KR20120000079A - 재프로그램된 다분화능 세포의 생성 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포를, 당해 세포를 재프로그램하기에 충분한 조건하에 하나 이상의 효능 결정 인자에 노출시키는 방법을 포함하는, 재프로그램된 세포의 생성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 이들 세포의 다양한 용도 뿐만 아니라 이러한 방법으로 생성된 세포 및 이로부터 분화된 세포를 제공한다.

Description

재프로그램된 다분화능 세포의 생성 방법{Production of reprogrammed pluripotent cells}
본 발명은 다분화능 세포 및 이의 생성 방법에 관한 것이다.
배아 줄기(ES) 세포는 다분화능을 유지하면서 의도적으로 무기한 성장하고, 모든 3개 배엽, 즉, 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 세포로 분화할 수 있다[참조: Evans & Kaufman, Nature 292: 154-156 (1981)]. 사람 ES 세포 및 이로부터 유도된 세포는 파킨슨씨병, 척수 손상 및 당뇨병 등과 같은 질환의 숙주 치료용으로 현재 평가되고 있다. 그러나, 사람 ES 세포가 사람 배로부터 수득된다는 사실은 다수의 매우 논쟁이 있는 윤리적 문제를 일으키고, 다수의 국가에서는 이들 세포의 유도가 법으로 금지되고 있다. 추가로, ES 세포 및 이로부터 유도된 세포는 이들이 유도되는 대상체로부터 항원을 발현하고, 이들 세포는 매칭되지 않는(예를 들면, 유사한 HLA 형태(들)를 발현하지 않는) 대상체에게 투여되는 경우에 거부될 것이다. 따라서, 과학자들은 ES 세포를 생성하는 현재의 방법을 회피하는 기술적 해결책을 찾고자 한다. 이들 해결책을 달성하는 한 가지 바람직한 방법은 출생후 대상체의 체세포로부터 직접, 예를 들면, 치료되는 대상체 또는 관련된 또는 달리는 매칭된 대상체로부터 직접 다분화능 세포를 생성하는 것일 수 있다.
체세포를 재프로그램하는 한 가지 방법은 세포의 핵 내용물을 난모세포로 전달하거나[참조: Wilmut et al, Nature 385:810-813(1997)] ES 세포와의 융합[참조: Cowan et al, Science 309: 1369-1373 (2005)]을 수반하고, 이는 비수정 난 및 ES 세포가 체세포에서 분화전능성(totipotency) 또는 다분화능을 제공하는 인자를 함유함을 나타낸다. 이들 방법과 관련된 어려움은 몇몇 국가에서 윤리적 문제를 일으킬 수 있는 난자 및/또는 배아의 파괴에 대한 요구를 포함한다.
다분화능의 전사 결정은 완전히 이해되지는 않지만, Oct 3/4[참조: Nichols et al , Cell 95:379-391(1998)], Sox2[참조: Avilion et al , Genes Dev . 17: 126-140 (2003)] 및 Nanog[참조: Chambers et al , Cell 113:643-655(2003)]를 포함한 몇몇 전사 인자는 ES 세포 다분화능의 유지에 관련되어 있지만, 어떤 것도 ES 세포 동일성을 단독으로 명시하기에는 충분하지 않다.
최근 들어, 다카하시 및 야마나카(Takahashi & Yamanaka)는 4개 인자(즉, Oct4, Sox2, c-Myc 및 Klf4)를 마우스 ES 세포 배양에 적합한 조건하에 배양한 마우스 ES 세포 및 마우스 성숙 섬유아세포 내로 도입했다. 소정 세포 종류로 형질도입 후, 상기 저자들은 유도된 다분화능 줄기(iPS) 세포를 수득했고, 이들 줄기 세포는 마우스 ES 세포 종류 및 성장 특성을 나타냈고, 마우스 ES 세포 마커 유전자를 발현했다[참조: Takahashi & Yamanaka, Cell 126:663-676 (2006)]. 누드 마우스 내로 iPS 세포의 피하 이식은 모든 3개 배엽으로부터 다양한 조직을 함유하는 종양을 생성했다. 섬유아세포 내로의 주입 후, iPS 세포는 마우스 배 발달에 기여했다. 이들 데이타는 다분화능 세포가 레트로바이러스 형질도입을 사용하는 소수의 규정된 인자만을 부가함으로써 마우스 섬유아세포 배양물로부터 직접 생성될 수 있음을 입증한다. 그러나, 이러한 기술은, 낮은 비율의 재프로그래밍(처리된 세포의 1% 미만에 상당) 및 온코진 c-Myc 및 Klf4의 게놈 통합 및 연속 발현에 대한 요구를 포함하는 몇몇 주요 단점을 갖는다. 이들 유전자의 발현은 당해 세포 및 이로부터 유도된 세포의 수용체에서 종양의 생성을 유도할 수 있다. 이와 관련하여, 이들 방법으로 생성된 iPS 세포를 사용하여 생성된 키메라 마우스는, 아마도 이들 온코진의 연속 발현의 결과로서, 종양을 발생시킨다. 결과적으로, 당해 분야에서의 주요 연구 목표는 이들 인자를 코딩하는 핵산의 게놈 통합을 필요로 하지 않거나 이들 및 다른 재프로그래밍 인자의 수 또는 발현 기간을 최소화하는 재프로그래밍 방법을 개발하는 것이다.
iPS 세포 기반 연구의 대다수는 섬유아세포를 사용하지만, 아마도 이들의 유도 용이성 및 융합 기반 재프로그래밍 연구에서의 광범위한 사용에 기인하여, 다양한 세포 모집단이 섬유아세포 이외에 마우스에서의 iPS 세포 유도에 사용되어 왔다. 이들 연구로부터의 중요한 관찰은 선택된 체세포 형태가 iPS 세포 생성 효능 및 재프로그래밍 수준에 대한 현저한 효과를 갖는다는 것이다. 이와 관련하여, 신경 줄기 세포, 위 세포 및 간 세포 등의 몇몇 세포 종류는 섬유아세포와 비교하여 비교적 높은 효율로 재프로그래밍하는 것 같다. 그러나, 사람으로부터 이들 세포의 분리는 조직 수집의 침략적 성질 및/또는 이용가능한 제한된 공여체 샘플에 기인하여 곤란하거나 용이하지 않다. 보다 접근가능한 몇몇 세포 종류(예: 근육 세포 또는 분화된 조혈 세포)가 iPS 연구를 위한 기초로서 사용되고 있으나, 재프로그래밍은 제한된 성공에 도달했다.
따라서, 당해 기술분야에서는 효율적인 재프로그래밍이 용이하게 접근가능하고 확실하게 가능한 최적 세포 종류를 동정하는 것이 요구되고 있다. 효율적인 재프로그래핑 특성을 갖는 이러한 세포 종류를 동정하는 것은 게놈 통합의 필요 없이 및/또는 최소 또는 감소된 수의 재프로그래밍 인자에 의해 재프로그래밍 방법의 사용을 촉진시킬 수 있다. 이는 신생물 형질전환의 위험 감소와 함께 보다 안전한 다분화능 iPS 세포 모집단을 생성할 것이다. 재프로그래밍에 매우 효율적이고 배 조직에 의존하지 않고서 수득되는 이러한 세포 종류는 종래의 다분화능 ES 세포에 대해 이미 고려된 분야에서의 사용에 적합할 것이다.
발명의 요약
본원 발명에 이르는 연구에서, 본 발명자들은, 다수의 조직 공급원이 iPS 세포를 효율적으로 생성하기에 적합한 공급원이 아니라는 통상의 지식에도 불구하고, 다양한 공급원으로부터의 세포를 사용하여 iPS 세포를 생성하려고 시도했다. 놀랍게도, 본 발명자는 Stro-1+ 다능성 세포 또는 이의 후대 세포(특히, 지방 조직 또는 치수 조직으로부터의 것들)가 높은 효율, 예를 들면, 섬유아세포보다 높은 효율로 iPS 세포를 생성하기에 유용한 공급원임을 발견하였다.
본 발명자들은 또한 Stro-1+ 다능성 세포 또는 이의 후대 세포가 재프로그램 섬유아세포에 통상 외생적으로 첨가될 필요가 있는 내생 인자를 발현하여 iPS 세포, 예를 들면, Klf4 및/또는 c-myc를 생성함을 측정했다. 이러한 내생 유전자 발현은 고도의 이들 단배질을 도입하지 않거나 비-내생 형태의 단백질을 전혀 도입하지 않고서 iPS 세포의 생성을 가능하게 할 수 있다. c-myc의 내생 발현은 또한 이들이 이러한 온코진의 구조적 및/또는 강력한 발현을 필요로 하지 않을 수 있기 때문에 종양원의 위험이 감소된 iPS 세포의 생성을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 한 가지 예는 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포를, 당해 세포를 재프로그램하기에 충분한 조건하에 하나 이상의 효능 결정 인자에 노출시키고, 노출된 세포를 배양하여 재프로그램된 세포를 수득함을 포함하는, 재프로그램된 세포의 생성 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 예는, Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포로 강화된 세포 모집단을 세포의 재프로그램화에 충분한 조건하에 하나 이상의 효능 결정 인자에 노출시킴을 포함하는 재프로그램된 세포의 생성 방법을 제공한다. 이 방법은 유도된 다분화능 줄기세포를 생성하는 방법에 동일하게 적용된다.
Stro-1+ 다능성 세포의 공급원은 이들 세포가 동일 반응계에 위치된 임의의 조직일 수 있다. 바람직하게는, Stro-1+ 다능성 세포의 공급원은 지방 세포 또는 치수 조직이다. Stro-1+ 세포의 공급원은 골수이다.
한 가지 예에서, Stro-1+ 다능성 세포 또는 이의 후대는 하나 이상의 효능 결정 인자에 노출시키기 전에 지방 조직, 치수 조직, 골수 또는 기타 부위로부터 강화된다.
한 가지 예에서, 본 발명의 방법은 노출된 세포를 배양하여, Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포보다 광범위한 분화 능력을 갖는, 즉 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대보다 광범위한 세포 계통 및/또는 세포 종류로 분화할 수 있는 재프로그램된 세포를 수득하는 것을 포함한다.
예시적인 효능 결정 인자에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, Lin28, c-Myc, bFGF, SCF, TERT, SV40 거대 T 항원, HPV16E6, HPV16E7, Bmil, Fbx15, Eras, ECAT15-2, Tcl1, β-카테닌, ECAT1, ESG1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sal14, Rex1, UTF1, Stella, Stat3, FoxD3, ZNF206, Mybl2, DPP A2, Otx2 및 Grb2, 또는 하나 이상의 이러한 인자와 동일하거나 유사한 활성을 갖는 화합물, 예를 들면, 이의 활성 단편 또는 작은 분자로 이루어진 그룹으로부터 개별적으로 또는 집합적으로 선택된 인자가 포함된다. 또 다른 예시적 효능 결정 인자는, 예를 들면, 본원 기재된 바와 같은 화학물질, 펩티드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA이다. 예를 들면, 하나 이상의 효능 결정 인자는,
(i) Oct4;
(ii) Oct4와 Sox2의 조합;
(iii) Oct4, Sox2 및 적어도 하나의 Nanog 및 Lin28의 조합;
(iv) Oct4, Klf4 및 c-Myc의 조합;
(v) Oct4, Sox2 및 Klf4의 조합;
(vi) OCT4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 조합;
(vii) Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 조합;
(viii) Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28의 조합; 및
(ix) 화학물질, 펩티드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA와 추가로 조합된 상기 (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 개별적으로 또는 집합적으로 선택된다.
바람직하게는, 효능 결정 인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc이다.
본 발명의 방법의 한 가지 예에서, Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포는 출생후 대상체로부터 수득된다. 이러한 양태에 따라서, 당해 방법은 대상체로부터 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포를 수득 또는 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이고/이거나, 세포는 포유동물 세포이다. 예시적인 포유동물 대상체에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 사람, 영장류, 가축(예: 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 동반 동물(예: 개, 고양이), 실험실 시험 동물(마우스, 래빗, 랫트, 기니아 피그, 햄스터), 사육 야생 동물(예: 여우, 사슴)이 포함된다. 바람직한 포유동물은 사람 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유동물은 사람이다.
본 발명의 한 가지 예시적 형태에서, Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포를 하나 이상의 효능 결정 인자에 노출시키는 것은 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 효능 결정 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포에 도입하는 것을 포함한다. 복수의 효능 인자 코딩 핵산은 서로 특이적이거나 단일 핵산, 예를 들면, 별개의 프로모터에 연결되거나 단일 프로모터에 연결된 복수의 핵산을 포함하는 단일 발현 벡터, 예를 들면, 다중 스트론 벡터에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 벡터, 보다 바람직하게는 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터에 함유된다.
본 발명의 한 가지 예에서, 핵산은 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포의 게놈 내로 통합되지 않는다. 예를 들면, 핵산(들)은 세포(들) 내의 하나 이상의 에피좀으로서 잔류하고/하거나 세포(들)로부터 결국 제거된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 다능 또는 다분화능 또는 분화전능 세포, 보다 바람직하게는 다분화능 세포를 생성한다. 한 가지 예에서, 재프로그램된 세포는 (i) Oct-4, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 마커를 발현시키고; (ii) 다분화능 세포의 형태학적 특성을 나타내며; (iii) 면역절충 동물 내로 도입되는 경우에 기형종을 형성한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 재프로그램된 세포를, 목적하는 세포 종류를 포함하거나 이러한 세포 종류로 강화된 세포 모집단 내로 분화시키는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 방법은 또한 목적하는 세포 종류를 분리하거나, 강화시키거나 선별하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 치료 또는 스크리닝에 유용하다. 또는, 이러한 분화된 세포는, 예를 들면, 다분화능 세포가 당해 증상을 앓는 대상체로부터 생성되는 경우, 질병 증상 또는 징후에 대한 연구에 유용하다.
또 다른 예에서, 본 발명의 방법은 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법으로 생성된 유효량의 세포를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물로 제형화하는 것을 포함한다.
또 다른 예에서, 본 발명은 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 세포 또는 이의 모집단 또는 재프로그램된 세포로 강화된 모집단을 제공한다. 유사하게는, 본 발명의 예시적 형태는 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 세포 또는 모집단으로부터 분하된 세포 또는 세포 모집단을 제공한다.
본 발명의 또 다른 예는 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된 효능 결정 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포를 제공한다. 이러한 세포는 재프로그램된 세포의 생성에 유용하다.
임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행하여 생성한 세포는 의약, 예를 들면, 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 유용하고, 당해 방법은 세포 또는 이의 모집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다.
임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행하여 생성한 세포는 또한 스크리닝에 유용하다. 예를 들면, 본 발명은 질환 또는 질병의 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 본 발명에 따르는 세포 또는 모집단을 상기 화합물에 노출시킴을 포함한다.
예를 들면, 본 발명은,
i) 본 발명에 따라 생성한 다분화능 세포 또는 이의 모집단을 시험 화합물과 접촉시키고 이로부터 분화된 세포의 양을 측정하는 단계;
ii) 본 발명에 따라 생성된 다분화능 세포 또는 이의 모집단으로부터 분화된 세포의 양을 당해 화합물의 부재하에 측정하는 단계 (여기서, 단계(ii)와 비교하여 단계(i)에서 분화된 세포의 증가량은 당해 화합물이 다분화능 세포의 분화를 유도함을 나타낸다)를 포함하는, 다분화능 세포의 분화를 유도하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 하나 이상의 특이적 분화된 세포 종류의 양을 측정함을 포함한다. 이러한 방식에서, 특이적 계통 또는 세포 종류로의 분화를 유도하는 화합물이 측정된다.
본 발명이 또한 다분화능 세포의 분화를 감소시키거나 방지하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는 것은 상기 기재를 토대로 하여 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
본 발명은 또한,
(i) 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행하여 증상을 앓고 있는 대상체로부터 다분화능 세포 또는 이의 모집단을 생성하는 단계; 및
(ii) 상기 세포 또는 모집단을 시험 화합물과 접촉시키고 상기 증상의 하나 이상의 징후에 대한 이의 효과를 측정하는 단계(여기서, 상기 증상의 징후를 개선시키거나 완화시키는 화합물은 당해 증상의 치료에 유용하다)를 포함하는, 증상의 치료에 유용한 화합물을 동정하거나 분리하는 방법을 제공한다.
한 가지 예에서, 당해 방법은
(a) 다분화능 세포 또는 이의 모집단을 당해 증상에서 발병된 세포로 분화시키는 단계; 및
(b) (a)에서의 당해 세포를 시험 화합물과 접촉시키고 당해 증상의 하나 이상의 징후에 대한 이의 효과를 측정하는 단계(여기서, 당해 증상의 징후를 개선시키거나 완화시키는 화합물은 당해 증상의 치료에 유용하다)를 포함한다.
이러한 방법은 증상을 치료하기 위한 신규 화합물을 동정 또는 분리하는 것 뿐만 아니라 대상체가 종래의 치료학적/예방학적 화합물에 의한 치료에 반응하는지의 여부를 동정하는데 유용하다.
이러한 방법은 또한, 당해 화합물이 성숙 및 분화되고 재프로그램된 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포으로부터 유도된 하나 이상의 표적 조직에 노출되는 경우에 화합물의 임의의 특이적 독성 효과를 동정하는데 유용하다.
일반
본 명세서 전체에 걸쳐, 달리 명시되거나 당해 문맥이 달리 요구하지 않는한, 단일 단계, 당해 조성, 단계 그룹 또는 당해 조성물 그룹에 대한 기준은 이들 단계, 당해 조성물, 단계 그룹 또는 당해 조성물 그룹의 하나 및 복수(즉, 하나 이상)를 포괄하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 기재된 각 양태는, 달리 명시되지 않는 한, 각각 및 모든 다른 양태에 준용하여 적용되어야 한다.
당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원에 기재된 본 발명이 구체적으로 기재된 것들 이외의 변화 및 변형에 적용되는 것을 인지할 것이다. 본 발명이 모든 변화 및 변형을 포함하는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 개별적으로 또는 집합적으로 참조되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 둘 이상의 상기 단계 또는 특징을 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 양태로 범위가 한정되지 않으며, 이는 단지 예시를 위한 것으로 의도된다. 균동 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 명백하게 포함된다.
