CN108118029A - 高抗癌活性t细胞的筛选方法和应用 - Google Patents

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CN108118029A CN201611080683.1A CN201611080683A CN108118029A CN 108118029 A CN108118029 A CN 108118029A CN 201611080683 A CN201611080683 A CN 201611080683A CN 108118029 A CN108118029 A CN 108118029A
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明提供了一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，包括以下步骤：提供分离的人外周血单个核细胞；提供CD27抗体包被磁珠；检测CD3和CD27双阳性细胞的比例；使用CD27抗体包被磁珠筛选CD27阳性目标细胞亚群。本发明首次采用CD27抗体包被磁珠对筛选具有高抗癌活性的T细胞特定亚群，简便易操作，成本低，便于得到离体生长情况好、再刺激扩增性强、肿瘤杀伤能力高且持久的高品质细胞免疫产品。本发明还提供了该筛选方法在免疫细胞治疗中的应用。

Description

高抗癌活性T细胞的筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高抗癌活性T细胞的筛选方法和应用。
背景技术
免疫细胞疗法是一种新兴的肿瘤治疗模式，已经成为全球的研究热点，特别是以肿瘤浸润细胞(TIL)、CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)/TCR-T(嵌合型T细胞)技术为主要代表，成为全球生物医学的主要发展方向。免疫细胞疗法是运用生物技术和生物制剂从患者体内分离免疫细胞进行体外培养、激活和扩增后，回输到患者体内，直接杀伤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤目的。
现有的细胞免疫疗法均使用未经筛选的外周血单个核细胞(PBMC)进行培养扩增，以此法得到的未经筛选的PBMC，含有包括免疫细胞疗法所需要的杀伤性T细胞，以及免疫细胞疗法不需要的NK细胞、巨噬细胞等。同时，杀伤性T细胞又可根据表型分为幼稚型、中枢记忆型、效应记忆型、效应型等多个表型，其形态功能、扩增性、细胞因子分泌能力等均有很大差别。换言之，未经筛选的外周血单个核细胞其中只有一部分适合生产免疫细胞产品(此类细胞可称为“目标细胞亚群”，主要是指幼稚型、中枢记忆型T细胞)，而不加筛选的使用单个核细胞进行生产不仅会导致人力、物力成本上升，而且无用的细胞亚群还有可能影响目标细胞亚群的功能，从而导致免疫细胞产品的质量下降。
因此，有必要提供一种生产成本低，且能高效筛选出高抗癌活性的目标T细胞的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，旨在解决现有技术中免疫细胞中无用细胞亚群多、目标细胞亚群少且活性低、质量差的问题。
第一方面，本发明提供了一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，包括以下步骤：
(1)提供CD27抗体包被磁珠；提供分离的人外周血单个核细胞；
(2)检测CD3和CD27双阳性细胞的比例：
将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞重悬在X-VIVO 15无血清培养基中，得到第一细胞重悬液；向所述第一细胞重悬液中加入第一荧光染料标记的鼠抗人CD27抗体与第二荧光染料标记的鼠抗人CD3抗体，孵育15-50min，采用流式细胞仪检测所述孵育后的细胞中CD3与CD27双阳性细胞的百分比；
