CN102405280A

CN102405280A - 重新设定的多能干细胞的制备

Info

Publication number: CN102405280A
Application number: CN201080012939XA
Authority: CN
Inventors: 西尔乌维·伊泰斯库
Original assignee: Medvet Science Pty Ltd
Current assignee: Angioblast Systems Inc
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2030-03-22
Also published as: WO2010105311A1; EP2408904B1; CA2755870A1; US9487756B2; JP6603529B2; CN102405280B; HK1252414A1; JP2012520660A; US20170037377A1; EP3293257B1; ES2900277T3; SG174426A1; JP6342115B2; JP2018068307A; KR101764437B1; US20120121548A1; EP2408904A4; AU2010225469A1; CA2755870C; KR20120000079A

Abstract

本发明提供一种制备重新设定的细胞的方法，所述方法包括在足以重新设定细胞的条件下，将Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞暴露于一个或多个潜能决定因子。本发明还提供通过这种方法制备的细胞及其分化型细胞，以及这些细胞的各种应用。

Description

重新设定的多能干细胞的制备

技术领域

本发明涉及多能干细胞(pluripotent cell)及其制备方法。

背景技术

据称胚胎干(Embryonic stem)(ES)细胞在保持多能性(pluripotency)的同时可以无限期地生长，并能分化成具有全部三个胚层即中胚层、内胚层和外胚层的细胞(Evans&Kaufman，Nature 292：154-156(1981))。人类ES细胞和由其衍生的细胞目前正被评估用于治疗宿主疾病如帕金森氏症、脊髓损伤和糖尿病。然而，事实上从人类胚胎中获得人类ES细胞引起了一些备受争议的伦理性考量，在许多国家这些细胞的衍生是法律所禁止的。此外，由于ES细胞和由其衍生的细胞表达衍生它们的个体中的抗原，如果施用于不匹配(例如，不能表达相似的HLA型)的个体，那么这些细胞将有被拒绝的风险。因此，科学家们已经开始寻求技术解决方案，避免用目前的方法生成ES细胞。实现这些解决方案的一个理想的方式是直接从产后个体的体细胞中生成多能干细胞，例如直接从待处理的或相关的或其他相匹配的个体中生成。

重新设定体细胞的方法之一涉及到将细胞的核内容物转移至卵母细胞中(Wilmut et al，Nature 385：810-813(1997))，或通过与ES细胞融合(Cowan et al，Science 309：1369-1373(2005))，这表明未受精的卵细胞和ES细胞中含有赋予体细胞全能性或多能性的因子。这些方法的难点包括对卵子和/或胚胎的破坏要求，这在一些国家可能引起伦理性考量。

虽然多能性的转录决定(transcriptional determination)未被完全弄明白，几种转录因子，包括Oct 3/4(Nichols et al.Cell95：379-391(1998))、Sox2(Avilion et al，Genes Dev.17：126-140(2003))和Nanog(Chambers et al，Cell 113：643-655(2003))都参与维持ES细胞的多能性；然而，没有一个能足以单独确定ES细胞的特性。

最近，Takahashi和Yamanaka向在适合小鼠ES细胞培养的条件下培养的小鼠ES细胞和小鼠成纤维细胞中引入了四种因子(即Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)。然后转导入这两种细胞类型，作者获得了诱导的多能干(induced pluripotent stem)(iPS)细胞，其表现出小鼠ES细胞的形态和生长特性，并表达了小鼠ES细胞标记基因(Takahashi&Yamanaka，Cell 126：663-676(2006))。将iPS细胞皮下移植到裸鼠的结果是产生了含有来自所有三个胚层各种组织的肿瘤。在注射到囊胚后，iPS细胞促进了小鼠胚胎发育。这些数据表明，采用逆转录病毒转导，通过只加入少量确定的因子，多能干细胞可直接从小鼠成纤维细胞培养物中产生。然而，这种技术存在一些重大的缺点，包括重新设定率低(大大低于处理细胞的1％)，需要基因整合和致癌基因c-Myc和Klf4的持续表达。这些基因的表达可能导致受体的细胞或由其衍生的细胞中产生肿瘤。在这方面，使用由这些方法产生的iPS细胞制备的嵌合体小鼠可产生肿瘤，推测可能是由于这些致癌基因的持续表达。因此，在该领域研究的主要目标是建立重新设定的方法，要么不要求对编码这些因子的核酸进行基因整合，要么最大限度地减少这些和其他重新设定因子的表达数量或时间。

大多数基于iPS细胞的研究使用成纤维细胞，主要是由于它们在基于融合的重新设定研究中容易衍生和广泛使用，各种细胞群已经在小鼠中而不是成纤维细胞用于诱导iPS细胞。这些研究中一个重要发现是，所选的体细胞类型对iPS细胞生成效率和重新设定的水平有显著的作用。在这方面，一些细胞类型，如神经干细胞、胃细胞和肝细胞，与成纤维细胞相比，表现出相对较高的重新设定效率。然而，由于组织收集的侵入性质和/或有限的捐助者样品，从人体中分离这些细胞有困难或不可行。一些更易于获得的细胞类型(例如，肌肉细胞或分化的造血干细胞)已被用来作为iPS研究，然而重新设定的成功率很有限。

因此，在该领域需要确定容易获得最佳细胞类型，以便于进行高效的重新设定。确定具有高效重新设定特性的这种细胞类型，将有助于使用无需基因整合和/或最小化或减少重新设定因子数量的重新设定方法。这将产生更安全的多能性iPS细胞群，其降低了肿瘤转化的风险。这种高效重新设定且不依赖胚胎组织获得的细胞类型，将适合应用于已经预期存在的多能性ES细胞。

发明内容

尽管传统观念认为许多组织来源都不适合高效制备iPS细胞，但在从事本发明的工作中，发明人试图使用各种来源的细胞产生iPS细胞。令人惊讶的是，本发明人发现，Stro-1⁺多能细胞(multipotential cell)或及其子代细胞(尤其是来源于脂肪组织或牙髓组织的细胞)是高效产生iPS细胞的有用来源，例如，效率高于成纤维细胞。

本发明人还确定，Stro-1⁺多能细胞及其子代细胞表达内源因子，其通常需要进行外源性补充以重新设定成纤维细胞来制备iPS细胞，例如，Klf4和/或c-myc。这种内源基因的表达可能会使得制备iPS细胞时根本无需引入高水平的这类蛋白，或无需引入这些非内源形式的蛋白。c-myc的内源表达可能也有利于制备肿瘤发生风险降低的iPS细胞，因为他们可能不需要构建该致癌基因和/或该致癌基因的强烈表达。

本发明的一个实施例提供了一种制备重新设定的细胞的方法，该方法包括在足以重新设定细胞的条件下，将Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞暴露于一个或多个潜能决定因子，培养所述暴露的细胞获得重新设定的细胞。这种方法同样适用于制备诱导的多能干(iPS)细胞。

本发明的另一个实施例提供了一种制备重新设定的细胞的方法，所述方法包括在足以重新设定细胞的条件下，将富含Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞的细胞群暴露于一个或多个潜能决定因子。

Stro-1⁺多能细胞的来源可以是这些细胞原位所在的任何组织。优选地，Stro-1⁺多能细胞的来源是脂肪组织或牙髓组织。Stro-1⁺多能细胞的另一个来源是骨髓。

在一个实施例中，在暴露于一个或多个潜能决定因子之前，Stro-1⁺多能细胞或其子代细胞富含于脂肪组织、牙髓组织、骨髓，或的其它部位(site)。

在一个实施例中，本发明的方法包括培养所述暴露的细胞获得重新设定的细胞，其比Stro-1⁺多能细胞或其子代细胞具有更广泛的分化能力，即与Stro-1⁺多能细胞或其子代细胞相比，其能分化出更广的细胞谱系和/或细胞类型。

示例性的潜能决定因子包括但不限于，单独地或共同地选自下组的因子：Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、Lin28、c-Myc、bFGF、SCF、TERT、SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Fbx15、Eras、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、ECAT1、ESG1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fthl17、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、FoxD3、ZNF206、Mybl2、DPPA2、Otx2和Grb2或者对一个或多个所述因子具有相同或相似活性的化合物，例如其活性片段或小分子。其它示例性的潜能决定因子为化学品、肽、siRNA、shRNA或微RNA，例如，如前所述。例如所述一个或多个潜能决定因子单独地或共同地选自下组：

(i)Oct4；

(ii)Oct4和Sox2的组合；

(iii)Oct4、Sox2，及Nanog和Lin28中至少一个的组合；

(iv)Oct4、Klf4和c-Myc的组合；

(v)Oct4、Sox2和Klf4的组合；

(vi)Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合；

(vii)Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的组合；

(viii)Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28的组合；以及

(ix)(i)至(x)中的任一项与化学品、肽、siRNA、shRNA或微RNA的组合。

优选地，所述潜能决定因子为Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。

在本发明方法的一个实施例中，所述Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞从产后的个体中获得。根据该实施例，该方法还可以包括从所述个体中获得或分离Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞。

优选地，所述个体为哺乳动物和/或所述细胞是哺乳动物的细胞。示例性的哺乳动物个体包括但不限于：人、灵长类动物、禽畜(如羊、牛、马、驴、猪)、宠物动物(如狗、猫)、实验室试验动物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养野生动物(如狐狸、鹿)。优选地，所述哺乳动物是人或灵长类动物。更优选地，所述哺乳类动物是人。

在本发明的一个实例形式中，将所述Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞暴露于一个或多个潜能决定因子包括将包含编码能可操作地将连接到启动子的一个或多个潜能决定因子的序列的核酸引入Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞中。编码核酸的多个潜能因子能够彼此明显区分或在单独的核酸中，例如在单独表达的载体中，该载体包括多个核酸，每个核酸连接一个独立的启动子或每个核酸连接一个单独的启动子，例如在多-顺反子载体中。优选地，所述核酸包含在载体中，更优选地，该载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体或腺病毒载体。

在本发明的一个实施例中，所述核酸没有整合到Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞的基因组中。例如，所述核酸仍作为一个或多个游离体存在于细胞内和/或最终被细胞排泄掉。

优选地，本发明的方法的结果是制备了多能细胞(multipotentcell)或多能干细胞或全能细胞，更优选地，制备多能干细胞。在一个实施例中，重新设定的细胞(i)能表达选自下组的细胞标记物：Oct-4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81；(ii)具有多能干细胞的形态特征；和(iii)当被引入到免疫缺陷(immunocompromised)的动物中时，形成畸胎瘤。

在另一个实施例中，本发明的方法还包括将重新设定的细胞分化成包含或富有所需细胞类型的细胞群。本发明的方法还可以包括分离、富集或筛选所需的细胞类型。这种细胞可用于治疗或进行筛查，如本文所描述。或者，这种分化的细胞可用于研究疾病状态或病症(condition)，例如多能干细胞是否产生于患有所述病症的个体。

在另一个实施例中，本发明的方法包括将有效量的根据本文任一实施方案所描述方法制备的细胞与药用载体或赋形剂制成药物组合物。

在另一个实施例中，本发明提供了一种细胞或细胞群，或由本文所述任一实施方案制备的富含重新设定的细胞的细胞群。类似地，本发明一个示例性实施方案提供了一种分化自本文任一实施方案所述细胞和细胞群的细胞和细胞群。

本发明的另一个实施例提供Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞，其包含编码能可操作地连接到异源启动子的潜能决定因子的核酸。所述细胞用于制备重新设定的细胞。

通过实施本文所描述的任一实施方案所制备的细胞可用于药物中，例如用于治疗或预防疾病(disease)或失调(disorder)的方法中，该方法包括对有需要的个体施用该细胞或细胞群。

通过实施本文所描述的任一实施方案所制备的细胞可用于进行筛查。例如，本发明提供一种筛查用于治疗或预防疾病或失调的化合物的方法，该方法包括将本发明的细胞或群暴露于所述化合物。

例如，本发明还提供一种鉴定调控(direct)多能干细胞分化的化合物的方法，该方法包括：

i)使本发明制备的多能干细胞或细胞群与受试化合物接触，测定由其分化的细胞的量；

ii)在不存在所述化合物时，测定由本发明制备的多能干细胞或细胞群分化的细胞的量，

其中，(i)与(ii)相比，增加的分化细胞的量表明该化合物调控了多能干细胞的分化。

优选地，该方法包括测定一种或多种不同分化细胞类型的量。以这种方式测定了调控分化成特定谱系或细胞类型的化合物。

在本发明前文的基础上，本领域技术人员容易获知本发明还提供一种用于鉴定能降低或阻止多能干细胞分化的化合物方法。

本发明还提供一种鉴定或分离用于治疗病症的化合物的方法，该方法包括：

(i)实施本文所述任一实施方案的方法，从患有所述病症的个体中制备多能干细胞或细胞群；和

(ii)将所述细胞或细胞群与受试化合物接触，测定其对所述病症的一种或多种症状的效果，其中能改善或缓解所述病症的症状的化合物可用于治疗所述病症。

在一个实施例中，该方法包括：

(a)将多能干细胞或细胞群分化成为受病症影响的细胞；和

(b)将(a)中的细胞与受试化合物接触，并确定其对所述病症一个或多个症状的效果，其中能改善或缓解病症症状的化合物能用于治疗所述病症。

这种方法不仅可以用于鉴定或分离能治疗病症的新化合物，还可以鉴定一个个体是否易于对已有的治疗型/预防型化合物的治疗产生应答。

当该化合物暴露于一个或多个靶组织时，这种方法也可以进一步用于鉴定化合物的任何特定的毒性作用，所述靶组织是成熟的、已分化并源自重新设定的Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞。

