MXPA03009622A

MXPA03009622A - Solucion amortiguadora para electroporacion y metodo que comprende el uso de la misma.

Info

Publication number: MXPA03009622A
Application number: MXPA03009622A
Authority: MX
Inventors: Siebenkotten Gregor
Original assignee: Amaxa Gmbh
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2005-03-07
Also published as: NO20034682L; AU2002315658B2; KR20040014503A; ZA200308127B; DE10291734D2; CA2445260A1; US20080145938A1; WO2002086134A2; US20070110736A1; KR20080005345A; US8003389B2; CN1630728A; JP2004535790A; EP1390518B1; IL158514A0; US20050064596A1; ES2230502T3; US7332332B2; WO2002086134B1; US8192990B2

Abstract

La presente invencion se relaciona a una solucion amortiguadora para suspender celulas animales o humanas y para disolver moleculas biologicamente activas con el fin de introducir las moleculas biologicamente activas a las celulas, utilizando una corriente electrica, y con un metodo para introducir dichas moleculas biologicamente activas a celulas animales o humanas utilizando una corriente electrica y una solucion amortiguadora. La solucion amortiguadora tiene una capacidad amortiguadora de al menos 20 mmol *I-1 * pH-1 y una fuerza ionica de al menos 200 mmoles * I-1 durante un cambio al valor de pH de pH 7 a pH 8, y a una temperatura de 25 degree C. El uso de una solucion amortiguadora de este tipo en el metodo correspondiente permite que las moleculas biologicamente activas se introduzcan a celulas animales y humanas con un alto grado de eficiencia de transfeccion, y al mismo tiempo una baja mortalidad celular. Diferentes tipos celulares, en particular celulas en reposo y celulas que se dividen activamente de baja actividad, se pueden transfectar exitosamente en la solucion amortiguadora.

