KR100845057B1

KR100845057B1 - 전기 천공을 위한 완충 용액 및 이의 이용을 포함하는 방법

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Publication number: KR100845057B1
Application number: KR1020037013803A
Authority: KR
Inventors: 키르스텐 로트만; 하이케 베쎈도르프; 율리아나 헬프리히; 코리나 티엘; 구둘라 리멘; 헬무트 브로스터후스; 헤르베르트 뮐러-하르트만; 마이케 바이겔; 엘케 로르바흐; 미카엘 닉스; 그레고르 지벤코텐
Original assignee: 아막사 아게
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2008-07-09
Also published as: IL158514A0; WO2002086134B1; US7332332B2; CA2445260A1; KR20080005345A; CA2445260C; NO20034682D0; AU2002315658B2; CN1630728A; CN1302115C; ZA200308127B; ES2230502T3; US20070110736A1; JP2004535790A; DE10291734D2; EP1390518A2; ATE278796T1; WO2002086134A3; US20080145938A1; US8192990B2

Abstract

본 발명은 동물 또는 인간 세포의 현탁과, 전류를 이용하여 상기 세포내로 생물학적 활성 분자를 도입시키기 위해 상기 생물학적 활성 분자를 용해시키기 위한 완충용액에 관한 것이며, 상기 완충용액의 이용을 포함하는, 전류를 이용하여 생물학적 활성 분자를 동물 또는 인간 세포내로 도입하는 방법에 관한 것이다. 상기 독창적인 완충용액은 적어도 20 mmol*l^-1*pH^-1 의 완충용량을 가지며, pH 7 로부터 pH 8 로의 pH 변화시에 그리고 온도 25℃ 에서 적어도 200 mmol*l^-1 의 이온 강도를 갖는다. 상응하는 방법에서 이러한 유형의 완충용액의 이용은 생물학적 활성 분자들이 높은 정도의 트랜스펙션 효율과 동시에 낮은 세포괴사율을 가지고 동물 및 인간 세포들 내로 도입될 수 있게 한다. 상이한 세포 유형들, 특히 휴지상태 및 낮은 활성도의 활성적으로 분열하는 세포들이 상기 완충용액 내에서 성공적으로 트랜스펙션될 수 있다.

Description

전기 천공을 위한 완충 용액 및 이의 이용을 포함하는 방법{BUFFER SOLUTION FOR ELECTROPORATION AND A METHOD COMPRISING THE USE OF THE SAME}

본 발명은, 동물 또는 인체 세포를 현탁시키고 전류를 이용하여 세포 내로 생물학적 활성 분자를 도입시키기 위해 생물학적 활성 분자를 용해시키는 완충 용액에 관한 것이며, 이러한 완충 용액의 이용을 포함하는 방법으로서 전류를 이용하여 생물학적 활성 분자를 동물 또는 인체 세포 내로 도입하는 방법에 관한 것이다.

생물학적 활성 분자, 예를 들면 DNA, RNA 또는 단백질과 같은 것들의 살아 있는 세포 내로의 도입은 이러한 분자들의 생물학적 기능을 연구하기 위한 중요한 방법이다. 외래 분자들을 세포 내로 도입하기 위한 바람직한 방법은 전기 천공(electroporation)으로서, 이는 다른 방법들과는 달리 트랜스퍼 제제에 의해 표적 세포의 생물학적 구조에 약간의 영구적인 변화만을 단지 야기한다. 전기 천공 동안에 외래 분자들은 짧은 전류 흐름에 의해 수용액으로부터 세포 내로 도입되고, 여기서 세포막은 짧은 전기 펄스의 작용에 의해 외래 분자들에 대해 투과성을 가지게 된다. 세포막에 잠시 동안 형성되는 "소공들(pores)"로 인해, 생물학적 활성 분자들은 먼저 세포질로 들어가고, 여기서 생물학적 활성 분자들은 필요한 경우 연구된 그것들의 기능을 이미 수행할 수 있다. DNA가 진핵 세포 내로 도입되는 경우에, 이것은 세포핵으로 진입해야 하지만, 이에 따라 유전자 정보가 발현되는 것이 가능하다. 세포 분열의 경우, 이것은 세포 분열 동안에 발생할 수 있으며 여기서 DNA 는 핵막의 일시적인 용해 후에 세포핵으로 수동적으로 진입한다. 그러나, 예를 들면 1차 동물 세포와 같은 불활동성의 또는 약하게 분열하는 세포의 연구에 있어서, DNA는 이러한 방법으로 세포핵 내로 진입하지 않으며, 이에 따라 상응하는 방법이 여기에 이용될 수 없거나 또는 적어도 매우 많은 시간이 소요된다. 게다가, 특히 DNA가 동물 세포 내로 도입되는 경우, 소위 트랜스펙션의 경우, 세포들의 불안정의 결과로서 특별한 문제들이 종종 발생하는데, 이는 세포들의 생존률이 트랜스펙션의 효율에 중요한 파라미터로서 영향을 미치기 때문이다.