优选实施方案详述

概述

纵观本发明，除非另有说明或文意另有所指外，参照一个步骤、物质的组成、步骤组或物质组成的组应包含一个和多个(即一个或多个)那些步骤、物质组成、步骤组或物质组成的组。除非另有说明，本文中所述的各实施方案作适当变动(mutatis mutandis)可用于其它各个以及每个实施方案。

本领域技术人员应知道，除了那些具体描述的，可对本文中所述的发明进行修改和改进。应理解本发明包括所有这些修改和改进。本发明还包括说明书中单独(individually)或共同(collectively)提及的或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意或所有组合或任意两个或两个以上的所述步骤或特征。

本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围，它们仅是出于例举的目的。本文中所述的功能相同的产品、组合物和方法，显然在本发明的范围内。

本发明没有不当使用实验，除非另有说明，采用分子生物学、微生物学、病毒学、DNA重组技术、溶液中肽合成、固相多肽合成和免疫学的常规技术。这些方法描述于，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第二版(1989)，I、II和DI全卷(whole of VoIs I，II，和DI)；DNA克隆：操作方法(DNACloning：A Practical Approach)，I和II卷(Vols.I和II)(D.N.Glover编，1985)，IRL Press，Oxford，全文；寡核苷酸合成：操作方法(Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach)(M.J.Gait编，1984)IRL Press，Oxford，全文，特别是Gait的论文，1-22页；Atkinson等，35-81页；Sproat等，83-115页；Wu等，135-151页；4.核酸杂交：操作方法(Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach)(B.D.Hames&S.J.Higgins编，1985)IRL Press，Oxford，全文；固定化细胞和酶：操作方法(Immobilized Cells and Enzymes：A Practical Approach)(1986)IRLPress，Oxford，全文；Perbal，B.，分子克隆操作指南(A Practical Guideto Molecular Cloning)(1984)；酶学方法(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)，全系列；J.F.RamalhoOrtigao，访问虚拟实验室网站的知识数据库中的“多肽合成化学”(″The Chemistry of Peptide Synthesis″In：Knowledge database ofAccess to Virtual Laboratory website)(Interactiva，Germany)；Sakakibara，D.，Teichman，J.，Lien，E.Land Fenichel，R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield，R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154；Barany，G.和Merrifield，多肽中的R.B.(1979)(R.B.(1979)in The Peptides)(Gross，E.和Meienhofer，J.eds.)，卷2，1-284页，Academic Press，New York.12.Wünsch，E.编(1974)Synthese vonPeptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Müler，E.，ed.)，卷15，4th edn.，第1和第2部分，Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.&Bodanszky，A.(1984)肽合成操作(ThePractice of Peptide Synthesis)，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25，449-474；免疫学实验手册(Handbook of Experimental Immunology)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，Blackwell Scientific Publications)；以及动物细胞培养：操作方法，第三版(Animal Cell Culture：Practical Approach，ThirdEdition)(John R.W.Masters编，2000)，ISBN 0199637970，全文。

选择的定义

“共同地”是指本发明包括任何数量的所述蛋白或标记物或蛋白或标记物的组或它们的组合，并且尽管该数量的蛋白或标记物或蛋白或标记物的组或它们的组合可能无法具体列于本文中，所附权利要求可以根据蛋白或标记物或蛋白或标记物的组的任意其它组合来分别地且分开地定义这些组合或子组合(sub-combinations)。

在本发明通篇中，除非文意另有所指，“包括/包含(comprise)”一词，或其变化形式如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，应被理解为包括了所述步骤或成分(element)或整体(integer)或步骤或成分或整体的组，但不排除任何其它步骤或成分或整体或成分或整体的组。

本文中使用的术语“源自”应表示可以从特殊来源获得特定的整体，虽然不一定直接从该来源获得。

本文中使用的术语“有效量”应表示，相比施用前相同的过程或状态和/或相比未施用该细胞的个体，用以改善生理过程或疾病状态或用来防止个体疾病状态的发生的重新设定的细胞(reprogrammedcells)或由其分化的细胞和/或其子代细胞的足够质量。

本文中使用的术语在细胞群中“富集的”应表示重新设定的细胞或多能干细胞的数量或百分比高于自然发生的细胞群中的数量或百分比。例如，在多能干细胞或重新设定的细胞中富集的细胞群是由至少约0.02％所述细胞组成的，或至少约0.05％所述细胞，或至少约0.1％所述细胞，或至少约0.2％所述细胞，或至少约0.5％所述细胞，或至少约0.5％所述细胞，或至少约0.8％所述细胞，或至少约1％所述细胞，或至少约2％所述细胞，或至少约3％所述细胞，或至少约4％所述细胞，或至少约5％所述细胞，或至少约10％所述细胞，或至少约15％所述细胞，或至少约20％所述细胞，或至少约25％所述细胞，或至少约30％所述细胞，或至少约40％所述细胞，或至少约50％所述细胞，或至少约60％所述细胞，或至少约70％所述细胞，或至少约80％所述细胞，或至少约85％所述细胞，或至少约90％所述细胞，或至少约95％所述细胞，或至少约97％所述细胞，或至少约98％所述细胞，或至少约99％所述细胞。

术语“暴露(expose)”及语法的等同物，例如“暴露(exposing)”应表示任何过程，通过该过程使细胞足够接近潜能决定因子以便该因子对细胞发挥生物作用。该术语应理解为包括但不限于，使细胞接触该因子和/或使细胞接触编码该因子的核酸和/或在胞内表达该因子的核酸。

“单独地(individually)”表示本发明分别地(seperately)包括所述蛋白或标记物或蛋白或标记物的组，并且尽管单独的蛋白或标记物或蛋白或标记物的组可能无法分别列于本文中，所附权利要求可以分别地且各自分开地定义这些蛋白或标记物或蛋白或标记物的组。

本文中使用的术语“iPS细胞”是指与起初它们各自的分化体细胞(例如，Stro-1⁺多能细胞或其子代细胞)的基因基本上相同且具有与较高潜能细胞(higher potency cells)的特征相似的细胞，如ES细胞。iPS细胞表现出的形态(即，圆形、核仁大和缺乏细胞质)和生长特性(即，倍增时间；ES细胞的倍增时间大约17～18小时)与ES细胞类似。此外，iPS细胞优选表达多能干细胞的特异性标记物(例如，Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81，但不表达SSEA-I)。然而，iPS细胞不是直接从胚胎中得到，它们可瞬时或稳定地表达一个或多个拷贝的所选潜能决定因子，至少直到它们成为多能干细胞。本文中使用的“不是直接从胚胎中得到”表示生成iPS细胞的起始细胞类型是非多能的Stro-1⁺多能细胞或从产后个体获得的其非多能的子代细胞。

本文中使用的术语“多能(细胞)(multipotent)”应理解为细胞能够分化成三个胚层(中胚层、内胚层和外胚层)中一个或两个或三个胚层的多个不同类型的细胞，优选三个胚层中的一个或两个胚层。

本文中使用的术语“多能干(细胞)(pluripotent)”应理解为细胞能够分化成三个胚层即内胚层、外胚层和中胚层之一的细胞。多能干细胞表达出各种多能干细胞的特异性标记物(例如，一个或多个以下多能干细胞的特异性标记物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60或TRA 1-81)，细胞形态的特征是未分化的细胞(即，紧凑的细胞群、高核质比和突出的核仁)，且当被引入到免疫缺陷的动物如SCID小鼠中时，形成畸胎瘤。畸胎瘤通常包含所有三个胚层的细胞或组织特点。本领域普通技术人员可采用本领域常用的技术来评价这些特点，参见例如，Thomson等，Science 282：1145-1 147(1998)。多能干细胞能够在细胞培养物中增殖，也能分化成多种具有多能特性的多种种系限制的细胞群。多能体细胞较多能干细胞表现出更加分化，但不是终末分化。因此，多能干细胞比多能细胞具有更高的潜能。

本文中使用的术语“潜能决定因子(potency-determining factor)”是指因子，如基因或其它核酸、其功能片段以及所编码的因子，例如，蛋白或其功能片段，或用于提高体细胞潜能的小分子或抗体，使之成为多能细胞、多能干细胞或全能细胞。潜能决定因子可任选地只短暂存在于重新设定的细胞中，或在核酸的情况下，可以转录活性状态或失活状态保存在重新设定的细胞的基因组中。同样，核酸潜能决定因子可以大于一个拷贝存在于重新设定的细胞中，所述潜能决定因子可整合至细胞的基因组中，可以是额外的染色体，或者可兼有两种形式。典型的潜能决定因子包括Oct4(典型的核苷酸和氨基酸序列在GenBank中的登录号为BC117435.1或NCBI登录号为NM 002701)、SOX2(典型的核苷酸和氨基酸序列在NCBI中的登录号为NM_0031060.2)、KLF4(典型的核苷酸和氨基酸序列在NCBI中的登录号为NM_004235.4)、NANOG(典型的核苷酸和氨基酸序列在NCBI中的登录号为NM_024865.2)、Lin28(典型的核苷酸和氨基酸序列在NCBI中的登录号为NM_024674.4)、c-Myc(典型的核苷酸和氨基酸序列在GenBank中的登录号为L16785.1)、bFGF、SCF、TERT、SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Fbx15、Eras、ECAT15-2、Tcl1、β-连锁蛋白、ECAT1、ESG1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fthl17、Sal14、Rex1(典型的序列在NCBI中的登录号为NM174900)、UTF1(典型的序列在NCBI中的登录号为NM 003577)、Stella(典型的序列在NCBI中的登录号为NM 199286)、Stat3、FoxD3(典型的序列在NCBI中的登录号为NM 012183)、ZNF206、Mybl2、DPP A2、Otx2和GRB2。本文中提供的登录号是2009年2月20日的。例如，采用数据库如NCBI或GenBank，熟练的技术人员可容易地确定本文中所述的其它潜能决定因子的结构。还包括与所述因子具有相同或类似活性的化合物。这类化合物包括能够增强或诱导重新设定的抗体或小分子，例如，组蛋白去乙酰酶抑制剂或DNA甲基化酶或其抑制剂。熟练的技术人员应能够确定合适的化合物，例如，采用本文中所述的方法，其中略去一个或多个潜能决定因子并评价一组受试化合物和/或使用Markoulaki等，Nature Biotechnology 27，169-171(2009)中描述的细胞和/或方法。

本文中使用的术语“潜能”应理解为细胞分化成大于一种细胞类型的能力。因此，具有更高潜能的细胞是比低潜能细胞能够分化成更多种细胞类型的细胞。

本文中使用的术语“预防性有效量”应理解为足够量的重新设定的细胞或由其分化的细胞和/或其子代细胞，以防止或抑制一种或多种临床疾病可检出症状的发病或延迟发病。

本文中使用术语“防止(prevent)”或“防止(preventing)”或“防止(prevention)”应理解为施用预防性有效量的细胞并停止或阻止或延迟或减轻至少一种临床疾病症状的发展。

本文中使用的“重新设定(reprogramming)”是指体细胞转化成去分化的(de-differentiated)细胞和/或多能细胞/多能干细胞/全能干细胞的过程，从而比它们所源自的细胞具有更高的潜能。优选地，重新设定的细胞是多能细胞、多能干细胞或全能细胞，更优选地，多能干细胞。术语“重新设定的(细胞)”是指已经去分化而成为多能细胞/多能干细胞/全能细胞的体细胞。

本文中使用的短语“Stro-1⁺多能细胞”应理解为能形成多能细胞集落(colony)的非造血Stro-1⁺和/或TNAP⁺祖(progenitor)细胞。本文中优选详细讨论了Stro-1⁺多能细胞。

本文中使用的术语“个体(subject)”应理解为任何包括Stro-1⁺细胞的个体，优选哺乳动物。典型的个体包括但不限于：人、灵长类动物、禽畜(例如羊、牛、马、驴、猪)、宠物动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养野生动物(例如狐狸、鹿)。优选哺乳动物是人或灵长类动物。最优选哺乳动物是人。

本文中使用的术语“全能(totipotent)”应理解为细胞能分化成三个胚层之一和胚外组织的细胞。

本文中使用的术语“治疗有效量”应理解为足量的重新设定的细胞或由其分化的细胞和/或其子代细胞，以减少或抑制临床疾病的一种或多种症状。

本文中所使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”应理解为施用治疗有效量的细胞并减轻或抑制临床疾病的至少一种症状。

Stro-1 ⁺ 多能细胞或子代细胞

Stro-1⁺多能细胞是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌肉、真皮及骨膜中发现的细胞；并能分化成生殖细胞系，如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。优选地，Stro-1⁺细胞来自骨髓、牙髓或脂肪组织，更优选来自牙髓或脂肪组织。因此，Stro-1⁺多能细胞能够分化成大量的细胞类型，包括但不仅限于，脂肪、骨、软骨、弹性组织(elastic)、肌肉和纤维结缔组织。具体的谱系提交(lineage-commitment)和这些细胞进入的分化途径取决于各种机械的影响和/或内源生物活性因子，如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件。因此Stro-1⁺多能细胞是非造血祖细胞，其分裂产生的子细胞是干细胞或会及时地不可逆地分化产生表型细胞的前体细胞。