(3)使用CD27抗体包被磁珠筛选CD27阳性目标细胞亚群：
将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞，采用X-VIVO 15无血清培养基重悬，得到第二细胞重悬液；根据所述CD3和CD27双阳性细胞的比例，将所述CD27抗体包被磁珠按照与双阳性细胞个数比为(2-5):1的比例加入到所述第二细胞重悬液中，混匀后，置于细胞培养箱中培养40-60min；
将所得培养混合液在施加磁场的情况下静置，弃去上清液，并撤去磁场；之后加入X-VIVO 15无血清培养基重悬，得到含CD27阳性目标细胞亚群的磁珠混悬液，即，含高抗癌活性T细胞的磁珠混悬液。
每100mL的志愿者血样中大约可分离出(0.5-2)×108个PBMC细胞。优选地，所述第一细胞重悬液的浓度为(0.5-3)×107个/100μL。
优选地，所述第一荧光染料与第二荧光染料的发射光不重合，以便区分开来。
进一步优选地，所述第一荧光染料为藻红蛋白(PE：Phycoerythrin)或藻红蛋白-菁类染料7(PE-Cy7)，其发红光。
所述第二荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)，其发绿光。
优选地，步骤(3)中，所述培养是在37℃、5％CO2的条件下进行。
优选地，在所述步骤(3)之后，还包括以下步骤：
对所述含CD27阳性目标细胞亚群的磁珠混悬液采用移液管反复吹打10-15次，并置于有磁场的情况下静置，弃去上清液，得到去除磁珠的CD27阳性目标细胞亚群，即高抗癌活性T细胞。所述高抗癌活性T细胞可以直接回输至人体，对患者机体免疫系统具有增强作用。
根据T细胞表达的受体的不同，通常将T细胞分为幼稚型、中枢记忆型、效应记忆型、效应型4个亚型，其中幼稚型与中枢记忆型T细胞具有更强的抗癌活性，是理想的免疫细胞产品生产原料(“目标细胞亚群”)，而效应记忆型与效应型T细胞不仅抗癌效果差，同时会促使幼稚型与中枢记忆型T细胞向效应记忆型与效应型T细胞转化，对免疫细胞产品的生产不利。目前通用的T细胞表型分类指标是CCR7，CD62L，以及CD45RA/RO，还没有将CD27作为T细胞表型分类指标。
本申请的发明人，在使用细胞免疫疗法的过程中，发现CD27仅表达在幼稚型与中枢记忆型T细胞表面，因此本发明首次将CD27抗体包被磁珠用于筛选高抗癌活性T细胞，发现可以得到具有高分裂能力和抗癌潜力的幼稚型与中枢记忆型T细胞(即目标细胞亚群)，此外，表达CD27的T细胞因为具有CD27共刺激通路，可以在抗肿瘤时更容易被激活，从而发挥强效持久的抗肿瘤效果。
现有技术中制备细胞免疫产品的过程，其主要步骤是细胞离体大规模扩增，以及使用转染试剂、病毒载体等方法进行的基因改造，均是以总细胞数目为基数进行的。总细胞数目越多，对其进行扩增所需要的成本就越高(包括培养人员的人力成本、培养用的培养基、血清等、基因改造用的慢病毒载体等试剂等)，而总细胞中无用的杂质细胞越多，因杂质细胞而白白消耗掉的成本就越高。而本申请中，根据分离的人外周血单个核细胞重悬液中CD3与CD27双阳性细胞的百分比，来加入CD27抗体包被磁珠进行筛选，可以大大减少杂质细胞含量，降低生产成本，更重要的是，本发明的研究者发现，CD27阴性细胞亚群会通过细胞-细胞相互作用，以及细胞因子分泌等方式，促进目标细胞亚群的分化，诱导其由CD27阳性细胞转化为CD27阴性细胞。而进行筛选分离之后，几乎不存在CD27阴性细胞，单独的CD27阳性细胞(幼稚型与记忆型T细胞，即目标细胞亚群)会更长久的维持其表型，从而可以在更长的时间发挥高效的抗肿瘤效能。