과거에 세포 배양 배지[Anderson et al.(1991), J. Biochem. Biophys. Meth. 22, 207], 또는 포스페이트나 HEPES로 완충된 염용액[Potter et al.(1984), Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161; Fromm et al.(1985), Nature 319,791]이 동물 세포 및 DNA 분자들을 테이크업(take up)하는 데 종종 사용되었다. 그러나, 동물 세포들의 전기 천공 동안에 완충되지 않거나 또는 약하게 완충된 만니톨(mannitol) 또는 사카로오스(saccharose) 용액들이 또한 이용되었다[Shimizu et al. (1986), Med. Immunol. 11, 105; Riggs et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5602]. 이러한 완충되지 않거나 약하게 완충된 용액들은 그것들의 사용에 의해 세포 괴사(cell mortality)를 증가시키고 트랜스펙션 효율을 상당히 감소시키는 단점을 갖는다[Yan et al. (1998), BioTechniques 24, 590].

따라서 Yan et al.(1998)에서는 100mM HEPES, 137mM NaCl, 4mM Na₂HPO₄및 6mM 덱스트로스로 구성된 완충 용액이 전기 천공에 사용되었다. 인체 대동맥으로부터의 평활 근육 세포는 이러한 완충 용액에서 확실하게 성공적으로 트랜스펙션될 수 있었지만, 이러한 트랜스펙션 효율은 단지 15%이고 생존률은 단지 10 내지 20%였다. 또한, 상기 Yan et al.에서 사용된 완충 용액은 단지 500V까지의 전압 펄스에 대해서만 최적화되고, 이에 따라 이러한 완충 용액이 세포핵 내로의 직접적인 트랜스펙션에 요구되는 것과 같이 보다 높은 전압 펄스에 대해 또한 사용될 수 있는지에 관한 어떠한 방안도 제시되지 않는다. 하여튼, 이러한 완충 용액에서 달성되는 트랜스펙션 효율은 더욱 높은 요구를 충족시키기에는 너무 낮다.

많은 경우에 있어서, 특히 더욱 긴 고압 펄스의 적용 동안에, 높은 전도성을 갖는 완충 용액을 사용할 때 관찰되었던 높은 전류로 인한 세포 손상을 막기 위해,낮은 이온 강도를 가져 결과적으로 낮은 전도성을 갖는 완충 용액들이 사용되었다.

Friedrich et al., 1998(Bioelectrochem. and Bioenerg. 47, 103)에는 전기천공 동안의 전류의 흐름은, 물의 전기 분해로 인해 전극 주위에서 pH의 변화를 가져오는 것을 보여준다. 이러한 pH 변화는 큐벳의 알루미늄 전극으로부터 세포 독성 Al³⁺ 이온을 유리시키고, 이에 따라 세포 괴사를 증가시킨다. 상기 저자는 여기서 트랜스펙션 효율을 증가시키기 위해 펄스의 지속 시간을 단축할 것을 제안한다. 사용되는 완충 용액에 대한 변화에 대해서는 어떠한 정보도 주어지지 않는다.

예를 들면, Mg²⁺와 같은 2가 양이온이 상기 전기 천공 완충 용액에 종종 첨가된다. 마그네슘 이온은 DNA의 세포 표면으로의 결합을 촉진시키고 이에 따라 트랜스펙션 속도를 증가시킨다. 그러나, 이것은 10mM까지의 Mg²⁺ 농도에만 적용되는 것으로 보이는데, 이는 더욱 높은 농도에서는 DNA 분자들의 전하의 중화에 의한 전기 영동의 감소 또는 전도성의 증가로 인한 완충 용액의 가열[Xie and Tsong(1993), Biophys. J. 65, 1684); Neumann et al.(1982), EMBO J. 1, 841; Klenchin et al.(1991), Biophys. J. 60, 804] 과 같은 부정적인 효과가 우세하기 때문이다.