在一个优选的实施方案中，Stro-1⁺多能细胞从个体，例如待治疗的个体或相关个体或不相关个体(不论是同种或不同种)样本中富集得到。这种富集可离体或体外进行。本文中使用的术语“富集(enriched)”、“富集(enrichment)”或它们的变化形式描述了细胞群，其中一种特定细胞类型的比例或一定数量特定细胞类型的比例，与未治疗的细胞群相比是增加的。

在一个优选的实施方案中，本发明中使用的细胞共同表达一种或多种单独地或共同地选自下组的标记物：TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺、CD45⁺、CD146⁺、3G5⁺或它们的组合。

优选地，STRO-1⁺细胞是STRO-1^亮(同STRO-1^bri)。优选地，STRO-1^亮细胞另外是一种或多种TNAP⁺、VCAM-1⁺、THY-1⁺、STRO-2⁺和/或CD146⁺。

在一个实施方案中，间质前体细胞是WO 2004/85630中定义的血管周围间质前体细胞。

被称为对于给定的标记物呈“阳性的”细胞可表达低(lo或暗淡的)或高(亮，bri)水平的所述标记物，这取决于存在于细胞表面的标记物的程度，该术语涉及荧光强度或细胞分选过程中使用的其它标记物。lo(或暗淡(dim)或暗(dull))和bri的区别应在所用待分类的特定细胞群的标记物背景(context)下理解。被称为对于给定的标记物呈“阴性的”细胞，不一定完全不存在于所述细胞中。该术语表示所述标记物被细胞以相对非常低的水平表达，且当被可检测地标记时其产生非常弱的信号，或检测不到高于背景(background)水平。

本文中使用的术语“亮”是指细胞表面的标记物当被可检测地标记时产生相对高的信号。在不希望受到理论的限制的同时，提出所述

“亮”细胞比样品中的其它细胞表达出更多的目标标记蛋白(例如受STRO-1识别的抗原)。例如，当用结合FITC的STRO-1抗体标记时，通过荧光激活细胞分类术(FACS)分析进行测定，STRO-1^bri细胞比非明亮细胞(STRO-1^暗淡/暗)产生更强的荧光信号。优选地，“亮”细胞构成至少约0.1％起始样品中含有的最明亮标记的骨骨髓单核细胞。在其它实施方案中，“亮”细胞构成至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1.5％或至少约2％起始样品中含有的最明亮标记的骨骨髓单核细胞。在一个优选的实施方案中，STRO-1^亮细胞相对于“背景”，即STRO-1^-细胞的STRO-1表面表达高出2个对数的表达。相比之下，STRO-1^暗淡和/或STRO-1^中等细胞比“背景”的STRO-1表面表达低出2个对数，通常约1个对数或更低的表达。

本文中使用的术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有亚型。例如，该术语包括肝亚型(LAP)、骨亚型(BAP)和肾脏亚型(KAP)。在一个优选的实施方案中，本文中使用的TNAP是指能够结合由杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子，所述杂交瘤细胞系在布达佩斯条约的规定下保藏于ATCC，保藏日期2005年12月19日，保藏号PTA-7282。

此外，在一个优选的实施方案中，STRO-1⁺多能细胞能够产生克隆形成的CFU-F。

优选所述显著比例的多能细胞能够分化成至少两个不同生殖细胞系。多能细胞谱系的非限制性实例可包括：骨前体细胞；肝细胞的祖细胞，其对胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经限制性细胞，其可以产生可发展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的神经胶质细胞前体；可发展为神经元的神经元前体；心肌和心肌细胞前体，响应葡萄糖分泌胰岛素的胰岛β细胞系。其它谱系包括但不仅限于，成牙本质细胞、产生牙本质的细胞和软骨细胞，以及下列前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞如角质形成细胞、树突状细胞、毛囊细胞、肾导管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮细胞、胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在另一个实施方案中，STRO-1⁺多能细胞经培养不能够产生造血干细胞。

在一个实施方案中，从待治疗的个体中取出细胞并采用标准技术进行体外培养，例如，在用于本文中所述任一实施方案的方法之前。可用这种细胞或由其分化的细胞以自体或异体组成施用于个体。在另一个替代性实施方案中，使用建立的人类细胞系中一种或多种细胞。在本发明的另一个有用的实施方案中，使用非人类的动物细胞(或假如患病体不是人类，而是另一个物种)。

可通过在任何合适的培养基中培养而获得子代细胞。使用的术语“培养基”是指细胞培养物，包括细胞周围环境的组分。培养基可以是固体、液体、气体或相和物质的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状的培养基，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原蛋白基质。典型的气体培养基包括生长在培养皿或其它固体或半固体支持物上的细胞暴露于其中的气相。术语“培养基”还指在细胞培养中使用的物质，即使它尚未与细胞接触。换句话说，准备用于细菌培养的营养丰富的液体是培养基。当与水或其它液体混合时变成适合于细胞培养的混合物粉末，可称为“粉状培养基”。

在一个实施方案中，通过使用STRO-3抗体标记的磁珠从骨髓中分离TNAP⁺STRO-1⁺多能细胞来获得用于本发明方法的子代细胞，然后培养使分离的细胞扩增(参见Gronthos等，Blood 85：929-940，1995，作为合适的培养条件的实例)。

在一个实施方案中，该扩增的细胞(子代)(优选地，至少经过5代)可以是TNAP^-、CC9⁺、HLA级I⁺、HLA级II^-、CD14^-、CD19^-、CD3^-、CD11a^-c^-、CD31^-、CD86^-、CD34^-和/或CD80^-。但是，在本文中所述的不同培养条件下，不同标记物的表达可能会有所不同。此外，这些表型的细胞在扩增的细胞群中可能占主导地位，这并不意味着不具备该表型的细胞是最小比例(例如，小比例的扩增细胞可以是CC9^-)。在一个优选的实施方案中，扩增细胞仍然具有分化成不同细胞类型的能力。

在另一个实施方案中，扩增细胞可共同表达一种或多种共同地或单独地选自下组的标记物：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择蛋白、L-选择蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整合素β6-19、血栓调节素、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素受体-R(STRO-2＝瘦素受体-R)、RANKL、STRO-1^亮和CD146或这些标记物的任意组合。

在一个实施方案中，子代细胞是WO 2006/032092中定义和/或描述的多能扩增的STRO-1⁺多能细胞子代(MEMPs)。制备可衍生子代细胞的富集的STRO-1⁺多能细胞细胞群的方法描述于WO 01/04268和WO 2004/085630中。在体外背景下的STRO-1⁺多能细胞很少能够制得绝对纯的细胞，一般会与其它组织特异定向的细胞(tissue specificcommitted cells)(TSCCs)共同存在。WO 01/04268涉及从骨髓细胞中收获约0.1％～90％纯度的这种细胞。所述含有能够衍生子代细胞的多能细胞的细胞群可直接从组织中收获得到，或者它可以是已经离体扩增的细胞群。

例如，子代细胞可以从收获的、未扩增的、基本上纯的含有至少约0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95％的其所在细胞群中总细胞的STRO-1⁺多能细胞的细胞群中获得。例如，该水平可通过选择共同对至少一种单独地或共同地选自下组的标记物呈阳性的细胞来实现：TNAP、STRO-1^亮、3G5⁺、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2。

MEMPS可以与新鲜收获的STRO-1⁺多能细胞区分开来，因为它们对标记物STRO-1^bri呈阳性，且对标记物碱性磷酸酶(ALP)呈阴性。相反，新鲜分离的STRO-1⁺多能细胞对STRO-1^bri和ALP都呈阳性。在本发明的一个优选实施方案中，至少15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的所施用细胞具有STRO-1^bri、ALP^-表型。在另一个优选实施方案中，MEMPs对一种或多种标记物Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1呈阳性。在另一个优选实施方案中，MEMPs不表现出TERT活性和/或对标记物CD18呈阴性。

STRO-1⁺多能细胞起始细胞群可源自WO 01/04268或WO2004/085630中列举的任意一种或多种组织类型，即骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤，或可更广泛地源自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨骼、韧带、骨髓、肌腱和骨骼肌。

在实施本发明中应知道，分离携带有任意给定细胞表面标记物的细胞可受到许多不同方法的影响，然而，优选的方法依赖于结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与相关标记物的结合，然后分离出那些表现出结合，可以是高水平结合或低水平结合或不结合的细胞。最方便的结合剂是抗体或基于抗体的分子，优选单克隆抗体或以单克隆抗体为基础，由于后者制剂的特异性。抗体可用于两个步骤，但也可使用其它制剂，因此用于这些标记物的配体也可被用来富集携带它们或缺乏它们的细胞。

抗体或配体可附着于固体支持物上，以便粗分离。优选的分离技术能够最大限度地保留要收集部分的活性。不同效果的各种技术可用于获得相对粗的分离物。所采用的特定技术取决于分离的效果、相关的细胞毒性、易用性和操作速度，以及先进的设备和/或技术人员的必要性。分离过程可包括但不仅限于，磁分离、用抗体包被的磁珠、亲和层析和用附着于固体基质的抗体“淘选(panning)”。提供准确分离的技术，包括但不限于FACS。进行FACS的方法对熟练的技术人员是显而易见的。

作用于本文中所述的各标记物的抗体可市售获得(例如，作用于STRO-1的单克隆抗体，可从R&D Systems，USA购买获得)，从ATCC获得或从其它保藏组织获得和/或采用本领域已知的技术制备得到。

优选的用于分离STRO-1⁺多能细胞的方法，例如，包括第一步采用例如可识别STRO-1高水平表达的磁活化细胞分选(MACS)的固相分选步骤。然后进行第二分选步骤，想要得到的结果是专利说明书WO 01/14268中所述的前体细胞的高水平表达。该第二分选步骤可能涉及使用两种或两种以上的标记物。

获得STRO-1⁺多能细胞的方法还可包括采用已知技术，在第一富集步骤之前收获细胞的来源。因此该组织将通过手术切除。然后含有源组织的细胞将被分离成所谓的单细胞悬液。这种分离可通过物理或酶法来实现。

一旦获得合适的STRO-1⁺多能细胞群，可通过任何合适的方法来培养或扩增细胞以获得MEMPs。

本发明可使用来自任何非人类的动物物种的细胞，包括但不限于：非人类的灵长类动物细胞、有蹄类动物、犬、猫、兔类动物、啮齿类动物、禽、鱼的细胞。本发明可使用的灵长类细胞包括但不限于：黑猩猩、狒狒、猕猴和任何其它新大陆或旧大陆猴的细胞。本发明可使用的有蹄类动物细胞包括但不限于：牛、猪、羊、山羊、马科动物、水牛和野牛的细胞。本发明可使用的啮齿动物细胞包括但不限于：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠细胞。本发明可使用的兔类物种的实例包括：家养的兔子、杰克兔、野兔、白尾野兔、雪靴兔和鼠兔。本发明可使用的鸡(原鸡)(Gallus gallus)的实例是鸟类。

用于本发明的细胞可在使用前或在获得上清液或可溶性因子之前贮存。保存和贮存真核细胞，特别是哺乳动物细胞的方法和指南是本领域已知的(参见，例如，Pollard，J.W.和Walker，J.M.(1997)，基础细胞培养指南(Basic Cell Culture Protocols)，第二版，Humana Press，Totowa，N.J.；Freshney，R.I.(2000)，动物细胞培养(Culture of AnimalCells)，第四版，Wiley-Liss，Hoboken，N.J.)。任何保持分离出的干细胞，如间充质干/祖细胞或其子代细胞的生物活性的方法可用于本发明中。在一个优选实施方案中，使用冷冻保存和贮存细胞。

表达潜能决定因子细胞的遗传修饰

在一个实施方案中，STRO-1⁺多能细胞和/或其子代细胞被遗传改造，例如，以表达一种或多种潜能决定因子。

遗传改造细胞的方法对于熟练的技术人员是显而易见的。例如，要在细胞中表达的核酸与启动子可操作地连接用于诱导胞内表达，优选在多能干细胞中的表达。例如，所述核酸与可在个体的多种细胞中操作的启动子可操作地连接，例如病毒启动子，例如，CMV启动子(例如，CMV-IE启动子)或SV-40启动子，或延伸因子启动子或诱导启动子，例如，四环素诱导的启动子。其它合适的启动子是本领域已知的，应适当变动而用于本发明实施方案。本发明还包括使用多顺反子载体，以使多种潜能决定因子从单一启动子，例如Oct4和Sox2表达。这种载体一般包括内部核糖体进入位点(IRES)，其将两个各编码不同潜能决定因子的核酸隔开。

本文中使用的术语“启动子”应采用广义的范围，包括基因组基因的转录调控序列，包括转录起始所需的TATA盒或起始元件，带或不带额外的改变基因表达的调控元件(即，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，例如，响应发育和/或外部刺激，或以组织特异的方式。在本文中，术语“启动子”还用来描述传递、激活或增强与其可操作连接的核酸表达的重组、合成或融合的分子或衍生物，优选其编码肽或蛋白。优选的启动子可包含一种或多种特定调控元件的额外拷贝，以进一步增强所述核酸分子的表达和/或改变空间表达和/或瞬时表达。

在本文中，当核酸被定位时，它与启动子“可操作地连接”(即，在启动子的调控下)，使它的表达受该启动子控制。启动子一般位于所述核酸的5′(上游)，控制核酸的表达。为构建异源启动子/核酸组合，一般优选启动子位于离开基因转录起始位点一定距离的位置，该距离大致与在自然位置中启动子和它所调控基因即该启动子所源自的基因之间的距离相同。这一点是本领域已知的，允许在不失去启动子功能的情况下发生一些距离变化。同样，调控序列元件相对于置于其控制下的异源核酸的优选位置，是由该元件在它的自然位置中的定位来确定的，即其所源自的基因。同样，这一点是本领域已知的，也可发生一些距离变化。