Description

SOLUCION AMORTIGUADORA PARA ELECTROPORACION Y METODO QUE COMPRENDE EL USO DE LA MISMA La presente invención se relaciona con una solución amortiguadora para suspender células animales o humanas, y para disolver moléculas biológicamente activas, con el fin de introducir las moléculas biológicamente activas a las células utilizando corriente eléctrica, y con un método para introducir moléculas biológicamente activas a células animales o humanas utilizando corriente eléctrica, que comprende el uso de la solución amortiguadora.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La introducción de moléculas biológicamente activas, tales como por ejemplo ADN, ARN o proteínas, a las células vivas es un instrumento importante para estudiar las funciones biológicas de estas moléculas. Un método preferido para introducir moléculas extrañas a las células es la electroporacion que, a diferencia de otros métodos, únicamente provoca ligeros cambios permanentes a la estructura biológica de la célula objetivo por los reactivos de transferencia. Durante la electroporacion las moléculas extrañas se introducen a las células a partir de una solución acuosa mediante un flujo de corriente breve, 2 en donde la membrana celular se hace permeable para las moléculas extrañas por la acción de pulsos eléctricos cortos. Como resultado de los "poros" brevemente formados en la membrana celular, las moléculas biológicamente activas entran inicialmehte al citoplasma, en el cual éstas pueden ejercer ya su función, para ser estudiadas si es necesario. En los casos en donde el ADN se introduce en células eucarióticas, éste debe entrar al núcleo celular no obstante, de modo que es posible que se exprese la información genética. En el caso de células en división, esto puede tener lugar durante la división celular, en donde el ADN entra pasivamente al núcleo celular después de la disolución temporal de la membrana nuclear. En estudios de células en reposo o que se dividen débilmente, por ejemplo, células animales primarias, de cualquier modo, el ADN no entra al núcleo celular de esta manera, de modo que no se pueden utilizar aquí los métodos correspondientes, o al menos son muy tediosos. Por otro lado, especialmente cuando el ADN se introduce a las células animales, la así denominada transfección, ocurren frecuentemente problemas particulares como resultado de la liabilidad de las células, ya que la tasa de supervivencia de las células influencia la eficiencia de la transfección como un parámetro importante . 3 Estado de la Técnica En el pasado, los medios de cultivo de células (Anderson et al. (1991), J. Biochem. Biophys . Meth. 22, 207) o las soluciones salinas amortiguadas con fosfato o HEPES .(Potter et al. (1984), Proc. Nati..Acad. Sci . EUA 81, 7161; Fromm et al.' (1985), Nature 319, 791) se utilizaron frecuentemente para recoger las células animales y las moléculas de ADN. No obstante, las soluciones de manitol o sacarosa no amortiguadas o débilmente amortiguadas se utilizaron también durante la electroporación de células animales (Shimízu et al. (1986), Med. Immunol . 11, 105; Riggs et al. (1986), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83, 5602). Tales soluciones no amortiguadas o débilmente amortiguadas tienen la desventaja de que su uso conduce a una mortalidad celular incrementada y una eficiencia de transfección reducida significativamente (Yan et al. (1998), Bio Techniques 24, 590) . Yan et al. (1998) utilizaron así una solución amortiguadora para electroporación, que consiste de HEPES 100 mM, NaCl 137 mM, Na2HP<¾ 4 mM, y dextrosa 6 mM. Las células del músculo liso provenientes de aorta humana pudieron ciertamente ser exitosamente transfectadas en esta solución amortiguadora, pero la eficiencia de transfección fue únicamente del 15% con una tasa de supervivencia únicamente del 10 al 20%. Además, la solución amortiguadora 4 utilizada por Yan et al., está únicamente optimizada para pulsos de voltaje hasta de 500 V, de modo que no se da ninguna indicación respecto de si esta solución amortiguadora se puede utilizar también para pulsos de voltaje más altos, tales como los que se requieren .para la transfección directa dentro del núcleo celular. En cualquier caso, no obstante, las eficiencias de transfección logradas en esta solución amortiguadora son demasiado bajas para satisfacer demandas más altas. En muchos casos, soluciones amortiguadoras que tienen una baja fuerza iónica y por lo tanto una baja conductividad se utilizaron con el fin de evitar daño celular como resultado de las altas corrientes que se observaron cuando se utilizan soluciones amortiguadoras que tienen alta conductividad, especialmente durante la aplicación de pulsos de alto voltaje más prolongados. Friedrich et al., 1998 (Bioelectrochem. And Bioenerg. 47, 103) demostraron que el flujo de corriente durante la electroporación conduce a un cambio en el pH en la cercanía de los electrodos, como resultado de la electrólisis del agua. Este cambio en el pH provoca la liberación de iones Al3+ citotóxicos a partir de los electrodos de aluminio de - las cubetas, y por lo tanto provoca una mortalidad celular incrementada. Los autores proponen aquí un acortamiento de la duración de los pulsos, 5 para incrementar la eficiencia de transfecció . No se da ninguna información sobre algún cambio a la solución amortiguadora utilizada. Cationes divalentes tales como el Mg2+ por. ejemplo, se agregan frecuentemente a la solución amortiguadora de electroporación. Los iones de magnesio facilitan el enlace del ADN en la superficie de las células, y con esto dan origen a una tasa de transfección incrementada. No obstante, esto parece aplicarse únicamente para las concentraciones de Mg2+ hasta de 10 mM, ya que en concentraciones más altas predominan los efectos negativos, tales como por ejemplo una reducción en la electroforesis como resultado de la neutralización de las cargas de las moléculas de ADN, o el calentamiento de la solución amortiguadora como resultado de un incremento en la conductividad (Xie y Tsong (1993), Biophys . J. 65, 1684); Neumann et al. (1982), EMBO J. 1, 841; Klenchin et al.. (1991)', Biophys. J. 60, 804) . Además, se propuso que la solución amortiguadora se debe equiparar con respecto a su composición a las condiciones intracelulares , con el fin de incrementar la tasa de supervivencia de las células. De este modo, una solución amortiguadora que tiene altas concentraciones de potasio y bajas concentraciones de sodio, correspondientes al citoplasma, se deben utilizar para prevenir cualquier 6 colapso de la relación intracelular Na+/K+ como resultado del intercambio de sustancias vía los poros formados en la membrana celular durante la electroporación (van den Hoff et al. (1995), Methods in .Mol . Biol . 48, Capítulo 15, 185-197) .. No obstante, una reducción en. la eficiencia de transfeccion se detectó para pulsos que tienen una resistencia de campo mayor a 1300 V/cm. Todas las soluciones amortiguadoras descritas hasta aquí, no obstante, tienen la desventaja de que las eficiencias de transfeccion logradas cuando se les utiliza, son relativamente bajas y/o las soluciones amortiguadoras no son adecuadas para su aplicación durante la electroporación de células en reposo o que se dividen débilmente .

