CN116333969A - 一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及狂犬病毒用Vero细胞扩增培养技术领域，具体为一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，在进行Vero细胞培养过程中，需要将Vero细胞从培养基中分离出来，通过将试管进行震荡移动，使得磁棒在试管的径向上进行移动，配合试管的自转，使得磁棒覆盖整个试管的横截面，进而将吸附了Vero细胞的磁珠完全吸附，达到快速、彻底分离Vero细胞的目的，分离出的Vero细胞与狂犬病毒进行混合后进行快速培养，实现狂犬病毒用Vero细胞大量、快速的扩大培养。
Description
技术领域
本发明涉及狂犬病毒用Vero细胞扩增培养技术领域，具体为一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法。
背景技术
Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiops monkey)肾建立的猴肾细胞系。其名称的由来是取自世界语中“绿”字的VERDE前两个字母和“肾”字前两个字母合在一起，但世界语中不允许VERE存在，而需以“0”结尾，故命名为“Vero”。其第93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCC NO.CCL-81。
除了常规的科研需要之外，经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合1987年WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。于是，Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹活疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国被研制出来并获批准生产。因此，Vero细胞的应用前景以及需求量极大。
而在Vero细胞用于狂犬病毒培养过程中，需要将Vero细胞从培养基中进行分离，而现有的干细胞分离方法主要有贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分离法，上述的几种细胞分离方法中，仅免疫磁珠分选法是一种简单高效的分离方法，仅需磁性分离器，不需要专业设备辅助，分离获得BMSCs细胞通量高，其他几种均需要较高的操作要求，技术难度高。
但是，现有的免疫磁珠分选法在对Vero细胞进行分离时，由于磁珠是游离在培养基中的，通过磁棒吸附磁珠，存在很难将磁珠完全吸附的技术问题。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，在进行Vero细胞培养过程中，需要将Vero细胞从培养基中分离出来，通过将试管进行震荡移动，使得磁棒在试管的径向上进行移动，配合试管的自转，使得磁棒覆盖整个试管的横截面，进而将吸附了Vero细胞的磁珠完全吸附，达到快速、彻底分离Vero细胞的目的，分离出的Vero细胞与狂犬病毒进行混合后进行快速培养，实现狂犬病毒用Vero细胞大量、快速的扩大培养。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，包括以下步骤：
步骤a、细胞培养，用移液枪将Vero细胞专用培养基吸尽，加入3-5mlPBS洗涤细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml的胰蛋白酶，于37℃条件下消化2-3min，加入2-3ml的新鲜的Vero细胞专用培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1200g/min条件下离心3-5min，用移液枪去除上清液，加入2-3ml新鲜的Vero细胞专用培养基，使用移液枪上下吹打细胞40-50次；平均加入到3-8个细胞培养皿中，进行贴壁扩大培养；
步骤b、分离收集细胞，将贴壁培养24-72小时的Vero细胞，用胰蛋白酶消化并通过免疫磁珠法分离收集细胞，其中，在通过免疫磁珠法分离Vero细胞时，在胰蛋白酶消化2-3min后，将细胞转移至试管内，向试管内加入磁珠，通过震荡台使得磁珠在试管内分布均匀，磁珠吸附Vero细胞，之后将分离棒套与磁棒同步插入到所述试管内，使得试管内吸附了Vero细胞的磁珠被磁棒吸附，进而分离收集，在磁棒吸附磁珠过程中，所述试管自转的同时，沿试管的径向往复移动，使得磁棒完全吸附所述试管内的磁珠；