优选地，以表达构建体的形式提供所述核酸。本文中使用的术语“表达构建体”是指能够在细胞内传递与其可操作连接的核酸的表达的核酸。在本发明的背景下，应知道表达构建体可包括或可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或其它能够传递异源DNA表达的核酸。所述表达构建体可整合至细胞基因组中或保持游离(episomal)。

优选的表达构建体能够保持游离，例如质粒和噬菌体。这种表达构建体可用于，例如，制备重新设定的细胞，其中表达构建体没有整合至基因组中。此外，由于这些表达构建体常在细胞分裂过程中丢失，有可能制备不包括所述重组表达构建体的重新设定的细胞(参见，例如Okita等，Science，322：949-53，2008)。

构建本发明合适的表达构建体的方法对熟练的技术人员是显而易见的，例如，描述于Ausubel等(参见，当代分子生物学指南(In：Current Protocols in Molecular Biology).Wiley Interscience，ISBN 047150338，1987)或Sambrook等(参见，分子克隆：分子克隆：实验室手册(In：Molecular Cloning：Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约，第三版，2001)。例如，表达构建体的每个组件是采用例如PCR从合适的核酸模板中扩增得到的，随后被克隆至合适的表达构建体例如质粒或噬菌粒中。

适合于这种表达构建体的载体是本领域已知的和/或本文中所描述的。例如，适合于本发明方法的哺乳细胞中的表达载体，例如由Invitrogen公司提供的pcDNA载体组(suite)、pCI载体组的载体(Promega)、pCMV载体组的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP 16载体(Clontech)或pcDNA载体组的载体(Invitrogen)。

熟练的技术人员应知道其它的载体和此类载体的来源，例如Invitrogen公司、Clontech公司或Promega公司。

将分离的核酸分子或含有其的基因构建体引入胞内用于表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定有机体的技术依赖于已知的成功技术。将重组DNA引入胞内的方法包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，Virology，52：456-467，1973；Chen和Okayama，Mol.CellBiol.，7：2745-2752，1987；Rippe等，Mol.Cell Biol.，10：689-695，1990)、DEAE-葡聚糖(Gopal，Mol.Cell Biol.，5：1188-1190，1985)、电穿孔(Tur-Kaspa等，Mol.Cell Biol.，6：716-718，1986；Potter等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，81：7161-7165，1984)、直接显微注射、载有DNA的脂质体(Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190，1982；Fraley等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，76：3348-3352，1979)、细胞超声破碎(Fechheimer等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，84：8463-8467，1987)、采用高速微粒轰击基因(Yang等，Proc.Natl Acad.Sci USA，87：9568-9572，1990)、受体介导的转染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，19877；Wu和Wu，Biochem.，27：887-892，1988)。在其它实施方案中，将核酸转移至胞内可用帽状纳米颗粒(例如，纳米颗粒CaPO4)、胶体金、纳米颗粒合成的聚合物和/或脂质体制备核酸来实现。

在一个优选的实施方案中，例如，采用Okita等，2008，见上中所述的方法，转染保持游离的或没有整合至细胞基因组中的表达构建体。优选地，质粒被重复转染至所述细胞中直至所述细胞被重新设定。在这种方式下，制备得到不含整合至其基因组中的异源DNA的细胞，这从治疗的观点来看更具吸引力。

或者，本发明的表达构建体是病毒载体。合适的病毒载体是本领域已知的且可市售获得。常规的用于运送核酸并将所述核酸整合至宿主细胞基因组中的基于病毒的系统包括，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，用于引入在宿主细胞中保持游离的核酸的腺病毒载体，例如，制备不包含整合至其基因组中的异源基因的重新设定的细胞。病毒载体是将基因转入靶细胞和组织的有效且广泛适用的方法。此外，已在许多不同的细胞类型和靶组织中发现的腺相关的高效转导病毒载体。典型的病毒载体讨论如下。

a)腺病毒载体

在一个实施例中，本发明的病毒基因传递系统使用腺病毒起源的载体。已知腺病毒的遗传组织为36kB，线性和双链DNA病毒，允许高达8kB的外源序列替换大块的腺病毒DNA。由于腺病毒DNA可以无潜在的遗传毒性的游离(episomal)方式进行复制，因此，腺病毒DNA感染宿主细胞，不会引起染色体整合。此外，腺病毒结构稳定，在大量扩增后也没有检测到基因组的重排。腺病毒可感染几乎所有的无论其细胞周期阶段的上皮细胞。重组腺病毒可转导分裂和非分裂的细胞。有效地转导非分裂细胞的能力使腺病毒成为肌肉或脂肪细胞基因转移的优良候选。

由于腺病毒的中等大小的基因组、易于操作、滴度高、广泛的靶细胞范围以及高传染性，因此特别适合用作基因转移载体。病毒基因组两端都含有100-200碱基对(bp)的末端反向重复序列(ITR)，其为病毒DNA复制和包装必要的顺式作用元件。

基因组的早期(E)和晚期(L)区域中含有被病毒DNA复制起始分割的不同转录单元。E1区域(E1A和E1B)编码调控病毒基因组和一些细胞基因转录的蛋白。E2区域(E2A和E2B)的表达引起用于病毒DNA复制的蛋白的合成。这些蛋白参与DNA复制，晚期基因表达，以及关闭宿主细胞(Renan(1990)Radiotherap.Oncol.19：197)。晚期基因产物，包括大多数的病毒衣壳蛋白，仅在由主要晚期启动子(MLP)启动的单个初级转录本的显著加工后表达。MLP(位于16.8μl)在感染晚期特别有效，并且所有由这个启动子启动的mRNA都具有一个5’三联体前导序列(TL)，这使得它们成为用于翻译的典型的mRNA的。

可对腺病毒的基因组进行操作，从而使它编码目的基因产物，但它在正常裂解病毒的生命周期中的复制能力期间是没有活性的(参见，例如Berkner等，(1988)BioTechniques 6：616；Rosenfeld等，(1991)Science 252：431-434；和Rosenfeld等，(1992)Cell 68：143-155)。来源于Ad 5dl324型或其他腺病毒株(例如，Ad2，Ad3，Ad7等)的适合的腺病毒载体是本领域技术人员公知的。

重组腺病毒在一些情况下有优势，因为其能够感染非分裂细胞，并可用于感染各种类型的细胞，包括气道上皮细胞(Rosenfeld等，(1992)引用同上)、内皮细胞(Lemarchand等，(1992)PNAS，美国，89：6482-6486)、肝细胞(Herz和Gerard，(1993)PNAS，美国，90：2812-2816)和肌肉细胞(Quantin等，(1992)PNAS，美国，89：2581-2584；Ragot等(1993)Nature 361：647)。

此外，病毒粒子相对稳定，适合进行纯化及浓缩，并可以进行修饰，从而影响传染谱。

此外，相对于其他的基因传递载体，腺病毒基因组的外源DNA的承载能力大(可达8千碱基)(Berkner等，同上；Haj-Ahmand和Graham(1986)J.Virol.57：267)。目前在使用以及本发明优选的大多数复制缺陷腺病毒载体的病毒E1和E3基因的全部或部分被删除，但保留高达80％的腺病毒的遗传物质(参见，例如，Jones等，(1979)Cell16：683；Berkner等，同上；和Graham等，分子生物学方法，E.J.Murray，Ed.(Humana，Clifton，NJ，1991)卷7，109-127页)。可在例如，E1A启动子、主要晚期启动子(MLP)和有关的前导序列、病毒的E3启动子，或外源添加的启动子序列控制下，表达插入的本发明的多核苷酸。

在某些实施方案中，腺病毒载体可为复制缺陷型，或条件缺陷型。腺病毒可为任何42种已知不同A-F血清型或亚组。亚组C的5型腺病毒是典型的起始原料，用以按照本申请所述的方法和组合物获得条件复制缺陷型腺病毒载体(conditional replication-defective adenovirusvector)。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，其大量的生化和遗传信息是已知的，而且历来用于大多数使用腺病毒为载体的构建。如上文所述，根据本发明，典型载体为复制缺陷型，并具有腺病毒E1区域。因此，在E1编码序列已被删除的位置引入目的核酸将最方便的。然而，在腺病毒序列中一个区域内插入多核苷酸的位置并不是本发明的关键。例如，也可在如Karlsson等(1986)所述的E3替换载体中被插入，代替删除的E3区域，或在E4区域插入，其中辅助细胞系或辅助病毒补充E4的缺陷。

典型的辅助细胞系为293(ATCC登录号CRL1573)。该辅助细胞系也被称为“包装细胞系”是由Frank Graham提出(Graham等(1987)J.Gen.Virol.36：59-72和Graham(1977)J.病毒学总论，68：937-940)，并提供反式ELA和E1B。然而，辅助细胞系也可来自人类的细胞，如人类胚胎肾细胞、肌肉细胞、造血细胞或其他人类胚胎间质或上皮细胞。或者，辅助细胞可来源于其他哺乳动物的允许人类腺病毒的细胞。这些细胞包括，例如Vero细胞或其他猴胚胎间质或上皮细胞。

腺病毒也可为细胞类型特异，即感染只限于有限的细胞类型和/或在有限的细胞类型中表达所需的核苷酸序列。例如，病毒可能含有在受靶宿主细胞特异性地调控的转录起始域的转录调控下的基因，如美国No.5,698,443所述。因此，可复制腺病毒的表达，可以限于某些细胞，如插入细胞特异性响应元件以调节复制所需的蛋白质的合成，如，E1A或E1B。

可用于本发明目的的腺病毒技术的详细指导，包括导入核酸、含有核酸的重组病毒的繁殖和纯化的方法和材料以及它在转染细胞和哺乳动物中的应用，也可见于Wilson等，WO 94/28938、WO 96/13597和WO 96/26285，以及本申请所应用的参考文献。

b)逆转录病毒

在某些实施方案中，根据本发明所述的方法和组合物可使用逆转录病毒载体。这种病毒以前已被用于生产重新设定细胞，尽管不是在Stro-1⁺细胞中。该逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于能够通过反转录过程在受感染的细胞中将它们的RNA转化成双链DNA(Coffin(1990)“反转录病毒及其复制(Retroviriae and theirReplication)”In Fields，Knipe ed.病毒学.纽约：Raven出版社)。然后，生成的DNA作为前病毒稳定整合入细胞染色体中，并指导病毒蛋白质的合成。该整合使受体细胞及其后代中的病毒基因序列的得以保留。逆转录病毒基因组中含有三个分别编码衣壳蛋白、聚合酶和的外壳组件的基因，gag、pol和env。Gag基因的上游序列，称为psi，其作为包装基因组成病毒颗粒信号。两个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因的5′端和3′端。这些含有强启动子和增强子的序列，也需要在宿主细胞基因组中整合(Coffin(1990)，同上)。

为了构建逆转录病毒载体，将目的核酸插入到病毒基因组的某些病毒序列位置中以产生复制缺陷型病毒。为了生产病毒粒子，构建含有gag、pol和env基因但不含有LTR和psi组件的包装细胞系(Mann等(1983)Cell 33：153)。当含有本发明的核酸与逆转录病毒的LTR和psi序列的重组质粒引入到这个细胞系(例如通过钙磷酸盐沉淀)，psi的序列使重组质粒的RNA转录本包装成病毒颗粒，其再分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein(1988)″逆转录病毒载体(Retroviral Vectors)″，In：Rodriguez和Denhardt ed.载体：分子克隆载体概述及其应用(Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses).Stoneham，Butterworth和Temin，(1986)″用于基因转移的逆转录病毒载体：在脊椎动物细胞基因组中有效整合并表达外源DNA(Retrovirus Vectors forGene Transfer：Efficient Integration into and Expression of ExogenousDNA in Vertebrate Cell Genome)″，In：Kucherlapati ed.Gene Transfer.纽约：Plenum Press；Mann等，1983，同上)。收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地进行浓缩，再用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染各种细胞类型。

只生产复制缺陷型逆转录病毒的专门细胞系(被称为“包装细胞”)的开发增加了逆转录病毒用于基因疗法的效用，缺陷型逆转录病毒的特征在于在用于基因治疗目的的基因转移中的应用(综述参见Miller，A.D.(1990)Blood 76：271)。因此，可以构建其中的逆转录病毒编码序列(gag、pol、env)已被编码本发明的肽或类似物的核酸如转录激活子所取代的重组逆转录病毒，以补充逆转录病毒复制缺陷。然后，将复制缺陷的逆转录病毒包装成可用于通过标准方法使用辅助病毒感染靶细胞的病毒颗粒。生产重组逆转录病毒和用该病毒体外或体内感染细胞的方法可见于“最新分子生物学实验方法汇编(CurrentProtocols in Molecular Biology)”，Ausubel，F.M.等，(eds.)GreenePublishing Associates，(1989)，9.10-9.14部分和其他标准实验室手册。

适合的逆转录病毒的实例包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，这些是本领域技术人员公知的。典型的逆转录病毒载体为pSR MSVtkNeo(Muller等(1991)Mol.Cell Biol.11：1785和pSR MSV(XbaI)(Sawyers等(1995)J.Exp.Med.181：307)和其衍生物。例如，如Clackson等的WO 96/41865中所述，在这两个载体中唯一的BamHI位点可通过用BamHI酶切载体去除，并用Klenow补平，重新连接以分别制备pSMTN2和pSMTX2。用于制备单嗜性和双嗜性逆转录病毒系统的适合的包装病毒系包括Crip和Cre。