DESCRIPCION DE LA INVENCION El objeto de la invención es de este modo proporcionar una solución amortiguadora para la electroporación, que hace posible lograr eficiencias de transfeccion más altas con una baja tasa de mortalidad celular, y desarrollar un método correspondiente. El objeto se resuelve por la solución amortiguadora de acuerdo con la invención, que tiene una capacidad amortiguadora de al menos 20 mmoles *pH":L y una fuerza iónica de al menos 200 mmoles a un cambio en 7 el H de pH 7 a pH 8, y a una temperatura de 25°C. Con tal solución amortiguadora es posible introducir moléculas biológicamente activas a las células animales o humanas por medio de electroporación con eficiencias de transfección hasta de 93%, .y al mismo tiempo con baja mortalidad celular. Diversos tipos celulares se pueden transfectar exitosamente en esta solución amortiguadora, especialmente células en reposo y las que se dividen débilmente. Por otro lado, mediante el uso de la solución amortiguadora es posible utilizar pulsos de alto voltaje que tienen una resistencia de campo de al menos 2,000 V/cm, lo que permite, que las moléculas de ADN" sean transíectadas directamente al núcleo celular de células animales y humanas primarias. Un factor decisivo para las propiedades ventajosas de la solución amortiguadora de acuerdo con la invención, es la combinación de una alta capacidad amortiguadora con una alta fuerza iónica. La capacidad amortiguadora ß describe la cantidad de un proteólito requerido para cambiar el pH de una solución amortiguadora por una unidad de pH (ß = dC * dpH-1, donde dC = cantidad agregada de ácido o de base, y dpH = cambio en el pH) . La fuerza iónica I de una solución se puede calcular utilizando la fórmula I = 0.5 *Z? (C± = concentración iónica en mol/litro, Zi = carga iónica) . El programa "Java Buffer Calculator" (Twigger & Beynon, 1998) se utilizó para calcular las fuerzas iónicas de las 8 sustancias amortiguadoras dadas en esta solicitud. En este marco, la solución amortiguadora se puede optimizar en términos de su composición para los diferentes tipos y requerimientos celulares . .En una modalidad preferida se provee que la solución amortiguadora tenga una capacidad amortiguadora de entre 22 y 80 mmoles *??.'1, preferentemente entre 40 y 70 mmoles *pH_1. Con respecto a la fuerza iónica, se- ha encontrado que un intervalo entre 200 y 500 mmoles preferentemente' entre 250 y 400 mmoles *?_1 es particularmente ventajoso. En general, existe de este modo un óptimo en relación con la capacidad amortiguadora y la fuerza iónica, dependiendo del tipo celular y de otras condiciones experimentales, existiendo una interacción entre estos dos parámetros . En otra modalidad preferida, se provee que la solución amortiguadora contenga al menos 10 mmoles de iones magnesio (Mg2+) , preferentemente 15 a 20 mmoles de iones magnesio. De manera contraria a los hallazgos hasta ahora, se ha encontrado sorprendentemente que el Mg2+ en la solución amortiguadora de acuerdo con la invención, incluso en concentraciones claramente altas, puede dar origen a un incremento en la proporción de transfeccion y a un grado significativamente mayor que el que se podría explicar por el ligero incremento simultáneo en la fuerza 9 iónica. En este caso, la solución amortiguadora puede contener cloruro de magnesio (MgCl2) y/o sulfato de magnesio (MgS04) . En una modalidad especialmente ventajosa, se provee que la solución amortiguadora de acuerdo con la invención tenga una 'menor concentración de iones potasio (K+) , preferentemente de 2 a 6 mmoles de K+, y una mayor concentración de iones sodio (Na+) , preferentemente de 100 a 150 mmoles de Na+, si se compara con el citoplasma de las células. De este modo, la solución amortiguadora de acuerdo con la invención no está equiparada a la relación intracelular Na+/K+ sino más bien están presentes relaciones "extracelulares" en este respecto. Sorprendentemente, no obstante, esto no tiene efectos negativos sobre las células, pero sin embargo da como resultado un incremento significativo en la transfección y en la tasa de supervivencia celular. Se provee ventajosamente que la solución amortiguadora de acuerdo con la invención contenga HEPES y/o Na2HP04/ aH2P0 como sustancia amortiguadora. No obstante, se puede utilizar también Tris/HCl o K2HPO4/KH2 O como sustancias amortiguadoras. Además, la solución amortiguadora ' puede también contener componentes adicionales, por ejemplo, cloruro de sodio, succinato de sodio, manitol, glucosa, lactobionato de sodio y/o 10 péptidos . Seis grupos de sistemas amortiguadores, cada uno optimizado a diferentes tipos celulares, se mencionan más adelante como ejemplos para composiciones especialmente ventajosas de las soluciones amortiguadoras de acuerdo con la invención. No obstante, también son posibles otras composiciones dentro del alcance de la invención, de modo que estos ejemplos no se deben entender como una restricción. 1) KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM y Na2HP04/NaH2P04 120-160 mM (pH 7.2) 2) KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, HEPES 5-25 mM y Na2H 04/ aH2P04 120-160 mM (pH 7.2) 3) KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, Na2H 04 NaH2P04 50-160 mM (pH 7.2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5- 100 mM, o succinato de sodio 5-100 mM, o cloruro de sodio 5-100 mM. 4) KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, HEPES 5-25 mM, Na2HP04/Na¾P04 50-160 mM (pH 7.2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM. 5) KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, NaCl 80-100 mM, glucosa 8- 12 mM, Ca(N03)2 0.3-0.5 mM, HEPES 20-25 mM y Tris/HCl 50-100 mM o Na2HP04/NaH2PO4 30-50 mM (pH 7.2) 6) MgCl2 0.1-3.0 mM, K2HP04/KH2P04 50-200 mM (pH 6.5) y/o 11 manitol 1-50 mM y/o succinato de sodio 1-50 tp?. El objetivo se resuelve además por un método para la introducción de moléculas biológicamente activas a células ' animales o humanas por medio de corriente eléctrica, que comprende suspender las células y disolver las moléculas biológicamente activas en una solución amortiguadora, que tiene una capacidad amortiguadora de al . menos 20 mmoles *?? 