本申请中提供的所述CD27抗体包被磁珠，可以与T细胞表面的CD27发生抗原抗体结合，之后在磁场的作用下，CD27磁珠与将表达CD27的T细胞(幼稚型与记忆型T细胞，即目标细胞亚群)一起发生定向迁移，从而与不表达CD27的杂质细胞(如B淋巴细胞以及效应记忆型、效应型T细胞)进行分离。经过CD27抗体包被磁珠筛选后得到的CD27阳性细胞具有较强的抗癌活性，可用于制备高品质细胞免疫产品。
优选地，所述CD27抗体包被磁珠是采用以下方法制得：
a、将负载磁珠采用pH为6.0-10.0的第一缓冲溶液进行洗涤、重悬，向重悬后的负载磁珠中加入抗人CD27抗体，在18-37℃下避光孵育16-24h；向所得避光孵育液中加入封闭剂，以封闭掉磁珠上未结合抗体的位点，之后再孵育10-30min，得到含CD27抗体包被磁珠的反应液；
b、对所述反应液静置，弃去上清液，对所得CD27抗体包被磁珠采用第二缓冲溶液进行清洗数次，并重悬于所述第二缓冲溶液，得到纯化后的CD27抗体包被磁珠，其中，所述第二缓冲溶液为含有牛血清白蛋白(BSA)和EDTA(乙二胺四乙酸)的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液。
可以理解的是，步骤(a)中，对所述负载磁珠的洗涤，可以是将装有负载磁珠、第一缓冲溶液的容器(例如试管、锥形瓶等)置于有磁场的环境中(如磁力架或磁铁上)静置，弃去上清液，得到洗涤后的磁珠。重悬时是将装有洗涤后磁珠的容器离开磁力架或磁铁提供的所述磁场环境，然后加入重悬溶液。对含CD27抗体包被磁珠的反应液的洗涤、重悬与之类似。首先将所述反应液的溶液置于磁场环境中，弃去上清液，得到含CD27抗体包被磁珠；然后撤去磁场环境，加入所述第二缓冲溶液混匀，实现包被磁珠的清洗。
优选地，在采用所述第二缓冲溶液清洗时，在加入第二缓冲溶液后，先室温孵育3-5min。
本申请中，所述负载磁珠是未连接抗体的普通磁珠。优选地，所述负载磁珠包括粒径为1nm-500μm的普通磁珠。进一步优选成粒径为100nm-300μm。更优选为5-100μm。
在本发明一实施方式中，所述负载磁珠为M-450Epoxy可负载型磁珠，其粒径为为2-10μm。还可以为其他普通磁珠，并不限于M-450Epoxy磁珠。
该M-450Epoxy负载磁珠为pH呈中性的亲水性磁珠，为无孔单分散超顺磁微珠，表面修饰有缩水甘油醚，该磁珠在溶液中有很强的运动能力，使偶联至磁珠的抗体可与细胞悬浮液持续进行相互作用。当置于磁场中时，微珠会轻轻地将靶细胞牵引至管壁。，可以轻松快速地倒出或吸走包含非靶细胞的上清液。
在本发明一实施方式中，所述第一缓冲溶液为pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液。进一步优选为pH＝7.4-8.0的磷酸钠缓冲液。
在本发明另一实施方式中，所述第一缓冲溶液为pH＝7.6-9.5的硼酸钠缓冲液。
所述孵育是在晃动条件下进行，例如可以是摇床或旋转仪中进行，以增加各原料的混合、反应程度。
优选地，步骤(a)中，所述CD27抗体与所述负载磁珠的加入比例为(150-300μg):(4×107个)。
优选地，步骤(a)中，所述封闭剂包括牛血清白蛋白(BSA)、甘氨酸、赖氨酸和精氨酸中的一种或多种。
进一步优选地，所述封闭剂为BSA。
优选地，所述封闭剂在所述避光孵育液中的浓度为0.01-0.1％(w/v)。
本申请中，所述第二缓冲溶液主要是对孵育完成后的反应液(含CD27抗体包被磁珠、游离磁珠)进行清洗、纯化。其中，BSA的作用是进一步封闭负载磁珠上的位点；EDTA主要是排除溶液中的大部分过渡金属元素离子(如铁(III)，镍(II)，锰(II)等)，以免影响磁珠与磁铁的结合。
优选地，所述第二缓冲溶液中，EDTA的浓度为0.5-5mM；BSA的浓度为0.02-0.2％(w/v)。例如，第二缓冲溶液中，EDTA的浓度可以是为0.5、1、1、5、2、2。5、3、4或4.5mM；BSA的质量体积浓度可以为0.02％、0.04％、0.06％、0.1％、0.15％或0.2％(w/v)。