逆转录病毒，包括慢病毒，已被用于将不同基因体外和/或体内导入到许多不同类型的细胞，包括神经细胞、上皮细胞、视网膜细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(参见例如综述Federico(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10：448；Eglitis等，(1985)Science 230：1395-1398；Danos和Mulligan，(1988)PNAS，美国，85：6460-6464；Wilson等，(1988)PNAS，美国，85：3014-3018；Armentano等，(1990)PNAS，美国，87：6141-6145；Huber等，(1991)PNAS，美国，88：8039-8043；Ferry等，(1991)PNAS，美国，88：8377-8381；Chowdhury等，(1991)Science 254：1802-1805；Kay等，(1992)Human Gene Therapy3：641-647；Dai等，(1992)PNAS，美国，89：10892-10895；Hwu等，(1993)J.Immunol.150：4104-4115；美国专利No.4,868,116；美国专利No.4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；和PCT申请WO 92/07573)。

此外，已经表明通过修饰病毒粒子表面的病毒包装蛋白，可限制逆转录病毒和基于逆转录病毒的载体的感染谱(参见例如PCT公开文本WO 93/25234、WO 94/06920、和WO 94/11524)。例如，修饰逆转录病毒载体感染谱的策略，包括耦合细胞表面抗原的特异性抗体到病毒env蛋白(Roux等，(1989)PNAS，美国，86：9079-9083；Julan等，(1992)J.Gen Virol 73：3251-3255；和Goud等，(1983)病毒学，163：251-254)；或耦合细胞表面配体到env蛋白(Neda等，(1991)J.Biol.Chem.266：14143-14146)。耦合可以与蛋白或其它变体(如转换env蛋白到去唾液酸糖蛋白的乳糖)化学交联的形式，以及通过产生融合蛋白(如单链抗体/env融合蛋白)进行耦合。

c)腺伴随病毒载体

用于传递本发明核酸的典型病毒载体系统为腺伴随病毒(AAV)。人类腺病毒是双链DNA病毒，其通过受体介导的内吞作用进入细胞。这些病毒被认为非常适合基因的转移，因为它们容易生长和操作，并且他们表现出体内和体外广泛的宿主范围。腺病毒是可以感染静态和正在复制的靶细胞，始终位于染色体外，而不整合到宿主基因组。AAV是一种辅助依赖型DNA细小病毒，属依赖病毒属。AAV没有已知的病变，若没有其它病毒如腺病毒、牛痘或疱疹病毒提供的额外的辅助功能其不能进行复制而用于有效的复制和生产生命周期。

在没有辅助病毒存在下，AVV通过将其基因组插入到宿主细胞染色体建立潜伏状态。随后通过辅助病毒的感染拯救整合的拷贝，其可随后复制产生感染性的病毒后代。野生型AAV病毒与腺病毒或疱疹病毒辅助功能的组合产生了可复制的重组AVV(rAVV)。这种系统的一个优点是其相对的安全性(综述，参见Xiao等，(1997)Exp.Neurol.144：113-124)。

AAV基因组由线性、单链DNA分子组成，其含有约4681个碱基(Berns和Bohenzky，(1987)，病毒研究进展(Academic Press，Inc.)32：243-307)。基因组的每个末端含有末端反向重复序列(ITRs)，其顺式作用为DNA复制的起点和病毒的包装信号。基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框，分别称为AAV的Rep和Cap域。这些域编码参与病毒粒子的复制和包装的病毒蛋白。对于AAV基因组的详细描述，请参阅，例如，Muzyczka，N.(1992)微生物学和免疫学的新话题(Current Topics in Microbiol.and Immunol.)158：97-129。

含有低至300个碱基对的AAV载体可以被包装并整合。外源DNA的空间被限制成约4.7kb，而这足以导入编码本发明的肽或类似物的核酸。如Tratschin等，(1985)Mol.Cell.Biol.5：3251-3260中详述的AAV载体可用于将DNA引入至细胞中。利用AAV载体已将各种核酸导入到不同类型的细胞中(参见例如Hermonat等，(1984)PNAS，美国，81：6466-6470；Tratschin等，(1985)Mol.Cell.Biol.4：2072-2081；Wondisford等，(1988)Mol.Endocrinol.2：32-39；Tratschin等，(1984)J.Virol.51：611-619；和Flotte等，(1993)J.Biol.Chem.268：3781-3790)。

用于构建和传递rAAV构建体的一般方法是本领域公知的，并描述于，例如，Barlett，J.S.，等，(1996)，神经系统科学中的基因转移指南(Protocols for Gene Transfer in Neuroscience)；神经疾病的基因治疗(Towards Gene Therapy of Neurological Disorders)，115-127页。

使用的基于AAV的表达载体，通常包括侧翼带有1个限制性酶切位点的145个核苷酸的AAV末端反向重复(ITRs)，可以用于亚克隆所需的核苷酸序列，可直接使用可用的限制性酶切位点，或通过用限制性内切酶切下所需的核苷酸序列，然后补平末端，连接上合适的DNA接头，再限制性消化并连接到ITRs之间的位点。

可用于本发明目的的AAV技术的详细指导，包括导入核酸、含有核酸序列的重组AAV载体的繁殖和纯化的方法和材料，以及它在转染细胞和哺乳动物中的应用，参见，例如Carter等，美国专利No.4,797,368(1989年1月10日)；Muzyczka等，美国专利No.5,139,941(1992年8月18日)；Lebkowski等，美国专利No.5,173,414(1992年12月22日)；Srivastava，美国专利No.5,252,479(1993年10月12日)；Lebkowski等，美国专利No.5,354,678(1994年10月11日)；Shenk等，美国专利No.5,436,146(1995年7月25日)；Chatterjee等，美国专利No.5,454,935(1995年12月12日)，Carter等，WO 93/24641(公开于1993年12月9日)，和Natsoulis，美国专利No.5,622,856(1997年4月22日)。

d)其它病毒系统

其它可用于传递核酸的病毒载体系统可源自例如，疱疹病毒，如单纯性疱疹病毒(Woo等的IJ St专利No.5,631,236，公布于1997年5月20日和Neurovex的WO 00/08191y)，牛痘病毒(Ridgeway(1988)Ridgeway，″哺乳动物表达载体，″In：Rodriguez R L，Denhardt D T.ed.载体：分子克隆载体及其应用概述。Stoneham：Butterworth，；Baichwal和Sugden(1986)″源自动物DNA病毒的基因转移载体：转移基因的瞬时和稳定表达，″In：Kucherlapati R，ed.基因转移.纽约：Plenum Press；Coupar等(1988)Gene，68：1-10)和一些RNA病毒。典型的病毒包括，例如，甲病毒、痘病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒等。他们为各种哺乳动物细胞提供一些很有吸引力的特点(Friedmann(1989)Science，244：1275-1281；Ridgeway，1988，同上；Baichwal和Sugden，1986，同上；Coupar等，1988；Horwich等(1990)J.Virol.，64：642-650)。

e)非整合病毒，自我裂解/可切割构建体和质粒直接转染靶胚细胞

由含有“自我裂解”2A肽的多顺反子表达盒同时表达所有遗传潜力决定因子，导致“核糖体的跳跃”使单个启动子启动的各个因子的类似表达(Sommer等，Stem Cells.27：543-549，2008；Carey等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，106：157-162，2009)。由于内部核糖体进入序列(IRES)分开了成对的因子，被感染的细胞能够表达所有潜力决定因子或其亚单位。Carey等，(2009，同上)不用IRES技术，构建被自我裂解2A肽分开的强力霉素可诱导的因子。

在另一个实例中，用DNA转座子传递一个或多个潜力决定因子。DNA转座子是由特定的“转座酶”切除并在整个基因组中重新整合的遗传元件，被称为转座现象。piggyBac是这样一种转座子，能够携带优选插入到携带TTAA序列的转录DNA单元的多基因有效载荷。诱导单或多顺反子的强力霉素可诱导的构建体，通过转座酶介导的整合和随后的切除而传递到鼠和人成纤维细胞，可产生表现出所有多潜能标志性特点的iPS细胞，包括通过四倍体互补试验促成妊娠中期胚胎(Woltjen等，Nature.458：766-770，2009)。

此外，可通过后续用临时Cre重组酶表达腺病毒感染切除floxed前病毒构建体(Kaji等，Nature.458：771-775，2009)。

产生iPS的非基于DNA的方法

a)化学方法

在一个实施例中，潜力决定因子是一种组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂，在适当的位置作为Oct4或作为Oct4的补充(例如，降低表达水平)。可用BIX-01294(BIX)，如Enzo Lifesciences的产品，实现化学抑制G9a，并已经缓和了对组蛋白3、赖氨酸9甲基化(H3K9me)介导的Oct4表达的拮抗，可以在一些细胞中完全替代用于iPS细胞衍生的病毒传递的Oct4(Shi等，Cell Stem Cell.2：525-528，2008)。

或者，将短发夹RNA(shRNA)用于敲除G9a表达。以表明这种shRNA是导致Oct4启动子去甲基化并部分复活Oct4的表达(Ma等，Stem Cells.26：2131-2141，2008)。

在另一个实施例中，L型通道钙激动剂(例如，Tocris Bioscience的Bayk8644)和G9a拮抗剂(如BIX)组合使用用于取代或补充Sox2和cMyc(Shi等，Cell Stem Cell.3：568-574，2008)。

在另一个实施例中，潜力决定因子为MEK抑制剂。化学抑制负责体细胞周期进展的MEK(例如，使用Cayman Chemical的PD0325901)，Oct4/Klf4感染后的7-9天，持续数天(如5天)，导致Oct4高表达的重新设定的iPS克隆生长增加(Shi等，2008，同上)。

在进一步的实施例中，潜力决定因子为Wnt3a。胞外Wnt3a可刺激靶细胞中β-连环蛋白介导的诱导内源cMyc的表达，在重新设定效率上产生了显着的改善(Marson等，2008)。

在另一个实施例中，潜力决定因子为冈田酸。冈田酸(OA)是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2A(PP2A)的强效抑制剂。PP2A特异地脱去cMyc中丝氨酸残基的磷酸，靶向它以进行快速的泛素调控的降解，也引起KLF4的增加，这反过来又结合cMyc启动子的OA响应元件而诱发cMyc基因的上调表达。通过抑制EIFα，OA额外的翻译抑制作用可引起mRNA转录的初始积累，并随后随着OA的退出传递大量翻译的蛋白质。

在另一个实施例中，潜力决定因子为肯泡隆(Kenpaullone)。用广谱蛋白激酶抑制剂肯泡隆(Kenpaullone)替换KLF4，Oct4/Sox2/cMyc逆转录病毒表达MEF生成了能够有助于可生殖嵌合体的Oct4可选择的iPS细胞(Lyssiotis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，106：8912-8917，2009)。

在进一步的实施例中，潜力决定因子为组氨酸脱乙酰酶抑制剂。通过化学抑制组氨酸脱乙酰酶活性，观察到鼠成纤维细胞重新设定成iPS细胞的iPS重新设定效率有一百倍的提高(Huangfu等，Nat Biotech.26：795-797，2008；Huangfu等，Nat Biotech.26：1269-1275，2008)。例如，丙戊酸提高遗传重新设定的重新设定效率。

在进一步的实施例中，潜力决定因子为DNA甲基化酶抑制剂。

b)蛋白传递

同使用小分子化合物一样，蛋自传递由于其可逆性是产生iPS细胞的有吸引力的方法。

在一个实施例中，蛋白潜力决定因子结合蛋白转导域以便于进入细胞内(优选核内)。蛋白转导域是本领域公知的，包括如精氨酸聚合物、HIV Tat基本结构域、触角蛋白(antannapedia)(如，描述于Jones等，Br J Pharmacol.，145：1093-102，2005中)。例如，大肠杆菌表达的含有连接到潜力决定因子的精氨酸聚合物靶向序列的重组蛋白，可将MEF转换成iPS细胞。

生产蛋白质的方法是本领域已知的，和/或描述于Sambrook等，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社(1989)或Ausubel等，(编辑)，最新分子生物学实验方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括直到现在的所有更新)。

c)基因沉默策略

在一个实施例中，潜力决定因子为基于核酸的化合物，其使内源基因表达沉默或降低。

在一个实施例中，潜力决定因子为微RNA(miRNA)。miRNA为单链、非编码RNA，其主要通过以序列特异性的方式结合靶转录本调节许多生物过程。miRNA最初表达成初级转录本，随后裂解释放有活性的miRNA，其与RNA诱导沉默复合体(RISC)复合而启动翻译的抑制。逆转录病毒感染后第0天和第6天，转染miR-294可以75％的效率取代cMyc(Judson等，Nat.Biotech.27：459-461，2009)。

Dnmt1的siRNA敲除可以辅助细胞实现由部分至完全重新设定的跨越，并增加4倍的重新设定效率(Mikkelsen等，Nature.454：49-55，2008)。同样地，组蛋白甲基转移酶G9a的短发夹RNA(shRNA)敲除涉及体内植入胚胎后Oct4的失活，导致Oct4启动子的去甲基化和部分复活(参见上文)。向成人包皮成纤维细胞中加入p53 siRNA，和Oct4/Sox2/Klf4感染一起，单独地或与另外的处理结合，增加了效率(Zhao等，Cell Stem Cell.3：475-479，2008)。