또한, 완충 용액은 세포의 생존률을 증가시키기 위해, 완충 용액의 조성에 대하여 세포 내 조건과 조화되어야 한다고 제안되었다. 따라서, 전기 천공 동안에 세포막에 형성된 소공들을 통한 물질 교환으로 인해 세포 내 Na⁺/K⁺ 비율의 붕괴를 막기 위해, 세포질에 상응하는 높은 포타슘 농도와 낮은 소듐 농도를 갖는 완충 용액이 사용되어야 한다[van den Hoff et al.(1995), Methods in Mol. Biol. 48, Chapter 15, 185-197]. 그러나, 1300V/cm 보다 높은 전기장 세기(field strength)를 갖는 펄스들에 대해서도 트랜스펙션 효율의 감소가 나타났다.

하지만, 지금까지 기술한 모든 완충 용액들은 그것들을 사용할 때 달성되는 트랜스펙션 효율이 비교적 낮고, 그리고/또는 완충 용액들은 불활동성 또는 약하게 분열하는 세포들의 전기 천공 동안에 적용하기에는 적합하지 않다는 단점을 갖는다.

따라서, 본 발명의 목적은, 낮은 괴사율을 가지며 더욱 높은 트랜스펙션 효율을 달성할 수 있는 전기 천공용 완충 용액을 제공하고 이의 사용 방법을 제공하는 데 있다.

이러한 목적은, pH 7로부터 pH 8로의 pH 변화시에 그리고 온도 25℃에서 적어도 200mmol×l^-1의 이온 강도와 적어도 20mmol×l^-1×pH^-1의 완충 용량을 갖는 본 발명에 따른 완충 용액에 의해 달성된다. 이러한 완충 용액에 의하면, 93%까지의 트랜스펙션 효율을 가지며 동시에 낮은 괴사율을 갖는 전기 천공에 의하여 생물학적 활성 분자들을 동물 또는 인체 세포 내로 도입시키는 것이 가능하다. 다양한 세포 유형들, 특히 불활동성 및 약하게 분열하는 세포들이 완충 용액에서 성공적으로 트랜스펙션될 수 있다. 또한, 완충 용액을 이용하면, 적어도 2000V/cm의 전기장 세기를 갖는 고압 펄스를 사용할 수 있으며, 이는 DNA 분자들이 1차 동물 세포 및 인체 세포의 세포핵 내로 직접적으로 트랜스펙션되도록 한다. 본 발명에 따른 완충 용액의 유리한 성질에 관한 결정적인 인자는 높은 완충 용량과 높은 이온 강도의 결합이다. 완충 용량(β)은, 완충 용액의 pH를 1 pH 유닛만큼 변화시키는 데 요구되는 단백질 분해 물질(proteolyte)의 양을 나타낸다(β=dC×dpH^-1, dC=첨가된 산 또는 염기의 양, dpH=pH 변화). 용액의 이온 강도 l는 식 l=0.5∑c_i×z_i ²(c_i=mol/l 단위의 이온 농도, z_i=이온 전하)을 이용하여 계산될 수 있다. 본 출원에 제시된 완충 물질들의 이온 강도를 계산하는 데는 "자바 완충 계산기(Java Buffer Calculator)" 프로그램(Twigger & Beynon, 1998)이 사용되었다. 이러한 구성에서 완충 용액은 상이한 세포 유형 및 요건에 대하여 완충 용액의 조성의 관점에서 최적화될 수 있다.

바람직한 실시예에 있어서, 완충 용액은 22 내지 80mmol×l^-1×pH^-1의 완충 용량을 가지며, 바람직하게는 40 내지 70mmol×l^-1×pH^-1의 완충 용량을 갖는 것으로 제시된다. 이온 강도에 관하여는, 200 내지 500mmol×l^-1, 바람직하게는 250 내지 400mmol×l^-1의 범위가 특히 바람직한 것으로 판명되었다. 따라서, 일반적으로 세포 유형 및 다른 실험 조건에 의존하는 완충 용량 및 이온 강도에 관한 최적 조건이 존재하며, 이러한 2개의 파라미터 사이에는 상호 작용이 존재한다.