본 발명은, 달리 지시되지 않는 한, 분자생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액 내에서의 펩티드 합성, 고상 펩티드 합성 및 면역학의 통상의 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 수행된다. 이러한 공정은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of VoIs I, II, and DI; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, whole of text; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, whole of text, and particularly the papers therein by Gait, ppl-22; Atkinson et al, pp35-81; Sproat et al, pp 83-115; and Wu et al, pp 135-151; 4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, whole of text; Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, whole of text; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), whole of series; J.F. Ramalho Ortigao, "The Chemistry of Peptide Synthesis" In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany); Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342; Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York. 12. Wusch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muer, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int . J. Peptide Protein Res . 25, 449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); and Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R. W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, 전체 텍스트]에 기재되어 있다.
선택된 정의
"집합적으로"란 본 발명이 임의 수 또는 조합의 인용된 단백질 또는 마커 또는 단백질 또는 마커 그룹을 포함하고, 이러한 수 또는 조합의 단백질 또는 마커 또는 단백질 또는 마커 그룹이 본원에서 구체적으로 수록되지 않더라도, 첨부 특허청구범위가 임의의 다른 조합의 단백질 또는 마커 또는 단백질 또는 마커 그룹으로부터 이러한 조합 또는 부조합을 개별적으로 또는 분리하여 규정할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 당해 문맥이 달리 요구하지 않으면, 단어 "포함하는" 또는 "포함한다" 또는 "포함한" 등의 변형태는 언급된 단계 또는 요소 또는 정수, 또는 단계들 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 포함하고, 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 정수, 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "로부터 유도된"은 명시된 정수가, 당해 공급원으로부터 반드시 직접 유도될 필요는 없지만, 특정 공급원으로부터 수득될 수 있음을 나타내는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은, 투여 전의 동일한 과정 또는 증상과 비교하고/하거나 당해 세포가 투여되지 않은 대상체와 비교하여, 생리학적 과정 또는 질환 증상을 개선하거나 질환 증상이 대상체에서 발생하는 것을 방지하기에 충분한 양의 재프로그램 세포 또는 이로부터 분화된 세포 및/또는 이의 후대 세포를 의미하는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 모집단과 관련하여 용어 "강화된"은 재프로그램된 세포 또는 다분화능 세포의 수 또는 비율이 자연 발생 세포 모집단에서의 수 또는 비율보다 큰 것을 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 재프로그램된 또는 다분화능 세포로 강화된 모집단은 상기 세포의 적어도 약 0.02%, 또는 상기 세포의 적어도 약 0.05% 또는 상기 세포의 적어도 약 0.1% 또는 상기 세포의 적어도 약 0.2% 또는 상기 세포의 적어도 약 0.5% 또는 상기 세포의 적어도 약 0.5% 또는 상기 세포의 적어도 약 0.8% 또는 상기 세포의 적어도 약 1% 또는 상기 세포의 적어도 약 2% 또는 상기 세포의 적어도 약 3% 또는 상기 세포의 적어도 약 4% 또는 상기 세포의 적어도 약 5% 또는 상기 세포의 적어도 약 10% 또는 상기 세포의 적어도 약 15% 또는 상기 세포의 적어도 약 20% 또는 상기 세포의 적어도 약 25% 상기 세포의 적어도 약 30% 또는 상기 세포의 적어도 약 40% 또는 상기 세포의 적어도 약 50% 또는 상기 세포의 적어도 약 60% 또는 상기 세포의 적어도 약 70% 또는 상기 세포의 적어도 약 80% 또는 상기 세포의 적어도 약 85% 또는 상기 세포의 적어도 약 90% 또는 상기 세포의 적어도 약 95% 또는 상기 세포의 적어도 약 97% 또는 상기 세포의 적어도 약 98% 또는 상기 세포의 적어도 약 99%로 구성된다.
용어 "노출" 및 문법적 동의어, 예를 들면, "노출하는"은 세포가 당해 인자에 대한 효능 결정 인자와 충분히 인접하여 세포에 대한 생물학적 효과를 나타내는 임의의 공정을 의미하는 것으로 간주된다. 당해 용어는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 세포를 인자와 접촉시키고/시키거나, 세포를 당해 인자를 코딩하고/하거나 세포에서 당해 인자를 발현시키는 핵산과 접촉시킴을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"개별적으로"는 본 발명이 인용된 단백질 또는 마커, 또는 단백질 또는 마커 그룹을 개별적으로 포함하고, 개개 단백질 또는 마커, 또는 단백질 또는 마커 그룹이 본원에서 별도로 수록되지 않더라도, 첨부 특허청구범위가 이러한 단백질 또는 마커, 또는 단백질 또는 마커 그룹을 서로 개별적으로 및 분리하여 규정할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "iPS 세포"는 이들의 각 분화된 체세포 기원(예: Stro-1+ 다능성 세포 또는 이의 후대 세포)과 유전적으로 실질적으로 동일하고 고효능 세포(예: ES 세포)와 유사한 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. iPS 세포는 형태학적(즉, 원형 형상, 거대 핵 및 불완전 세포질) 및 ES 세포와 유사한 성장 특성(즉, 배가 시간; ES 세포는 약 17 내지 18시간의 배가 시간을 갖는다)을 나타낸다. 또한, iPS 세포는 바람직하게는 다분화능 세포 특이적 마커(예: Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, 단, SSEA-I 제외)를 발현한다. 그러나, iPS 세포는 배로부터 즉시 유도되지 않고, 적어도 이들이 다분화능으로 될 때까지, 선택된 효능 결정 인자의 하나 이상의 복사체를 일시적으로 또는 안정하게 발현시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "배로부터 즉시 유도되지 않는"은 iPS 세포를 생성하는 개시 세포 종류가 출생후 대상체로부터 수득된 비-다분화능 Stro-1+ 다능성 세포 또는 이의 비-다분화능 후대임을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능(multipotent)"은 세포가 3개의 배엽(중배엽, 내배엽 및 외배엽) 중의 1개 또는 2개 또는 3개, 바람직하게는 배엽 중의 1 또는 2개의 복수의 상이한 세포 종류로 분화할 수 있음을 의미하는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다분화능(pluripotent)"는 세포가 3개 배엽(즉, 내배엽, 외배엽 및 중배엽) 각각의 세포로 분화할 수 있음을 의미하는 것으로 간주된다. 다분화능 세포는 다양한 다분화능 세포 특이적 마커(예: 다음 다분화능 세포 특이적 마커 중의 하나 이상: SSEA-3, SSEA-4, TRA- 1-60 또는 TRA 1-81)을 발현하고, 미분화 세포의 세포 형택 특징(즉, 소형 콜로니, 높은 핵 대 세포질 비율 및 현저한 핵소체)를 갖고, 면역절충 동물, 예를 들면, SCID 마우스 내로 도입되는 경우에 기형종을 형성한다. 기형종은 통상 3개 모든 배엽의 세포 또는 조직 특성을 함유한다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 당해 기술분야에 통상적으로 공지된 기술을 사용하여 이들 특성을 평가할 수 있다[참조: Thomson et al , Science 282:1145-1 147 (1998)]. 다분화능 세포는 세포 배양물에서 증식할 수 있고, 다능 특성을 나타내는 다양한 계통 제한 세포 모집단으로 분화할 수 있다. 다능 체세포는 다능성 세포와 비교하여 보다 더 분화되지만, 정기적으로 분화되지는 않는다. 따라서, 다분화능 세포는 다능성 세포보다 높은 효능을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효능 결정 인자"는, 다능, 다분화능 또는 분화전능으로 되도록, 체세포의 효능 증가에 사용된 인자, 예를 들면, 유전자 또는 기타 핵산, 이의 작용성 단편뿐만 아니라, 코딩된 인자(예: 단백질 또는 이의 작용성 단편) 또는 작은 분자 또는 항체를 지칭한다. 효능 결정 인자는 임의로 재프로그램된 세포에 단지 일시적으로 존재할 수 있거나, 핵산의 경우에는 재프로그램된 세포의 게놈 내에 전사 활성 또는 불활성 상태로 유지될 수 있다. 마찬가지로, 핵산 효능 결정 인자는 재프로그램된 세포 내에 하나 이상의 복사체로 존재할 수 있고, 여기서 효능 결정 인자는 세포 게놈 내에 통합되거나 염색체 외(extra-chromosomal)에 존재할 수 있거나 이들 둘 다일 수 있다. 예시적 효능 결정 인자는 Oct4 (예시적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 유전자은행 기탁번호(Genbank Accession No.) BC117435.1 또는 NCBI 기탁번호(Accession No.) NM 002701에 기재되어 있다), Sox2 (예시적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 NCBI 기탁번호 NM_003106.2에 기재되어 있다), Klf4 (예시적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 NCBI 기탁번호 NM_004235.4에 기재되어 있다), Nanog (예시적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 NCBI 기탁번호 NM_024865.2에 기재되어 있다), Lin28 (예시적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 NCBI 기탁번호 NM_024674.4에 기재되어 있다), c-Myc (예시적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 Genbank 기탁번호 L16785.1에 기재되어 있다), bFGF, SCF, TERT, SV40 거대 T 항원, HPV16E6, HPV16E7, Bmil, Fbx15, Eras, ECAT15-2, Tcl1, β-카테닌, ECAT1, ESG1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sal14, Rex1 (예시적 서열은 NCBI 기탁번호 NM 174900에 기재되어 있다), UTF1 (예시적 서열은 NCBI 기탁번호 NM 003577에 기재되어 있다), Stella (예시적 서열은 NCBI 기탁번호 NM 199286에 기재되어 있다), Stat3, FoxD3 (예시적 서열은 NCBI 기탁번호 NM 012183에 기재되어 있다), ZNF206, Mybl2, DPP A2, Otx2 및 Grb2을 포함한다. 본원에 제공된 모든 기탁번호는 2009년 2월 20일 현재이다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는, 예를 들면, NCBI 또는 GenBank 당의 데이타베이스를 사용하여 본원에 기재된 기타 효능 결정 인자의 구조를 용이하게 결정할 수 있다. 상기 인자와 동일하거나 유사한 활성을 갖는 화합물도 포함된다. 이러한 화합물은 재프로그래밍을 향상 또는 유도할 수 있는 항체 및 작은 분자, 예를 들면, 히스톤 데아세틸라제 억제제 또는 DNA 메틸라제 또는 이의 억제제를 포함한다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는, 예를 들면, 하나 이상의 효능 결정 인자가 생략된 본원에 기재된 방법 및/또는 평가된 시험 화합물의 패널을 사용하고/하거나 문헌[참조: Markoulaki et al Nature Biotechnology 27, 169 - 171 (2009)]에 기재된 방법을 사용하여 적합한 화합물들을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효능"은 하나 이상의 세포 종류로 분화하는 세포의 능력을 의미하는 것으로 간주된다. 따라서, 효능이 보다 큰 세포는 효능이 보다 작은 세포보다 보다 많은 세포 종류로 분화할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방학적 유효량"은 임상적 증상의 하나 이상의 검출가능한 징후의 개시를 예방 또는 억제하거나 지연시키기 위한 재프로그램된 세포 또는 이로부터 분화된 세포 및/또는 이의 후대 세포의 충분한 양을 의미하는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다" 또는 "예방하는" 또는 "예방"은 예방학적 유효량의 세포를 투여하여 임상적 증상의 적어도 하나의 징후의 발달을 중단시키거나 차단하거나 지연시키거나 감소시킴을 의미하는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재프로그램"은, 체세포가 탈분화된 및/또는 다능/다분화능/분화전능 세포로 전환되고, 이에 의해 이들이 유도되는 세포보다 큰 효능 가능성을 갖는 과정을 지칭한다. 바람직하게는, 재프로그램된 세포는 다능, 다분화능 또는 분화전능 세포이고, 보다 바람직하게는 다분화능 세포이다. 용어 "재프로그램된"은 이를 다능/다분화능/분화전능으로 되도록 탈분화된 체세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 문구 "STRO-1+ 다능성 세포"는 다능성 세포 콜로니를 형성할 수 있는 비조혈성 STRO-1+ 및/또는 TNAP+ 선조 세포를 의미하는 것으로 간주된다. 바람직한 STRO-1+ 다능성 세포는 본원에 상세히 언급되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 Stro-1+ 세포, 바람직하게는 포유동물을 포함하는 임의의 대상체를 의미하는 것으로 간주된다. 예시적 대상체에는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 사람, 영장류, 가축(예: 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 동반 동물(예: 개, 고양이), 실험실 시험 동물(예: 마우스, 래빗, 랫트, 기니아 피그, 햄스터), 사육 야생 동물(예: 여우, 사슴)이 포함된다. 바람직하게는, 포유동물은 사람 또는 영장류이다. 가장 바람직하게는, 포유동물은 사람이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분화전능"은 세포가 3개의 배엽 및 배체외 조직 각각의 세포로 분화할 수 있는 것을 의미하는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료학적 유효량"은 임상 증상의 하나 이상의 징후를 감소 또는 억제시키기 위한 재프로그램된 세포 또는 이로부터 분화된 세포 및/또는 이의 후대 세포의 충분한 양을 의미하는 것으로 간주된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료" 또는 "치료하는"은 치료학적 유효량의 세포를 투여하여 임상 증상의 적어도 하나의 징후를 감소 또는 억제시킴을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
STRO -1 + 다능성 세포 또는 후대 세포
STRO-1+ 다능성 세포는 골수, 혈액, 치수 세포, 지방 세포, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 림프절, 전립샘, 골, 인대, 건, 골격근, 피부 및 골막에서 발견되는 세포이고, 배엽, 예를 들면, 중배엽 및/또는 내배엽 및/또는 외배엽으로 분화할 수 있다. 바람직하게는, STRO-1+ 세포는 골수, 치수 또는 지방 조직, 바람직하게는 치수 또는 지방 조직 기원이다. 따라서, STRO-1+ 다능성 세포는 다수의 세포 종류, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 지방, 골, 연골, 탄성, 근육 및 섬유성 결합 조직을 포함하는 세포 종류로 분화할 수 있다. 이들 세포가 도입되는 특정의 계통 예약 및 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내생 생활성 인자, 예를 들면, 성장 인자, 사이토킨 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국지 미환경 조건의 다양한 영향에 따라 달라진다. 따라서, STRO-1+ 다능성 세포는 비-조혈성 선조 세포이고, 이는 분열하여, 줄기 세포이거나 표현형 세포를 제공하기 위해 비가역적으로 분화하는 선조 세포인 딸세포를 제공한다.
바람직한 양태에서, STRO-1+ 다능성 세포는 대상체, 예를 들면, 치료되는 대상체 또는 관련 대상체 또는 무관 대상체(동일한 종 또는 상이한 종이든지)로부터 수득한 샘플로부터 강화된다. 이러한 강화는 생체외 또는 시험관 내에서 수행할 수 있다. 용어 "강화된", "강화" 또는 이의 변형태는 특정 세포 종류의 비율 또는 특정 세포 종류의 수의 비율이 무처리 모집단과 비교하여 증가되는 세포 모집단을 기재하기 위해 본원에서 사용된다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 사용된 세포는 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 개별적으로 또는 집합적으로 발현한다.
바람직하게는, STRO-1+ 세포는 STRO-1bright (동의어, STRO-1bri)이다. 바람직하게는, STRO-1bright 세포는 추가로 하나 이상의 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ 및/또는 CD146+이다.
한 가지 양태에서, 간엽 전구 세포는 국제공개공보 제WO 2004/85630호에 정의된 바와 같은 혈관주위 간엽 전구 세포이다.
소정 마커에 대해 "양성"인 것으로 언급되는 세포는, 당해 마커가 세포 표면에 존재하는 정도에 따라 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 수준의 당해 마커를 발현시킬 수 있고, 여기서 당해 용어는 세포의 분류 과정에 사용된 형광 또는 다른 마커의 강도와 관련된다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 분류되는 특정 세포 모집단에 사용된 마커와 관련하여 이해될 것이다. 소정 마커에 대해 "음성"인 것으로 언급되는 세포는 당해 세포로부터 반드시 완전히 부재하는 것은 아니다. 당해 용어는 마커가 당해 세포에 의해 비교적 매우 낮은 수준으로 발현되고, 검출가능하게 표지되는 경우에 매우 낮은 신호를 생성하거나 배경 수준 이상으로 검출불가능함을 의미한다.
용어 "bright"는, 본원에 사용되는 경우, 검출가능하게 표지된 경우 비교적 높은 신호를 생성하는 세포 표면 상의 마커를 나타낸다. 이론에 한정시키고자 하는 것은 아니지만, "bright" 세포는 샘플에서 다른 세포보다 더 많은 표적 마커 단백질(예를 들면, STRO-1에 의해 인지된 항원)을 발현하는 것으로 제안된다. 예를 들어, STRO-1bri 세포는 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 분석에 의해 측정된 것으로서 FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지된 경우 비-bright 세포(STRO-1dull / dim)보다 더 큰 형광성 신호를 생성한다. 바람직하게는, "bright" 세포는 출발 샘플 속에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포중 적어도 약 0.1%를 차지한다. 다른 예에서, "bright" 세포는 출발 샘플 속에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵 세포를 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 또는 적어도 약 2%를 차지한다. 바람직한 예에서, STRO-1bright 세포는 "배경", 즉 STRO-1-인 세포에 비해 STRO-1 표면 발현의 2 log 크기의 보다 높은 발현을 갖는다. 비교시, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 STRO-1 표면 발현의 2 log 크기 미만의 보다 높은 발현, 통상적으로 "배경"보다 약 1 log 또는 미만을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적인 알칼리성 포스파타제의 모든 이소형(isoform)을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 당해 용어는 간 이소형(LAP), 골 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)을 포함한다. 바람직한 예에서, TNAP는 BAP이다. 특히 바람직한 예에서, 본원에 사용된 바와 같이 TNAP는 기탁에 관한 부다페스트 조약하에 2005년 12월 19일자로 ATCC에 수탁 번호 제PTA-7282호로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.