本领域技术人员应当知晓适合的基于RNA的化合物。典型的化合物包括反义多核苷酸、核糖酶、PNA、干扰RNA、siRNA、短发夹RNA和微RNA。

反义多核苷酸

术语“反义多核苷酸”是指与至少部分的编码本申请中任何实施方案中所述多肽的特异性mRNA分子互补，并能干扰转录后事件如mRNA翻译的DNA或RNA，或其组合。反义方法的使用是本领域公知的(参见，例如Hartmann和Endres，反义方法学手册(Manual ofAntisense Methodology)，Kluwer(1999))。

本发明的反义多核苷酸在生理条件下与靶核苷酸杂交。反义多核苷酸包括相应于结构基因的序列或控制基因表达或剪接作用的序列。例如，反义寡核苷酸可对应本发明基因的目标编码区，或5′端非翻译区(UTR)或3′UTR，或其组合。它可部分与内含子序列互补，该内含子序列可在转录中或转录后被剪接掉，优选其仅与靶基因的外显子序列互补。反义序列的长度应为靶核酸或编码其的结构基因的至少19个连续的核苷酸，优选至少50个核苷酸，更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。可使用与整条基因转录本都互补的全长序列。长度最优选为100-2000个核苷酸。反义序列和靶转录本的一致性应至少为90％，更优选95-100％。

催化多核苷酸

术语“催化多核苷酸/核酸”，是指DNA分子或含DNA的分子(本领域也称为“脱氧核酶”或“脱氧核酶”)或RNA或含RNA的分子(又称为“核糖酶“或“RNA酶”)，其特异性地识别不同的底物并催化该底物的化学修饰。催化核酸中的核酸碱基可为A，C，G，T(RNA为U)。

通常情况下，催化核酸含有用于特异性识别靶核酸的反义序列和裂解酶活性的核酸(本申请中也称为“催化结构域”)。本发明中特别有用的核酶类型为锤头状核酶和发夹状核酶。

RNA干扰

RNA干扰(RNAi)用于特异性的抑制特定蛋白质的生产。虽然尽管不希望受理论的限制，Waterhouse等，(1998)已经为该机制提供了一种模型，其中dsRNA(双链RNA)可用于减少蛋白质的生产。这项技术依赖于含有基本与目标基因的mRNA或其部分相同的序列的dsRNA分子的存在。便利地，双链RNA可以由重组载体或宿主细胞中的单启动子产生，其中正义和反义序列连接在不相关的序列两侧，使正义和反义序列杂合形成的双链RNA分子，与不相关的序列形成环结构。用于本发明的适合的dsRNA分子的设计和生产属于本领域技术人员的能力范围内，特别地，可考虑WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029和WO01/34815。

杂合的正义和反义序列的长度每个序列应至少各为19个连续的核苷酸，优选至少30或50个核苷酸，更优选至少100，200，500或1000个核苷酸。可使用整个基因转录本对应的全长序列。长度最优选100-2000个核苷酸。正义和反义序列与靶转录本的一致性应至少为85％，优选至少为90％，最优选为95-100％。

优选的小干扰RNA(“siRNA”)分子含有与靶mRNA约19-23个连续的核苷酸相同的核苷酸序列。优选地，siRNA序列开始于二核苷酸AA，GC含量约30-70％(优选30-60％，更优选40-60％，最优选45％-55％)，并且与要被导入的哺乳动物基因组中除靶基因外的其它核苷酸序列没有较高一致性，例如，通过标准的BLAST搜索确定。

培养条件

多能干细胞和/或重新设定的细胞和/或正在重新设定的细胞可以培养于任何用于支持多能干细胞生长的培养基中。典型的培养基，包括但不限于，确定成分的培养基，如TeSR^TM(StemCell Technologies，Inc.；Vancouver，加拿大)、mTeSR^TM(StemCell Technologies，Inc.)和StemLine无血清培养基(Sigma；St.Louis，MO)，以及条件培养基，如鼠胚胎成纤维细胞(MEF)-条件培养基。其他培养基包括基础培养基，例如，DMEM或添加KoSR的DMEM-F12(Invitrogen公司)。可选地，Silva等，PLOS Biology，6：e253，2008描述了一种用于制备重新设定的细胞和维持重新设定的细胞处于未分化状态的培养基，例如，含有MAPK信号传递和糖原合酶激酶3信号传递的抑制剂和白血病抑制因子(LIF)。如本申请中所用，“确定成分的培养基”是指仅含有生化确定组分的生化确定制剂。确定成分的培养基还可仅包括具有已知化学组成的组分。确定成分的培养基还可进一步包括已知来源的组分。如本申请中所用，“条件培养基”，是指进一步用培养基中所培养细胞的可溶性因子补充的生长培养基。或者，细胞可在培养基中维持在MEFs上。

细胞优选在37℃下，培养于湿润的培养箱中。根据本发明细胞的细胞培养条件可有很大的不同，然而，在一些实施方案中，使细胞维持于适合细胞生长的环境中，例如含有5％O₂，10％CO₂，85％N₂或含有10％CO₂二氧化的空气。

在另一个实施方案中，细胞培养于基质上或基质内，如细胞外基质，如Matrigel^TM、层粘连蛋白、胶原蛋白、Culturex

等。在另一个实施方案中，细胞可在细胞外基质的存在下培养。在这种基质存在下增殖细胞的合适方法描述于，例如美国专利No.7,297,539中。

细胞的分离或富集

下述方法用于分离或富集Stro-1⁺细胞和/或重新设定的/多能肝细胞，如通过检测本申请所述的或本领域公知的标记。

典型的富集所需细胞的方法为磁珠细胞分选(MACS)或其它任何利用磁性的细胞分选方法，例如Dynabeads

传统的MACS方法是Miltenyi等(Cytometry 11：231-238，1990)所述的方法。在这种方法中，细胞被结合有抗体或其它结合到细胞表面标记或蛋白的化合物的磁珠标记，细胞通过顺磁性分离柱，或暴露在另一种形式的磁场中。分离柱被放置在强磁性的磁铁中，从而在柱内创造一个磁场。柱内捕获被磁力标记的细胞；不能通过的细胞。然后将被捕获的细胞从柱子中洗脱下来。

本发明的细胞，例如，可从如上所述的合适的储集体(reservoirbody)中富集，使用MACS分离表达合适蛋白质的细胞。将样品与结合蛋白质的免疫磁珠一起孵育。孵育后，洗涤样品，重悬，并通过磁场去除结合到免疫磁珠的细胞，收集结合到磁珠的细胞。这些技术同样适用于负选择，例如，去除表达非所需标记的细胞，即非所需细胞。这种方法包括将大量细胞与被结合到在非所需细胞类型中以可检测水平表达出的细胞表面标记的化合物所标记的磁性颗粒进行接触。孵育后，洗涤样品，重悬，并通过磁场去除结合到免疫磁珠的细胞。收集去除非所需细胞类型后的剩余细胞。

在另一实施方案中，结合到蛋白或细胞标记的化合物被固定到固体表面，再将细胞群与其接触。洗涤并去除未结合的细胞后，可回收结合到该化合物的细胞，例如，洗脱，从而分离或富集表达所述化合物结合的蛋白质的细胞。或者，如果需要的话，可回收没有结合化合物的细胞。

在一个优选的实施方案中，使用荧光激活细胞分选法(FACS)分离或富集细胞。FACS是一种已知的基于颗粒荧光特性的用于分离颗粒包括细胞的方法，并描述于，例如Kamarch，Methods Enzymol，151：150-165，1987中。通常，这种方法包括将可结合一个或多个蛋白质或细胞表面标记的化合物与细胞群接触，其中，结合到不同标记的化合物用不同的荧光基团标记，如荧光团。细胞被夹在狭窄的、快速流动的液体流中间。这样设置液体流是为了相对其直径的细胞之间的分离。振动机制引起细胞流分解成单个的液滴。调整系统从而使液滴中含有一个以上细胞的概率很低。在液体流分解成液滴前，液体流通过荧光检测站，其中，检测每个细胞的目的荧光特性，如是否结合有标记的化合物。将带电荷的环置于液体流分解为液滴的位点。基于荧光强度的测量之前，将电荷置于环上，随着液体流分解成液滴，相反的电荷被捕获在液滴上。然后，带电荷的液滴下落通过静电偏转系统，其根据它们的电荷将液滴转移入容器中，例如，如果标记的化合物结合到细胞的转入一个容器，如果没有结合的则转入另一个容器。在一些系统中，电荷直接应用于液体流，并且分解后的液滴保留与液体流相同符号的电荷。然后，在液滴分离后，液体流恢复至中性。

细胞的分化

本发明的重新设定的细胞或多能干细胞用来制备大量的各种商业和治疗上重要组织类型的分化细胞。通常，可通过扩大细胞至所需数量实现。此后，根据任何一种分化策略，将它们进行分化。例如，可以通过将细胞改到含有一种或多种神经营养因子(如神经营养因子3或脑源性神经营养因子)，一种或多种分裂素(如表皮生长因子、bFGF、PDGF、IGF 1和促红细胞生成素)，或一种或多种维生素(如视黄酸、抗坏血酸)的培养基中进行培养，产生高度富集的神经谱系(neural lineage)细胞群。或者，多能神经干细胞可通过胚胎体阶段产生，并维持在含有bFGF的化学上确定成分的培养基中。基于他们是否表达神经前体细胞标记物，如巢蛋白、武藏素(Musashi)、波形蛋白、A2B5、nurr1或NCAM，任选地分离培养的细胞。使用这种方法，可获得具有同时生成神经细胞(包括成熟的神经元)和神经胶质细胞(包括星形胶质细胞和少突胶质细胞)能力的神经祖/干细胞。可选地，可获得具有形成分化的细胞群能力的复制型神经前体细胞。

高度富集的用于肝细胞系标记的细胞可以通过，在组蛋白去乙酰酶抑制剂如正丁酸盐的存在下，培养干细胞，由重新设定的或多能干细胞中分化出。培养的细胞任选地同时或相继与肝细胞成熟因子如EGF、胰岛素或FGF培养。

重新设定的或多能干细胞也可用于生成具有心肌细胞和定期自发收缩活性特征标记的细胞。影响DNA甲基化的核苷酸类似物(如5-氮杂脱氧胞嘧啶)、生长因子和骨形态形成蛋白可促进这种分化方法。可通过基于密度的细胞分离方法进一步富集细胞，并将细胞维持在含有肌酸、肉毒碱和牛磺酸的培养基中。

可在含有骨形态形成蛋白(BMP)、人TGF-β受体的配体或人维生素D受体的配体的培养基中将重新设定的细胞或多能干细胞调控至分化成间质细胞或软骨细胞。培养基还可进一步含有地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸酯、以及钙源和磷源。在优选实施方案中，衍生细胞具有成骨细胞系细胞的表型特征。

应当理解，从重新设定的或多能干细胞中分化出的细胞还可在人类患者亟需时用于组织重建或再生。用以下方式施用该细胞：将它们嫁接到预定的组织位置并重建或再生功能缺陷区域。例如，根据正在治疗的疾病，神经前体细胞可被直接移植到中枢神经系统的薄壁组织或鞘内的位置。可在急性脊髓损伤的大鼠模型中评价神经细胞移植的功效，如McDonald，等((1999)Nat.Med.，卷5：1410)和Kim，等((2002)Nature，卷418：50)中所述。2-5周后，成功的移植将显示出，在病变位置出现移植物衍生的细胞，细胞分化成星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经元，并且细胞从病变末端沿着脊髓迁移，并在步态、协调性和承重方面得到改善。

同样，即时施用的受试者已经证明施用间质干细胞治疗骨折或软骨损伤的功效。

同样，可在合适的心肌损伤或功能障碍的动物模型中，评价对心肌的功效，如心脏低温损伤动物模型，其中约55％的左心室壁组织成为未经治疗的瘢痕组织(Li，等(1996)，Ann.Thorac.Surg.，卷62：654；Sakai，等(1999)，Ann.Thorac.Surg.，卷8：2074；Sakai，等(1999)，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，卷118：715)。成功的治疗将减少疤痕的面积，限制疤痕的扩张，并改善通过收缩压、舒张压和充盈压确定的心脏功能(Kehat，等(2004))。心肌损伤还可以被模型化，例如，利用左前降支远侧部分的弹簧圈栓塞(Watanabe，等(1998)，细胞移植(CellTransplant)，卷7：239)，或利用左前降支冠状动脉的结扎(Min，等(2002)，J.Appl.Physiol.，卷92：288)。可通过组织学和心功能评价疗效。本发明的心肌细胞制剂，可用于治疗心肌再生和治疗心功能不足。

还可通过施用分化自例如，根据本发明生长的灵长类动物多能干细胞的肝细胞和肝细胞前体恢复肝功能。可在动物模型中评价这些分化的细胞修复肝功能损害的能力。一个这样的实例为通过腹腔注射D-半乳糖而造成的损害(Dabeva，等(1993)，Am.J.Pathol.，卷143：1606)。通过对肝细胞标记的免疫细胞化学染色，显微镜确定生长的组织中是否形成了微管结构，以及该治疗恢复肝特异性蛋白质合成的能力，确定治疗的效果。在治疗上，可通过直接施用，或在患者的肝组织自生再生时，例如，暴发性肝衰竭衰竭后，作为提供临时肝脏功能的生物辅助肝设备的一部分使用肝细胞。