步骤c、制备细胞悬液，加入新鲜的Vero细胞专用培养基，调节PH值为7.0-8.0，制成密度为5×105-2×106cells/ml的细胞悬液；
步骤d、狂犬病毒对Vero细胞；按病毒：细胞为1：1-1：100的量加入预先制备的狂犬病毒悬液，25-40℃条件下放置10-60分钟；
步骤e、接种培养，加入M199培养基，PH7.0-8.0，接种细胞培养瓶，接种量0.5×105-1×105cells/cm2，37℃条件下贴壁培养；24-48小时后培养液更换M199培养基，PH7.0-8.0，30-34℃条件下贴壁培养；
步骤f、完成培养；96-144小时后收获培养液，蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，为低代次细胞适应病毒。
作为改进，所述步骤a中，向细胞培养皿中加入的胰蛋白酶的百分比为0.38％，且该胰蛋白酶中含有0.05％的EDTA。
作为改进，所在步骤a、b及c中，新鲜的Vero细胞专用培养基为含胰蛋白酶、EDTA、牛血清白蛋白的M199培养基。
作为改进，所述的含胰蛋白酶、EDTA、牛血清白蛋白的M199培养基中胰蛋白酶的浓度为0.01％-0.1％、EDTA的浓度为0.1-1mM、牛血清白蛋白的浓度为0.5-1％。
作为改进，所述步骤e中，第一次加入的M199培养基为含5-10％牛血清白蛋白的M199培养基。
作为改进，所述步骤e中，第二加入的M199培养基为含0.5％牛血清白蛋白的M199培养基。
作为改进，所述步骤b中，所述试管在沿径向进行往复移动过程中，该试管仅在其单程移动过程中，进行自转，而在所述试管复位过程中，该试管不进行自转。
作为改进，所述步骤b中，若干的所述试管插设于试管架上，随所述震荡台沿径向进行移动的同时，所述试管同步进行自转。
作为改进，所述震荡台包括底座、第一移动座、第二移动座、电机及连杆组件；
所述底座固定设置，该底座上设置有对所述第二移动座的移动进行导向的导向槽；
所述第一移动座通过滑轨组滑动设置于所述底座上，且该第一移动座由所述电机通过所述连杆组件带动沿滑轨组进行往复滑动；
所述第二移动座安装于所述第一移动座上，该第二移动座随所述第一移动座往复滑动的同时，所述第二移动座通过滚轮配合所述导向槽的导向沿垂直于所述第一移动座的移动方向进行移动设置，所述第二移动座上安装有所述试管架。
作为改进，所述试管架包括支架、管套及齿轮；
所述支架套设安装于所述第二移动座上；
若干的所述管套转动安装于所述支架上，该管套用于插设所述试管；
所述齿轮安装于所述管套的底部，该齿轮与设置于所述第一移动座上的齿条配合，使得所述管套进行旋转设置；
所述第一移动座上设置有驱动所述齿条移动的电磁铁，所述电磁铁驱动所述齿条与所述齿轮离合设置。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明在进行Vero细胞培养过程中，需要将Vero细胞从培养基中分离出来，通过将试管进行震荡移动，使得磁棒在试管的径向上进行移动，配合试管的自转，使得磁棒覆盖整个试管的横截面，进而将吸附了Vero细胞的磁珠完全吸附，达到快速、彻底分离Vero细胞的目的，分离出的Vero细胞与狂犬病毒进行混合后进行快速培养，实现狂犬病毒用Vero细胞大量、快速的扩大培养；
(2)本发明在对试管内的Vero细胞进行分离时，先对Vero细胞进行震荡，使得磁珠在试管内与细胞全面的进行连接吸附，并且在试管进行震荡时，试管在横向与纵向上进行往复移动，达到对试管内的细胞与磁珠进行快速均匀分散的目的；
(3)本发明在对细胞进行分离的过程中，通过试管的震荡移动配合试管自身的旋转，使得相对试管固定的磁棒在试管内以圆环状的8字形轨迹进行移动，使得磁棒覆盖整个试管，进而达到吸附试管内部所有磁珠的目的，使得最终分离出的细胞数量与分离速度都得到最佳；
(4)本发明在试管进行旋转和震荡的过程中，试管仅在往复移动的单程中进行旋转，试管在复位过程中，试管是不进行旋转的，因而每次试管与磁棒的配合范围均是不同的，使得磁棒每次的路径均不同，达到磁珠吸附的最大值；
(5)本发明实现对狂犬病毒用的Vero细胞的快速扩展，方法合理，应用方便，培养的Vero细胞细胞生长速度快，细胞状态好，并且狂犬病毒在Vero细胞上连续多次传代依然保持生物学、遗传学和其他特性的稳定性。