1 y una fuerza iónica de al menos 200 mmoles con un cambio en el pH de pH 7 a pH 8 y a una temperatura de 25°C, y aplicando un voltaje eléctrico a la suspensión. Con ayuda de este método, se pueden introducir moléculas biológicamente activas a las células animales y humanas por medio de electroporación, con eficiencias de transfección hasta de 93% y al mismo tiempo con baja mortalidad celular. Diversos tipos celulares, especialmente células en reposo y las que se dividen débilmente, se pueden transfectar exitosamente. Los desarrollos ventajosos adicionales del método de acuerdo con la invención, con referencia a la composición de la solución amortiguadora, se dan en las reivindicaciones dependientes y se pueden deducir a partir de la descripción previa. La solución amortiguadora de acuerdo con la invención es especialmente adecuada para llevar a cabo un método de electroporación en el cual se introducen 12 moléculas biológicamente activas a las células por un pulso de voltaje que tiene una resistencia de campo de hasta 2 a 10 kV*cm_1 y una duración de 10 a 200 µ3 y una densidad de corriente de al menos 2 A*cm-2. Como resultado del pulso de alto voltaje, es posible que el ADN sea transfectado directamente dentro del núcleo celular de células animales y humanas, evitándose el daño irreversible a la membrana por la brevedad del pulso. Como resultado de la brevedad del pulso de alto voltaje, la alta fuerza iónica o conductividad de la solución amortiguadora tampoco da como resultado ningún calentamiento desventajoso de la solución, de modo que además de células en división, las células en reposo o las que se dividen débilmente también se pueden transfectar con alta eficiencia y baja mortalidad. La interacción de la alta fuerza iónica de la solución amortiguador y los cortos pulsos de alto voltaje da origen más bien a una apertura eficiente del poro, en donde el efecto amortiguador fuerte puede también compensar las fluctuaciones extremas del pH. Un flujo de corriente después del pulso de alto •voltaje sin interrupción, que tiene una densidad de corriente de 2 a 14 A*cnf2, preferentemente hasta 5 A*cm"2, y una duración de 1 a 100 ms, preferentemente hasta 50 ms, también se puede aplicar de una manera particularmente ventajosa mediante el uso de la solución amortiguadora de 13 acuerdo con la invención en el método. La alta capacidad amortiguadora de la solución amortiguadora de acuerdo con la invención, reduce cualquier cambio en el pH en la cercanía de los electrodos durante el segundo pulso de larga duración, lo cual contribuye a la electroforesis del ADN, de modo que la mortalidad celular se puede reducir efectivamente . Como resultado del método de acuerdo con la invención, la transfección de las moléculas biológicamente activas es de este modo optimizada por medio de la corriente eléctrica en el núcleo celular de las células animales o humanas. En este caso, los ácidos nucleicos, las proteínas o los péptidos se pueden introducir a células animales o humanas en reposo o en división, con una alta eficiencia. La solución amortiguadora de acuerdo con la invención también favorece la introducción de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos a las células primarias soportando los pulsos de alto voltaje. Los ácidos nucleicos pueden también estar presentes en la solución amortiguadora en complejos o en compuestos con péptidos, proteínas u otras moléculas biológicamente activas. El método de acuerdo con la invención es especialmente adecuado para la transfección de células ' sanguíneas humanas primarias,* células precursoras 14 pluripotenciales de sangre humana, fibroblastos primarios humanos y células endoteliales, así como células musculares o melanocitos . Las células producidas mediante el método de acuerdo con la invención son adecuadas de una manera especialmente ventajosa para métodos de diagnóstico y/o analíticos y para la producción de productos farmacéuticos para la terapia génica ex vivo. La Tabla 1 proporciona composiciones específicas de las soluciones amortiguadoras de acuerdo con la invención, las cuales están optimizadas cada una para diferentes aplicaciones o tipos celulares, y han probado ser especialmente ventajosas con referencia a altas eficiencias de transfección y a la reducción de la mortalidad celular. No obstante, otras composiciones pueden también estar comprendidas dentro del alcance de la invención, de modo que estos ejemplos tampoco se deben considerar como restrictivos . Los ejemplos de aplicación para soluciones amortiguadoras individuales se describen con detalle abajo con referencia a los dibujos.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La invención se describe con detalle abajo con referencia a los dibujos. 15 En las figuras La Figura 1 es una representación gráfica de la eficiencia de transfección y la tasa de supervivencia para células endoteliales humanas primarias, como una función de la capacidad amortiguadora y de la fuerza iónica de la solución amortiguadora. La Figura 2 es una representación gráfica de la eficiencia de transfección y la tasa de supervivencia para linfocitos primarios humanos, como una función de la capacidad amortiguadora y de la fuerza iónica de la solución amortiguadora. La Figura 3 muestra un análisis citométrico de flujo de los fibroblastos primarios humanos transfectados con el vector de expresión H-2Kk, durante el cual las células se incubaron por un anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5, y se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-1, FL-2, FL-3 = canal de fluorescencia 1, 2, 3; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión delantera) . La Figura 4 muestra un análisis citométrico de flujo de células de músculo liso humano transfectadas con el vector de expresión H-2Kk durante el cual las células se incubaron con un anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5, y se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-1, FL-2, FL-3 = canal de 16 fluorescencia 1, 2, 3,· SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión delantera) . , La Figura 5 muestra un análisis citométrico de flujo de melanocitos humanos primarios transfectados con el vector de expresión GFP, durante el cual las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-2, FL-3, FL-4 = canal de fluorescencia 1, 3, 4; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión delantera) , y . La Figura 6 muestra un análisis citométrico de flujo de la línea celular CML humana K562 transfectada con el vector de expresión GFP, durante el cual las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) (FL-2, FL-3, FL-4 = canal de fluorescencia 2, 3, 4; SSC = dispersión lateral, FSC = dispersión delantera) .

Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no se deben considerar como restrictivos.

Ejemplo 1 Eficiencia de transfección y tasa de supervivencia de células endoteliales primarias humanas Con el fin de estudiar la transfección y tasa de 17 supervivencia de las células durante la electrotransfección, como una función de la capacidad amortiguadora y de la fuerza iónica, células endoteliales humanas primarias se transíectaron con un vector que codifica para la cadena pesada de la proteína H-2Kk .de la clase 1 MHC de ratón. Respectivamente, 7 x 10s células con respectivamente 5 \ic¡ de ADM de vector y la solución amortiguadora de electrotransfección respectivo, se colocaron a temperatura ambiente en una cubeta que tenía un espacio libre interelectrodos de 2 mm y se transíectaron por un pulso de 1,000 V con duración de 100 . Además, se determinaron valores comparativos utilizando PBS (Solución Salina Amortiguada con Fosfato: fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2 + NaCl 137 mM, fuerza iónica = 161.5 mM, capacidad amortiguadora = 4.8 mM/pH) . Directamente después de la electrotransfección, las células se retiraron por lavado de la cubeta, utilizando 400 µ? de medio de cultivo, se incubaron por 10 minutos a 37°C y luego se transfirieron a una caja de cultivo con medio calentado previamente. Después de la incubación por 6 horas, las células se incubaron con un anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 , y se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . Como se puede observar de la Figura 1, tanto las 18 eficiencias de transfección como las tasas de supervivencia se incrementan conforme se incrementa la capacidad amortiguadora y la fuerza iónica. En cada caso, se pudieron alcanzar valores significativamente mejores en comparación con la solución comparativa de PBS, en la cual ocurrió una tasa de mortalidad extremadamente alta. En algunas soluciones amortiguadoras, la tasa de mortalidad fue tan alta que estos valores no se pudieron evaluar estadísticamente .