细胞组合物

在本发明的一个实施例中，重新设定的细胞或多能干细胞和/或由其分化的细胞以组合物或制备成组合物剂型的形式进行施用。优选这种组合物含有药用载体和/或赋形剂。

术语“载体”和“赋形剂”是指本领域通常用于促进存储、施用和/或活性化合物生物活性的物质的组成成分(参见，例如Remington的药物科学，第十六版，Mac出版公司(1980)。载体还可减少活性化合物的任何不良副作用。合适的载体，例如是稳定的，如，不能与载体中的其他成分发生反应。在一个实施例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下，不会造成施用者显著的局部或全身的不良反应。

本发明的合适的载体包括常规使用的，例如，水、盐水、葡萄糖水、乳糖，林格氏液、缓冲液，透明质酸和乙二醇为优选的液体载体，特别是针对溶液(等渗时)。适当的药用载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一个实施例中，载体为培养基组合物，例如，其中细胞生长或暂停。优选地，这种培养基组合物的不会诱导被施用者产生任何不良反应。

优选的载体或赋形剂不会对细胞活性和/或细胞发生生物作用的能力产生不利影响，优选具有有益作用。

在一个实施例中，载体或赋形剂提供了缓冲活性，以维持细胞和/或可溶性因子的合适的pH值，从而发挥生物活性，例如，载体或赋形剂为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表有吸引力的载体或赋形剂，因为它与细胞和因子的反应最小，并使细胞和因子迅速释放，在这种情况下，本发明的组合物可制备成液体直接施用，如注射到血液流或组织或组织周围或邻近区域。

重新设定的细胞或多能干细胞和/或由其分化的细胞还可被纳入或嵌入到与受体兼容的支架内，其降解成对受体无害的产品。这些支架为移植到受体对象的细胞提供支持和保护。这种支架的实例为天然的和/或合成的可生物降解的支架。

各种不同的支架可成功地用于实施本发明。优选的支架包括，但不限于生物、可降解支架。天然生物可降解的支架包括胶原蛋白、纤维连接蛋白和层粘连蛋白支架。用于细胞移植支架的适合合成材料应能够支持大量的细胞生长和细胞的功能。这种支架也可以是可吸收的。合适的支架包括聚乙醇酸支架，例如，Vacanti，等J.Ped.Surg.23：3-9 1988；Cima，等Biotechnol.Bioeng.38：145 1991；Vacanti，等Plast.Reconstr.Surg.88：753-9 1991所述；或合成聚合物，如聚酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一个实施例中，细胞可施用到凝胶支架内(如Upjohn公司的明胶海绵)。

用于本发明的细胞组合物可单独施用或与其他细胞组成混合物施用。可与本发明组合物联用的细胞包括但不限于，其他多功能细胞或多能干细胞或干细胞或骨髓细胞。可在施用前或施用前不久将本发明组合物与不同类型的细胞进行混合，或它们可在施用前一起共培养一段时间。

优选地，组合物含有有效量的或治疗或预防有效量的细胞。例如，组合物含有约1x10⁵重新设定的细胞或多能干细胞和/或其所分化的细胞/kg至约1x10⁷重新设定的细胞或多能干细胞和/或其所分化的细胞/kg，或约1x10⁶重新设定的细胞或多能干细胞和/或其所分化的细胞/kg至约6x10⁶重新设定的细胞或多能干细胞和/或其所分化的细胞/kg。施用的细胞确切数量取决于多种因素，包括病人的年龄、体重和性别以及被治疗病症的严重程度。

在一些实施方案中，将细胞都含在腔(chamber)内，不让其进入受体的循环，但允许细胞分泌的因子进入循环。在这种方式下，可通过使细胞分泌因子进入受体的循环，给受体施用可溶性因子。这种腔可同样在受体的某个位置植入以提高该位置的可溶性因子的水平。

在本发明的一些实施方案中，没有必要或需要在开始用细胞组合物治疗前免疫抑制病人。因此，在某些情况下，重新设定的细胞或多能干细胞和/或由其分化的细胞可耐受同种异体甚至异种异体移植。

然而，在其它情况下，细胞疗法开始前药理免疫抑制病人是可取的或适当的。可通过使用全身或局部的免疫抑制剂实现，或可通过在封装设备中传递细胞实现。可将细胞包裹在细胞所需营养和氧气可渗透的胶囊内，而细胞的治疗因子还未渗透出来至免疫体液因子和细胞。优选地，密封剂为低过敏性，可易于和稳定地处于靶组织中，为植入的结构提供额外的保护。这些以及其它用于降低或消除移植细胞的免疫反应的方法是本领域公知的。可选地，可将细胞进行遗传修饰以降低其免疫原性。

筛选方法

本发明还提供了一个用于鉴定或分离诱导或增强重新设定的Stro-1⁺多功能细胞和/或其后代细胞的化合物的方法，所述方法包括，将Stro-1⁺多功能细胞和/或其后代细胞与化合物接触一段时间，在足以发生重新设定的条件下，如果化合物诱导或增强了重新设定并确定细胞是否被重新设定。

在一个实施例中，该方法包括：

(i)将一群富集的Stro-1+多功能细胞和/或其后代细胞与化合物接触一段时间，在足以发生重新设定的条件下，如果化合物诱导或增强了重新设定，并确定重新设定细胞的数量；和

(ii)确定在与没有与化合物接触的富集的Stro-1+多功能细胞和/或其后代细胞群体中，重新设定的细胞的数量，

其中，与(ii)相比，(i)的重新设定的细胞数量的增加表明化合物诱导或增强了Stro-1+多功能细胞和/或其后代细胞的重新设定。

在一个实施例中，在一种或多种如上所述的潜力决定因子的存在下实施该方法。

本发明还提供分离或鉴定诱导或增强重新设定的细胞或多能干细胞分化为所需细胞类型的化合物的方法，所述方法包括：与根据本申请任何实施方案所述的方法制备的重新设定的细胞或多能干细胞接触，并确定所述细胞是否分化成了所需细胞类型。

优选地，该方法包括：

(i)与根据本申请任何实施方案所述的方法生产的一群富集的重新设定的细胞或多能干细胞接触一段时间，并在足以发生细胞分化的条件下确定所需细胞类型的细胞数量；和

(ii)在相同的但无该化合物的条件下，通过培养根据本申请任何实施方案所述的方法生产的重新设定的细胞或多能干细胞，确定所需细胞类型的细胞数量，

其中，与(ii)相比，(i)中所需细胞类型的细胞数量的增加表明所述化合物诱导或增强了所需细胞类型的分化。

本发明还提供鉴定或分离用于治疗病症的化合物方法，该方法包括：

(i)实施根据本申请任何实施方案所述的方法制备患有病症的患者的多能干细胞或细胞群；和

(ii)将该细胞或细胞群与测试化合物接触，并确定其对该病症的一种或多种症状的作用，其中，改善或减轻病症的症状的化合物有助于该病症治疗。

在一个实施例中，该方法包括：

(a)将多能干细胞或细胞群分化成受该病症影响的细胞；和

(b)将(a)中细胞与测试化合物接触，确定其对该病症的一种或多种症状的作用，其中，改善或减轻病症的症状的化合物有助于该病症治疗。

这种方法不仅可用于鉴定或分离治疗病症的新化合物，还可用于鉴定患者是否可响应目前的治疗/预防化合物的治疗。

本领域技术人员知晓分化细胞的适合方法，如基于本申请所公开的和/或适合的条件和/或这些病症的症状。例如，病症为囊性纤维化，症状为肺细胞的分泌物；或神经退行性病症(例如，阿尔茨海默氏病或亨廷顿氏病)，症状为神经退化或斑块/胞内聚合体的形成；或心脏病，症状为心肌细胞的收缩力。

本发明还提供鉴定具有降低了的细胞或组织类型毒性的化合物的方法，如确定毒性风险降低了的治疗化合物。例如，本发明提供的方法包括：

(i)实施根据本申请任何实施方案所述的方法制备多能干细胞或细胞群；

(ii)将多能干细胞或细胞群分化成一种或多种特异谱系的细胞和/或组织；

(iii)将细胞与测试化合物接触；和

(iv)确定所述化合物对细胞活力和/或增值的作用，其中，不杀死一个细胞或一个细胞群的显著比例或不降低增值的化合物被认为具有降低了的毒性。

分化的细胞的典型实例为血细胞、肝细胞、肾细胞和心脏细胞。

确定化合物对细胞活力和/或增值的作用的方法是本领域技术公知的，包括末端转脱氧核苷酰酶介导的生物素化的UTP缺口末端标记试验(TUNEL)、台盼蓝染料排除试验、MTT试验、胸腺嘧啶渗入试验或BrdU渗入试验。

本领域技术人员根据前述内容可知晓，本发明包括应用本申请任何实施方案所述的细胞鉴定和/或分离化合物的各种方法。适合的用于筛选的化合物包括抗体、肽或小分子。

本发明还提供鉴定或分离出的化合物的相关信息。因此，筛选方法可进一步作如下修饰：

(i)任选地，确定化合物的结构；和

(ii)提供该化合物或化合物的名称或结构，例如，以纸张形式、机器可读形式，或计算机可读形式。

当然，对于尽管是已知的但以前没有用本发明提供的筛选方法进行测定的化合物，确定该化合物的结构是暗含的。这是因为本领域技术人员在筛选时会知晓该化合物的名称和/或结构。

如本申请中所用的，术语“提供该化合物”应包括任何制备所述化合物的化学或重组合成方法，或可选地，提供先前已通过任何人或任何方法合成的化合物。这显然包括分离该化合物。

在一个优选的实施方案中，提供指示其用途的化合物或化合物的名称或结构，例如，如本申请筛选方式确定的。

筛选试验可进一步作如下修饰：

(i)任选地，确定化合物的结构；

(ii)任选地，提供该化合物的名称或结构，例如，以纸张形式、机器可读形式，或计算机可读形式；

(iii)提供该化合物。

在一个优选的实施方案中，提供指示其用途的合成化合物或该化合物的名称或结构，例如，如本申请筛选方式确定的。

在一个实施方案中，提供化合物库中的化合物，其各自或其亚单位可与其它成员分离(即，物理上分离的)。这种情况下，通过它的鉴定从该库中分离出化合物，然后，其使本领域技术人员能够通过分离独立制备该化合物，如在无该库中其它成员存在下。

具体实施方式

用下述的非限制性实例进一步描述本发明。

实施例1

由Stro-1⁺多能祖细胞制备重新设定的细胞

1.1富集Stro-1 ⁺ 多能祖细胞的细胞群

Stro-1⁺多能祖细胞从各种组织，包括骨髓、脂肪组织和牙髓组织中获得。为比较源自不同位点的Stro-1⁺多能祖细胞的重新设定效率，使用STRO3mAb通过免疫选择，使这些组织的每种细胞富集Stro-1^亮细胞，然后扩大培养并冻存于ProFreezeTM-CDM(Lonza，美国)中，基本上按照Gronthos和Zannettino(Methods Mol Biol.449：45-57，2008)描述的方法操作。为比较采用不同免疫选择方法源自相同位点的Stro-1⁺多能祖细胞的重新设定效率，使用STRO3或STRO1 mAbs通过免疫选择，使源自相同供体的配对骨髓样本富集Stro-1^亮细胞，然后扩大培养并冻存于ProFreezeTM-CDM(Lonza，美国)中，对于所有研究而言，解冻第4代的细胞，并于容器中配制备用。

1.2慢病毒载体包装和制备

转基因-表达的慢病毒载体在293FT细胞系(Invitrogen)中制备。293T是一种源自转化的293胚胎肾细胞的快速生长、高度转移性克隆变体，所述293胚胎肾细胞含有能高水平表达有助于更高病毒滴度的包装蛋白的大T抗原。对于常规维持和扩增而言，这些细胞在含有500μg/ml遗传霉素的293FT培养基(DMEM/10％FBS，2mM L-谷氨酰胺和0.1mM MEM非必需氨基酸)中培养。通过胰蛋白酶化收集293FT细胞用于包装。然后通过离心除去胰蛋白酶，这些细胞被分装到T75烧瓶(15×10⁶细胞/烧瓶中，每个构建6个烧瓶)内不含遗传霉素的293FT培养基中。

用Superfect

转染试剂(Qiagen)共转染慢病毒载体和两个辅助质粒，随后立即分装细胞。第二天用添加了1mM丙酮酸钠(8ml/烧瓶)的新鲜293FT培养基替换含有转染混合物的培养基。转导后大约48至72小时，收集含慢病毒的上清液。在4℃离心15分钟从上清液中除去293FT细胞碎片。取上清液通过0.4μM醋酸纤维素(CA)膜(Cornington，1 15ml低蛋白结合)过滤，40℃下在70ml灭菌瓶中超速离心(贝克曼，CAT#355622，仅45Ti转子为聚碳酸酯)2.5小时，浓缩慢病毒。然后除去上清液，加入PBS(每个构建约300μL)在40℃下摇动离心管8至14小时重悬颗粒，或在室温下摇动2小时。通过离心除去剩余的细胞碎片，将重悬的慢病毒分装并在-80℃储存。慢病毒带有编码一个或多个潜能决定因子的序列。