또한, 바람직한 양태에서, STRO-1+ 다능성 세포는 클론원성 CFU-F를 생성할 수 있다.
현저한 비율의 다능성 세포를 적어도 2개의 상이한 배아주로 분화시킬 수 있는 것이 바람직하다. 다능성 세포가 기여할 수 있는 계통의 비-제한적 예는 골 전구체 세포; 담즙관 상피 세포 및 간세포에 대해 다능성인, 간세포 선조체; 희소돌기아교세포 및 별아교세포로 진행되는 신경아교 세포 전구체를 생성할 수 있는 신경 제한된 세포; 신경으로 진행하는 신경 전구체; 심장 근육 및 심근세포, 당-반응성 인슐린 분비 췌장 베타 세포주에 대한 전구체를 포함한다. 다른 계통은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 상아질모세포, 상아질-생성 세포 및 연골세포, 및 망막 색소 내피 세포, 섬유모세포, 각질세포와 같은 피부 세포, 수지상 세포, 모낭 세포, 신관 내피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 전구 세포, 혈관 내피 세포, 건, 인대, 연골, 지방세포, 섬유모세포, 골수버팀질, 심근, 평활근, 골격근, 혈관주위세포, 혈관, 내피, 아교세포, 신경, 별아교세포 및 희소돌기아교 세포의 전구체 세포를 포함한다.
또 다른 예에서, STRO-1+ 다능성 세포는 배양시 조혈 세포를 생성할 수 없다.
한 가지 양태에서, 세포는 치료될 대상체로부터 취하여, 시험관 내에서 표준 기술을 사용하여 배양한 다음, 예를 들면, 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법에 사용한다. 이러한 세포 또는 이로부터 분화된 세포는 대상체에게 자가 또는 동종이형 조성물로서 투여하기에 유용하다. 대체 양태에서, 하나 이상의 확립된 사람 세포주의 세포가 사용된다. 본 발명의 또 다른 유용한 양태에서, 비-사람 동물(또는 환자가 사람이 아닌 경우, 다른 종으로부터)의 세포가 사용된다.
후대 세포는 어떠한 적합한 배지 속에서도 배양하여 수득할 수 있다. 세포 배양과 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "배지"는 세포 주변의 환경의 성분을 포함한다. 배지는 고체, 액체, 가스, 또는 상 및 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 세포 성장을 지속하지 않는 액체 배지뿐만 아니라 액체 성장 배지도 포함한다. 배지는 또한 아가, 아가로즈, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스와 같은 젤라틴성 배지를 포함한다. 예시적인 가스성 배지는 페트리 접시 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체 상에서 성장하는 세포가 노출되는 가스 상을 포함한다. 용어 "배지"는 또한, 여전히 세포와 접촉되어 있지 않는 경우에도 세포 배양시 사용하기 위해 의도된 물질을 지칭한다. 다시 말해서, 세균 배양을 위해 제조된 영양소가 풍부한 액체가 배지이다. 물 또는 기타 액체와 혼합하는 경우, 세포 배양에 적합해지는 분말 혼합물은 "분말화된 배지"로 언급할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 후대 세포는 STRO-3 항체로 표지한 자기 비드를 사용하여 골수로부터 TNAP+ STRO-1+ 다능성 세포를 분리한 후, 분리된 세포를 배양 신장함으로써 수득된다[참조: 적합한 배양 조건의 예에 대한 Gronthos et al. Blood 85: 929-940, 1995].
하나의 양태에서, 이러한 신장된 세포(후대)(바람직하게는, 적어도 5회 계대배양 후)는 TNAP-, CC9+, HLA class I+, HLA class II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86-, CD34- 및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 본원에 기술된 것에 대해 상이한 배양 조건하에서, 상이한 마커의 발현이 변할 수 있다는 것이 가능하다. 또한, 이들 표현형의 세포가 신장된 세포 집단에서 우세할 수 있지만, 작은 비율의 세포가 당해 표현형(들)을 가질 수 없음을 의미하지는 않는다(예를 들면, 신장된 세포중 작은 비율은 CC9-일 수 있다). 하나의 바람직한 양태에서, 신장된 세포는 여전히 상이한 세포 종류로 분화되는 능력을 가진다.
추가의 양태에서, 신장된 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD 90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R(STRO-2 = 렙틴-R), RANKL, STRO-1bright 및 CD146로 이루어진 그룹 중에서 개별적으로 또는 집합적으로 선택된 하나 이상의 마커 또는 이들 마커의 특정 조합을 발현할 수 있다.
하나의 양태에서, 후대 세포는 국제특허공보 제WO 2006/032092호에 정의되고/되거나 기술된 다능성 신장된 STRO-1+ 다능성 세포 후대(MEMP)이다. 후대 세포가 기원할 수 있는 STRO-1+ 다능성 세포의 강화된 모집단을 제조하는 방법은 국제특허공보 제WO 01/04268호 및 국제특허공보 제WO 2004/085630호에 기술되어 있다. 시험관내 내용물에서 STRO-1+ 다능성 세포는 절대적으로 순수한 제제로서 거의 존재하지 않을 것이며, 일반적으로 조직 특이적인 위임 세포(TSCC)인 다른 세포와 함께 존재할 것이다. 국제특허공보 제WO 01/04268호는 골수로부터 이러한 세포를 약 0.1% 내지 90%의 순도 수준으로 수거하는 것을 언급한다. 후대가 유도되는 다능성 세포를 포함하는 모집단은 조직 공급원으로부터 직접 수거할 수 있거나, 이와는 달린 이미 생체 외에서 신장된 집단일 수 있다.
예를 들면, 후대는 STRO-1+ 다능성 세포가, 존재하는 모집단의 총 세포중 적어도 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함하는, 실질적으로 정제된 STRO-1+ 다능성 세포의 수거된, 신장되지 않은 모집단으로부터 수득될 수 있다. 당해 수준은, 예를 들면, TNAP, STRO-1bright, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 이루어진 그룹으로부터 개별적으로 또는 집합적으로 선택된 적어도 하나의 마커에 대해 양성인 세포에 대해 선택함으로써 달성할 수 있다.
MEMPS는, 이들이 마커 알칼리성 포스파타제(ALP)에 대해 음성이고 마커 STRO-1bri에 대해 양성이라는 점에서 새로이 수거된 STRO-1+ 다능성 세포와는 구별될 수 있다. 대조적으로, 새로이 분리된 STRO-1+ 다능성 세포는 STRO-1bri 및 ALP 둘 다에 대해 양성이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 투여된 세포중 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 표현형 STRO-1bri, ALP-을 가진다. 추가의 바람직한 양태에서, MEMPS는 하나 이상의 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1에 대해 양성이다. 여전히 추가의 바람직한 양태에서, MEMP는 TERT 활성을 나타내지 않고/않거나 마커 CD18에 대해 음성이다.
STRO-1+ 다능성 세포 출발 집단은 국제특허공보 제WO 01/04268호 또는 국제특허공보 제WO 2004/085630호에 기재된 임의의 하나 이상의 조직 종류, 즉, 골수, 치수 세포, 지방 조직 및 피부로부터, 또는 아마도 보다 더 광범위하게는 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 비장, 림프절, 전립샘, 췌장, 골, 인대, 골수, 건 및 골격근으로부터 기원할 수 있다.
본 발명을 수행하는데 있어서, 소정의 세포 표면 마커를 수반하는 세포의 분리는 다수의 상이한 방법으로 수행할 수 있으나, 바람직한 방법은 높은 수준 결합 또는, 낮은 수준 결합 또는 비결합인, 결합을 나타내는 것들의 분리가 수반되는 관련된 마커에 대한 결합제(예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 결합에 의존함을 이해할 것이다. 가장 편리한 결합제는 바람직하게는 모노클로날 항체이거나, 상기 후자의 제제의 특이성으로 인하여 모노클로날 항체를 기초로 하는 항체 또는 항체계 분자이다. 항체는 단계 둘 다에 대해 사용될 수 있으나, 다른 제제도 사용할 수 있으므로, 이들 마커에 대한 리간드를 사용하여 이들을 수반하거나, 이들을 결여하는 세포를 강화할 수도 있다.
항체 또는 리간드는 조 분리(crude separation)를 위해 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 분리 기술은 바람직하게는 수집될 분획의 생존력의 보유를 최대화한다. 효능이 상이한 각종 기술을 사용하여 상대적인 조 분리를 수득할 수 있다. 사용된 특수 기술은 분리 효능, 관련된 세포독성, 수행의 용이성 및 속도, 및 정교한 장비 및/또는 기교에 대한 필요성에 의존할 것이다. 분리 과정은 항체-피복된 자기 비드, 친화성 크로마토그래피 및 고체 매트릭스에 부착된 항체와의 "패닝(panning)"을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 정밀한 분리를 제공하는 기술은 FACS를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. FACS를 수행하기 위한 방법은 당해 분야의 숙련가에게 익숙할 것이다.
본원에 기술된 각각의 마커에 대한 항체는 상업적으로 시판되거나[예를 들면, STRO-1에 대한 모노클로날 항체는 미국의 알 앤드 디 시스템스(R&D Systems, USA)로부터 시판된다], ATCC 또는 다른 기탁 기관으로부터 이용가능하고/하거나 당해 분야에 인지된 기술을 사용하여 생성할 수 있다.
예를 들면, STRO-1+ 다능성 세포를 분리하는 방법은, STRO-1의 고도 수준 발현을 인지하는 자기(magnetic) 활성화된 세포 분류(MACS)를 이용하는 고체상 분류 단계인 제1 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이어서, 제2 분류 단계를 수행하여 국제특허공보 제WO 01/14268호에 기술된 바와 같은 보다 높은 수준의 전구체 세포 신장을 수득할 수 있다. 당해 제2 분류 단계는 2개 이상의 마커의 사용을 포함할 수 있다.
STRO-1+ 다능성 세포를 수득하는 방법은 또한 공지된 기술을 사용하는 제1 강화 단계(enrichment step) 전에 세포의 공급원을 수거함을 포함할 수 있다. 따라서, 조직은 외과적으로 제거될 것이다. 이어서, 공급원 조직을 포함하는 세포를 소위 단일 세포 현탁액으로 분리할 것이다. 당해 분리는 물리적 및/또는 효소적 수단으로 달성할 수 있다.
일단 적합한 STRO-1+ 다능성 세포 모집단이 수득되면, 이를 어떠한 적합한 수단으로 배양하거나 신장시켜 MEMP를 수득할 수 있다.
본 발명은 비-사람 영장류 세포, 유제류, 개과, 고양이과, 토끼목, 설치류, 조류, 및 어류 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 비-사람 동물 종으로부터의 세포를 사용하여 실시할 수 있다. 본 발명이 수행할 수 있는 영장류 세포는 침팬지, 개코원숭이, 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이, 및 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 수행될 수 있는 유제류 세포는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 버펄로(buffalo) 및 들소의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 수행할 수 있는 설치류 세포는 마우스, 랫트, 기니아 피그, 햄스터 및 저빌(gerbil) 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명이 수행할 수 있는 토끼목 종의 예는 집토끼, 산토끼, 토끼(cottontails), 솜꼬리토끼, 스노우슈 토끼(snowshoe rabbit), 및 새앙토끼(pika)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 닭[갈루스 갈루스(Gallus gallus)]은 본 발명을 수행할 수 있는 조류 종의 예이다.
본 발명의 방법에 유용한 세포는 사용 전에, 또는 상층액 또는 가용성 인자를 수득하기 전에 저장할 수 있다. 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포를 보존하고 저장하는 방법 및 프로토콜은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.]. 중간엽 줄기/선조 세포, 또는 이의 후대와 같은 분리된 줄기 세포의 생물학적 활성을 유지하는 어떠한 방법도 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 세포는 동결-보존(cryo-preservation)을 사용함으로써 유지 및 저장된다.
효능 결정 인자를 발현시키기 위한 유전자 변형 세포
한 가지 양태에서, STRO-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포는, 예를 들면, 효능 결정 인자 또는 이의 복수를 발현시키기 위해 유전적으로 변형된다.
세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 예를 들면, 세포에서 발현시키고자 하는 핵산을 세포 및 바람직하게는 다분화능 세포에서 발현을 유도하는 프로모터에 작동적으로 연결시킨다. 예를 들면, 핵산은 대상체의 다양한 세포에서 작동가능한 프로모터, 예를 들면, 바이러스 프로모터, 예를 들면, CMV 프로모터(예: CMV-IE 프로모터) 또는 SV-40 프로모터 또는 신장 인자 프로모터 또는 유도가능한 프로모터, 예를 들면, tet-유도가능한 프로모터에 작동적으로 연결시킨다. 추가의 적합한 프로모터는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있고, 본 발명의 양태에 준용하여 적용되어야 한다. 본 발명은 또한 단일 프로모터, 예를 들면, Oct4 및 Sox2로부터 복수의 효능 결정 인자를 발현시키는 다중시스트론 벡터의 사용을 포함한다. 이러한 벡터는 일반적으로 상이한 효능 결정 인자를 각각 코딩하는 2개의 핵산을 분리한 내부 리보솜 도입 부위(IRES)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 이의 가장 넓은 의미로 해석되어야 하고, 예를 들면, 발달 및/또는 외부 자극에 반응하여 또는 조직 특이적 방식으로 유전자 발현을 변경하는 추가의 조절 요소(즉, 상부 활성화 서열, 전사 인자 결합 부위, 인핸서 및 사일런서)의 존재 또는 부재하에 전사 개시에 요구되는, TATA 박스 또는 개시제 요소를 포함하는 게놈 유전자의 전사 조절 서열을 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "프로모터"는 또한, 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 제공하거나 활성화시키거나 향상시키고 바람직하게는 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 재조합, 합성 또는 융합 분자 또는 유도체를 기재하기 위해 사용된다. 바람직한 프로모터는 하나 이상의 특이적 조절 요소의 추가의 복사체를 함유하여, 상기 핵산 분자의 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경시킬 수 있다.
본 명세서에서, 핵산은, 이의 발현이 당해 프로모터에 의해 조절되도록 위치는 경우, 프로모터와 또는 프로모터에 "작동가능하게 연결"된다(즉, 프로모터의 조절 제어하에). 프로모터는 일반적으로 이의 발현이 조절되는 핵산의 5'(상부)에 위치된다. 이종성 프로모터/핵산 조합체를 작제하기 위해, 프로모터와 유전자 사이의 거리와 대략 동일한 유전자 전사 개시 부위로부터 소정 거리에 당해 프로모터를 위치시키는 것이 바람직하고, 이는 이의 자연적 환경(즉, 프로모터가 유도되는 유전자)에서 조절된다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 당해 거리의 몇몇 변화는 프로모터 기능의 소실 없이 달성될 수 있다. 유사하게는, 이의 조절하에 위치되는 이종성 핵산과 관련하여 조절 서열 요소의 바람직한 포지셔닝은 이의 천연 환경(즉, 당해 프로모터가 유도되는 유전자)에서 당해 요소의 포지셔닝에 의해 규정된다. 또한, 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 당해 거리에서의 몇몇 변화가 또한 발생할 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 발현 작제물의 형태로 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 작제물"은 세포 내에서 작동가능하게 연결된 핵산 위에서 발현하는 능력을 갖는 핵산을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 발현 작제물은 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드, 코스미드, 바이러스 서브게놈 또는 게놈 단편, 또는 이종성 DNA 상에서 발현할 수 있는 기타 핵산이거나 이를 포함할 수 있다. 발현 작제물은 세포 게놈 내로 통합될 수 있거나 에피좀 상태일 수 있다.
바람직한 발현 작제물은 에피좀, 예를 들면, 플라스미드 및 파지미드 상태일 수 있다. 이러한 발현 작제물은, 예를 들면, 발현 작제물이 게놈 내로 통합되지 않은 재프로그램된 세포의 생성에 유용하다. 더욱이, 이들 발현 작제물은 종종 세포 분화 동안 소실되기 때문에, 재조합 발현 작제물을 포함하지 않는 재프로그램된 세포를 생성할 수 있다[참조: Okita et al ., Science , 322:949-53, 2008].
본 발명의 수행에 적합한 발현 작제물의 작제 방법은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 예를 들면, 문헌[참조: Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 또는 Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Third Edition 2001)]에 기재되어 있다. 예를 들면, 발현 작제물의 각 성분들은, 예를 들면, PCR을 사용하여 적합한 주형 핵산으로부터 증폭시키고, 이어서 적합한 발현 작제물, 예를 들면, 플라스미드 또는 파지미드 내로 클로닝한다.
이러한 발현 작제물에 적합한 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 예를 들면, 포유동물 세포에서 본 발명의 방법에 적합한 발현 벡터는, 예를 들면, 인비트로겐(Invitrogen)에 의해 공급되는 pcDNA 벡터 조의 벡터, pCI 벡터 조(Promega)의 벡터, pCMV 벡터 조(Clontech)의 벡터, pM 벡터(Clontech), pSI 벡터(Promega), VP 16 벡터(Clontech) 또는 pcDNA 벡터 조(Invitrogen)의 벡터이다.
당해 기술분야의 숙련가들은 추가의 벡터 및 이러한 벡터의 공급원, 예를 들면, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation), 클론테크(Clontech) 또는 프로메가(Promega)을 알 수 있을 것이다.