综上所述，本发明具有Vero细胞分离彻底、快速，且狂犬病毒在Vero细胞上连续多次传代保持良好的稳定性等优点，尤其适用于狂犬病毒用Vero细胞扩增培养技术领域。
附图说明
图1为本发明磁珠分离设备立体结构示意图；
图2为本发明震荡台立体结构示意图；
图3为本发明震荡台剖视结构示意图；
图4为本发明试管架正视结构示意图；
图5为本发明震荡台俯视结构示意图；
图6为本发明震荡台剖视结构示意图一；
图7为本发明试管架剖视结构示意图；
图8为本发明震荡台局部结构示意图一；
图9为本发明震荡台局部结构示意图二；
图10本发明第二移动座立体结构示意图；
图11为本发明底座俯视结构示意图；
图12为本发明震荡台剖视结构示意图二；
图13为本发明试管与分离管套配合结构示意图；
图14为本发明试管相对于分离管套移动路径示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
实施例1：
如图1所示，一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，包括以下步骤：
步骤a、细胞培养，用移液枪将Vero细胞专用培养基吸尽，加入3-5mlPBS洗涤细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml的胰蛋白酶，于37℃条件下消化2-3min，加入2-3ml的新鲜的Vero细胞专用培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1200g/min条件下离心3-5min，用移液枪去除上清液，加入2-3ml新鲜的Vero细胞专用培养基，使用移液枪上下吹打细胞40-50次；平均加入到3-8个细胞培养皿中，进行贴壁扩大培养；
步骤b、分离收集细胞，将贴壁培养24-72小时的Vero细胞，用胰蛋白酶消化并通过免疫磁珠法分离收集细胞，其中，在通过免疫磁珠法分离Vero细胞时，在胰蛋白酶消化2-3min后，将细胞转移至试管10内，向试管10内加入磁珠，通过震荡台1使得磁珠在试管10内分布均匀，磁珠吸附Vero细胞，之后将分离棒套2与磁棒3同步插入到所述试管10内，使得试管10内吸附了Vero细胞的磁珠被磁棒3吸附，进而分离收集，在磁棒3吸附磁珠过程中，所述试管10自转的同时，沿试管10的径向往复移动，使得磁棒3完全吸附所述试管10内的磁珠；
步骤c、制备细胞悬液，加入新鲜的Vero细胞专用培养基，调节PH值为7.0-8.0，制成密度为5×105-2×106cells/ml的细胞悬液；
步骤d、狂犬病毒对Vero细胞；按病毒：细胞为1：1-1：100的量加入预先制备的狂犬病毒悬液，25-40℃条件下放置10-60分钟；
步骤e、接种培养，加入M199培养基，PH7.0-8.0，接种细胞培养瓶，接种量0.5×105-1×105cells/cm2，37℃条件下贴壁培养；24-48小时后培养液更换M199培养基，PH7.0-8.0，30-34℃条件下贴壁培养；
步骤f、完成培养；96-144小时后收获培养液，蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，为低代次细胞适应病毒。
其中，所述步骤a中，向细胞培养皿中加入的胰蛋白酶的百分比为0.38％，且该胰蛋白酶中含有0.05％的EDTA。
进一步的，所在步骤a、b及c中，新鲜的Vero细胞专用培养基为含胰蛋白酶、EDTA、牛血清白蛋白的M199培养基。
更进一步的，所述的含胰蛋白酶、EDTA、牛血清白蛋白的M199培养基中胰蛋白酶的浓度为0.01％-0.1％、EDTA的浓度为0.1-1mM、牛血清白蛋白的浓度为0.5-1％。
此外，所述步骤e中，第一次加入的M199培养基为含5-10％牛血清白蛋白的M199培养基，第二加入的M199培养基为含0.5％牛血清白蛋白的M199培养基。
值得具体说明的是，所述步骤b中，所述试管10在沿径向进行往复移动过程中，该试管10仅在其单程移动过程中，进行自转，而在所述试管10复位过程中，该试管10不进行自转，并且若干的所述试管10插设于试管架4上，随所述震荡台1沿径向进行移动的同时，所述试管10同步进行自转。
实施例2：
结合实施例一描述本发明实施例二的一种用于Vero细胞分离的震荡机构。