또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 완충 용액은 적어도 10mmol×l^-1마그네슘 이온(Mg²⁺), 바람직하게는 15 내지 20mmol×l^-1마그네슘 이온을 포함하는 것으로 제시된다. 놀랍게도, 지금까지 발견된 것과는 대조적으로, 본 발명에 따른 완충 용액 내 Mg²⁺는 매우 높은 농도에서도 트랜스펙션 비율을 증가시키고 이것은 동시적인 이온 강도의 약간의 증가에 의해 설명될 수 있는 것보다 그 정도가 상당히 큰 것으로 판명되었다. 이러한 경우, 완충 용액은 마그네슘 클로라이드(MgCl₂) 및/또는 마그네슘 설페이트(MgSO₄)를 포함할 수 있다.

특히 바람직한 실시예에 있어서, 세포들의 세포질과 비교할 때, 본 발명에 따른 완충 용액은 바람직하게는 2 내지 6mmol×l^-1K⁺의 더욱 낮은 포타슘 이온(K⁺) 농도를 가지며, 바람직하게는 100 내지 150mmol×l^-1Na⁺의 더욱 높은 소듐 이온(Na⁺) 농도를 갖는 것으로 제시된다. 따라서, 본 발명에 따른 완충 용액은 세포 내 Na⁺/K⁺비율과 조화되지는 않지만, 오히려 "세포외" 비율은 이러한 관점으로 존재한다. 그러나, 놀랍게도, 이것은 세포들에 부정적인 효과를 갖지는 않지만 그럼에도 불구하고 트랜스펙션 및 세포 생존률의 상당한 증가를 가져온다.

본 발명에 따른 완충 용액은 완충 물질로서 HEPES 및/또는 Na₂HPO₄/NaH₂PO₄를 포함하는 것으로 바람직하게 제시된다. 그러나, Tris/HCl 또는 K₂HPO₄/KH₂PO₄가 완충 물질로서 또한 사용될 수 있다. 또한, 완충 용액은 예를 들면 소듐 클로라이드, 소듐 숙시네이트, 만니톨, 글루코오스, 소듐 락토비오네이트 및/또는 펩티드들과 같은 추가적인 성분들을 또한 포함할 수 있다.

상이한 세포 유형에 대해 각각 최적화된 완충 시스템의 6개 그룹들이 본 발명에 따른 완충 용액의 특히 바람직한 조성에 대한 예로서 아래에 언급된다. 그러나, 다른 조성들도 본 발명의 범위 내에서 또한 가능하며, 이에 따라 이러한 예들은 제한적인 것으로 이해되어서는 안된다.

1) 4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂ 및 120 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2).

2) 4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 5 내지 25mM HEPES 및 120 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2).

3) 4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 50 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2) 및 5 내지 100mM 소듐 락토비오네이트 또는 5 내지 100mM 만니톨 또는 5 내지 100mM 소듐 숙시네이트 또는 5 내지 100mM 소듐 클로라이드.

4) 4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 5 내지 25mM HEPES, 50 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2) 및 5 내지 100mM 소듐 락토비오네이트 또는 5 내지 100mM 만니톨 또는 5 내지 100mM 소듐 숙시네이트 또는 5 내지 100mM 소듐 클로라이드.

5) 4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 80 내지 100mM NaCl, 8 내지 12mM 글루코오스, 0.3 내지 0.5mM Ca(NO₃)₂, 20 내지 25mM HEPES, 50 내지 100mM tris/HCl 또는 30 내지 50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2).

6) 0.1 내지 3.0mM MgCl₂, 50 내지 200mM K₂HPO₄/KH₂PO₄(pH 6.5) 및/또는 1 내지 50mM 만니톨 및/또는 1 내지 50mM 소듐 숙시네이트.