분리된 핵산 분자 또는 이를 포함하는 유전자 작제물을 발현 세포 내로 도입하는 수단은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 소정 생물체에 사용된 기술은 공지된 성공적 기술에 따라 달라진다. 재조합 DNA를 세포 내로 도입하는 수단은 인산칼슘 침전[참조: Graham and Van Der Eb, Virology , 52: 456-467,1973; Chen and Okayama, Mol . Cell Biol ., 7: 2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol . Cell Biol ., 10: 689-695,1990], DEAE-덱스트란[참조: Gopal, Mol . Cell Biol., 5: 1188-1190,1985], 전기천공[참조: Tur-Kaspa et al ., Mol . Cell Biol ., 6: 716-718, 1986; Potter et al ., Proc . Natl Acad . Sci . USA , 81: 7161-7165,1984], 직접 마이크로주입, DNA-적재 리포좀[참조: Nicolau and Sene, Biochim. Biophys . Acta , 721: 185-190,1982; Fraley et al ., Proc . Natl Acad . Sci. USA , 76: 3348-3352,1979], 세포 초음파[참조: Fechheimer et al ., Proc . Natl Acad . Sci . USA , 84: 8463-8467,1987], 고속 마이크로발사체를 사용한 유전자 충격[참조: Yang et al ., Proc . Natl Acad . Sci USA , 87: 9568-9572, 1990], 수용체 매개된 형질감염[참조: Wu and Wu, J. Biol . Chem ., 262: 4429-4432, 19877; Wu and Wu, Biochem ., 27: 887-892,1988]을 포함한다. 다른 양태에서, 세포 내로 핵산의 전달은 핵산을 나노캡(예: 나노입자 CaP04), 콜로이드성 금, 나노입자 합성 중합체 및/또는 리포솜으로 제형화하여 달성할 수 있다.
한 가지 바람직한 양태에서, 에피좀 상태로 존재하거나 달리는 세포 게놈 내로 통합되지 않은 발현 작제물은, 예를 들면, 상기 또는 문헌[참조: Okita et al, 2008, 상기 참조)에 기재된 방법을 사용하여 형질감염시킨다. 바람직하게는, 플라스미드는 상기 세포가 재프로그램될 때까지 상기 세포 내로 반복적으로 형질감염시킨다. 이러한 방식으로, 이의 게놈 내로 통합된 이종성 DNA를 갖지 않는 세포가 생성되며, 이는 치료학적 관점에서 보다 매력적이다.
또는, 본 발명의 발현 작제물은 바이러스 벡터이다. 적합한 바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 핵산을 전달하고 당해 핵산을 숙주 세포 게놈 내로 통합하기 위한 통상의 바이러스 기반 시스템은, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함한다. 또는, 아데노바이러스 벡터는, 예를 들면, 이의 게놈 내로 통합된 이종성 DNA를 포함하지 않는 재프로그램된 세포를 생성하기 위해, 에피좀 상태로 존재하는 핵산을 숙주 세포로 도입하는데 유용하다. 바이러스 벡터는 표적 세포 및 조직에서 효율적이고 다목적인 유전자 전달 방법이다. 추가로, 높은 형질전환 효율은 다수의 상이한 세포 종류 및 표적 조직에서 관찰되었다. 예시적 바이러스 벡터는 하기에 언급되어 있다.
a) 아데노바이러스 벡터
한 가지 양태에서, 본 발명에 유용한 바이러스 유전자 전달 시스템은 아데노 유도된 벡터를 사용한다. 아데노바이러스, 즉 36 kB의 선형 및 이중가닥 DNA 바이러스의 유전자 구성의 지식은 8 kB 이하의 외래 서열을 갖는 아데노바이러스 DNA의 거대 부분의 치환을 가능하게 한다. 숙주 세포 내로 아데노바이러스 DNA의 감염은 아데노바이러스 DNA가 잠재적 유전독성 없이 에피좀 방식으로 복제할 수 있기 때문에 염색체 통합을 발생시키지 않는다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고, 게놈 재배열은 광범위한 증폭 후에 검출되지 않았다. 아데노바이러스는 이들의 세포 사이클 단계에 무관하게 모든 상피 세포를 실질적으로 감염시킬 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 분화 및 미분화 세포 둘 다를 형질전환시킬 수 있다. 미분화 세포를 효과적으로 형질전환시키는 능력은 아데노바이러스를 근육 또는 지방 세포 내로 유전자 전달하기 위한 우수한 후보로 되게 한다.
아데노바이러스는 이의 중간 크기의 게놈, 조작 용이성, 높은 역가, 넓은 표적-세포 범위 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈 양 말단은 100 내지 200 염기쌍(bp)의 역전된 말단 반복체(ITR)을 함유하고, 이는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소이다.
게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제 개시에 의해 분화되는 상이한 전사 단위를 함유한다. E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 소수의 세포 유전자의 전사 조절에 관여하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질을 합성시킨다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 셧 오프(shut off)에 관여한다[참조: Renan (1990) Radiotherap. Oncol. 19: 197]. 주요 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 후기 유전자의 생성물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 허여된 단일 주요 전사체의 현저한 처리 후에만 발현된다. MLP(16.8μ에 위치됨)은 감염의 후기 상 동안 특히 효율적이고, 당해 프로모터로부터 허여된 mRNA 모두는 이들을 해독용 예시적 mRNA로 되게 하는 5' 삼자간 리더(TL) 서열을 보유한다.
아데노바이러스의 게놈은, 목적하는 유전자 생성물을 코딩하고 정상 세포용해 바이러스의 라이프 사이클에서 복제하는 이의 능력과 관련하여 불활성화되도록 조작될 수 있다[참조: Berkner et al., (1988) BioTechniques 6: 616; Rosenfeld et al., (1991) Science 252: 431-434; and Rosenfeld et al., (1992) Cell 68: 143-155]. 아데노바이러스 균주 Ad 유형 5d1324 또는 기타 아데노바이러스 균주(예: Ad2, Ad3, Ad7 등)로부터 유도되는 적합한 아데노바이러스 벡터는 당해 기술분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.
재조합 아데노바이러스는 이들이 비분화 세포를 감염시킬 수 있고 기로 상피[참조: Rosenfeld et al., (1992) cited supra), 상피 세포[참조: Lemarchand et al., (1992) PNAS USA 89: 6482-6486], 간세포[참조: Herz and Gerard, (1993) PNAS USA 90: 2812-2816] 및 근육 세포[참조: Quantin et al., (1992) PNAS USA 89: 2581-2584; Ragot et al. (1993) Nature 361: 647]를 포함하는 다양한 세포 종류를 감염시키는데 사용될 수 있다.
추가로, 바이러스 입자는 비교적 안정하고, 정제 및 농축이 용이하며, 변형시켜 감염 범위에 영향을 줄 수 있다.
더욱이, 외래 DNA에 대한 아데노바이러스 게놈의 수용 능력은 기타 유전자 전달 벡터와 비교하여 크다(8 kB 이하)[참조: Berkner et al., supra; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57: 267]. 현재 사용되고 따라서 본 발명에 바람직한 대부분의 복제-결함 아데노바이러스 벡터는 바이러스 E1 및 E3 유전자의 전부 또는 일부가 결여되어 있지만, 80%와 같이 많은 아데노바이러스 유전자 물질을 보유한다[참조: Jones et al., (1979) Cell 16: 683; Berkner et al., supra; and Graham et al., in Methods in Molecular Biology, E. J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109-127]. 본 발명의 삽입된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, E1 A 프로모터, 주요 후기 프로모터(MLP) 및 관련 리더 서열, 바이러스 E3 프로모터 또는 외생 부가된 프로모터 서열의 조절하에 발현될 수 있다.
특정한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 복제 결함이거나 조건적 결함일 수 있다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 공지된 세로타입 또는 아그룹 A-F 중의 어느 것으로 이루어질 수 있다. 아그룹 C의 아데노바이러스 유형 5는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 사용하기 위한 조건적 복제-결함 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위한 예시적 출발 물질이다. 이는 아데노바이러스 유형 5가 사람 아데노바이러스이고, 이에 관한 생화학적 및 유전적 정보가 공지되어 있고 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 대부분의 작제물에 역사적으로 사용되었기 때문이다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따르는 통상의 벡터는 복제 결합이며, 아데노바이러스 E1 영역을 갖지 않을 것이다. 따라서, 목적하는 핵산을 E1 코딩 영역이 제거된 위치에 도입하는 것이 가장 편리할 것이다. 그러나, 아데노바이러스 서열 내의 영역에서 폴리뉴클레오티드의 삽입 위치는 본 발명에서 중요하지 않다. 예를 들면, 결실된 E3 영역 대신에 문헌[참조: Karlsson et. al. (1986)]에 이미 기재된 E3 치환 벡터에서 또는 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결함을 보충하는 E4 영역에서 또한 삽입할 수 있다.
예시적 헬퍼 세포주는 293(ATCC 기탁번호 CRL1573)이다. 이러한 헬퍼 세포주(또한 "패키징 세포주"로 지칭됨)은 프랭크 그라함(Frank Graham)[참조: Graham et al. (1987) J. Gen. Virol. 36: 59-72 and Graham (1977) J. General Virology 68: 937-940]에 의해 개발되었고, E1A 및 E1B를 트랜스로 제공한다. 그러나, 헬퍼 세포주는 또한 사람 세포, 예를 들면, 사람 배 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 기타 사람 배 간엽 또는 상피 세포로부터 유도될 수 있다. 또는, 헬퍼 세포는 사람 아데노바이러스에 대해 허용되는 기타 포유동물 종의 세포로부터 유도될 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들면, 베로(vero) 세포 또는 기타 원숭이 배 간엽 또는 상피 세포를 포함한다.
아데노바이러스는 또한 세포 종 특이적일 수 있고, 즉 제한된 종류의 세포만을 감염시키고/시키거나 제한된 종류의 세포에서만 목적하는 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 당해 바이러스는, 미국 특허 제5,698,443호에 기재된 바와 같이, 표적 숙주 세포에 의해 특이적으로 조절된 전사 개시 영역의 전사 조절하에 유전자를 포함할 수 있다. 따라서, 복제 경쟁 아데노바이러스로부터의 발현은, 예를 들면, 세포 특이적 반응 요소를 삽입하여 복제에 필요한 단백질(예: E1A 또는 E1B)의 합성을 조절함으로써 특정한 세포로 제한될 수 있다.
핵산을 도입하는 방법 및 물질, 당해 핵산을 함유하는 재조합 바이러스의 증식 및 정제 및 세포 및 포유동물의 형질감염에서의 이의 용도를 포함하는, 본 발명의 실시에 유용할 수 있는 아데노바이러스 기술에 대한 추가의 상세한 가이드라인은 문헌[참조: Wilson et al, WO 94/28938, WO 96/13597 및 WO 96/26285, 및 그 안에 인용된 참조문헌]을 참조한다.
b) 레트로바이러스
특정한 양태에서, 레트로바이러스 벡터는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 사용될 수 있다. 이러한 바이러스는, Stro-1+ 세포가 아닌, 이미 재프로그램된 세포의 생성에 사용될 수 있다. 레트로바이러스는 역전사 방법에 의해 감염된 세포에서 이들의 RNA를 이중가닥 DNA로 전환시키는 능력을 특징으로 하는 단일가닥 RNA 바이러스이다[참조: Coffin (1990) Retroviriae and their Replication" In Fields, Knipe ed. Virology. New York: Raven Press]. 이어서, 생성 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체 내로 안정하게 통합되고, 바이러스 단백질의 합성을 유도한다. 상기 통합은 수용체 세포 및 이의 후대에서 바이러스 유전자 서열을 체류시킨다. 레트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 엔벨로프 성분을 각각 코딩하는 3개 유전자, gag, pol 및 env를 함유한다. gag 유전자의 상부에서 발견된 서열(psi로서 지칭됨)은 비리온 내로 게놈을 패키징하는 신호로서 작용한다. 2개의 긴 말단 반복체(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 함유하고, 또한 숙주 세포 게놈에서 통합에 요구된다[참조: Coffin (1990), 상기 참조].
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 목적하는 핵산은 복제 결함 바이러스를 생성하기 위해 특정한 바이러스 서열의 위치에서 바이러스 게놈 내로 삽입된다. 비리온을 생성하기 위해, gag, pol 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 psi 성분이 없는 패키징 세포주가 작제된다[참조: Mann et al. (1983) Cell 33: 153]. 레트로바이러스 LTR 및 psi 서열과 함께 본 발명의 핵산을 함유하는 재조합 플라스미드가 당해 세포주에 도입되는 경우(예를 들면, 인산칼슘 침전에 의해), psi 서열은 바이러스 입자 내로 패키징되는 재조합 플라스미드의 RNA 전사를 가능하게 하고, 이어서 배양 배지 내로 분비된다[참조: Nicolas and Rubenstein (1988) "Retroviral Vectors", In: Rodriguez and Denhardt ed. Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses. Stoneham, Butterworth, and Temin, (1986)"Retrovirus Vectors for Gene Transfer: Efficient Integration into and Expression of Exogenous DNA in Vertebrate Cell Genome", In: Kucherlapati ed. Gene Transfer. New York : Plenum Press; Mann et al., 1983, 상기 참조]. 이어서, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 종류를 감염시킬 수 있다.
복제 결함 레트로바이러스만을 생성하는 특수한 세포주("패키징 세포"로 지칭됨)의 개발은 유전자 치료를 위한 레트로바이러스의 사용을 증대시켰고, 결함 레트로바이러스는 유전자 치료 목적을 위한 유전자 전달에서의 사용을 특징으로 한다[참조: Miller, A. D. (1990) Blood 76: 271]. 따라서, 재조합 레트로바이러스가 작제될 수 있으며, 여기서 레트로바이러스 코딩 서열(gag, pol, env)의 일부분은 본 발명의 펩티드 또는 동족체를 코딩하는 핵산, 예를 들면, 전사 활성화인자로 치환되어, 레트로바이러스를 복제 결함으로 되게 한다. 이어서, 복제 결함 레트로바이러스를 비리온 내로 패키징하고, 이를 사용하여 표준 기술로 헬퍼 바이러스의 사용을 통해 표적 세포를 감염시킬 수 있다. 재조합 레트로바이러스를 생성하고 시험관내 또는 생체내에서 이러한 바이러스로 세포를 감염시키는 프로토콜은 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al., (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9. 14 및 기타 표준 실험실 매뉴얼]에서 발견할 수 있다.
적합한 레트로바이러스의 예는 pLJ, pZIP, pWE 및 pEM를 포함하고, 이들은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 예시적 레트로바이러스 벡터는 pSR MSVtkNeo[참조: Muller et al. (1991) Mol. Cell Biol. 11: 1785 and pSR MSV (XbaI) (Sawyers et al. (1995) J. Exp. Med. 181: 307] 및 이의 유도체이다. 예를 들면, 이들 벡터 둘 다에서 독특한 BamHI 부위는, 클락손(Clackson) 등의 국제공개공보 제WO 96/41865호에 기재된 바와 같이, 벡터를 BamHI로 분해시키고, 클레나우(Klenow)로 충전시키고, 재연결시켜 각각 pSMTN2 및 pSMTX2를 생성함으로써 제거할 수 있다. 동종지향성(ecotropic) 및 양쪽지향성(amphotropic) 바이러스 시스템의 제조에 적합한 패키징 바이러스 세포주의 예는 Crip 및 Cre를 포함한다.
렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스는 시험관내 및/또는 생체내에서 신경 세포, 상피 세포, 망막 세포, 내피 세포, 림프 세포, 근아세포, 간세포, 골수 세포를 포함하는 다수의 상이한 세포 종류로 다양한 유전자를 도입하는데 사용되어 왔다[참조: Federico (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10: 448; Eglitis et al., (1985) Science 230: 1395-1398; Danos and Mulligan, (1988) PNAS USA 85: 6460- 6464; Wilson et al., (1988) PNAS USA 85: 3014-3018; Armentano et al., (1990) PNAS USA 87: 6141-6145; Huber et al., (1991) PNAS USA 88: 8039-8043; Ferry et al., (1991) PNAS USA 88: 8377-8381; Chowdhury et al., (1991) Science 254: 1802-1805; Kay et al., (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647; Dai et al., (1992) PNAS USA 89: 10892-10895; Hwu et al., (1993) J. Immunol. 150: 4104-4115; U. S. Patent No. 4,868, 116; U. S. Patent No. 4,980, 286; PCT Application WO 89/07136; PCT Application WO 89/02468; PCT Application WO 89/05345; and PCT Application WO 92/07573].
추가로, 바이러스 패키징 단백질을 바이러스 입자의 표면 상에서 변형시킴으로써 레트로바이러스 및 결과적으로 레트로바이러스 벡터의 감염 범위를 제한할 수 있다[참조: PCT 공개공보 WO 93/25234, WO 94/06920 및 WO 94/11524]. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터의 감염 범위를 변형시키는 전략은 세포 표면 항원에 특이적인 항체를 바이러스 env 단백질에 커플링[참조: Roux et al., (1989) PNAS USA 86: 9079-9083; Julan et al., (1992) J. Gen Virol 73: 3251-3255; and Goud et al., (1983) Virology 163: 251-254]; 또는 세포 표면 리간드를 바이러스 env 단백질에 커플링[참조: Neda et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 14143-14146]시키는 것을 포함한다. 커플링은 융합 단백질(예: 일본쇄 항체/env 융합 단백질)의 생성에 의한 것 뿐만 아니라 단백질 또는 기타 종류와의 화학적 가교결합 형태로 존재할 수 있다(예를 들면, env 단백질을 아시아로글리코단백질로 전환시키는 락토즈).
c) 아데노-관련 벡터
본 발명의 핵산의 전달에 유용한 예시적 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV)이다. 사람 아데노바이러스는 수용체 매개된 세포내이입에 의해 세포로 유입되는 이중가닥 DNA 바이러스이다. 이들 바이러스는, 성장 및 조작이 용이하고 생체내 및 시험관내에서 광범위한 숙주 범위를 나타내기 때문에, 유전자 전달에 적합한 것으로 고려되었다. 아데노바이러스는 표적 세포의 복제 뿐만 아니라 정지 세포를 감염시킬 수 있고, 숙주 게놈 내로의 통합보다는 염색체 외부에서 지속한다. AAV는 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하는 헬퍼 의존성 DNA 파르보바이러스이다. AAV는 공지된 병리학을 갖지 않고, 효율적인 복제 및 생식 라이프 사이클을 위한 또 다른 바이러스, 예를 들면, 아데노바이러스, 백시니아 또는 헤르페스 바이러스에 의해 제공된 추가의 헬퍼 기능의 부재하에 복제 불가능하다.