进一步优选地，所述第二缓冲溶液中，EDTA的浓度为2mM；BSA的浓度为0.1％(w/v)。
优选地，所述人外周血单个核细胞(PBMC)是采用如下方法分离获得：
从抽取的患者血液中采集外周血单个核细胞，经密度梯度离心分离后取中间层细胞，采用生理盐水或磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤，得到PBMC。
具体地，采集患者血液并稀释；倾斜装有细胞密度梯度分离液的离心管，并沿管壁缓慢加入稀释后的患者血样，使血样覆盖于细胞密度梯度分离液之上；将装样的离心管在离心锂为200-500g下离心15-30min；
之后取出离心管，吸去最上层血浆，中间层即为外周血单核细胞层，并将其转移至新的离心管中保存。
本发明提供的高抗癌活性T细胞的筛选方法，主要是使用CD27抗体包被磁珠对目标细胞群的筛选富集，该方法简便易操作，成本低，便于得到离体生长情况好、再刺激扩增性强、肿瘤杀伤能力高且持久的高品质细胞免疫产品；所采用的磁珠可以简便去除，对T淋巴细胞的损伤小，不影响后续制备细胞免疫产品；可以进行规模化生产。
第二方面，本发明提供一种CD27抗体包被磁珠或如第一方面所述的筛选方法在免疫细胞治疗中的应用。
本申请的有益效果：
1、首次将CD27抗体包被磁珠用于筛选得到高抗癌活性T细胞，所述筛选方法简便易操作，成本低，筛选效率高；所采用的磁珠可以简便去除，对T淋巴细胞的损伤小，不影响后续制备细胞免疫产品；可以进行规模化生产；
2、比未经筛选的PMBC细胞或经其他CCR7，CD62L免疫磁珠筛选得到的T细胞而言，本发明筛选得到的CD27阳性T细胞中，杂质细胞少，细胞离体生长情况好、再刺激扩增性强，回输人体后具有持久高效的肿瘤杀伤能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
图1为本发明中CD27抗体包被磁珠来筛选高抗癌活性T细胞(CD27阳性目标细胞亚群)的示意图；
图2为本发明实施例提供的筛选方法得到的T细胞与未经筛选的人外周血单个核细胞(PBMC)的离体生长情况的对比；
图3为本发明实施例提供的筛选方法得到的T细胞与未经筛选的人外周血单个核细胞(PBMC)的再刺激扩增情况的对比；
图4为经本发明实施例提供的筛选方法得到的T细胞与未经筛选的PBMC细胞在小鼠肿瘤模型中对小鼠寿命的延长作用的结果对比。
具体实施方式
以下所述是本发明的可选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
以下为本发明实施例中所使用的试剂如下：
[1]M-450Epoxy可负载型磁珠，赛默飞世尔公司，货号：14011；
[2]高纯度抗人CD27抗体，Biolegend公司，货号：302802；
[3]Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液，GE公司，货号：17-1440-02；
[4]X-VIVO 15无血清血细胞专用培养基，Lonza公司，货号：04-744Q；
[5]磷酸盐缓冲液(PBS)，Gibco公司，货号：10010023；
[6]PE-Cy7anti-human CD27Antibody，PE-Cy7荧光标记鼠抗人CD27抗体，Biolegend公司，货号：356412；
[7]FITC anti-human CD3Antibody，FITC荧光标记鼠抗人CD3抗体，Biolegend公司，货号：300406；
[8]CellTraceTMCFSE Cell Proliferation Kit，羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)，Invitrogen公司，货号：C34554。
