄由来のｉＰＳ細胞コロニーは、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６
０およびＴＲＡ１−８１を発現することが免疫蛍光により示された。これらの細胞は、ア
ルカリホスファターゼを発現することがさらに示された。

脂肪組織由来のｉＰＳ細胞コロニーは、Ｏｃｔ４を発現することが免疫蛍光により示さ
れ、アルカリホスファターゼを発現することが示された。

ｉＰＳ細胞系の遺伝子発現
遺伝子発現研究の結果を表２に提示する。

要約として、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞濃縮細胞集団が歯髄、脂肪組織，または
骨髄から得られたかどうかにかかわらず、すべてのＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞濃縮
細胞集団が、感染前にＫＬＦ４およびｃ−ｍｙｃを内因性に発現した。理論および作用機
序に縛られることを好むものではないが、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞によるこれら
の能力因子の内因性発現は、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞を使用したｉＰＳ作製の、
線維芽細胞より高い効率を一部説明できる。しかし、さらなる因子は、歯髄又は脂肪組織
を起源とするＳｔｒｏ−１^＋多分化能前駆細胞において観察されたｉＰＳ系を作製する効
率が、骨髄を起源とするものより高いことを説明できる。

確立された歯のｉＰＳ細胞系は、すべての内因性遺伝子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍ
ｙｃおよびＫｌｆ４を発現した。外因性Ｏｃｔ４およびｃ−ｍｙｃは、第３継代および第
８継代で発現停止されたが、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４は発現されたままである。

第２継代の脂肪ＩＰＳＣは内因性Ｋｌｆ４だけを発現した。外因性Ｏｃｔ４およびｃ−
ｍｙｃは発現停止されないままであった。

第２継代骨髄−ＭＰＣは、いずれの内因性遺伝子の発現も示さなかった。これらの細胞
におい発現停止された唯一の外因性遺伝子はＳｏｘ２であった。

一実施形態において、化合物は化合物のライブラリーで提供され、ライブラリーの１つ１つ、またはライブラリーのサブセットは他のメンバーから分離され得る（すなわち、物理的に単離される）。このような場合、化合物はその同定によりライブラリーから単離され、その同定により、その後、例えばライブラリーの他のメンバーの不在下で、当業者が、例えばその化合物を単離して作製することが可能になる。
本出願は例えば以下の発明を提供するものである。
［１］再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
［２］再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
［３］Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／もしくはその子孫細胞、またはＳｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／もしくはその子孫細胞が濃縮された細胞集団が脂肪組織、歯髄組織または骨髄に由来するものである、［１］または［２］に記載の方法。
［４］再プログラム化細胞を作製するために、曝露された細胞を培養するステップをさらに含む、［１］または［２］に記載の方法。
［５］再プログラム化細胞を単離するステップをさらに含む、［１］または［２］に記載の方法。
［６］Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する再プログラム化細胞を得るために、曝露された細胞を培養するステップを含む、［１］から［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］１種または複数の能力決定因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、およびＧｒｂ２または１種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似の活性を有する化合物からなる群から個別にまたは集約的に選択される、［１］から［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］１種または複数の能力決定因子が化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、［１］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］１種または複数の能力決定因子が、
（ｉ）Ｏｃｔ４、
（ｉｉ）Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つとの組み合わせ、
（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、
（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、
（ｖｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、ならびに
（ｉｘ）（ｉ）から（ｘ）のうちのいずれか１つと、さらに化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される、［１］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が、出生後の哺乳動物から得られる、［１］から［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］哺乳動物がヒトである、［１０］に記載の方法。
［１２］Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を１種または複数の能力決定因子に曝露するステップが、プロモーターに作動可能に連結された１種または複数の能力決定因子をコードする配列を含む核酸をＳｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞に導入するステップを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［１３］プロモーターに作動可能に連結した異なる能力決定因子をコードする配列をそれぞれが含む複数の核酸を投与するステップを含む、［１２］に記載の方法。
［１４］核酸が１種または複数のベクターの内部にある、［１２］または[１３］に記載の方法。
［１５］ベクターがウイルスベクターである、［１４］に記載の方法。
［１６］核酸が、Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞のゲノム中に組み込まれない、［１２］に記載の方法。
［１７］再プログラム化細胞が多能性である、［１］または［２］に記載の方法。
［１８］再プログラム化細胞が、（ｉ）Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞マーカーを発現し、（ｉｉ）多能性細胞に特徴的な形態を示し、および／または（ｉｉｉ）免疫不全動物に導入されると奇形腫を形成する、［１］または［２］に記載の方法。
［１９］［１］から［１８］のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される細胞。
［２０］［１］から［１８］のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される、多能性細胞が濃縮された細胞集団。
［２１］多能性細胞が集団の少なくとも６０％を占める、［２０］に記載の細胞の濃縮集団。
［２２］［１８］から［２１］のいずれか一項に記載の細胞または集団から分化した細胞または細胞集団。
［２３］異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードする核酸を含む、Ｓｔｒｏ−１ ^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞。
［２４］医薬における［１９］から［２３］のいずれか一項に記載の細胞または集団の使用。
［２５］疾患または障害を治療または予防する方法であって、［１９］から［２３］のいずれか一項に記載の細胞または集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
［２６］疾患または障害の治療または予防において有用な化合物をスクリーニングする方法であって、［１９］から［２３］のいずれか一項に記載の細胞または集団を前記化合物に曝露するステップを含む方法。