헬퍼 바이러스의 부재하에, AAV는 이의 게놈의 숙주 세포 염색체 내로의 삽입에 의해 잠복 상태를 확립한다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염은 통합된 복사체를 구조하고, 이어서 복제되어 감염성 바이러스 후대를 생성할 수 있다. 야생형 AAV 바이러스와, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스로부터의 헬퍼 기능의 조합은 복제 가능한 재조합 AVV(rAVV)를 생성한다. 이러한 시스템의 한 가지 잇점은 비교적 안전하다는 것이다[참조: Xiao et al., (1997) Exp. Neurol. 144: 113-124].
AAV 게놈은 대략 4681개 염기를 함유하는 선형 단일가닥 DNA 분자로 구성된다[참조: Berns and Bohenzky, (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32: 243-307]. 당해 게놈은 시스에서 DNA 복제 기원으로서 및 바이러스를 위한 패키징 신호로서 작용하는 각 말단에 역전 말단 반복체(ITR)을 포함한다. 당해 게놈의 내부 비반복 부분은 각각 AAV rep 및 cap 영역으로 공지된 2개의 거대 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 이들 영역은 비리온의 복제 및 패키징에 수반된 바이러스 단백질을 코딩한다. AAV 게놈의 상세한 설명은 문헌[참조: Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129]을 참조한다.
300 염기쌍과 같은 작은 AAV를 함유하는 벡터를 패키징하고 통합할 수 있다. 외생 DNA용 공간은 약 4.7 kb로 제한되고, 이는 본 발명의 펩티드 또는 동족체를 코딩하는 핵산을 도입하기에 충분한다. 문헌[참조: Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260]에 기재된 바와 같은 AAV 벡터를 사용하여 DNA를 세포 내로 도입할 수 있다. 다양한 핵산은 AAV 벡터를 사용하여 상이한 세포 종류로 도입되었다[참조: Hermonat et al., (1984) PNAS USA 81: 6466-6470; Tratschin et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081; Wondisford et al., (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39; Tratschin et al., (1984) J. Virol. 51: 611-619; and Flotte et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781-3790].
rAAV 작제물을 작제하고 전달하는 일반 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Barlett, J. S., et al., (1996), Protocols for Gene Transfer in Neuroscience; Towards Gene Therapy of Neurological Disorders, pp. 115-127]에 기재되어 있다.
통상적으로 사용되는 AAV 기반 발현 벡터는 제한 부위를 플랭킹하는 145개 뉴클레오티드 AAV 역전 말단 반복체(ITR)을 포함하고, 당해 제한 부위는 이용가능한 제한 부위를 직접 사용하거나, 목적하는 뉴클레오티드 서열을 제한 효소로 분해, 이어서 말단의 둔화, 적절한 DNA 링커의 연결, 제한 분해, 및 ITR 사이의 부위 내로의 연결에 의해 목적하는 뉴클레오티드 서열의 서브클로닝에 사용될 수 있다.
뉴클레오티드 서열을 도입하는 방법 및 물질, 당해 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 AAV 벡터의 증식 및 정제 및 세포 및 포유동물의 감염에서의 이의 용도를 포함하는, 본 발명의 실시에 유용할 수 있는 AAV 기술에 대한 추가의 상세한 설명은 문헌[참조: Carter 등, 미국 특허 제 4,797, 368 (1989년 1월 10일); Muzyczka 등, 미국 특허 제 5,139, 941 (1992년 8월 18일); Lebkowski 등, 미국 특허 제 5,173, 414 (1992년 12월 22일); Srivastava, 미국 특허 제 5,252, 479 (1993년 10월 12일); Lebkowski 등, 미국 특허 제 5,354, 678 (1994년 10월 11일); Shenk 등, 미국 특허 제 5,436, 146 (1995년 7월 25일); Chatterjee 등, 미국 특허제 5,454, 935 (1995년 12월 12일), Carter 등 WO 93/24641 (1993년 12월 9일 공개), 및 Natsoulis, 미국 특허 제 5,622, 856 (1997년 4월 22일)]을 참조한다.
d) 기타 바이러스 시스템
핵산의 전달에 사용될 수 있는 기타 바이러스 벡터 시스템은, 예를 들면, 헤르페스 바이러스[참조: Herpes Simplex Virus (IJ St 특허 제 5,631, 236 by Woo et al., issued May 20, 1997 and WO 00/08191 by Neurovex], 백시니아 바이러스[참조: Ridgeway (1988) Ridgeway, "Mammalian expression vectors, "In : Rodriguez R L, Denhardt D T, ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth,; Baichwal and Sugden (1986) "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press; Coupar et al. (1988) Gene, 68 : 1-10], 및 몇몇 RNA 바이러스로부터 유도될 수 있다. 예시적인 바이러스는, 예를 들면, 알파바이러스, 폭시바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스 등을 포함한다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 대한 몇몇 매력적인 특징을 제공한다[참조: Friedmann (1989) Science, 244 : 1275-1281; Ridgeway, 1988, supra; Baichwal and Sugden, 1986, supra; Coupar et al., 1988; Horwich et al. (1990) J. Virol., 64: 642-650].
e) 비-통합 바이러스, 자가-절단/분해가능한 작제물 및 표적 체세포에 대한 플라스미드의 직접 형질감염
"자가 절단" 2A 펩티드를 도입한, 폴리시스트론 발현 카세트로부터 동시에 모든 유전자 효능 결정 인자의 발현은 단일 프로모터로부터 각 인자의 비교가능한 발현을 가능하게 하는 "리보솜 스키핑"을 유발한다[참조: Sommer et al., Stem Cells. 27: 543-549, 2008; Carey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 157-162, 2009]. 인자의 쌍을 분리하는 내부 리보솜 도입 서열(IRES)와 함께, 감염된 세포는 모든 효능 결정 인자 또는 이의 서브셋을 발현시킬 수 있다. 카레이(Carey) 등(2009년, 상기 참조)은 IRES 기술의 부재하에 자가 절단 2A 펩티드에 의해 분리된 독시사이클린 유도성 인자를 작제했다.
또 다른 예에서, 하나 이상의 효능 결정 인자는 DNA 트랜스포손을 사용하여 전달된다. DNA 트랜스포손은 특이적 "트랜스포사제" 효소에 의해 게놈 전체에 걸쳐 분비 및 재통합되는(전좌로 지칭되는 현상) 유전자 요소이다. piggyBac는 TTAA 서열을 함유하는 전사 DNA 단위에서 우선적으로 삽입되는 다중 유전자 탑재를 함유할 수 있는 한 가지 트랜스포손이다. 트랜스포사제 매개된 통합 및 후속의 삭제에 의해 쥐 및 사람 섬유아세포로 전달된, 개개 또는 폴리시스트론의 독시사이클린 유도성 작제물의 도입은 4배성 상보적 분석에 의한 중간 임신배아(mid-gestation embryos)에의 기여를 포함하는, 다분화능의 특징 모두를 나타내는 iPS 세포를 생성한다[참조: Woltjen et al ., Nature. 458: 766-770, 2009].
추가로, 플록스된(floxed) 프로바이러스 작제물은 일시 크레-재조합효소 발현 아데노바이러스에 의한 후속 감염을 통해 분해될 수 있다[참조: Kaji et al., Nature. 458: 771-775, 2009].
iPS 생성을 위한 비-DNA-기반 방법
a) 화학적 접근법
한 가지 예에서, 효능 결정 인자는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 억제제이고, G9a는 Oct4 대신에 또는 Oct4에 대한 보충으로서(예: 이의 발현 수준을 감소시키기 위해) 사용된다. G9a의 화학적 억제는, 예를 들면, 엔조 라이프사이언시스(Enzo Lifesciences)사의 BIX-01294 (BIX)로 달성할 수 있고, 히스톤 3, 리신 9 메틸화 (H3K9me) 매개된 Oct4 발현에 대한 길항작용을 용이하게 했고, 몇몇 세포에서 바이러스 전달된 Oct4로 iPS 세포의 유도체화를 완전히 치환할 수 있다[참조: Shi et al., Cell Stem Cell. 2: 525-528, 2008].
또는, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 사용하여 발현 G9a를 녹다운시킨다. 이러한 shRNA는 Oct4 프로모터를 탈메틸화시키고 Oct4 발현을 부분 재활성화시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Ma et al., Stem Cells. 26: 2131-2141, 2008].
또 다른 예에서, L-채널 칼슘 길항제[예; 토크리스 바이오사이언시스(Tocris Bioscience)사의 Bayk8644]를 G9a 길항제(예, BIX)와 조합 사용하여, 상보성 Sox2 및 cMyc를 치환할 수 있다[참조: Shi et al., Cell Stem Cell. 3: 568-574, 2008].
또 다른 예에서, 효능 결정 인자는 MEK 억제제이다. 체세포 사이클 진행에 관여하는 MEK(예: 카이맨 케미칼(Cayman Chemical)사의 PD0325901)의 화학적 억제는, Oct4/Klf4 감염 후 7일 내지 9일 및 연속적으로 7일(예: 5일) 동안 보다 높은 Oct4 발현과 함께 재프로그램된 iPS 콜로니의 증가된 성장을 나타냈다[참조: Shi et al., 2008, 상기 참조].
추가의 예에서, 효능 결정 인자는 Wnt3a이다. 세포외 Wnt3a는 표적 세포에서 내생 cMyc 발현의 β-카테닌 매개된 유도를 자극하여, 재프로그래밍 효능의 현저한 개선을 생성할 수 있다[참조: Marson et al., 2008].
추가의 예에서, 효능 결정 인자는 오카다산(okadaic acid)이다. 오카다산(OA)는 단백질 세린/트레오닌 포스파타제 2A(PP2A)의 강력한 억제제이다. PP2A는 cMyc에서 특이적 세린 잔기를 탈포스포릴화하고, 이를 신속한 유비퀴틴 조절된 분화에 대해 표적화하고, 또한 Klf4의 증가를 유도하여, cMyc 유전자 발현의 상향 조절을 유도하는 cMyc 프로모터에서 OA-반응성 요소에 순차 결합한다. EIFα의 억제를 통해 해독에 대한 OA의 추가 억제 효과는 mRNA 전사의 초기 축적을 유도하고, 후속적으로 OA 회수시에 해독된 단백질의 볼루스 양의 전달을 유도할 수 있다.
또 다른 예에서, 효능 결정 인자는 켄폴론(kenpaullone)이다. MEF를 발현하는 Oct4/Sox2/cMyc 레트로바이러스에 대해 Klf4의 켄폴론(광범위한 단백질 키나제 억제제)으로의 치환은 생식세포 경쟁 키메라에 관여할 수 있는 Oct4 선별가능한 iPS 세포를 생성한다[참조: Lyssiotis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 8912-8917, 2009].
추가의 예에서, 효능 결정 인자는 히스틴 데아세틸라제 억제제이다. iPS 세포에 대해 쥐 섬유아세포의 iPS 재프로그래밍 효능의 1백배 개선은 히스톤 데아세틸라제 활성의 화학적 억제에 의해 관찰되었다[참조: Huangfu et al., Nat Biotech. 26: 795-797, 2008; Huangfu et al., Nat Biotech. 26: 1269-1275, 2008]. 예를 들면, 발프론산(valproic acid)은 유전자 재프로그래밍의 재프로그래밍 효능을 개선시킨다.
추가의 예에서, 효능 결정 인자는 DNA 메틸라제 억제제이다.
b) 단백질 전달
작은 분자 화합물의 사용과 마찬가지로, 단백질 전달은 이의 가역성에 기인하여 iPS 세포 생성에 대한 매력적인 접근법이다.
한 가지 예에서, 단백질 효능 결정 인자를 단백질 형질전환 도메인에 접합시켜 세포내(바람직하게는 핵내) 도입을 촉진시킨다. 단백질 형질전환 도메인은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 폴리아르기닌, HIV Tat 염기성 도메인, 안타나페디아(예를 들면, 문헌[참조: Jones et al., Br J Pharmacol., 145:1093-102, 2005]에 기재된 바와 같음)를 포함한다. 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)는 MEF를 iPS 세포로 전환시킬 수 있는 효능 결정 인자에 연결된 폴리-아르기닌 표적화 서열을 도입한 재조합 단백질을 발현시켰다.
단백질을 생성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고/있거나 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) or Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988), 현재까지의 모든 업데이트 포함]에 기재되어 있다.
c) 유전자 침묵 전략
한 가지 예에서, 효능 결정 인자는 내생 유전자의 발현을 침묵하거나 감소시키는 핵산 기반 화합물이다.
한 가지 예에서, 효능 결정 인자는 마이크로RNA(miRNA)이다. miRNA는 서열 특이적 방식으로 표적 전사체의 결합을 통해 주로 다수의 생물학적 과정을 조절하는 단일가닥의 비코딩 RNA이다. miRNA는 초기에 주요 전사체로서 발현되고, 이어서 절단되어 활성 miRNA를 방출하며, 이는 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)와 복합체화되어 해독의 억제를 개시한다. 레트로바이러스 감염후 0일 및 6일에서 miR-294의 형질감염은 cMyc를 75% 효능까지 대체할 수 있다[참조: Judson et al., Nat. Biotech. 27: 459-461, 2009].
Dnmt1의 siRNA 녹다운은 재프로그램되는 세포의 초과를 부분적으로 또는 충분히 보조하고 재프로그래밍 효능을 4배 증가시킬 수 있다[참조: Mikkelsen et al., Nature. 454: 49-55, 2008]. 유사하게는, 생체내에서 이식후 배의 Oct4 탈활성화에 관련된 히스톤 메틸트랜스퍼라제인 G9a의 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 녹다운은 Oct4 프로모터 및 부분 재활성화의 탈메틸화를 생성한다(상기 참조). Oct4/Sox2/Klf4 감염과 함께 성체 포피 섬유아세포에 대한 p53 siRNA의 부가는 단독으로 또는 추가의 치료제와 함께 효능을 증가시킨다[참조: Zhao et al., Cell Stem Cell. 3:475-479, 2008].
당해 기술분야의 숙련가들은 적합한 RNA 기반 화합물을 알 것이다. 예시적 화합물은 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자인, PNA, 간섭 RNA, siRNA, 짧은 헤어핀 RNA, 마이크로RNA를 포함한다.
안티센스 폴리뉴클레오티드
용어 "안티센스 폴리뉴클레오티드"는, 임의의 양태에서 본원에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 특이적 mRNA 분자의 적어도 일부분에 상보성이고 mRNA 해독과 같은 전사후 사건을 간섭할 수 있는 DNA 또는 RNA 또는 이의 조합을 의미하는 것으로 간주된다. 안티센스 방법의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: Hartmann and Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)].
본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 생리학적 조건하에 표적 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 구조 유전자에 상응하는 서열 또는 유전자 발현 또는 스플라이싱의 조절을 수행하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 안티센스 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 유전자의 표적화 코딩 영역, 또는 5'-비해독된 영역(UTR) 또는 3'-UTR 또는 이들의 조합에 상응할 수 있다. 이는 인트론 서열에 부분적으로 상보성일 수 있고, 인트론 서열은 전사 동안 또는 전사 후에 바람직하게는 표적 유전자의 엑손 서열에 대해서만 스플라이싱될 수 있다. 안티센스 서열의 길이는 표적 핵산 또는 이를 코딩하는 구조 유전자의 적어도 19개 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오티드, 및 보다 바람직하게는 적어도 100개, 200개, 500개 또는 1000개 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상보적인 전장 서열이 사용될 수 있다. 당해 길이는 가장 바람직하게는 100 내지 2000개 뉴클레오티드이다. 표적화 전사체에 대한 안티센스 서열의 상동성 정도는 적어도 90% 및 보다 바람직하게는 95 내지 100%이어야 한다.
촉매적 폴리뉴클레오티드
용어 "촉매적 폴리뉴클레오티드/핵산"은, 독특한 기질을 특이적으로 인지하고 당해 기질의 화학적 변형을 촉매하는, DNA 분자 또는 DNA 함유 분자(또한 당해 기술분야에서 "데옥시리보자임" 또는 "DNAzyme"로서 알려져 있음) 또는 RNA 또는 RNA 함유 분자(또한 "리보자임" 또는 "RNAzyme"으로 알려져 있음)를 지칭한다. 촉매적 핵산 중의 핵산 염기는 염기 A, C, G, T(및 RNA의 경우 U)이다.
통상적으로, 촉매적 핵산은 표적한 핵산의 특이적 인지 및 핵산 분리 효소적 활성(또한 본원에서 "촉매적 도메인"으로 지칭됨)을 위한 안티센스 서열을 함유한다. 본 발명에 특히 유용한 리보자임 유형은 햄머헤드 리보자임 및 헤어핀 리보자임이다.
RNA 간섭
RNA 간섭(RNAi)은 특정 단백질의 생성을 특이적으로 억제하는데 유용하다. 이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, 워터하우스(Waterhouse) 등(1998)은 dsRNA(이본쇄 RNA)가 단백질 생성의 감소에 사용될 수 있는 메카니즘에 대한 모델을 제공했다. 당해 기술은 목적하는 유전자 또는 이의 부분의 mRNA와 실질적으로 동일한 서열을 함유하는 dsRNA 분자의 존재에 의존한다. 편리하게는, dsRNA는 재조합 벡터 또는 숙주 세포 중의 단일 프로모터로부터 생성될 수 있고, 여기서 센스 및 안티센스 서열은 센스 및 안티센스 서열이 하이브리드화하여, 루프 구조를 형성하는 비관련 서열를 갖는 dsRNA 분자를 형성할 수 있는 비관련 서열에 의해 플랭킹되어 있다. 본 발명에 적합한 dsRNA 분자의 설계 및 생성은 국제공개공보 WO99/32619, WO99/53050, WO99/49029 및 WO01/34815를 고려하여 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 능력 내에 있다,
하이브리드화하는 센스 및 안티센스 서열의 길이는 각각 적어도 19개 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 30개 또는 50개 뉴클레오티드, 및 보다 바람직하게는 적어도 100개, 200개, 500개 또는 1000개 뉴클레오티드이어야 한다. 전체 유전자 전사체에 상응하는 전장 서열이 사용될 수 있다. 당해 길이는 바람직하게는 많아야 100 내지 2000개 뉴클레오티드이다. 표적화 전사체에 대한 센스 및 안티센스의 상동성 정도는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 및 보다 바람직하게는 95 내지 100%이어야 한다.