实施例1
一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，包括以下步骤：
(一)CD27抗体包被磁珠的制备：
1.1取1mL的粒径为4.5μm的M-450Epoxy可负载型磁珠(以下简称“磁珠”)(4千万粒/mL)，将其置于磁力架上静置1min，弃去上清，并将试管从磁力架上取出；
1.2加入1mL的第一缓冲溶液(pH＝8.0的磷酸钠缓冲液)重复清洗2次；
1.3将磁珠重悬在第一缓冲溶液中，加入200μg的CD27抗体，控制总体积为1mL，充分混合；
1.4将所得混合溶液于20℃下置于摇床或旋转仪上轻轻晃动，避光孵育20小时；
1.5然后加入牛血清白蛋白(BSA)，控制其在所得避光孵育液中的浓度为0.02％(w/v)，再于20℃下孵育15min；
1,6待孵育完成后，将装样的试管置于磁力架上静置1min，弃去上清，并将试管从磁力架上取出；
1.7配制第二缓冲溶液，其为含0.1％BSA(w/v)和2mM EDTA、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，其中；向上述试管中加入适量第二缓冲溶液，混匀，轻轻晃动，室温孵育5min，以实现对磁珠的清洗；
1.8重复上述1.6-1.7的步骤2-3次；
1.9将试管从磁力架上取出，重悬于1mL的第二缓冲溶液中，完成CD27抗体包被磁珠制备。
(二)PBMC细胞(人外周血单个核细胞)的分离
2.1通过单采等方法获得患者血液(或者由医院或血站等血液提供单位完成)；将获得的单采血液，与PBS混匀，拧紧管盖，轻缓颠倒混匀6次,放置于管架，得到稀释过的血样；
2.2倾斜装有细胞密度梯度分离液(Ficoll-paque PREMIUM)的离心管，沿管壁缓慢加入上述稀释过的血样，血样覆盖于分离液上，注意避免分离液层与血样层混合；
2.3将装样的管放入离心机中，设置离心力400g，温度18℃，离心时间30min，关闭刹车功能，开始离心；
2.4取出离心管，吸去最上层血浆，小心地保留中间单个核细胞(PBMC)层，将中间的单个核细胞层转移到新的离心管，注意每个50ml离心管最多转入10ml。
(三)采用流式细胞术检测CD3和CD27双阳性细胞的比例
3.1取上述分离后的PBMC细胞100万个，以100μL的X-VIVO 15无血清培养基重悬；
3.2加入PE-Cy7荧光标记的鼠抗人CD27抗体与FITC荧光标记的鼠抗人CD3抗体，在4℃下孵育30min；
3.3对孵育后的细胞使用流式细胞仪检测，得到其中CD3与CD27双阳性细胞占总细胞数的百分比。
(四)使用CD27抗体包被磁珠筛选CD27阳性目标细胞亚群
4.1取上述分离后的单个核细胞1亿个，以20mL的X-VIVO 15无血清血细胞专用培养基来重悬，并倒入50mL试管中；
4.2取步骤1.9中获得的CD27包被磁珠，根据3.3步骤中测定的CD3+CD27+双阳细胞的比例，按照包被磁珠与双阳性的个数比为3:1的比例添加CD27包被磁珠，轻柔混匀；
4.3将试管放入37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱，静置培养55-60分钟；
4.4培养结束后，将装样的试管放于磁力分离架上，静置1分钟；
4.5吸去试管内上层液体，并弃掉，尽量不要吸走被磁力架吸附于试管璧的细胞，之后将试管从磁力架上移走；
4.6加入10mL的X-VIVO 15无血清血细胞专用培养基，来重悬细胞与磁珠，得到筛选后的含CD27阳性目标细胞亚群的磁珠混悬液，即，含高抗癌活性T细胞的磁珠混悬液。
实施例2
一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，包括以下步骤：
(一)CD27抗体包被磁珠的制备：