Claims

再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／ま
たはその子孫細胞を、細胞を再プログラムするために十分な条件下で１種または複数の能
力決定因子に曝露するステップを含む方法。
再プログラム化細胞を作製する方法であって、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／ま
たはその子孫細胞が濃縮された細胞の集団を、細胞を再プログラムするために十分な条件
下で１種または複数の能力決定因子に曝露するステップを含む方法。
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／もしくはその子孫細胞、またはＳｔｒｏ−１^＋多
分化能細胞および／もしくはその子孫細胞が濃縮された細胞集団が脂肪組織、歯髄組織ま
たは骨髄に由来するものである、請求項１または２に記載の方法。
再プログラム化細胞を作製するために、曝露された細胞を培養するステップをさらに含
む、請求項１または２に記載の方法。
再プログラム化細胞を単離するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法
。
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞よりも広い分化能を有する再
プログラム化細胞を得るために、曝露された細胞を培養するステップを含む、請求項１か
ら５のいずれか一項に記載の方法。
１種または複数の能力決定因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉ
ｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶ１６
Ｅ６、ＨＰＶ１６Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｆｂｘ１５、Ｅｒａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１
、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、ＥＳＧ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ
１５、ＥＣＡＴ１５−１、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌ１４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌ
ａ、Ｓｔａｔ３、およびＧｒｂ２または１種もしくは複数の前記因子と同一もしくは類似
の活性を有する化合物からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項１から６
のいずれか一項に記載の方法。
１種または複数の能力決定因子が化学物質、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮ
ＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
１種または複数の能力決定因子が、
（ｉ）Ｏｃｔ４、
（ｉｉ）Ｏｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、
（ｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つ
との組み合わせ、
（ｉｖ）Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の組み合わせ、
（ｖｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの組み合わせ、
（ｖｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の組み合わせ、
（ｖｉｉｉ）Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８
の組み合わせ、ならびに
（ｉｘ）（ｉ）から（ｘ）のうちのいずれか１つと、さらに化学物質、ペプチド、ｓｉＲ
ＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡとの組み合わせ
からなる群から個別にまたは集約的に選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載
の方法。
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞が、出生後の哺乳動物から得
られる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
哺乳動物がヒトである、請求項１０に記載の方法。
Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞を１種または複数の能力決定
因子に曝露するステップが、プロモーターに作動可能に連結された１種または複数の能力
決定因子をコードする配列を含む核酸をＳｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその
子孫細胞に導入するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
プロモーターに作動可能に連結した異なる能力決定因子をコードする配列をそれぞれが
含む複数の核酸を投与するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
核酸が１種または複数のベクターの内部にある、請求項１２または１３に記載の方法。
ベクターがウイルスベクターである、請求項１４に記載の方法。
核酸が、Ｓｔｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞のゲノム中に組み込
まれない、請求項１２に記載の方法。
再プログラム化細胞が多能性である、請求項１または２に記載の方法。
再プログラム化細胞が、（ｉ）Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔ
ｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１からなる群から選択される細胞マーカーを発現し
、（ｉｉ）多能性細胞に特徴的な形態を示し、および／または（ｉｉｉ）免疫不全動物に
導入されると奇形腫を形成する、請求項１または２に記載の方法。
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される細胞
。
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施することによって作製される、多
能性細胞が濃縮された細胞集団。
多能性細胞が集団の少なくとも６０％を占める、請求項２０に記載の細胞の濃縮集団。
請求項１８から２１のいずれか一項に記載の細胞または集団から分化した細胞または細
胞集団。
異種プロモーターに作動可能に連結された能力決定因子をコードする核酸を含む、Ｓｔ
ｒｏ−１^＋多分化能細胞および／またはその子孫細胞。
医薬における請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団の使用。
疾患または障害を治療または予防する方法であって、請求項１９から２３のいずれか一
項に記載の細胞または集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
疾患または障害の治療または予防において有用な化合物をスクリーニングする方法であ
って、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の細胞または集団を前記化合物に曝露す
るステップを含む方法。