바람직한 작은 간섭 RNA("siRNA") 분자는 표적 mRNA의 약 19 내지 23개 인접 뉴클레오티드에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, siRNA 서열은 디뉴클레오티드 AA로 개시되고, 약 30 내지 70%(바람직하게는 30 내지 60%, 보다 바람직하게는 40 내지 60% 및 보다 바람직하게는 약 45 내지 55%)의 GC 함량을 포함하고, 예를 들면, 표준 BLAST 검색으로 측정한 바와 같이, 도입되어야 하는 포유동물 게놈 중의 표적 이외의 임의의 뉴클레오티드 서열에 대해 높은 비율의 상동성을 갖지 않는다.
배양 조건
다분화능 세포 및/또는 재프로그램된 세포 및/또는 재프로그램되는 세포는 다분화능 세포의 성장을 지지하는데 사용된 임의의 배지에서 배양할 수 있다. 전형적인 배양 배지는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 규정 배지, 예를 들면, TeSRTM(StemCell Technologies, Inc.; Vancouver, Canada), mTeSRTM(StemCell Technologies, Inc.) 및 StemLineR 혈청 비함유 배지(Sigma; St. Louis, MO), 또한 조절된 배지, 예를 들면, 마우스 배 섬유아세포(MEF) 조절된 배지를 포함한다. 추가의 배지는 염기성 배지, 예를 들면, KoSR(Invitrogen Corporation)가 보충된 DMEM 또는 DMEM-F12를 포함한다. 또는, 문헌[참조: Silva et al., PLOS Biology, 6: e253, 2008]은 재프로그램된 세포의 생성 및 미분화 상태로 재프로그램된 세포를 유지하는, 예를 들면, MAPK 시그날링 억제제 및 글리코겐 신타제 키나제-3 시그날링의 억제제 및 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하는데 유용한 배지를 기재한다. 본원에 사용된 바와 같이, "규정된 배지"는 생화학적으로 규정된 구성분으로 단독으로 구성된 생화학적으로 규정된 제형을 지칭한다. 규정된 배지는 또한 공지된 화학 조성물을 갖는 구성분을 단독으로 포함할 수 있다. 규정된 배지는 공지된 공급원으로부터 유도된 구성분을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "조절된 배지"는 배지에서 배양된 세포로부터 가용성 인자로 추가 보충된 성장 배지를 지칭한다. 또는, 세포는 배양 배지 중의 MEF 상에 유지될 수 있다.
배양 배지는 바람직하게는 습윤 인큐베이터에서 약 37도℃에서 배양된다. 세포 배양 조건은 본 발명의 세포에 대해 상당히 달라질 수 있지만, 몇몇 양태에서 세포는, 예를 들면, 5% O2, 10% CO2, 85% N2를 포함하거나 공기중 10% CO2를 포함하는, 세포 성장에 적합한 환경에서 유지된다.
또 다른 양태에서, 세포는 매트릭스, 예를 들면, 세포외 매트릭스, 예를 들면, MatrigelTM, 라미닌, 콜라겐, CulturexR 등 위에 또는 내에서 배양된다. 다른 양태에서, 세포는 세포외 매트릭스의 존재하에 배양될 수 있다. 이러한 매트릭스의 존재하에 세포를 증식시키는 적합한 공정은, 예를 들면, 미국 특허 제7,297,539호에 기재되어 있다.
세포의 분리 또는 강화
다음 방법은, 예를 들면, 본원에 기재되거나 당해 기술분야에 공지된 마커를 검출함으로써 Stro-1+ 세포 및/또는 재프로그램된/다분화능 세포의 분리 및 강화에 유용하다.
목적한 세포를 강화시키는 한 가지 예시적 접근법은 자기, 예를 들면, DynabeadsR을 사용하는 자기 비드 세포 분류(MACS) 또는 임의의 기타 세포 분류 방법이다. 통상의 MACS 공정은 문헌[참조: Miltenyi et al. (Cytometry 11:231-238, 1990)]에 기재되어 있다. 당해 공정에서, 세포는 세포 표면 마커 또는 단백질에 결합하는 항체 또는 기타 화합물에 결합된 자기 비드로 표지되고, 당해 세포는 파라자기 분리 컬럼을 통과시키거나 또 다른 형태의 자기장에 노출시킨다. 분리 컬럼은 강력한 자석에 위치시키고, 이에 의해 당해 컬럼 내에 자기장을 생성한다. 자기 표지된 세포는 컬럼 내에 포획되고, 그렇지 않은 세포는 컬럼을 통과한다. 이어서, 포획된 세포를 컬럼으로부터 용출시킨다.
본 발명의 세포는, 예를 들면, 적합한 단백질을 발현하는 세포를 분리하기 위해 MACS를 사용하여 상기한 바와 같은 적합한 체내 저장소로부터 강화될 수 있다. 샘플은 당해 단백질에 결합하는 면역자기 비드와 함께 항온처리한다. 항온처리 후, 샘플을 세척하고, 재현탁시키고, 자기장에 통과시켜 면역자기 비드에 결합된 세포를 제거하고, 비드에 결합된 세포를 수집한다. 이들 기술은 음성 선별, 예를 들면, 바람직하지 않은 마커를 발현하는 세포, 즉 바람직하지 않은 세포의 제거에 동등하게 적용가능하다. 이러한 방법은 세포 모집단을 바람직하지 않은 세포 종류(들) 상에 검출가능한 수준으로 발현된 세포 표면 마커에 결합하는 화합물로 표지된 자기 입자에 세포 모집단을 접촉시킴을 포함한다. 항온처리 후, 샘플을 세척하고, 재현탁시키고, 자기장에 통과시켜 면역자기 비드에 결합된 세포를 제거한다. 이어서, 바람직하지 않은 세포 종류(들)이 고갈된 잔류하는 세포를 수집한다.
또 다른 양태에서, 단백질 또는 단백질 표면 마커에 결합하는 화합물은 고체 표면 상에 고정시키고, 세포 모집단을 여기에 접촉시킨다. 세척하여 결합하지 않은 세포를 제거한 후, 화합물에 결합된 세포를 회수하고, 예를 들면, 용출시키고, 이에 의해 당해 화합물이 결합하는 단백질을 발현하는 세포를 분리하거나 강화시킬 수 있다. 또는, 당해 화합물에 결합하지 않는 세포를 필요에 따라 회수할 수 있다.
바람직한 양태에서, 세포는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 분리하거나 강화시킨다. FACS는, 입자의 형광 특성에 기반하고, 예를 들면, 문헌[참조: Kamarch, Methods Enzymol , 151:150-165, 1987]에 기재된 바와 같은 세포를 포함하는 입자를 분리하는 공지된 방법이다. 일반적으로, 이 방법은 세포 모집단을 하나 이상의 단백질 또는 세포 표면 마커에 결합할 수 있는 화합물과 접촉시킴을 포함하고, 여기서 독특한 마커에 결합하는 화합물은 상이한 형광 잔기, 예를 들면, 형광단으로 표지한다. 당해 세포는 좁고 신속하게 유동하는 액체 스트림의 중심에 동반된다. 유동은 이들의 직경에 대해 세포가 분리되도록 정렬된다. 와동 메카니즘은 세포의 스트림이 개개 액적으로 파괴되도록 한다. 당해 시스템은 하나 이상의 세포가 액적 내에 존재할 가능성이 낮도록 조절된다. 당해 스트림이 액적으로 파괴되기 직전에, 당해 유동을 형광 측정 스테이션에 통과시키고, 여기서 각 세포의 목적하는 형광 특성, 예를 들면, 표지된 화합물이 여기에 결합되는지의 여부가 측정된다. 전기적 하전 링을 당해 스트림이 액적으로 파괴되는 지점에 위치시킨다. 전하는 직전 형광 강도 측정에 기반한 환 상에 위치시키고, 반대측 전하는 스트림이 파괴됨에 따라 액적 상에 포획된다. 이어서, 하전된 액적을 이들의 전하에 기반하여 용기 내로, 예를 들면, 표지된 화합물이 세포에 결합되는 경우의 특정 용기에 및 그렇지 않은 경우의 또 다른 용기에 액적을 전환시키는 정전기 편향 시스템에 의해 떨어진다. 몇몇 시스템에서, 전하는 스트림에 직접 인가되고, 액적 파괴는 당해 스트림과 동일한 징후의 전하를 보유한다. 이어서, 당해 스트림을 액적 분리 후에 중성으로 되돌아 가게 한다.
세포의 분화
본 발명의 재프로그램된 세포 또는 다분화능 세포는 상업적으로 및 치료학적으로 중요한 다양한 조직 유형의 분화된 세포의 모집단을 제조하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이는 세포를 목적하는 수로 신장함으로써 달성된다. 그 후, 이들은 다양한 분화 전략에 따라 분화를 유발한다. 예를 들면, 신경 계통 세포의 고도 강화된 모집단은 하나 이상의 신경성장인자(예를 들면, 신경성장인자 3 또는 뇌 유도된 신경성장 인자), 하나 이상의 미토겐(예: 상피 성장 인자, bFGF, PDGF, IGF 1 및 에리트로포이에틴) 또는 하나 이상의 비타민(예: 레티노익산, 아스코르브산)을 함유하는 배양 배지로 당해 세포를 변경함으로써 생성할 수 있다. 이와는 달리, 다능성 신경 줄기 세포는 배양체 단계를 통해 생성될 수 있고, bFGF를 함유하는 화학적으로 규정된 배지에서 유지시킬 수 있다. 배양된 세포는 이들이 신경 전구체 세포 마커, 예를 들면, 네스틴, 무사시, 비멘틴, A2B5, nurr1 또는 NCAM을 발현하는지에 기반하여 임의로 분리할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 신경 세포(성숙 뉴론 포함) 및 아교 세포(별아교세포 및 희소돌기아교세포 포함)를 갖는 신경 선조체/줄기 세포를 수득할 수 있다. 또는, 분화된 세포 모집단을 형성하는 능력을 갖는 복제 신경 선조체가 수득될 수 있다.
조혈 계통의 마커가 고도 강화된 세포는 당해 줄기 세포를 히스톤 데아세틸라제 억제제, 예를 들면, n-부티레이트의 존재하에 배양함으로써 재프로그램된 또는 다분화능 세포로부터 분화될 수 있다. 배양된 세포는 EGF, 인슐린 또는 FGF 등의 간세포(hepatocyte) 성숙 인자와 함께 동시에 또는 순차로 임의로 배양된다.
또한, 재프로그램된 또는 다분화능 세포를 사용하여, 심근세포 및 자발적 주기적 수축 활성의 특징적 마커를 갖는 세포를 생성할 수 있다. 이러한 방식의 분화는 DNA 메틸화(예: 5-아자-데옥시-시티딘), 성장 인자 및 골 형태형성 단백질에 영향을 주는 뉴클레오티드 동족체에 의해 촉진된다. 당해 단백질은 밀도 기반 세포 분리에 의해 추가로 강화될 수 있고, 크레아틴, 카르니틴 및 타우린을 함유하는 배지에서 유지될 수 있다.
재프로그램된 또는 다분화능 세포는 골 형태형성 단백질(BMP), 사람 TGF-베타 수용체에 대한 리간드 또는 사람 비타민 D 수용체에 대한 리간드를 함유하는 배지에서 간엽 세포 또는 연골발생 세포로 분화하도록 지시된다. 당해 배지는 덱사메타손, 아스코르브산-2-포스페이트, 및 칼슘 및 인산염 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 유도체 세포는 골아세포 계통의 세포의 표현형 특성을 갖는다.
인지할 수 있는 바와 같이, 재프로그램된 또는 다분화능 세포로부터 유도된 분화 세포는 또한 이를 필요로 하는 사람 환자에서 조직 재구성 또는 재생에 사용될 수 있다. 당해 세포는 이들을 의도된 조직 부위로 이식되도록 하고 기능적 결함 부위를 재구성 또는 재생하도록 하는 방식으로 투여된다. 예를 들면, 신경 전구체 세포는 치료되는 질환에 따라 중추신경계의 실질 및 경막 부위 내로 직접 이식될 수 있다. 신경 세포 이식체의 효능은 문헌[참조: McDonald, et al. ((1999) Nat. Med., vol. 5:1410) and Kim, et al. ((2002) Nature, vol. 418:50]에 기재된 바와 같이 급성 손상 수초에 대한 랫트 모델에서 평가될 수 있다. 성공적인 이식체는 별아교세포, 희소돌기아교세포 및/또는 뉴론으로 분화된 2 내지 5주 후의 병변에 존재하는 이식체 유도된 세포를 나타내고, 병변 말단으로부터 척수를 따라 이동하여 족적, 조정 및 중량 부하를 개선시킨다.
유사하게는, 본 발명의 양수인은 골절 또는 연골 손상의 치료를 위한 간 줄기 세포의 투여의 용도를 입증했다.
유사하게는, 심근세포의 효능은 심장 손상 또는 기능부전의 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있고, 예를 들면, 심장 냉동손상에 대한 동물 모델의 경우, 좌측 심실벽 조직의 약 55%가 치료 없이 흉터 조직으로 된다[참조: Li, et al. (1996), Ann. Thorac. Surg., vol. 62:654; Sakai, et al. (1999), Ann. Thorac. Surg., vol. 8:2074; Sakai, et al. (1999), J. Thorac. Cardiovasc. Surg., vol. 118:715]. 성공적인 치료는 흉터 부분을 감소시키고, 흉터 신장을 제한하고, 수축기, 심확장기 및 발달된 압력에 의해 측정한 바와 같이 심장 기능을 개선시킨다[참조: Kehat, et al. (2004)]. 심장 손상은 또한, 예를 들면, 좌측 전방 하류 동맥의 원위 부분에서 색전혈증 코일을 사용하거나[참조: Watanabe, et al. (1998), Cell Transplant., vol. 7:239], 좌측 전방 하류 관상 동맥의 연결[참조: Min, et al. (2002), J. Appl. Physiol., vol. 92:288]에 의해 모델링할 수 있다. 처리 효능은 조직학 및 심장 기능에 의해 평가할 수 있다. 본 발명에서 실시된 심근세포 제제는 심근 재생의 치료에 또는 불충분한 심장 기능의 치료에 사용될 수 있다.
간 기능은 또한, 예를 들면, 본 발명에 따라 성장시킨 영장류 다분화능 줄기 세포로부터 분화된 간세포 및 간세포 전구체를 투여함으로 회복될 수 있다. 이들 분화된 세포는 간 손상을 회복하는 능력에 대한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 이러한 한 가지 예는 D-갈락토스아민의 복강내 주사에 의해 유발된 손상이다[참조: Dabeva, et al. (1993), Am. J. Pathol., vol. 143:1606]. 치료 효능은 간 세포 마커에 대한 면역세포화학적 염색, 세포 구조가 성장 조직에서 형성되는지에 대한 현미경 측정, 및 간 특이적 단백질의 합성을 회복하는 치료 능력에 의해 측정할 수 있다. 간 세포는 직접 투여에 의해, 또는 일시적 간 기능을 제공하는 생물보조 장치의 일부로서 치료에 사용될 수 있고, 이때 대상체의 간 조직은, 예를 들면, 전격성 간 발작 후에 자체로 재생된다.
세포 조성물
본 발명의 한 가지 예에서, 재프로그램된 또는 다분화능 세포 및/또는 이로부터 분화된 세포는 조성물로 투여되거나 이러한 조성물로 제형화된다. 바람직하게는, 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "담체" 및 "부형제"는 활성 화합물의 저장, 투여 및/또는 생물학적 활성을 촉진시키기 위해 당해 기술분야에 통상 사용되는 당해 조성물을 지칭한다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)]. 담체는 또한 활성 화합물의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다. 적합한 담체는, 예를 들면, 안정하고, 예를 들면, 담체 내의 다른 성분과 반응할 수 없다. 한 가지 예에서, 담체는 치료에 사용된 용량 및 농도에서 수용체에 현저한 국소 또는 전신 부작용을 생성하지 않는다.
본 발명에 적합한 담체는 통상 사용되는 것들을 포함하고, 예를 들면, 물, 염수, 수성 덱스트로즈, 락토즈, 링거액, 완충액, 히알루로난 및 글리콜이 특히 용액(등장성인 경우)의 경우에 바람직한 액체 담체이다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제는 전분, 셀룰로즈, 글루코즈, 락토즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산마그네슘, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
또 다른 예에서, 담체는 배지 조성물이고, 예를 들면, 세포가 그 안에서 성장하거나 현탁된다. 바람직하게는, 이러한 배지 조성물은 투여되는 대상체에서 어떠한 부작용도 유도하지 않는다.
바람직한 담체 및 부형제는 세포의 생존력 및/또는 생물학적 효과 및 바람직하게는 유익한 효과를 나타내는 세포의 능력에 역효과를 나타내지 않는다.
한 가지 예에서, 담체 또는 부형제는 적합한 pH에서 세포 및/또는 가용성 인자를 유지하는 완충 활성을 제공하여 생물학적 활성을 나타내고, 예를 들면, 담체 또는 부형제는 인산염 완충된 염수(PBS)이다. PBS는, 세포 및 인자와 최소로 반응하고 세포 및 인자를 신속하게 방출하기 때문에 매력적인 담체 또는 부형제이고, 이 경우에, 본 발명의 조성물은 혈류 또는 조직 또는 조직 주위의 영역 또는 조직에 인접한 영역 내로, 예를 들면, 주사에 의해 직접 적용하기 위한 액체로서 제조될 수 있다.