如图2至图14所示，具体的，所述震荡台1包括底座11、第一移动座12、第二移动座13、电机14及连杆组件15；
所述底座11固定设置，该底座11上设置有对所述第二移动座13的移动进行导向的导向槽111；
所述第一移动座12通过滑轨组滑动设置于所述底座11上，且该第一移动座12由所述电机14通过所述连杆组件15带动沿滑轨组进行往复滑动；
所述第二移动座13安装于所述第一移动座12上，该第二移动座13随所述第一移动座12往复滑动的同时，所述第二移动座13通过滚轮131配合所述导向槽111的导向沿垂直于所述第一移动座12的移动方向进行移动设置，所述第二移动座13上安装有所述试管架4。
所述试管架4包括支架41、管套42及齿轮43；
所述支架41套设安装于所述第二移动座13上；
若干的所述管套42转动安装于所述支架41上，该管套42用于插设所述试管10；
所述齿轮43安装于所述管套42的底部，该齿轮43与设置于所述第一移动座12上的齿条121配合，使得所述管套42进行旋转设置；
所述第一移动座12上设置有驱动所述齿条121移动的电磁铁122，所述电磁铁122驱动所述齿条121与所述齿轮43离合设置。
在细胞转移至试管10内后，首先，加入磁珠，之后需要通过震荡台1对磁珠进行快速的分散，使得磁珠均匀的分布于试管10内，紧接着，利用震荡台1带动试管10进行震荡，使得磁珠快速的在试管10内进行分散，在磁珠完成分散后，磁珠与Vero细胞完成结合吸附工作，之后将磁棒分离棒套2与磁棒3插入到试管内，分离棒套2套在磁棒3的外侧，分离棒套2采用无磁材料制备，磁棒3的强磁力隔着分离棒套对磁珠进行吸附，使得磁珠吸附在分离棒套2上，之后磁棒与分离棒套一起同步抽离试管10，同时，磁珠上吸附的Vero细胞也随之进行分离，转移到新的试管10内，之后磁棒3从分离棒套2内抽离，分离棒套2吸附的磁珠从分离棒套2掉落到新的试管10内，进行洗涤，重复洗涤2-3次后，分离干净的Vero细胞与狂犬病毒进行混合。
进一步说明的是，分离棒套2与磁棒3分别由对应的升降机构带动进行升降设置，而震荡台1进行快速震荡时，是由电机14通过连杆组件15带动第一移动座12进行往复移动，而在第一移动座12进行移动过程中，第二移动座13也随着第一移动座12进行移动，并且，在移动过程中，第二移动座13通过导向槽111与滚轮131配合，使得第二移动座13还在垂直第一移动座12的移动方向上进行移动，使得试管架4获得双向上的往复震荡。
此外，在试管架4上，管套42的顶部设置有用于对试管10进行夹紧的橡胶套44，橡胶套44可以对试管10进行固定，使得试管10在震荡过程中不会出现晃动，并且，并且在针对过程中，试管10的在横向与纵向上的移动距离刚好为试管10的直径，分离棒套2在震荡过程中的极限位置处，刚好位于试管10内腔的边沿处。
更进一步说明的是，在为了使得试管10在试管架4上是单程进行旋转，而在复位过程中是不旋转的，特别设置了两组的电磁铁122对齿条121进行吸附，使得齿条121可以进行移动，一组的电磁铁122对齿条121进行吸附，使得齿条121在与齿轮43完成配合后，可以由另一组的电磁铁122进行吸附，使得齿条121远离齿轮43，。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a、细胞培养，用移液枪将Vero细胞专用培养基吸尽，加入3-5mlPBS洗涤细胞2-3次，向细胞培养皿中加入1-2ml的胰蛋白酶，于37℃条件下消化2-3min，加入2-3ml的新鲜的Vero细胞专用培养基，使用移液枪吹打细胞培养皿底40-50次；将液体移至细胞离心管中，在1000-1200g/min条件下离心3-5min，用移液枪去除上清液，加入2-3ml新鲜的Vero细胞专用培养基，使用移液枪上下吹打细胞40-50次；平均加入到3-8个细胞培养皿中，进行贴壁扩大培养；
步骤b、分离收集细胞，将贴壁培养24-72小时的Vero细胞，用胰蛋白酶消化并通过免疫磁珠法分离收集细胞，其中，在通过免疫磁珠法分离Vero细胞时，在胰蛋白酶消化2-3min后，将细胞转移至试管(10)内，向试管(10)内加入磁珠，通过震荡台(1)使得磁珠在试管(10)内分布均匀，磁珠吸附Vero细胞，之后将分离棒套(2)与磁棒(3)同步插入到所述试管(10)内，使得试管(10)内吸附了Vero细胞的磁珠被磁棒(3)吸附，进而分离收集，在磁棒(3)吸附磁珠过程中，所述试管(10)自转的同时，沿试管(10)的径向往复移动，使得磁棒(3)完全吸附所述试管(10)内的磁珠；