1.1取1mL的粒径为10μm的M-450Epoxy可负载型磁珠(以下简称“磁珠”)(4千万粒/mL)，将其置于磁力架上静置1min，弃去上清，并将试管从磁力架上取出；
1.2加入1mL的第一缓冲溶液(pH＝8.4的硼酸钠缓冲液)重复清洗3次；
1.3将磁珠重悬在第一缓冲溶液中，加入300μg的CD27抗体，控制总体积为1mL，充分混合；
1.4将所得混合溶液于18℃下置于摇床或旋转仪上轻轻晃动，避光孵育24小时；
1.5然后加入牛血清白蛋白(BSA)，控制其在所得避光孵育液中的浓度为0.02％(w/v)，再于25℃下孵育30min；
1,6待孵育完成后，将装样的试管置于磁力架上静置1min，弃去上清，并将试管从磁力架上取出；
1.7配制第二缓冲溶液，其为含0.02％BSA(w/v)和0.5mM EDTA、pH＝7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)，其中；向上述试管中加入适量第二缓冲溶液，混匀，轻轻晃动，室温孵育5min，以实现对磁珠的清洗；
1.8重复上述1.6-1.7的步骤2-3次；
1.9将试管从磁力架上取出，重悬于1mL的第二缓冲溶液中，完成CD27抗体包被磁珠制备。
(二)PBMC细胞(人外周血单个核细胞)的分离：操作步骤同实施例1。
(三)采用流式细胞术检测CD3和CD27双阳性细胞的比例
3.1取上述分离后的单个核细胞100万个，以100μL的X-VIVO 15无血清培养基重悬；
3.2加入PE-Cy7荧光标记的鼠抗人CD27抗体与FITC荧光标记的鼠抗人CD3抗体，在4℃下孵育30min；
3.3对孵育后的细胞使用流式细胞仪检测，得到其中CD3与CD27双阳性细胞占总细胞数的百分比。
(四)使用CD27抗体包被磁珠筛选CD27阳性目标细胞亚群
4.1取上述分离后的单个核细胞0.5亿个，以20mL的X-VIVO 15无血清血细胞专用培养基来重悬，并倒入50mL试管中；
4.2取步骤1.9中获得的CD27包被磁珠，根据3.3步骤中测定的CD3+CD27+双阳细胞的比例，按照包被磁珠与双阳性的个数比为4:1的比例添加CD27包被磁珠，轻柔混匀；
4.3将试管放入37℃、5％二氧化碳的细胞培养箱，静置培养40分钟；
4.4培养结束后，将装样的试管放于磁力分离架上，静置1分钟；
4.5吸去试管内上层液体，并弃掉，尽量不要吸走被磁力架吸附于试管璧的细胞，之后将试管从磁力架上移走；
4.6加入20mL的X-VIVO 15无血清血细胞专用培养基，来重悬细胞与磁珠，得到筛选后的含CD27阳性目标细胞亚群的磁珠混悬液，即，含高抗癌活性T细胞的磁珠混悬液。
实施例3
一种CD27抗体包被磁珠的制备方法，包括以下步骤：
1.1取1mL的粒径为50-100μm的M-450Epoxy可负载型磁珠(以下简称“磁珠”)(4千万粒/mL)，将其置于磁力架上静置1min，弃去上清，并将试管从磁力架上取出；
1.2加入1mL的第一缓冲溶液(pH＝9.0的Tris-盐酸缓冲液)重复清洗3次；
1.3将磁珠重悬在第一缓冲溶液中，加入150μg的CD27抗体，控制总体积为1mL，充分混合；
1.4将所得混合溶液于35℃下置于摇床或旋转仪上轻轻晃动，避光孵育16小时；
1.5然后加入牛血清白蛋白(BSA)，控制其在所得避光孵育液中的浓度为0.02％(w/v)，再于35℃下孵育10min；
1,6待孵育完成后，将装样的试管置于磁力架上静置1min，弃去上清，并将试管从磁力架上取出；
1.7配制第二缓冲溶液，其为含0.2％BSA(w/v)和5mM EDTA、pH＝8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)，其中；向上述试管中加入适量第二缓冲溶液，混匀，轻轻晃动，室温孵育6min，以实现对磁珠的清洗；
1.8重复上述1.6-1.7的步骤2-3次；