재프로그램된 또는 다분화능 세포 및/또는 이로부터 분화된 세포는 또한 수용체 혼화성이고 수용체에 유해하지 않은 생성물로 분해되는 스캐폴드로 도입되거나 매립될 수 있다. 이들 스캐폴드는 수용체 대상체 내로 이식되어야 하는 세포를 지지하고 보호한다. 자연 및/또는 합성 생분해성 스캐폴드가 이러한 스캐폴드의 예이다.
다수의 상이한 스캐폴드가 본 발명의 실시에 성공적으로 사용될 수 있다. 바람직한 스캐폴드는, 이로써 한정되지는 않지만, 생물학적 분해가능한 스캐폴드이다. 자연 생분해성 스캐폴드는 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌 스캐폴드이다. 세포 이식 스캐폴드에 적합한 합성 물질은 광범위한 세포 성장 및 세포 기능을 지지할 수 있어야 한다. 이러한 스캐폴드는 또한 재흡수성일 수 있다. 적합한 스캐폴드는, 예를 들면, 문헌[참조: Vacanti, et al. J. Ped. Surg. 23:3-9 1988; Cima, et al. Biotechnol. Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al. Plast. Reconstr. Surg. 88:753-9 1991]에 기재된 바와 같은 폴리글리콜산 스캐폴드 또는 합성 중합체, 예를 들면, 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 포함한다.
또 다른 예에서, 세포는 겔 스캐폴드(예: Gelfoam from Upjohn Company)로 투여될 수 있다.
본 발명에 유용한 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 세포와 혼합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 세포는, 이로써 한정되지는 않지만, 기타 다능성 또는 다분화능 세포 또는 줄기 세포 또는 골수 세포를 포함한다. 상이한 종류의 세포를 본 발명의 조성물과 즉시 또는 투여 직전에 혼합하거나, 투여 전에 소정 시간 동안 함께 공-배양할 수 있다.
바람직하게는, 당해 조성물은 유효량 또는 치료학적 또는 예방학적 유효량의 세포를 포함한다. 예를 들면, 당해 조성물은 약 1×105개 재프로그램된 또는 다분화능 세포 및/또는 이로부터 분화된 세포/kg 내지 약 1×107개 재프로그램된 또는 다분화능 세포 및/또는 이로부터 분화된 세포/kg 또는 약 1×106개 재프로그램된 또는 다분화능 세포 및/또는 이로부터 분화된 세포/kg 내지 약 5×106개 재프로그램된 또는 다분화능 세포 및/또는 이로부터 분화된 세포/kg을 포함한다. 투여되는 세포의 정확한 양은 연령, 체중 및 환자의 성별, 및 치료되는 질환의 정도 및 중증도를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라진다.
몇몇 양태에서, 세포는, 세포가 대상체의 순환으로 배출되지는 않지만 세포에 의해 분비된 인자가 순환에 도입되도록 하는 챔버 내에 함유된다. 이러한 방식에서, 가용성 인자는 세포가 대상체의 순환으로 인자를 분비시킴으로써 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 챔버는 가용성 인자의 국소 수준을 증가시키기 위해 대상체의 소정 부위에 동등하게 이식될 수 있다.
본 발명의 몇몇 양태에서, 세포 조성물에 의한 치료의 개시 전에 환자를 면역억제하는 것이 필요하지 않거나 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 동종성 또는 심지어 이종성의 재프로그램된 또는 다분화능 세포 및/또는 이로부터 분화된 세포에 의한 이식은 몇몇 예에서 허용될 수 있다.
그러나, 다른 예에서, 세포 치료의 개시 전에 환자를 약리학적으로 면역억제시키는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이는 전신 또는 국소 면역억제제의 사용을 통해 달성될 수 있거나, 세포를 캡슐화된 장치에 전달함으로써 달성될 수 있다. 세포는 세포 및 치료학적 인자에 의해 요구되는 영양소 및 산소에 투과성인 캡슐에 캡슐화되고, 세포는 여전히 면역 체액 인자 및 세포에 불투과성이다. 바람직하게는, 캡슐화제는 저알레르기성이고, 표적 조직에 용이하고 안정하게 위치되며, 이식된 구조체에 대한 부가의 보호를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역 반응을 감소시키거나 제거하는 이들 및 기타 수단은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 대체 방법으로서, 세포는 유전적으로 변형시켜 이들의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명은 또한 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포를, 당해 화합물이 재프로그래밍 및 당해 세포 재프로그래밍 여부의 결정을 유도하거나 향상시키는 경우에 재프로그램이 발생하기에 충분한 시간 및 조건하에 소정 화합물과 접촉시킴을 포함하는, Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대의 재프로그래밍을 유도 또는 향상시키는 화합물을 동정 또는 분리하는 방법을 제공한다.
한 가지 예에서, 당해 방법은
(i) Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포로 강화된 모집단을, 당해 화합물이 재프로그래밍 및 재프로그램된 세포 수의 결정을 유도하거나 향상시키는 경우에 재프로그램이 발생하기에 충분한 시간 및 조건하에 소정의 화합물과 접촉시키는 단계 및
(ii) 당해 화합물과 접촉하지 않은 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포로 강화된 모집단에서 재프로그램된 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하고,
여기서, 단계(ii)와 비교하여 단계(i)에서 재프로그램된 세포의 증가된 수는 당해 화합물이 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포의 재프로그래밍을 유도 또는 향상시킴을 나타낸다.
한 가지 예에서, 당해 방법은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 효능 결정 인자의 존재하에 수행된다.
본 발명은 또한 재프로그램된 또는 다분화능 세포의 목적하는 세포 종류로의 분화를 유도하거나 향상시키는 화합물을 분리 또는 동정하는 방법을 제공하고, 여기서, 당해 당법은 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 생성된 재프로그램된 또는 다분화능 세포를 접촉시키고, 당해 세포가 목적하는 세포 종류로 분화되는지의 여부를 측정하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은
(i) 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 생성된 재프로그램된 또는 다분화능 세포로 강화된 모집단을 세포 분화가 발생하기에 충분한 시간 및 조건하에 소정의 화합물과 접촉시키고 목적하는 세포 종류의 세포 수를 측정하는 단계 및
(ii) 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행함으로써 생성된 재프로그램된 또는 다분화능 세포를 배양하여 생성된 목적하는 세포의 세포 수를 동일한 조건으로 상기 화합물의 부재하에 측정하는 단계를 포함하고,
여기서, 단계(ii)와 비교하여 단계(i)에서 목적하는 세포 종류의 세포 수의 증가는 당해 화합물이 목적하는 세포 종류로의 분화를 유도하거나 향상시킴을 나타낸다.
본 발명은 또한
(i) 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행하여, 당해 증상을 앓고 있는 대상체로부터 다분화능 세포 또는 이의 모집단을 생성하는 단계 및
(ii) 당해 세포 또는 모집단을 시험 화합물과 접촉시키고 이의 효과를 상기 증상의 하나 이상의 징후에 대해 측정하는 단계를 포함하는, 소정 증상의 치료에 유용한 화합물을 동정 또는 분리하는 방법을 제공하고, 여기서 당해 증상의 징후를 개선 또는 완화시키는 화합물은 당해 증상의 치료에 유용하다.
한 가지 예에서, 당해 방법은
(a) 다분화능 세포 또는 이의 모집단을 당해 증상에서 영향을 받은 세포로 분화시키는 단계 및
(b) 단계(a)에서의 세포를 시험 화합물과 접촉시키고, 이의 효과를 상기 증상의 하나 이상의 징후에 대해 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 증상의 징후를 개선 또는 완화시키는 화합물은 상기 증상의 치료에 유용하다.
적합한 방법은 소정 증상을 치료하기 위한 신규 화합물을 동정 또는 분리하는 것 뿐만 아니라, 대상체가 종래의 치료학적/예방학적 화합물에 의한 치료에 반응할 것인지의 여부를 동정하는데 유용하다.
당해 기술분야의 숙련가들은, 예를 들면, 본원의 개시 및/또는 적합한 조건 및/또는 이들 증상의 징후에 기반하여 세포를 분화시키는 적합한 방법을 인지할 것이다. 예를 들면, 소정 증상은 낭포성 섬유증이고 징후는 폐 세포로부터의 분비물이거나, 소정 증상은 신경퇴행성 증상(예: 알츠하이머병 또는 헌팅톤 질환)이고 징후는 신경퇴행 또는 플라크/세포내 응집물 형성이거나, 소정 증상은 심장 증상이고 징후는 심근세포 수축성이다.
본 발명은 또한, 예를 들면, 독성 위험이 감소된 치료학적 화합물을 결정하기 위해, 세포 또는 조직 종류에 대한 독성이 감소된 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은
(i) 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 방법을 수행하여 다분화능 세포 또는 이의 모집단을 생성하는 단계,
(ii) 다분화능 세포 또는 이의 모집단을 하나 이상의 특이적 계통의 세포 및/또는 조직으로 분화시키는 단계,
(iii) 당해 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및
(iv) 세포 생존력 및/또는 증식에 대한 당해 화합물의 효과를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 여기서, 세포 또는 현저한 비율의 세포 모집단을 사멸시키지 않거나 증식을 감소시키지 않는 화합물은 독성이 감소된 것으로 간주된다.
예시적 분화된 세포는 혈액 세포, 간 세포, 신장 세포 및 심장 세포이다.
세포 생존력 및/또는 증식에 대한 소정 화합물의 효과를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개된 비오티닐화 UTP 닉 말단 표지(TUNEL) 분석, 트립판 청색 염료 배제 분석, MTT 분석, 티미딘 도입 분석 또는 BrdU 도입 분석을 포함한다.
당해 기술분야의 숙련가들은 본 발명이 임의의 양태에 따라 본원에 기재된 세포를 사용하여 화합물을 동정 및/또는 분리하는 다양한 방법을 포함한다는 것을 상기 기재로부터 알 수 있을 것이다. 스크리닝에 적합한 화합물은, 예를 들면, 항체, 펩티드 또는 작은 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 동정되거나 분리된 화합물에 관한 정보를 제공한다. 따라서, 스크리닝 방법은
(i) 임의로, 화합물의 구조를 측정하는 단계 및
(ii) 화합물 또는 화합물의 명칭 또는 구조를, 예를 들면, 종이 형태, 기계 판독 형태 또는 컴퓨터 판독 형태로 제공하는 단계에 의해 추가로 변형된다.
당연히, 공지되어 있는 화합물은 본 발명에 의해 제공된 스크리닝을 사용하여 이들의 기능에 대해 사전에 시험되지 않더라도, 당해 화합물의 구조의 측정이 내포된다. 이는 당해 기술분야의 숙련가들은 당해 스크리닝을 수행할 때에 당해 화합물의 명칭 및/또는 구조를 인지할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "화합물의 제공"은 상기 화합물을 생성하는 임의의 화학적 또는 재조합 합성 수단을 포함하거나, 이와는 달리, 임의의 사람 또는 수단에 의해 이미 합성된 화합물의 제공을 포함하는 것으로 간주된다. 이는 당해 화합물의 분리를 명백히 포함한다.
바람직한 양태에서, 당해 화합물 또는 당해 화합물의 명칭 또는 구조는, 예를 들면, 본원에 기재된 스크리닝에 의해 측정한 바와 같이, 이의 용도에 대한 지시와 함께 제공된다.
스크리닝 분석은
(i) 임의로, 당해 화합물의 구조를 측정하는 단계,
(ii) 임의로, 당해 화합물의 명칭 또는 구조를, 예를 들면, 종이 형태, 기계 판독 형태 또는 컴퓨터 판독 형태로 제공하는 단계 및
(iii) 당해 화합물을 제공하는 단계에 의해 추가로 변형될 수 있다.
바람직한 양태에서, 합성된 화합물 또는 당해 화합물의 명칭 또는 구조는, 예를 들면, 본원에 기재된 스크리닝으로 측정된 바와 같이, 이의 용도에 대한 지시와 함께 제공된다.
한 가지 양태에서, 당해 화합물은 화합물 라이브러리에서 제공되고, 이들 각각 및 이의 서브세트는 다른 구성원으로부터 분리될 수 있다(즉, 물리적으로 분리됨). 이러한 경우, 소정 화합물은 이의 동정에 의해 라이브러리로부터 분리된 다음, 당해 기술분야의 숙련가가, 예를 들면, 라이브러리의 다른 구성원의 부재하에 분리시에 당해 화합물을 생성한다.
효율적인 재프로그래밍이 용이하게 접근가능하고 확실하게 가능한 최적 세포 종류를 동정하여 게놈 통합의 필요 없이 및/또는 최소 또는 감소된 수의 재프로그래밍 인자에 의해 재프로그래밍 방법의 사용을 촉진하는 데 유용하다. 이는 신생물 형질전환의 위험 감소와 함께 보다 안전한 다분화능 iPS 세포 모집단을 생성할 수 있다. 재프로그래밍에 매우 효율적이고 배 조직에 의존하지 않고서 수득되는 이러한 세포 종류는 종래의 다분화능 ES 세포에 대해 이미 고려된 분야에서의 사용에 적합할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에서 추가로 기재된다.
실시예 1
Stro-1+ 다능성 선조 세포로부터 재프로그램된 세포의 생성
1.1 Stro -1 + 다능성 선조 세포 강화 모집단
Stro-1+ 다능성 선조 세포는 골수, 지방 조직 및 치수 조직을 포함하는 각종 조직으로부터 수득된다. 상이한 부위로부터 유도된 Stro-1+ 다능성 선조 세포의 재프로그램 효능의 비교를 위해, 이들 조직 각각으로부터 세포는 STRO3 mAb를 사용하는 면역선별로 Stro-1Bright 세포가 강화된 다음, 배양-신장되고, 본질적으로 문헌[참조: Gronthos and Zannettino Methods Mol Biol . 449:45-57, 2008]에 기술된 바와 같이 ProFreezeTM-CDM(Lonza, USA)에서 동결 보존된다. 상이한 면역선별 방법을 사용하여 동일한 부위로부터 유도된 Stro-1+ 다능성 선조 세포의 재프로그램 효능의 비교를 위해, 동일 공여체로부터 쌍을 이룬 골수 샘플은 STRO3 또는 STRO1 mAbs를 사용하는 면역선별로 Stro-1Bright 세포가 강화된 다음, 배양 신장되고, ProFreezeTM-CDM(Lonza, USA)에서 동결 보존된다. 모든 연구를 위해, 계대 4 세포를 해동시키고, 즉시 사용을 위해 비히클을 형성한다.
1.2 렌티바이러스 벡터 패키지 및 생성
유전자 이식 발현 렌티바이러스 벡터는 293FT 세포주(Invitrogen)에서 생성된다. 293T는 형질전환된 293개의 배 신장 세포로부터 유도된 신속 성장하는 매우 이동가능한 클론 변형체이고, 이는 높은 바이러스 역가(titer)에 기여하는 패키징 단백질의 높은 수준의 발현을 위한 거대 T 항원을 함유한다. 통상적인 유지 및 신장을 위해, 이들 세포를 293FT 배지(DMEM/10%FBS, 2mM L-글루타민 및 0.1mM MEM 비필수 아미노산)에서 500㎍/ml 제네티신의 존재하에 배양한다. 패키징을 위해, 293FT 세포를 트립신화로 수집한다. 트립신을 원심분리로 제거 후, 이들 세포를 제네티신이 없는 293FT 배지 중의 T75 플라스크에서 분주했다(15 x 106세포/플라스크, 6개의 플라스크/구성물).
렌티바이러스 및 2개의 보조 플라스미드의 동시 형질감염을 세포 분주 직후 SuperfectR 형질감염 시약(Qiagen)으로 수행한다. 다음날, 형질감염 혼합물을 함유하는 배양 배지를 1mM 피루브산 나트륨(sodium pyruvate) 보충된 새로운 293FT 배지로 대체시켰다(8ml/플라스크). 렌티바이러스 함유 상청액을 형질도입 후 48 내지 72시간에 수집한다. 293FT 세포 잔층은 4℃에서 15분 동안 원심분리로 상청액으로부터 제거한다. 렌티바이러스를 농축시키기 위해, 상청액을 0.4μM 셀룰로즈 아세테이트(CA) 멤브레인(Cornington, 115ml 저-단백질 결합)을 통해 여과하고, 40℃에서 2.5시간 동안 70ml 멸균된 보틀(Beckman, Cat# 355622, 단지 45Ti 로터를 위해 폴리카보네이트)에서 초원심분리시킨다. 상청액 제거 후, PBS(각 구성물에 대해 약 300㎕)를 첨가하여 40℃에서 8 내지 14시간 동안 또는 실온에서 2시간 동안 원심분리관을 진동시켜 펠렛을 재현탁시킨다. 잔류하는 세포 잔층을 원심분리 제거하고, 재현탁된 렌티바이러스를 분주하고, -80℃에서 저장한다. 렌티바이러스는 하나 이상의 효능 결정 인자를 코딩하는 서열을 수반한다.
1.3 효능 결정 인자의 렌티바이러스 형질도입 및 발현 후 세포의 재프로그램
하나 이상의 효능 결정 인자(들)(예: Oct4; 또는 Oct4와 Sox2의 조합; 또는 Oct4, Sox2 및 Nanog 및 Lin28 중의 적어도 하나의 조합; 또는 Oct4, Klf4 및 c-Myc의 조합; 또는 Oct4, Sox2 및 Klf4의 조합; 또는 OCT4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 조합; 또는 Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 조합; 또는 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28의 조합)를 코딩하는 렌티바이러스를 최종 농도 약 6㎍/ml(Sigma)에서 폴리브렌 담체 첨가 후 세포 배양물에 첨가한다.
다음 날, 렌티바이러스 함유 배지를 새로운 배지로 대체하고, 세포를 적합한 배지에서 추가로 배양한다. 필요한 경우, 약물 선별은 형질도입 후 3일째에 시작한다.