Ejemplo 2 Eficiencia de transfección y tasa de supervivencia de linfocitos humanos primarios Además, la transfección y tasa de supervivencia de los linfocitos humanos primarios durante la electrotransfección, se estudió como una función de la capacidad amortiguadora y la fuerza iónica. Para este propósito, respectivamente 5 x 106 células, respectivamente con 5 µ?; de ADN de vector de expresión H-2Kk en las ' soluciones amortiguadoras respectivas, se colocaron a temperatura ambiente en una cubeta que tenía un espacio libre interelectrodos de 2 mm y se electrotransfectaron por un pulso de 1, 000 V y 100 µ? , seguido por un flujo de corriente que tenía una densidad de corriente de 4 A*cm~2 y 40 ms . Además, se determinaron los 19 valores comparativos utilizando PBS (fuerza iónica = 161.5 mM, capacidad amortiguadora' = 4.8 mM/PH) . El análisis se realizó después de 16 horas. Como se puede observar de la Figura 2, es claro que las tasas de supervivencia de las células se incrementan conforme se incrementan la capacidad amortiguadora y la fuerza iónica de las soluciones amortiguadoras utilizadas. En algunos casos, se pudieron lograr valores significativamente mejores en comparación con la solución comparativa (PBS: 40.1% de células transfectadas , 38.3% de células vivas). Aquí también, la eficiencia de transfección se puede de este modo incrementar significativamente por la selección de la selección amortiguadora adecuada de acuerdo con la invención, en comparación con soluciones convencionales, tal como medio o PBS por ejemplo.

Ej emplo 3 Transfección de fibroblastos humanos primarios La Figura 3 muestra un análisis de FACScan de fibroblastos primarios humanos transfectados con el vector de expresión H-2 k. Se colocaron 5 x 10s células con 5 µg del ADN de vector en la solución amortiguadora 6 de la Tabla 1, a temperatura ambiente en una cubeta que tenía un espacio "libre interelectrodos de 2 mm y se transfectaron 20 por un pulso de 1,000 V, de 100 µß seguido por un flujo de corriente de 6 A*cm~2 y 33 ms . Después de incubación por 5 horas, las células se incubaron con un anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 y se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio . El 93% de las células vivas expresaron el antígeno H-2Kk, lo cual corresponde a una muy alta eficiencia de transfección .

Ejemplo 4 Transfección de células humanas de músculo liso La Figura 4 muestra un análisis de FACScan de células humanas de músculo liso transfectadas con el vector de expresión H-2Kk. 5 x 105 células con 5 µg de ADN de vector en el amortiguador 6 de la Tabla 1, se colocaron a temperatura ambiente en una cubeta que tenía un espacio libre interelectrodos de 2 mm, y se transfectaron por un pulso de 1, 000 V, de 100 µß, seguido por un flujo de corriente que tenía una densidad de corriente de 5.6 A*cm~2 y 40 ms . Después de incubación por 13.5 hr, las células se incubaron utilizando un anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a Cy5 utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. El 53.8% de las 21 células vivas expresaron el antigeno H-2Kk, lo cual corresponde también a una alta eficiencia de transfeccion.

Ejemplo 5 Transfeccion de melanocitos humanos primarios La Figura 5 muestra un análisis de FACScan de melanocitos humanos primarios, los cuales se transfectaron con el vector de expresión GFP. 5 x 10s células con 5 µg del vector pEGFP-Cl (Clontech Lab.) en la solución amortiguadora 40 de la Tabla 1, se colocaron a temperatura ambiente en una cubeta que tenía un espacio libre interelectrodos de 2 mm y se transfectaron por un pulso dé 1,000 V, 100 seguido por un flujo de corriente que tenía una densidad de corriente de. 6 A*cra"2 y 33 ms . Después de incubación por 24 horas, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. El 56.2% de las células vivas expresaron el GFP, lo cual también corresponde a una muy alta eficiencia de transfeccion.

Ejemplo 6 Transfeccion de la línea celular CML humana K562 La Figura 6 muestra un análisis de FACScan de la línea de células CML humanas K562, la cual se transfectó 22 con el vector de expresión GFP. 5 x 105 células con 5 µg del vector pEGFP-Cl (Clontech, Lab.) en la solución amortiguadora 42 de la Tabla 1, se colocaron a temperatura ambiente en una cubeta que tenia un espacio libre interelectrodos de 2 mm, y se transfectaron por un pulso de 1,000 V, 70 µß , seguido por un flujo de corriente que tenía una densidad de corriente de 4 A*cm"2 y 10 ms. Después de incubación por 24 horas, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo (FACScalibur, Becton Dickinson) . El número de células muertas se determinó mediante tinción con yoduro de propidio. 77.7% de las células vivas expresaron el GFP, lo cual corresponde también a una muy alta eficiencia de transfección.