본 발명의 목적은, 전류에 의해 생물학적 활성 분자들을 동물 또는 인체 세포들 내로 도입하는 방법에 의해 달성되는데, 이것은 pH 7로부터 pH 8로의 pH 변화시 그리고 온도 25℃에서 적어도 200mmol×l^-1의 이온 강도와 적어도 20mmol×l^-1×pH^-1의 완충 용량을 갖는 완충 용액에서 세포들의 현탁과, 생물학적 활성 분자들의 용해와, 전기 전압을 현탁액에 적용시키는 것을 포함한다. 이러한 방법으로 인해, 생물학적 활성 분자들은 93%까지의 트랜스펙션 효율과 동시에 낮은 괴사율을 갖는 전기 천공에 의해 동물 및 인체 세포 내로 도입될 수 있다. 다양한 세포 유형, 특히 불활동성 및 약하게 분열하는 세포들이 성공적으로 트랜스펙션될 수 있다.

이러한 완충 용액의 조성에 관한 본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 실시예가 종속 청구항들에 제시되며 전술한 설명으로부터 추론될 수 있다.

본 발명에 따른 완충 용액은 전기 천공법을 수행하는 데 특히 적합한데, 여기서 생물학적 활성 분자들은 2 내지 10kV×cm^-1까지의 전기장 세기 및 10 내지 200㎲의 지속 시간 및 적어도 2A×cm^-2의 전류 밀도를 갖는 전압 펄스에 의해 세포들 내로 도입된다. 높은 전압 펄스로 인해, DNA가 동물 및 인체 세포들의 세포핵 내로 직접적으로 트랜스펙션될 수 있고, 이러한 펄스의 단속성(shortness)에 의해 비가역적 막 손상이 방지된다. 고압 펄스의 단속성으로 인하여, 완충 용액의 높은 이온 강도 또는 전도성은 용액의 불리한 가열을 야기하지 않으며, 이에 따라 분열하는 세포 이외에 불활동성 또는 약하게 분열하는 세포들이 높은 효율과 낮은 괴사율을 가지고 또한 트랜스펙션될 수 있다. 완충 용액의 높은 이온 강도 및 짧은 고압 펄스의 상호 작용은 오히려 효과적인 소공의 개방을 가져오며, 여기서 강한 완충 효과는 pH의 극심한 변동을 또한 보상할 수 있다.

2 내지 14A×cm^-2, 바람직하게는 5A×cm^-2까지의 전류 밀도와 1 내지 100ms, 바람직하게는 50ms까지의 지속 시간을 가지며 중단없이 고압 펄스에 후속하는 전류가 상기 방법에서 본 발명에 따른 완충 용액을 이용하여 특히 바람직한 방법으로 또한 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 완충 용액의 높은 완충 용량은 오래 지속되는 제2 펄스 동안에 전극 주위에서의 pH 변화를 감소시키며, 이것은 DNA의 전기 영동에 기여하여, 결과적으로 세포 괴사가 효과적으로 감소될 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로 인하여, 따라서 생물학적 활성 분자들의 트랜스펙션이 동물 또는 인체 세포들의 세포핵 내에서 전류에 의해 최적화된다. 이러한 경우, 핵산, 단백질 또는 펩티드들은 높은 효율을 가지고 불활동성 또는 분열하는 동물 또는 인체 세포들 내로 도입될 수 있다. 본 발명에 따른 완충 용액은 고압 펄스를 지지함에 의해 핵산, 단백질 또는 펩티드들의 1차 세포들 내로의 도입을 또한 가능하게 한다.

핵산들은 완충 용액 내에서 펩티드들, 단백질들 또는 다른 생물학적 활성 분자들과의 컴플렉스로 또는 화합물로 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은, 1차 인체 혈액 세포들, 인체 혈액의 고활성 전구 세포들(pluripotent precursor cells), 1차 인체 섬유아세포들 및 내피 세포들뿐만 아니라 근육 세포들 또는 멜라노 세포의 트랜스펙션에 특히 적합하다.

본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 세포들은 진단 및/또는 분석 방법 및 생체외 유전자 치료용 약품의 제조를 위한 특히 바람직한 방법으로서 적합하다.

표 1은 본 발명에 따른 완충 용액의 특정 조성을 제시하는데 이것은 상이한 적용 또는 세포 유형에 대해 각각 최적화되었으며 높은 트랜스펙션 효율 및 세포 괴사의 감소에 관하여 특히 바람직한 것으로 판명되었다. 그러나, 본 발명의 범위 내에서 다른 조성들이 또한 이해될 수 있으며 이에 따라 이러한 실시예들은 제한적인 것으로서 이해되어서는 또한 안된다.