세포는 체세포의 인자에의 노출 전후에 세포 분류 방법을 사용하여 분석한다. 부착 세포는 트립신 처리(0.05% 트립신/0.5mM EDTA, Invitrogen)로 분리시키고, 실온에서 20분 동안 2% 파라포름알데히드로 고정시킨다. 세포를 40-㎛ 메시를 통해 여과하고, FACS 완충액(2% FBS 및 0.1% 아지드화 나트륨(sodium azide)를 함유하는 PBS)에 재현탁시킨다. 현탁액에서 성장된 세포를 1mM EDTA 및 1% 정상 마우스 혈청(Sigma)이 보충된 FACS 완충액으로 염색시킨다. 세포내 미엘로퍼옥시다제(MPO) 염색은 Fix & PermR시약(Caltag Laboratories; Burlingame, CA)을 사용하여 수행한다. 5 x 105 세포를 함유하는 약 100㎕의 세포 현탁액을 각 표지화에 사용한다. (적용된) 제1 및 제2 항체 배양 모두를 실온에서 약 30분 동안 수행한다. 대조 샘플을 이소형-일치된 대조 항체로 염색한다. 세척 후, 세포를 약 300-500㎕의 FACS 완충액에 재현탁시키고, CellQuestTM 획득 및 분석 소프트웨어(BDIS)를 사용하여 FACSCalibur 유동 혈구계(BDIS; San Jose, CA) 상에서 분석한다. 총 20,000 사건이 획득된다. 검출된 마커는 SSEA-3, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, CD29, Tra-1-85, CD56, CD73, CD105, CD31 또는 CD34로부터 선택된다.
일부 형질유도 및 후속 배양물에서 세포를 발프로산의 존재하에 유지시킨다.
EB 및 기형종 형성을 또한 사용하여 재프로그램된 세포가 3개의 주요 배엽의 분화된 유도체를 생성하는 발전적인 가능성을 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 2
Stro-1+ 다능성 선조 세포로부터 재프로그램된 세포의 생성
2.1 물질 및 방법
Stro -1+ 다능성 세포 강화 모집단
Stro-1+ 다능성 선조 세포로 강화된 세포 모집단은 골수, 지방 조직 및 치수 조직으로부터 수득된다. 상이한 부위로부터 유도된 Stro-1+ 다능성 선조 세포의 재프로그램 효능의 비교를 위해, 이들 조직 각각으로부터 세포는 STRO3 mAb를 사용하는 면역선별로 Stro-1Bright 세포가 강화된 다음, 배양-신장되고, 본질적으로 문헌[참조: Gronthos and Zannettino Methods Mol Biol . 449:45-57, 2008]에 기술된 바와 같이 ProFreezeTM-CDM(Lonza, USA)에서 동결 보존된다. 상이한 면역선별 방법을 사용하여 동일한 부위로부터 유도된 Stro-1+ 다능성 선조 세포의 재프로그램 효능의 비교를 위해, 동일 공여체로부터 쌍을 이룬 골수 샘플은 STRO3 또는 STRO1 mAbs를 사용하는 면역선별로 Stro-1Bright 세포가 강화된 다음, 배양 신장되고, ProFreezeTM-CDM(Lonza, USA)에서 동결 보존된다. 모든 연구를 위해, 계대 4 세포를 해동시키고, 즉시 사용을 위해 비히클을 형성한다.
세포주
바이러스 패키지 세포인 백금-A(Plat-A) 세포는 셀 바이오랩스, 인코포레이티드(Cell Biolabs, Inc.)로부터 입수했다. 디트로이트(Detroit) 551 섬유아세포는 실험용 양성 대조군이었다.
레트로바이러스 생성 및 iPS 세포 세대
OCT4, SOX2, KLF4 및 cMYC의 사람 cDNA를 함유하는 몰로니계 레트로바이러스 벡터(pMX)는 애드진(Addgene)으로부터 입수했다. 9㎍의 각 플라스미드를 Fugene 6(Roche)을 사용하여 바이러스 패키지 Plat-A 세포 속에서 형질감염시켰다. 바이러스 함유 상청액을 형질감염 48시간 및 72시간 후에 수집하고, 0.45㎛ 세공 크기 필터를 통해 여과하고, 4㎍/ml의 폴리브렌(Sigma)으로 보충했다. 표적 세포를 밀도 1x103에서 5x103세포/cm2로 감염 24시간 전에 플레이팅했다. 4개의 전사조절 인자의 레트로바이러스 상청액은 동량으로 혼합하고, 이중 감염을 24시간 및 48시간에 표적 세포에 가했다. 감염된 세포를 위한 배양 배지를 감염 후 4일째에 hES 세포 배지로 변경했다. 세포를 3주 이하 동안 또는 세포가 합류될 때까지 매일 배지를 새롭게 하여 배양물에 유지시켰다.
iPS 세포의 전파
iPS 세포를 확립하기 위해, iPS 세포 콜로니는 감염 후 약 3주에 hES 세포형 콜로니 형태론에 기초하여 취했다. 취한 콜로니는 hES 세포 배지 중의 새로운 유사분열 불활성화된 MEF 상에서 신장되었다.
iPS 세포의 유지
사람 iPS 세포를 20% FBS(Hyclone), 1mM L-Glutamax, 0.1mM 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 1% ITS, 및 10ng/ml bFGF(모두 인비트로겐(Invitrogen)으로부터) 보충된 DMEM에서 배양했다. 사람 iPS 세포를 매일 배양 배지로 새롭게 했다. 기계적인 해리는 iPS 세포 콜로니를 29G 침을 겸비한 1ml 인슐린 시린지를 사용하여 보다 작은 세포군으로 분해하여 수행했다. 콜로니는 감염 후 8일 내지 10일 후에 새로 유사분열된 불활성화 MEF 상에서 옮겼다. iPS 콜로니는 이후 매 7 내지 10일 기계적 해리에 의해 통과되었다.
FACS 분석
세포의 형질전환 효율을 평가하기 위해, pMXs-GFP 레트로바이러스 벡터를 또한 상기 기술된 바와 동일한 방법을 사용하여 Plat-A 세포에서 형질전환시켰다. GFP cDNA를 함유하는 pMX 레트로바이러스는 부가 세포였다. GFP 발현 세포의 수는 감염후 48시간에 유동 세포계측법으로 평가했다. 세포는 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)로 분리하고, 유동 혈구계(MoFLO)를 사용하여 분석했다.
효율 분석의 재프로그램
지방 세포, 치수 세포 및 MPC를 상기 "레트로바이러스 생성 및 iPS 세포 세대"에서 기술된 바와 같이 4개의 인자로 감염시켰다. 세포를 매일 배지 변경하면서 17일 동안 유지시켰다. 이어서, 세포를 트립신으로 분리하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 세포를 2.5%(w/v) 탈지유, PBS 중의 2% (v/v) 염소 혈청으로 차단시켰다. 세포는 4℃에서 밤새 주요 항체(마우스 항-Oct4, 항-Nanog 또는 항-SSEA4)로 표지한 다음, 실온에서 1시간 동안 염소 항 마우스 Alexa 488 제2 항체로 표지했다. 샘플을 상기한 바와 같이 FACS로 분석하여 양성적으로 염색된 세포수를 측정했다.
2.2 결과
모든 Stro-1+ 다능성 선조 강화된 모집단은 이들이 치수 조직, 지방 조직 또는 골수로부터 공급되었는지의 여부와 무관하게, 그리고 이들이 STRO-3 또는 STRO-1 mAbs로 면역선별되었지의 여부와 무관하게, 재프로그램되어 iPS 세포주를 생성할 수 있었다.
각종 세포의 재프로그램 결과 요약은 표 1에 제시된다.
Figure pct00001
GFP 리포터 작제물에 의해 측정된 바와 같이, 모든 세포 종류의 형질전환 효율은 71.2 내지 98.3%에 걸쳐 유사했다. 플레이트당 성장하는 iPS 콜로니의 수를 측정하는 연구로부터의 결과는 D551 치사 섬유아세포로부터 유도된 세포주와 비교하여 치수 조직 및 지방 조직으로부터 공급된 Stro-1+ 다능성 선조 세포가 강화된 세포 모집단으로부터 유도된 세포주에 대한 상당히 높은 추정 iPS 세포 콜로니 형성을 지시했다. 또한, 치수 조직 및 지방 조직으로부터 공급된 Stro-1+ 다능성 선조 세포 강화된 세포 모집단으로부터 유도된 세포주에 대한 iPS 세포 콜로니 형성은 골수로부터의 Stro-1+ 다능성 선조 세포로부터 유도된 세포주보다 상당히 높았다. 치수 조직 및 지방 조직(각각 56 및 22)에 대한 평균 콜로니 수(플레이팅된 50,000개 세포 당)는 D551 섬유아세포(7) 또는 골수(0.5)에 대해 관찰된 것보다 상당히 높았다(p<0.05, Chi Square test).
D551 섬유아세포에 대한 Stro-1+ 다능성 선조 세포로부터의 iPS 세대의 증가된 효율이 외생적으로 형질감염된 유전자 또는 유도 내생 유전자의 지속 발현과 관련되는지의 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 총 배양된 형질감염 세포 모집단에서 Oct4 및 Nanog의 발현을 측정했다. 표 1에 제시된 바와 같이, 형질감염된 D551 섬유아세포는 최고 수준의 지속 Oct4 발현(69%)을 입증하고, 치수 조직 또는 지방 조직으로부터 공급된 형질감염된 Stro-1+ 다능성 선조 세포는 중간 수준의 Oct4 발현(각각 57% 및 56%, respectively)을 갖고, 형질감염된 골수 Stro-1+ 다능성 선조 세포는 최저 수준의 Oct4 발현(36%)을 가졌다.
치수 조직 또는 지방 조직으로부터 공급된 Stro-1+ 다능성 선조 세포의 형질감염된 모집단은 형질감염된 D551 섬유아세포(28%)보다 낮은 Nanog 발현 세포 총수(각각 5% 및 10%)를 가졌다. 골수 Stro-1+ 다능성 선조 세포의 경우, 유사한 패턴의 Oct4 및 Nanog 발현이, 이들이 STRO-3 또는 STRO-1 mAb과 동일한 쌍을 이룬 골수 샘플로부터 면역선별되었는지의 여부와 무관하게 지속적으로 나타났다(Oct4의 경우, 각각 30% 및 37%, Nanog의 경우, 각각 17% 및 21%,).
유도된 Nanog 발현이 중간 단계에 있지만, 필수적으로 최종 iPS 단계로 진행하지 않는 iPS형 콜로니와 연관될 수 있음을 보여주는 이미 공개된 데이터[참조: Chan et al., Nature Biotech. 27(11):1033-1037(2009)]와 함께, 치수 조직 또는 지방 조직으로부터 공급된 형질감염된 Stro-1+ 다능성 선조 세포가 D551 섬유아세포보다 낮은 Nanog 발현을 갖지만, 상당히 높은 iPS 콜로니 수를 갖는다는 본 발견은 Stro-1+ 다능성 선조 세포가 효능 인자에의 노출 후 최종 iPS 콜로니 형성으로의 진행에 대한 보다 허용성인 세포 종류를 나타낸다는 것을 기술한다.
함께, 이들 결과는 다음을 기술한다:
1) 형질감염 후 유사한 Oct 4 발현에도 불구하고, 치수 조직 및 지방 조직으로부터 공급된 Stro-1+ 다능성 선조 세포가 강화된 세포 모집단이 대조군 섬유아세포보다 더 효율적으로 그리고 보다 많은 수로 iPS 세포 콜로니를 생성했고;
2) 형질감염 후, 보다 낮은 유도된 Nanog 발현에도 불구하고, 치수 조직 및 지방 조직으로부터 공급된 Stro-1+ 다능성 선조 세포가 강화된 세포 모집단이 대조군 섬유아세포보다 더 효율적으로 그리고 보다 많은 수로 최종 iPS 세포 콜로니를 생성했고;
3) 조직 공급원은 iPS 세포 콜로니 형성의 효율에 영향을 미칠 수 있는데, 이는 치수 조직 및 지방 조직으로부터 공급된 Stro-1+ 다능성 선조 세포로 강화된 세포 모집단이 골수로부터의 Stro-1+ 다능성 선조 세포로 강화된 세포 모집단보다 더 효율적으로 iPS 세포 콜로니를 생성하기 때문이다.
면역형광검사법
치수로부터의 iPS 세포 콜로니는 면역형광검사법에 의해 Oct4, Nanog, SSEA4, TRA1-60 및 TRA1-81을 발현하는 것으로 나타났다. 이들 세포는 또한 알칼리성 포스파타제를 발현하는 것으로도 나타났다.
지방 조직으로부터의 iPS 세포 콜로니는 면역형광검사법에 의해 Oct4를 발현하는 것으로 나타났고, 알칼리성 포스파타제를 발현하는 것으로 나타났다.
iPS 세포주의 유전자 발현
유전자 발현 연구 결과는 표 2에 제시한다.
요약하면, 치수 조직, 지방 조직 또는 골수로부터 수득되었지는의 여부와 무관하게 모든 Stro-1+ 다능성 선조 세포 강화된 세포 모집단은 감염 전에 KLF4 및 c-myc를 내생적으로 발현한다. 이론 또는 작용 방식에 결부시키지 않고, Stro-1+ 다능성 선조 세포에 의한 이들 효능 인자의 내생적 발현은 부분적으로 섬유아세포보다 Stro-1+ 다능성 선조 세포를 사용하여 iPS 세대의 보다 높은 효율을 설명할 수 있다. 그러나, 추가 인자는 iPS 세포주를 생성하기 위한 골수로부터의 Stro-1+ 다능성 선조 세포보다 치수 조직 또는 지방 조직으로부터 공급된 Stro-1+ 다능성 선조 세포의 보다 큰 관찰 효율을 설명할 수 있다.
확립된 치수 iPS 세포주는 모두 내생적 유전자 Oct 4, Sox 2, c-myc 및 Klf4를 발현한다. 외생적 Oct4 및 c-myc는 계대 3 및 8에서 침묵하지만, Sox 2 및 Klf4는 발현되어 유지되었다.
단지 계대 2에서 지방 IPSC가 내생적 Klf4를 발현했다. 외생적 Oct 4 및 c-myc는 침묵하지 않고 유지되었다.
계대 2에서 골수-MPC는 어떤 내생적 유전자 발현도 나타내지 않았다. 이들 세포에서 침묵한 유일한 외생적 유전자는 Sox2였다.
Figure pct00002

Claims (26)

  1. Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포를, 당해 세포를 재프로그램하기에 충분한 조건하에 하나 이상의 효능 결정 인자에 노출시킴을 포함하는, 재프로그램된 세포의 생성 방법.
  2. Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포로 강화된 세포 모집단을, 당해 세포를 재프로그램하기에 충분한 조건하에 하나 이상의 효능 결정 인자에 노출시킴을 포함하는, 재프로그램된 세포의 생성 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포, 또는 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포로 강화된 세포 모집단이 지방 조직, 치수 조직 또는 골수로부터 유도되는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 노출된 세포를 배양하여 재프로그램된 세포를 생성함을 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재프로그램된 세포를 분리함을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 노출된 세포를 배양하여, Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포보다 광범위한 분화 효능을 갖는 재프로그램된 세포를 수득함을 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 효능 결정 인자가 Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, Lin28, c-Myc, bFGF, SCF, TERT, SV40 거대 T 항원, HPV16E6, HPV16E7, Bmil, Fbx15, Eras, ECAT15-2, Tcl1, β-카테닌, ECAT1, ESG1, Dnmt3L, ECAT8, Gdf3, Sox15, ECAT15-1, Fthl17, Sal14, Rex1, UTF1, Stella, Stat3 및 Grb2, 또는 하나 이상의 상기 인자와 동일하거나 유사한 활성을 갖는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 개별적으로 또는 집합적으로 선택되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 효능 결정 인자(들)가 화학물질, 펩티드, siRNA, 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA 또는 마이크로RNA인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 효능 결정 인자가
    (i) Oct4;
    (ii) Oct4와 Sox2의 조합;
    (iii) Oct4, Sox2 및 적어도 하나의 Nanog 및 Lin28의 조합;
    (iv) Oct4, Klf4 및 c-Myc의 조합;
    (v) Oct4, Sox2 및 Klf4의 조합;
    (vi) OCT4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 조합;
    (vii) Oct4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 조합;
    (viii) Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog 및 Lin28의 조합; 및
    (ix) 화학물질, 펩티드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA와 추가로 조합된 상기 (i) 내지 (viii) 중의 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 개별적으로 또는 집합적으로 선택되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포가 출생후 포유동물로부터 수득되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 효능 결정 인자에 대한 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포의 노출이, 프로모터에 작동적으로 연결된 하나 이상의 효능 결정 인자를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 프로모터에 작동적으로 연결된 특이적 효능 결정 인자를 코딩하는 서열을 각각 포함하는 복수의 핵산을 투여함을 포함하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 핵산(들)이 하나 이상의 벡터(들) 내에 존재하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 벡터(들)이 바이러스 벡터(들)인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 상기 핵산(들)이 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포 내로 통합되지 않는 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재프로그램된 세포가 다분화능인 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재프로그램된 세포가 (i) Oct-4, Nanog, SSEA3, SSEA4, Tra-1-60 및 Tra-1-81로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포 마커를 발현하거나, (ii) 다분화능 세포의 형태학적 특징을 나타내거고/내거나 (iii) 면역절충 동물 내로 도입되는 경우에 기형종을 형성하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하여 생성한 세포.
  20. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따르는 방법을 수행하여 생성한 다분화능 세포로 강화한 세포 모집단.
  21. 제20항에 있어서, 다분화능 세포가 모집단의 적어도 60%를 차지하는 강화된 세포 모집단.
  22. 제18항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 따르는 세포 또는 모집단으로부터 분화된 세포 또는 세포 모집단.
  23. 이종성 프로모터에 작동적으로 연결된 효능 결정 인자를 코딩하는 핵산을 포함하는 Stro-1+ 다능성 세포 및/또는 이의 후대 세포.
  24. 의약으로 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따르는 세포 또는 모집단의 용도.
  25. 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따르는 세포 또는 모집단을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 질환 또는 질병의 치료 또는 예방 방법.
  26. 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 따르는 세포 또는 모집단을 질환 또는 질병의 치료 또는 예방에 유용한 화합물에 노출시킴을 포함하는, 상기 화합물의 스크리닝 방법.
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