1.9将试管从磁力架上取出，重悬于1mL的第二缓冲溶液中，完成CD27抗体包被磁珠制备。
图1为本申请中采用CD27抗体包被磁珠来筛选CD27阳性目标细胞亚群示意图。所述CD27抗体包被磁珠，可以与T细胞表面的CD27发生抗原抗体结合，之后在磁场的作用下，CD27磁珠与将表达CD27的T细胞(幼稚型与记忆型T细胞，即目标细胞亚群)一起发生定向迁移，从而与不表达CD27的杂质细胞(如B淋巴细胞以及效应记忆型、效应型T细胞)进行分离。分离后的CD27阳性细胞即可作为高品质的细胞免疫产品。
为了评估本发明提供的筛选方法得到的T细胞与未经筛选的人外周血单个核细胞(PBMC)的离体生长情况、扩增速度和肿瘤杀伤能力，选用人来源的血液进行外周血单个核细胞分离、CD27抗体包被磁珠法分离T淋巴细胞等步骤，最后将所得的CD27阳性T淋巴细胞做体外细胞培养实验，同时设置未经CD27抗体包被磁珠筛选的对照组，分别进行以下实验：
1、评估细胞生长情况：
将经过CD27抗体包被磁珠筛选后所得的阳性T淋巴细胞与未经筛选的人外周血单个核细胞(PBMC)，按106/mL的浓度接种，在37℃，5％CO2下连续培养21天，每3天进行半量换液，通过LUNA自动细胞计数仪来检测细胞的生长情况，结果如附图2所示。
2、评估细胞增殖情况：
将经过CD27磁珠阳性筛选的T淋巴细胞与未经CD27免疫磁珠筛选的人外周血单个核细胞(PBMC)，按106/mL的浓度接种，并按照磁珠与细胞的比例为3:1的比例，加入CD3/CD28磁珠(购买自thermo-fisher公司，货号40203D)进行刺激，在37℃，5％CO2下培养5天后，通过CFSE流式细胞仪检测法来检测细胞增殖情况，结果如附图3所示。
3、小鼠体内评估细胞杀伤情况：
首先构建Nalm6小鼠肿瘤模型，选取15只6-10周龄的免疫缺陷小鼠进行尾静脉注射1×106个Nalm6肿瘤细胞，在注射后的第7天，随机分成三组，每组5只，筛选组为通过尾静脉注射2×106个经过CD27磁珠筛选得到的阳性T淋巴细胞，未筛选组为尾静脉注射2×106个未经筛选的PBMC细胞，阴性对照组为不注射免疫T细胞的小鼠组，采用小鼠三维成像系统观察小鼠肿瘤情况，并记录小鼠死亡情况，结果如附图4所示。
图2、图3为经过本发明实施例提供的筛选方法得到的T细胞与未经筛选的人外周血单个核细胞(PBMC)的离体生长情况与再刺激扩增情况的对比。图2中的生长测试图中，三角形的点构成的曲线代表筛选组，方块形状的点构成的曲线代表未筛选组；其中，x轴代表细胞培养时间，y轴代表细胞扩增倍数，星号*表示生长情况具有统计学差异(n＝6)。图3中，上方曲线代表未筛选组，下方曲线代表筛选组；其中x轴代表CFSE的荧光强度，y轴为细胞数目，x轴越偏左则说明扩增性越好。
图2和图3的结果表明，经过本发明实施例提供的筛选方法得到的T细胞，在生长情况与靶细胞刺激下的扩增情况，均优于未经筛选的细胞。
图4中x轴代表饲养时间(天)，y轴代表小鼠存活率(％)，曲线下移代表有小鼠死亡。在未接受免疫细胞治疗的小鼠肿瘤模型中(阴性对照组)，小鼠在20天内全部死亡，而未经筛选组(方块型的点构成的虚线)在饲养30天后开始有部分小鼠死亡，55天后小鼠全部死亡。筛选组(三角型的点构成的实线)中，小鼠在饲养60天内仍大部分存活，存活率达到90％。图4的结果表明，相较于比未筛选的PBMC细胞而言，经过本发明实施例提供的筛选方法所得的T淋巴细胞，可以起到更好的保护小鼠免于因肿瘤导致的死亡。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种高抗癌活性T细胞的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供CD27抗体包被磁珠；提供分离的人外周血单个核细胞；
(2)检测CD3和CD27双阳性细胞的比例：