步骤c、制备细胞悬液，加入新鲜的Vero细胞专用培养基，调节PH值为7.0-8.0，制成密度为5×105-2×106cells/ml的细胞悬液；
步骤d、狂犬病毒对Vero细胞；按病毒：细胞为1：1-1：100的量加入预先制备的狂犬病毒悬液,25-40℃条件下放置10-60分钟；
步骤e、接种培养，加入M199培养基,PH7.0-8.0，接种细胞培养瓶，接种量0.5×105-1×105cells/cm2,37℃条件下贴壁培养；24-48小时后培养液更换M199培养基，PH7.0-8.0，30-34℃条件下贴壁培养；
步骤f、完成培养；96-144小时后收获培养液，蔗糖密度梯度超速离心纯化和浓缩病毒，制备病毒悬液，为低代次细胞适应病毒。
2.根据权利要求1所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述步骤a中，向细胞培养皿中加入的胰蛋白酶的百分比为0.38％，且该胰蛋白酶中含有0.05％的EDTA。
3.根据权利要求1所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所在步骤a、b及c中，新鲜的Vero细胞专用培养基为含胰蛋白酶、EDTA、牛血清白蛋白的M199培养基。
4.根据权利要求3所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述的含胰蛋白酶、EDTA、牛血清白蛋白的M199培养基中胰蛋白酶的浓度为0.01％—0.1％、EDTA的浓度为0.1—1mM、牛血清白蛋白的浓度为0.5—1％。
5.根据权利要求1所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述步骤e中，第一次加入的M199培养基为含5-10％牛血清白蛋白的M199培养基。
6.根据权利要求1所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述步骤e中，第二加入的M199培养基为含0.5％牛血清白蛋白的M199培养基。
7.根据权利要求1所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述步骤b中，所述试管(10)在沿径向进行往复移动过程中，该试管(10)仅在其单程移动过程中，进行自转，而在所述试管(10)复位过程中，该试管(10)不进行自转。
8.根据权利要求1所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述步骤b中，若干的所述试管(10)插设于试管架(4)上，随所述震荡台(1)沿径向进行移动的同时，所述试管(10)同步进行自转。
9.根根据权利要求8所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述震荡台(1)包括底座(11)、第一移动座(12)、第二移动座(13)、电机(14)及连杆组件(15)；
所述底座(11)固定设置，该底座(11)上设置有对所述第二移动座(13)的移动进行导向的导向槽(111)；
所述第一移动座(12)通过滑轨组滑动设置于所述底座(11)上，且该第一移动座(12)由所述电机(14)通过所述连杆组件(15)带动沿滑轨组进行往复滑动；
所述第二移动座(13)安装于所述第一移动座(12)上，该第二移动座(13)随所述第一移动座(12)往复滑动的同时，所述第二移动座(13)通过滚轮(131)配合所述导向槽(111)的导向沿垂直于所述第一移动座(12)的移动方向进行移动设置，所述第二移动座(13)上安装有所述试管架(4)。
10.根据权利要求9所述的一种狂犬病毒用Vero细胞培养方法，其特征在于：
所述试管架(4)包括支架(41)、管套(42)及齿轮(43)；
所述支架(41)套设安装于所述第二移动座(13)上；
若干的所述管套(42)转动安装于所述支架(41)上，该管套(42)用于插设所述试管(10)；
所述齿轮(43)安装于所述管套(42)的底部，该齿轮(43)与设置于所述第一移动座(12)上的齿条(121)配合，使得所述管套(42)进行旋转设置；
所述第一移动座(12)上设置有驱动所述齿条(121)移动的电磁铁(122)，所述电磁铁(122)驱动所述齿条(121)与所述齿轮(43)离合设置。
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