표 1

이하 개별적인 완충 용액에 대한 적용 실시예들을 도면들을 참조로 더욱 상세하게 설명한다.

도 1은 완충 용액의 완충 용량 및 이온 강도의 작용으로서의 1차 인체 내피 세포들에 대한 트랜스펙션 효율과 생존률을 도시한 그래프이다.

도 2는 완충 용액의 완충 용량 및 이온 강도의 작용으로서의 1차 인체 임파구 세포에 대한 트랜스펙션 효율과 생존률을 도시한 그래프이다.

도 3은 세포들이 Cy5-공역 항-H-2K^k(Cy5-coupled anti-H-2K^k) 항체를 가지고 항온 처리되고 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)(FL-1, FL-2, FL-3 = fluoroscence channel 1, 2, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter)를 이용하여 분석되는 동안 H-2K^k 발현 벡터로 트랜스펙션된 1차 인체 섬유아세포의 세포 유속 분석을 도시한 도면이다.

도 4는 세포들이 Cy5-공역 항-H-2K^k(Cy5-coupled anti-H-2K^k) 항체를 가지고 항온 처리되고 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)(FL-1, FL-2, FL-3 = fluoroscence channel 1, 2, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter)를 이용하여 분석되는 동안 H-2K^k 발현 벡터로 트랜스펙션된 인체의 평활 근육 세포의 유속 세포 분석을 도시한 도면이다.

도 5는 세포들이 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)(FL-2, FL-3, FL-4 = fluoroscence channel 2, 3, 4; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter)를 이용하여 분석되는 동안 GFP 발현 벡터로 트랜스펙션된 1차 인체 멜라노 세포의 유속 세포 분석을 도시한 도면이다.

도 6은 세포들이 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)(FL-2, FL-3, FL-4 = fluoroscence channel 2, 3, 4; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter)를 이용하여 분석되는 동안 GFP 발현 벡터로 트랜스펙션된 인체 CML 세포주 K562의 유속 세포 분석을 도시한 도면이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 설명하지만 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예 1

1차 인체 내피 세포의 트랜스펙션 효율 및 생존률

완충 용량 및 이온 강도의 작용으로서 일렉트로트랜스펙션되는 동안 세포들의 트랜스펙션 및 생존률을 연구하기 위해, 1차 인체 내피 세포들이 마우스 MHC 클래스 1 단백질 H-2K^k의 큰 사슬을 코딩하는 벡터로 트랜스펙션되었다.

각각 5㎍ 벡터 DNA를 갖는 각각 7×10⁵개의 세포들과 각각의 일렉트로트랜스펙션 완충 용액이 실온에서 2mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳 내에 위치되었고 100㎲ 지속 시간을 갖는 1000V 펄스에 의해 트랜스펙션되었다. 또한, 비교값이 PBS(Phosphate Buffered Saline: 10mM 소듐 포스페이트, pH 7.2 + 137mM NaCl, 이온 강도=161.5mM, 완충 용량=4.8mM/pH)를 이용하여 결정되었다. 일렉트로트랜스펙션 직후에 세포들은 400㎕의 배지를 이용하여 큐벳으로부터 세척되었고, 37℃에서 10분 동안 항온 처리되었으며, 그 다음 예열된 배지를 갖는 배양 접시로 이송되었다. 6시간 동안 항온 처리 후, 세포들은 Cy5-공역 항-H-2K^k-항체를 가지고 항온 처리되고 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.

도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 트랜스펙션 효율 및 생존률은 완충 용량 및 이온 강도가 증가함에 따라 증가된다. 각각의 경우에, 극히 높은 괴사율이 발생된 PBS 비교 용액과 비교할 때 매우 우수한 값들이 달성될 수 있었다. 몇몇 완충 용액에 있어서는 괴사율이 매우 높아서 이러한 값들은 통계적으로 산입되지 않았다.

실시예 2

1차 인체 임파구 세포의 트랜스펙션 효율 및 생존률

또한, 일렉트로트랜스펙션 동안에 1차 인체 임파구 세포의 트랜스펙션 및 생존률이 완충 용량 및 이온 강도의 작용으로서 연구되었다.