Lista de abreviaturas utilizadas Se utilizaron las siguientes abreviaturas además de aquellas comúnmente empleadas en Duden: A Amperio APC Alficocianina CD Racimo de diferenciación . cm Centímetro ADN ácido desoxirribonucleico FACScan Exploración de células activadas por 23 fluorescencia FCS Suero fetal de ternera FL Fluorescencia FSC Dispersión delantera HEPES N- (2-hidroxietil) -piperazin-N' - (ácido 2- etansulfónico) mi Mililitro mM Milimolar msec Milisegundo PBS Solución salina amortiguada con fosfato PE Ficoeritrina PerCP Proteina de clorofila de peridinina pH logaritmo común negativo de la concentración de iones hidrógeno ARN Ácido ribonucleico RPMI Instituto Rosewell Park Memorial SSC Dispersión lateral Tris Clorhidrato de tris- (hidroximetil) -aminoetano µg Microgramo µ? Microlitro µ3es Mierosegundo V Voltio

Claims

24 REIVINDICACIONES 1. Una solución amortiguadora para suspender células animales o humanas y para disolver moléculas biológicamente activas con el fin de introducir dichas moléculas biológicamente activas dentro de las células utilizando corriente eléctrica, la solución amortiguadora tiene una capacidad amortiguadora de al menos 20 mmoles * pET1 y una fuerza iónica de al menos 200 mmoles a un cambio de pH de pH 7 a pH 8 y a una temperatura dé 25°C, y contiene una concentración más baja de iones potasio (K+) y una concentración más alta de iones sodio (Na+) , si se compara con el citoplasma de las células . 2. La solución amortiguadora de conformidad con la reivindicación 1, que tiene una capacidad amortiguadora (pH 7-8, 25°C) entre 22 y 80 mmoles*!"1*?!!"1. 3. La solución amortiguadora de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, que tiene una capacidad amortiguadora (pH 7-8, 25°C) entre 40 y 70 mmoles *I"1*pH"1. 4. La solución amortiguadora de conformidad con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que tiene una fuerza iónica entre 200 y 500 mmoles *I"1. 5. La solución amortiguadora de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, que tiene una fuerza iónica entre 250 y 400 mmoles 6. La solución amortiguadora de conformidad con 25 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene al menos 10 mmoles de iones de magnesio (Mg2+) . 7. La solución amortiguadora de conformidad con la reivindicación 6, que contiene 15 a 20 mmoles de iones de magnesio. 8. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. que contiene cloruro de magnesio (MgCl2) y/o sulfato de magnesio (MgS04) . 9. La solución amortiguadora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde contiene una concentración de iones de potasio (K+) entre 2 y 6 mmoles * I"1 K+, y una concentración de iones de sodio (Na+) entre 100 y 150 mmoles * I"1 Na+. . 10. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que contiene HEPES y/o a2HP04/NaH2P04 y/o Tris/HCl y/o ?2??04/??2?04 como sustancia amortiguadora. 11. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que contiene componentes adicionales, por ejemplo, cloruro de sodio, succinato de sodio, manitol , glucosa, lactobionato de sodio y/o péptidos. 12. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 11, que contiene C1 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM y Na2HP04/NaH2P04 120-160 mM (pH 7.2) . 26 13. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que contiene KC1 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, HEPES 5-25 mM y Na2HP04/NaH2P04 120-160 mM (pH 7.2). 14. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que contiene KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, Na2HP04/NaH2P04 50-160 mM (pH 7.2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM. 15. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que contiene KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, HEPES 5-25 mM, Na2HP04/NaH2P04 50-160 mM (pH 7.2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM. 16. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que contiene KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, NaCl 80-100 mM, glucosa 8-12 mM, Ca(N03)2 0.3-0.5 mM, HEPES 20-25 mM y tris/HCl 50-100 mM o 17. La solución amortiguadora de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que contiene MgCl2 0.1-3.0 mM, K2HP04/KH2P04 50-200 mM (pH 6.5) y/o manitol 1-50 mM y/o succinato de sodio 1-50 mM. 18. Un método para introducir moléculas 27 biológicamente activas dentro de células animales o humanas por medio de corriente eléctrica, que comprende: i. suspender las células y disolver las moléculas biológicamente activas en una solución amortiguadora que tiene una capacidad amortiguadora de al menos 20 mmoles *pH"1 y una fuerza iónica de al menos 200 mmoles a un cambio en el pH de pH 7 a pH 8 y a una temperatura de 25°C, y ii . aplicar un voltaje eléctrico a la suspensión. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la solución amortiguadora tiene una capacidad amortiguadora (pH 7-8, 25°C) entre 22 y 80 mmoles *pBT1. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o 19, en donde la solución amortiguadora tiene una capacidad amortiguadora (pH 7-8, 25°C) entre 40 y 70 mmoles *??~1. 21. El método de conformidad con las reivindicaciones 18, 19 ó 20, en donde la solución amortiguadora tiene una fuerza iónica entre 200 y 500 mmoles 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde la solución amortiguadora tiene una fuerza iónica entre 250 y 400 mmoles 28 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en donde la solución amortiguadora contiene al menos 10 mmoles de iones de magnesio (Mg2+) . 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la solución amortiguadora contiene 15 a 20 mmoles de iones de magnesio. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en donde la solución amortiguadora contienen cloruro de magnesio (MgCl2) y/o -sulfato de magnesio (MgSOj . 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, en donde la solución' amortiguadora contiene una menor concentración de iones de potasio (K+) , preferentemente 2 a 6 mmoles de +, y una más alta concentración de iones de sodio (Na+) , preferentemente 100 a 150 mmol de Na+, si se compara con el citoplasma de las células. 27. El- método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, en donde la solución amortiguadora contiene HEPES y/o a2HP04/NaH2P04 y/o Tris/HCl y/o K2HPO4/KH2PO4 como sustancia amortiguadora. 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, en donde la solución amortiguadora contiene componentes adicionales, por 29 ejemplo, cloruro de sodio, succinato de sodio, manitol, glucosa, lactobionato de sodio y/o péptidos. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en donde la solución amortiguadora contiene KCl 4-6 mM, . MgCl2 10-20 mM . y Na2HP04/NaH2P04 120-160 M (pH 7.2). 30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en donde la solución amortiguadora contiene KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, HEPES 5-25 mM y Na2HP04/ a2HP04/NaH2P04 120-160 mM (pH 7.2) . 31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en donde la solución amortiguadora contiene KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, Na2HP04/ aH2P04 50-160 mM (pH 7.2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM. 32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en donde la solución amortiguadora contiene KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, HEPES 5-25 mM, Na2HP04/NaH2P04 50-160 mM (pH 7.2) y lactobionato de sodio 5-100 mM o manitol 5-100 mM o succinato de sodio 5-100 mM o cloruro de sodio 5-100 mM. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en donde la solución amortiguadora contiene KCl 4-6 mM, MgCl2 10-20 mM, NaCl 80- 30 100 mM, glucosa 8-12 mM, Ca(M03)2 0.3-0.5 mM, HEPES 20-25 mM y tris/HCl 50-100 mM o N 2HP04/ aH2P04 30-50 mM (pH 7.2). 3 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, en donde la solución amortiguadora contiene MgCl2 0.1-3.0 mM, K2HPO4/KH2PO4 50-200 mM (pH 6.5) y/o manitol 1-50 mM y/o succinato de sodio 1-50 mM. 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 34, en donde la introducción de las moléculas biológicamente activas dentro de las células es lograda por un pulso de voltaje que tiene una fuerza de campo de hasta 2 a 10 kV*cm"1 y una duración de 10 a 200 µe y una densidad de corriente de al menos 2 A*cm'2. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, en donde la introducción de las moléculas biológicamente activas dentro de las células es lograda por un flujo de corriente después del pulso de alto voltaje, sin interrupción, que tiene una densidad de corriente de 2 a 14 a*cm-2, preferentemente hasta 5 Acrtf2, y una duración de 1 a 100 ms, preferentemente hasta 50 ms . 37. El método de conformidad con la reivindicación 35 ó 36, en donde las moléculas biológicamente activas son transíectadas dentro del núcleo celular de células animales o humanas por medio de corriente eléctrica. 31 38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 37, en donde los ácidos nucleicos, las proteínas o los péptidos son introducidos dentro de células animales o humanas en reposo o en división.. 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 38, en" donde los ácidos nucleicos, proteínas o péptidos son introducidos dentro de células animales o humanas primarias . 40. El método de conformidad con la reivindicación 38 ó 39, en donde los ácidos nucleicos están presentes en complejos o en compuestos con péptidos, proteínas u otras moléculas biológicamente activas . 41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 40, en- donde las células son células sanguíneas humanas primarias, células precursoras pluripotenciales de sangre humana, fibroblastos humanos primarios y células' endoteliales, así como células musculares o melanocitos .