将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞重悬在X-VIVO 15无血清培养基中，得到第一细胞重悬液；向所述第一细胞重悬液中加入第一荧光染料标记的鼠抗人CD27抗体与第二荧光染料标记的鼠抗人CD3抗体，孵育15-50min，采用流式细胞仪检测所述孵育后的细胞中CD3与CD27双阳性细胞的百分比；
(3)使用CD27抗体包被磁珠筛选CD27阳性目标细胞亚群：
将步骤(1)中分离出的人外周血单个核细胞，采用X-VIVO 15无血清培养基重悬，得到第二细胞重悬液；根据所述CD3和CD27双阳性细胞的比例，将所述CD27抗体包被磁珠按照与双阳性细胞个数比为(2-5):1的比例加入到所述第二细胞重悬液中，混匀后，置于细胞培养箱中培养40-60min；
将所得培养混合液在施加磁场的情况下静置，弃去上清液，并撤去磁场；之后加入X-VIVO 15无血清培养基重悬，得到含CD27阳性目标细胞亚群的磁珠混悬液，即，含高抗癌活性T细胞的磁珠混悬液。
2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，在所述步骤(3)之后，还包括以下步骤：
对所述含CD27阳性目标细胞亚群的磁珠混悬液采用移液管反复吹打10-15次，并置于有磁场的情况下静置，弃去上清液，得到去除磁珠的CD27阳性目标细胞亚群，即高抗癌活性T细胞。
3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述CD27抗体包被磁珠是采用以下方法制得：
a、将负载磁珠采用pH为6.0-10.0的第一缓冲溶液进行洗涤、重悬，向重悬后的负载磁珠中加入抗人CD27抗体，在18-37℃下避光孵育16-24h；向所得避光孵育液中加入封闭剂，以封闭掉磁珠上未结合抗体的位点，之后再孵育10-30min，得到含CD27抗体包被磁珠的反应液；
b、对所述反应液静置，弃去上清液，对所得CD27抗体包被磁珠采用第二缓冲溶液进行清洗数次，并重悬于所述第二缓冲溶液，得到纯化后的CD27抗体包被磁珠，其中，所述第二缓冲溶液为含有牛血清白蛋白和EDTA的pH＝7.0-8.0的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(a)中，所述CD27抗体与所述负载磁珠的加入比例为(150-300μg):(4×107个)。
5.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤(a)中，所述封闭剂包括牛血清白蛋白、甘氨酸、赖氨酸和精氨酸中的一种或多种；所述封闭剂在所述避光孵育液中的质量体积浓度为0.01-0.1％。
6.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述第二缓冲溶液中，EDTA的浓度为0.5-5mM；牛血清白蛋白的质量体积浓度为0.02-0.2％。
7.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述负载磁珠包括粒径1nm-500μm的普通磁珠。
8.如权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，所述负载磁珠为M-450Epoxy磁珠，其粒径为2-10μm。
9.如权利要求1-8任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述第一荧光染料为藻红蛋白或藻红蛋白-菁类染料7；第二荧光染料为异硫氰酸荧光素。
10.如权利要求1-9任一项所述的筛选方法或CD27抗体包被磁珠在免疫细胞治疗中的应用。
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