이러한 목적을 위해, 각각의 완충액 내에서 각각 5㎍의 H-2K^k-발현 벡터-DNA를 갖는 각각 5×10⁶개의 세포들이 실온에서 2mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고, 4A×cm^-2의 전류 밀도를 갖는 40ms의 전류가 뒤따르는 1000V, 100㎲ 펄스에 의해 일렉트로트랜스펙션 되었다. 또한, 비교값들은 PBS(이온 강도=161.5mM, 완충 용량=4.8mM/pH)를 이용하여 결정되었다. 이러한 분석은 16시간 후에 수행되었다.

도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포들의 생존률은 사용된 완충 용액들의 완충 용량 및 이온 강도가 증가함에 따라 증가한다. 어떤 경우에는 비교 용액(PBS: 40.1% 트랜스펙션된 세포들 38.3% 살아있는 세포)과 비교해서 상당히 우수한 값들이 달성될 수 있었다. 여기서 또한 트랜스펙션 효율은 따라서 예를 들어 배지 또는 PBS 와 같이 종래의 용액들과 비교해서 본 발명에 따른 적당한 완충 용액의 선택에 의해 상당히 증가될 수 있다.

실시예 3

1차 인체 섬유아세포의 트랜스펙션

도 3은 H-2K^k발현 벡터를 가지고 트랜스펙션된 1차 인체 섬유아세포의 FACScan 분석을 도시하고 있다. 표 1의 완충액 6 내에서 5㎍의 벡터 DNA를 갖는 5×10⁵ 세포들이 실온에서 2mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고, 6A×cm^-2의 전류 밀도를 갖는 33ms의 전류가 뒤따르는 1000V, 100㎲ 펄스에 의해 트랜스펙션 되었다. 5시간 동안 항온 처리된 후, 세포들은 Cy5-공역 항-H-2K^k항체를 가지고 항온 처리되고 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함에 의해 결정되었다. 살아있는 세포들의 93%는 매우 높은 트랜스펙션 효율과 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 4

인체의 평활 근육 세포의 트랜스펙션

도 4는 H-2K^k발현 벡터를 가지고 트랜스펙션된 인간의 평활 근육 세포의 FACScan 분석을 도시하고 있다. 표 1의 완충액 6 내에서 5㎍의 벡터 DNA를 갖는 5×10⁵ 세포들이 실온에서 2mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고, 5.6A×cm^-2의 전류 밀도를 갖는 40ms의 전류가 뒤따르는 1000V, 100㎲ 펄스에 의해 트랜스펙션 되었다. 13.5시간 동안 항온 처리된 후, 세포들은 Cy5-공역 항-H-2K^k항체를 가지고 항온 처리되고 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함에 의해 결정되었다. 살아있는 세포들의 53.8%는 높은 트랜스펙션 효율과 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 5

1차 인체 멜라노 세포의 트랜스펙션

도 5는 GFP발현 벡터를 가지고 트랜스펙션된 1차 인체 멜라노 세포의 FACScan 분석을 도시하고 있다. 표 1의 완충액 40 내에서 5㎍의 pEGFP-C1 벡터(Clontech Lab.)를 갖는 5×10⁵ 세포들이 실온에서 2mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고, 6A×cm^-2의 전류 밀도를 갖는 33ms의 전류가 뒤따르는 1000V, 100㎲ 펄스에 의해 트랜스펙션 되었다. 24시간 동안 항온 처리된 후, 세포들은 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함에 의해 결정되었다. 살아있는 세포들의 56.2%는 매우 높은 트랜스펙션 효율과 상응하는 GFP를 발현시켰다.

실시예 6

인체 CML 세포주 K562의 트랜스펙션

도 6은 GFP발현 벡터를 가지고 트랜스펙션된 인체 CML 세포주 K562의 FACScan 분석을 도시하고 있다. 표 1의 완충액 42 내에서 5㎍의 pEGFP-C1 벡터(Clontech Lab.)를 갖는 5×10⁵ 세포들이 실온에서 2mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고, 4A×cm^-2의 전류 밀도를 갖는 10ms의 전류가 뒤따르는 1000V, 70㎲ 펄스에 의해 트랜스펙션 되었다. 24시간 동안 항온 처리된 후, 세포들은 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함에 의해 결정되었다. 살아있는 세포들의 77.7%는 매우 높은 트랜스펙션 효율과 상응하는 GFP를 발현시켰다.

사용된 약어

다음 약어들이 Duden에서 일반적으로 사용되는 것에 추가적으로 사용되었다.