1.3慢病毒转导和表达潜能决定因子后重新设定细胞

加入聚凝胺载体使终浓度为约6μg/ml(Sigma)后，将编码一个或多个潜能决定因子(例如，Oct4；或者Oct4和Sox2的组合；或者Oct4、Sox2，及Nanog和Lin28中至少一个的组合；或者Oct4、Klf4和c-Myc的组合；或者Oct4、Sox2和Klf4的组合；或者Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合；或者Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的组合；或者Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28的组合)的慢病毒加入到细胞培养物中。

第二天用新鲜的培养基替换含有慢病毒的培养基，使细胞进一步在适宜的培养基中培养。如果需要的话，转导后的第三天开始选择药物。

在体细胞曝露于所述因子前后，利用细胞分选法分析细胞。通过胰蛋白酶(0.05％胰蛋白酶/0.5mM EDTA，Invitrogen)处理消化贴壁细胞，室温下用2％多聚甲醛固定20分钟。通过40μm筛过滤这些细胞，重悬于FACS缓冲液中(PBS含2％FBS和0.1％叠氮化钠)。在添加1mMEDTA和1％正常小鼠血清(Sigma)的FACS缓冲液中对悬浮液中生长的细胞进行染色。用Fix&Perm试剂(Caltag实验室；伯林格姆，CA)进行细胞内过氧化物酶(MPO)染色。每个标签中使用约100μl含5×10⁵个细胞的细胞悬浮液。在室温下进行一级和二级抗体孵育(适用时)约30分钟。用亚型匹配的对照抗体染色对照样品。洗涤后，将细胞重悬于约300-500μl FACS缓冲液中，使用CellQuest^TM采集和分析软件(BDIS)在FACSCalibur流式细胞仪(BDIS，加利福尼亚州圣何塞)上进行分析。共取得20,000件样品。检测的标志物选自SSEA-3、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60、Tra-1-81、CD29、Tra-1-85、CD56、CD73、CD105、CD31或CD34。

在一些转导和随后的培养中，细胞保持现状或保存于丙戊酸中。

EB和畸胎瘤的形成也被用来证明，重新设定的细胞具有成为所有三个初级胚层的分化型衍生细胞的发育潜能。

实施例2

由Stro-1⁺多能祖细胞制备重新设定的细胞

2.1材料和方法

富集Stro-1⁺多能细胞的细胞群

富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群从骨髓、脂肪组织和牙髓组织中获得。为比较源自不同位点的Stro-1⁺多能祖细胞的重新设定效率，使用STRO3 mAb通过免疫选择，使这些组织中每种细胞都富集Stro-1^亮细胞，然后扩大培养并冻存于ProFreezeTM-CDM(Lonza，美国)中，基本上按照Gronthos和Zannettino(Methods Mol Biol.449：45-57，2008)描述的方法操作。为比较采用不同免疫选择方法源自相同位点的Stro-1⁺多能祖细胞的重新设定效率，使用STRO3或STRO1 mAbs通过免疫选择，使来自相同供体的配对骨髓样本富集Stro-1^亮细胞，然后扩大培养并冻存于ProFreezeTM-CDM(Lonza，美国)中，对于所有研究而言，解冻第4代的细胞，于容器中配制备用。

细胞系

铂-A(Plat-A)细胞和病毒包装细胞从Cell Biolabs，Inc.获得。Detroit 551成纤维细胞为实验的阳性对照。

逆转录病毒的制备和iPS细胞的生产

从Addgene获得含有OCT4、SOX2、KLF4和cMYC的人cDNA的Moloney-逆转录病毒载体(pMXs)。用Fugene 6(Roche)将9μg每种质粒转染入病毒包装Plat-A细胞。转染后48h和72h收集含病毒的上清液，通过0.45μm孔径的过滤器过滤，补充4μg/ml聚凝胺(Sigma)。感染前以1×10³至5×10³细胞/cm²的密度平板培养靶细胞24h。将四个转录因子的逆转录病毒上清液等量混合，在24h和48h将双重感染物添加到靶细胞中。在感染后第4天将感染细胞的培养基更换为hES细胞培养基。细胞在每天更新的培养基中培养至3周，或直到细胞达到汇合。

iPS细胞的繁殖

在感染后约第3周，根据hES细胞样的集落形态挑取iPS细胞集落，建立iPS细胞系。将挑取的集落于hES细胞培养基中在新鲜分裂灭活的MEFs上扩增。

iPS细胞的维持

在增补了20％FBS(Hyclone)、1mM L-Glutamax、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM β-巯基乙醇、1％ITS和10ng/ml bFGF(均来自Invitrogen)的DMEM中培养人iPS细胞。每天更新人iPS细胞的培养基。通过使用具有29G针的1ml胰岛素注射器将iPS细胞集落分割成更小的细胞簇，进行机械消化。感染后8-10天之后，将集落转移到新鲜分裂灭活的MEFs。iPS集落每7-10天传代后，再进行机械消化。

FACS分析

用上述同样的方法将pMXs-GFP逆转录病毒载体转染到Plat-A细胞，估计细胞的转染率。将含有GFP cDNA的pMXs逆转录病毒添加到细胞中。感染后48小时通过流式细胞仪评估表达GFP的细胞数量。用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)消化细胞5分钟，使用流式细胞仪(MoFLO)进行分析。

重新设定率分析

按照上面“逆转录病毒的制备和iPS细胞的生产”的描述，用4个因子感染脂肪细胞、牙髓细胞和MPCs。每天变换新培养基维持细胞17天。然后用胰蛋白酶消化细胞，用4％多聚甲醛固定。细胞用2.5％(w/v)脱脂奶粉和含2％(v/v)山羊血清的PBS封锁。用一级抗体(鼠抗-Oct4、抗-Nanog或抗-SSEA4)标记细胞，4℃过夜，然后用山羊抗小鼠Alexa 488二级抗体在室温下标记1小时。按照上述方法采用FACS分析样品，测定阳性染色细胞的数量。

2.2结果

所有富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群，不论它们是源自牙髓、脂肪组织还是骨髓，也不论它们是由STRO-3还是由STRO-1mAbs进行免疫选择，都能够被重新设定并产生iPS细胞系。

各种细胞的重新设定结果总结如表1所示。

表1：细胞重新设定实验的结果

所有细胞类型的转染率，如GFP报告构建所测定，都是相似的，范围在71.2-98.3％之间。测量每平板生长的iPS集落数量的研究结果表明，与源自D551胎儿成纤维细胞的细胞系相比，源自牙髓和脂肪组织的富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群的细胞系推定的iPS细胞集落形成显著较高。此外，源自牙髓和脂肪组织的富集Stro-1⁺多能祖细胞细胞群的细胞系的iPS细胞集落形成明显高于源自骨髓的Stro-1⁺多能祖细胞细胞系。牙髓和脂肪组织(分别为56和22)的平均集落数(每50,000个细胞培养)均显著高于观察到的D551的成纤维细胞(7)或骨髓(0.5)(p＜0.05，卡方检验)。

为了检验由Stro-1⁺多能祖细胞生成的iPS相对于D551成纤维细胞所提高的效率是否与外源转染的基因或诱导内源基因的持续表达相关，我们下一步在总的培养的转染细胞群中测量了Oct4和Nanog的表达。如表1所示，转染的D551成纤维细胞表现出Oct4持续表达的水平最高(69％)，转染的源自牙髓或脂肪组织的Stro-1⁺多能祖细胞的Oct4表达水平居中(分别为57％和56％)，转染的骨髓Stro-1⁺多能祖细胞的Oct4表达水平最低(36％)。

源自牙髓或脂肪组织的Stro-1⁺多能祖细胞的转染群表达Nanog的细胞总数(分别为5％和10％)低于转染的D551成纤维细胞(28％)。骨髓Stro-1⁺多能祖细胞的Oct4和Nanog的表达模式始终相似，不论它们是否从相同的配对骨髓样本用STRO-3或STRO-1mAb进行免疫选择(Oct4的分别为30％和37％，Nanog的分别为17％和21％)。

结合此前公布的数据(Chan et al.，Nature Biotech.27(11)：1033-1037(2009))显示，诱导的Nanog表达可能与处在中期的iPS样的集落相关，但不一定进展到最终的iPS阶段，我们发现转染的源自牙髓或脂肪组织的Stro-1⁺多能祖细胞的Nanog表达较低，但显着高于D551成纤维细胞的iPS集落数，这表明对于在暴露于潜能因子后进展成为最终的iPS细胞集落形成，Stro-1⁺多能祖细胞代表一种适应面更广的(permissive)细胞类型。

这些结果共同表明：

1)尽管转染后有相似的Oct 4表达，但源自牙髓和脂肪组织的富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群产生iPS细胞集落，比对照的成纤维细胞更高效且具有更多的数量；

2)尽管转染后诱导Nanog的表达较低，但源自牙髓和脂肪组织的富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群产生最终的iPS细胞集落，比对照的成纤维细胞更高效且具有更多的数量；以及

3)组织来源可以影响iPS细胞集落形成的效率，因为源自牙髓和脂肪组织的富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群产生iPS细胞集落比源自骨髓的富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群更高效。

免疫荧光法

通过免疫荧光法，源自牙髓的iPS细胞集落显示能表达Oct4、Nanog、SSEA4、TRA1-60和TRA1-81。这些细胞也显示能表达碱性磷酸酶。

通过免疫荧光法，源自脂肪组织的iPS细胞集落显示能表达Oct4和表达碱性磷酸酶。

iPS细胞系的基因表达

基因表达的研究结果见表2。

综上所述，所有富集Stro-1⁺多能祖细胞的细胞群，不论它们是从牙髓、脂肪组织还是骨髓获得，在感染前均能内源表达KLF4和c-myc。不希望被理论或行为模式束缚，通过Stro-1⁺多能祖细胞内源表达这些潜能因子，可以部分解释用Stro-1⁺多能祖细胞比用成纤维细胞生成的iPS具有更高的效率。然而，其他因子也可以解释源自牙髓或脂肪组织的Stro-1⁺多能祖细胞生成的iPS系比源自骨髓的那些观察到的效率更高。

建立的牙iPS细胞系表达了所有内源基因Oct 4、Sox 2、c-myc和Klf4。外源Oct4和c-myc在第3代和第8代沉默，但Sox 2和Klf4仍然表达。

第2代脂肪IPSCs仅表达了内源性Klf4。外源性Oct 4和c-myc仍然保持未沉默。

第2代骨髓MPCs没有显示任何内源基因表达。在这些细胞中沉默的唯一的外源基因是Sox2。

表2：iPS细胞株的RT-PCR特征

Claims

1.一种制备重新设定的细胞的方法，所述方法包括在足以重新设定细胞的条件下，将Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞暴露于一个或多个潜能决定因子。

2.一种制备重新设定的细胞的方法，所述方法包括在足以重新设定细胞的条件下，将富含Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞的细胞群暴露于一个或多个潜能决定因子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞或富含Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞的细胞群源自脂肪组织、牙髓组织或骨髓。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括培养所述暴露的细胞以制备重新设定的细胞。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括分离所述重新设定的细胞。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其包括培养所述暴露的细胞以获得比Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞具有更广泛分化潜能的重新设定的细胞。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述一个或多个潜能决定因子单独地或共同地选自下组：Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、Lin28、c-Myc、bFGF、SCF、TERT、SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Fbx15、Eras、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、ECAT1、ESG1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fthl17、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3和Grb2或者对一个或多个所述因子具有相同或相似活性的化合物。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述一个或多个潜能决定因子为化学品、肽、siRNA、短发夹RNA或微RNA。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述一个或多个潜能决定因子单独地或共同地选自下组：

(i)Oct4；

(ii)Oct4和Sox2的组合；

(iii)Oct4、Sox2，及Nanog和Lin28中至少一个的组合；

(iv)Oct4、Klf4和c-Myc的组合；

(v)Oct4、Sox2和Klf4的组合；

(vi)Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的组合；

(vii)Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的组合；

(viii)Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog和Lin28的组合；以及

(ix)(i)至(x)中的任一项再与化学品、肽、siRNA、shRNA或微RNA的组合。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞从产后的哺乳动物中获得。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述哺乳动物为人。

12.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞暴露于一个或多个潜能决定因子包括将包含编码能可操作地连接到启动子的一个或多个潜能决定因子的序列的核酸引入Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其包括施以多个核酸，每个核酸包含编码能可操作地连接到启动子的不同的潜能决定因子的序列。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述核酸存在于一个或多个载体中。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体为病毒载体。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸没有整合到Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞的基因组中。

17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重新设定的细胞为多能的。

18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重新设定的细胞(i)表达选自下组的细胞标记物：Oct-4、Nanog、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81；(ii)具有多能干细胞的形态特征；和/或(iii)当被引入到免疫缺陷的动物中时，形成畸胎瘤。

19.通过实施权利要求1-18任一项所述方法制备的细胞。

20.通过实施权利要求1-18任一项所述方法制备的富含多能干细胞的细胞群。

21.根据权利要求20所述的富含多能干细胞的细胞群，其中所述多能干细胞占所述细胞群的至少60％。

22.分化自权利要求18-21任一项所述细胞或细胞群的细胞或细胞群。

23.Stro-1⁺多能细胞和/或其子代细胞，其包含编码能可操作地连接到异源启动子的潜能决定因子的核酸。

24.权利要求19-23任一项所述细胞或细胞群在药物中的应用。

25.一种治疗或预防疾病或失调的方法，该方法包括向有需要的个体施用权利要求19-23任一项所述的细胞或细胞群。

26.一种筛选用于治疗或预防疾病或失调的化合物的方法，该方法包括将权利要求19-23任一项所述的细胞或细胞群暴露于所述化合物。