A Ampere

APC Allphycocyanin

CD Cluster of differentiation

cm Centimetre

DNA Deoxyribonucleic acid

FACScan Fluorescence activated cell scanning

FCS Foetal calf serum

FL Fluorescence

FSC Forward scatter

HEPES N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-(2-ethanesulphonic acid)

ml Millilitre

mM Millimolar

msec Millisecond

PBS Phosphate buffered saline

PE Phycoerythrin

PerCP Peridinin chlorophyll protein

pH negative commom logarithm of the hydrogen ion concentration

RNA Ribonucleic acid

RPMI Rosewel Park Memorial Institute

SSC Sideward scatter

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethane-hydrochloride

㎍ Microgram

㎕ Microlitre

μsec Microsecond

V Volt

상술한 바와 같은 본 발명은 동물 또는 인체 세포의 현탁과 전류를 이용하여 세포 내로 생물학적 활성 분자를 도입시키기 위해 생물학적 활성 분자를 용해시키기 위한 완충 용액의 제공 및 이를 이용하여 전류에 의해 생물학적 활성 분자를 동물 또는 인체 세포 내로 도입하는 데 이용될 수 있다.

Claims

동물 또는 인체 세포들을 현탁시키고, 전류를 이용하여 생물학적 활성 분자들을 상기 세포들 내로 도입시키기 위해 상기 생물학적 활성 분자들을 용해시키는, 완충 용액으로서, 상기 완충 용액은 pH 7로부터 pH 8로의 pH 변화시에 그리고 온도 25℃에서 200mmol×l^-1이상의 이온 강도와 20mmol×l^-1×pH^-1이상의 완충 용량을 가지며, 상기 완충 용액은 2 내지 6mmol×l^-1K⁺의 포타슘 이온(K⁺) 농도 및 100 내지 150mmol×l^-1Na⁺의 소듐 이온(Na⁺) 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

22 내지 80mmol×l^-1×pH^-1의 완충 용량(pH 7-8, 25℃)을 갖는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항 또는 제2항에 있어서,

40 내지 70mmol×l^-1×pH^-1의 완충 용량(pH 7-8, 25℃)을 갖는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

200 내지 500mmol×l^-1의 이온 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항 또는 제2항에 있어서,

250 내지 400mmol×l^-1의 이온 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

10mmol×l^-1 이상의 마그네슘 이온(Mg²⁺)을 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제6항에 있어서,

15 내지 20mmol×l^-1의 마그네슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제6항 또는 제7항에 있어서,

마그네슘 클로라이드(MgCl₂) 및 마그네슘 설페이트(MgSO₄) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
삭제
제1항에 있어서,

완충 물질로서 HEPES, Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, Tris/HCl 및 K₂HPO₄/KH₂PO₄ 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

추가적인 성분들을 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂ 및 120 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 5 내지 25mM HEPES 및 120 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 50 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2) 및 5 내지 100mM 소듐 락토비오네이트 또는 5 내지 100mM 만니톨 또는 5 내지 100mM 소듐 숙시네이트 또는 5 내지 100mM 소듐 클로라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 5 내지 25mM HEPES, 50 내지 160mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2) 및 5 내지 100mM 소듐 락토비오네이트 또는 5 내지 100mM 만니톨 또는 5 내지 100mM 소듐 숙시네이트 또는 5 내지 100mM 소듐 클로라이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

4 내지 6mM KCl, 10 내지 20mM MgCl₂, 80 내지 100mM NaCl, 8 내지 12mM 글루코오스, 0.3 내지 0.5mM Ca(NO₃)₂, 20 내지 25mM HEPES 및 50 내지 100mM tris/HCl 또는 30 내지 50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(pH 7.2)을 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
제1항에 있어서,

0.1 내지 3.0mM MgCl₂와, 50 내지 200mM K₂HPO₄/KH₂PO₄(pH 6.5), 1 내지 50mM 만니톨 및 1 내지 50mM 소듐 숙시네이트 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
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제11항에 있어서,

상기 추가적인 성분들은 소듐 클로라이드, 소듐 숙시네이트, 만니톨, 글루코오스, 소듐 락토비오네이트 및 펩티드들로 구성된 그룹으로부터 선정되는 것을 특징으로 하는 완충 용액.
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