CN117813387A - 有效递送多聚核苷酸至细胞的成分与方法 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了一种通过电转将多聚核苷酸有效递送至细胞核的成分与方法。同时，本披露提供了一种有助于递送、显著降低细胞毒性的新缓冲液系统。缓冲液包括琥珀酸盐、甘露醇、一种糖、谷氨酰胺或类似物以及抗氧化剂。此外，还提供了一种特别适用于电转递送DNA、RNA或蛋白质至胞内的方法，这种方法需在渗透压大于310mOsmol/kg的溶液条件下进行。

Description

有效递送多聚核苷酸至细胞的成分与方法
背景
将靶向插入的非病毒基因组编辑应用于T细胞的重编程，具有巨大的治疗潜力。然而，电转递送DNA会引发严重细胞毒性，限制其广泛应用。
非病毒重编程人类原代T细胞提供了一种安全、快速且无病毒的CAR-T细胞制备方法。与利用慢病毒(lentivirus)随机整合或利用腺相关病毒(AAV)作为模板进行位点特异性整合的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)构建不同，非病毒重编程CAR-T细胞节省为供体DNA递送而制备lentivirus或AAV的步骤，可快速用于制造工艺开发。然而，电转递送DNA供体后产生的细胞毒性以及递送效率相对较低，是阻碍非病毒递送的最大障碍。
需要改进方法以有效地将多核苷酸递送至胞内，尤其是递送至核内。
摘要
在某些实施案例中，本披露提供了一种用于有效将多核苷酸递送至胞内，尤其是递送至核内的成分和方法。本披露开发了一种新型缓冲系统，可极大减少细胞毒性，从而促进递送。还提供了使用该缓冲系统进行递送的方法。这些多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA。多核苷酸还可以RNA-蛋白质复合物的形式提供。
因此，在一种实施案例中，本披露提供了一种包括琥珀酸、甘露醇，和从葡萄糖、蔗糖和肌醇糖中选择的一种糖类，以及谷氨酰胺或其类似物和抗氧化剂的水溶液。
在某些实施案例中，糖是D-葡萄糖。在某些实施案例中，谷氨酰胺或其类似物从L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酸和D-谷氨酸中选择。在某些实施案例中，琥珀酸可以是琥珀酸钠、琥珀酸钾或琥珀酸镁。在某些实施案例中，抗氧化剂可以是丙酮酸钠或乙酰半胱氨酸。
在某些实施案例中，该溶液还包括Na2HPO4和/或NaH2PO4。在某些实施案例中，该溶液还包括血清。
在某些实施案例中，该溶液不包括或仅包括有限的NaCl，例如小于浓度80mM的NaCl，或者最好小于70mM、60mM或50mM的NaCl。
在一个特定实施案例中，该溶液包括浓度为5mM至30mM的琥珀酸钠、1mM至30mM的甘露醇、3mM至30mM的葡萄糖、50mg/L至800mg/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.1mM至0.6mM的丙酮酸钠，并且包括浓度小于60mM的NaCl。
本披露的另一实施方案提供了一种将多核苷酸递送至细胞的方法，包括将电脉冲应用于包含多核苷酸和细胞样品的水溶液中。
本披露的另一实施方案提供了一种将多核苷酸递送至细胞的方法，包括将电脉冲应用于包含多核苷酸和细胞的样品，所述样品位于包括浓度小于80mM NaCl，或者最好小于70mM、60mM或50mM NaCl的培养基中。在某些实施方案中，培养基包括琥珀酸、甘露醇、一种糖、谷氨酰胺或其类似物以及抗氧化剂。
在某些实施方案中，多核苷酸是DNA或RNA。在某些实施方案中，DNA可以是单链或双链DNA。在某些实施方案中，RNA可以是siRNA、sgRNA、mRNA或双链RNA。在某些实施方案中，RNA以RNA-蛋白质复合物的形式提供。
在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，培养基进一步包括抑制cGAS-STING途径的药物。在某些实施方案中，该药物为靶向cGAS或STING蛋白的siRNA。
在某些实施方案中，该方法导致多核苷酸进入细胞核。
在某个实施方案中，还提供了一种将生物分子递送至细胞的方法，包括将电脉冲应用于包含生物分子和细胞的样品，样品位于渗透压高于310mOsmol/kg的水溶液中，其中生物分子是RNA分子、蛋白质或他们的混合物。
在某些实施方案中，水溶液的渗透压高于320mOsmol/kg、330mOsmol/kg、340mOsmol/kg或350mOsmol/kg。在某些实施方案中，渗透压低于600mOsmol/kg。
在某些实施方案中，水溶液如本披露所述。在某些实施方式中，水溶液包含用于调节水溶液渗透压的非电解质溶剂。在某些实施方案中，非电解质溶剂从葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、甘油、PEG300、PEG400、PEG600、甘氨酸、脯氨酸、牛磺酸、甜菜碱和硼酸中选择。在某些实施方案中，非电解质溶剂的浓度为10mM至300mM、20mM至300mM、30mM至300mM、40mM至300mM、50mM至300mM、10mM至200mM、20mM至200mM、30mM至200mM、40mM至200mM、50mM至200mM、10mM至100mM、20mM至100mM、30mM至100mM、40mM至100mM或50mM至100mM。
在某些实施方案中，水溶液包含用于调节水溶液的渗透压的电解质溶剂。在某些实施方案中，电解质溶剂选择从NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、Ca(NO3)2、MgSO4和NaHCO3中选择。在某些实施方案中，非电解质剂的浓度为3mM到90mM、4mM到90mM、5mM到90mM、6mM到90mM、7mM到90mM、8mM到90mM、9mM到90mM、10mM到90mM、15mM到90mM、20mM到90mM、3mM到60mM、4mM到60mM、5mM到60mM、6mM到60mM、7mM到60mM、8mM到60mM、9mM到60mM、10mM到60mM、15mM到60mM、20mM到60mM、3mM到40mM、4mM到40mM、5mM到40mM、6mM到40mM、7mM到40mM、8mM到40mM、9mM到40mM、10mM到40mM、15mM到40mM、20mM到40mM、3mM到20mM、4mM到20mM、5mM到20mM、6mM到20mM、7mM到20mM、8mM到20mM、9mM到20mM、10mM到20mM或15mM到20mM。
在某些实施方式中，水溶液的pH值为7到7.4。在某些实施方式中，生物分子是siRNA、sgRNA、信使RNA、双链RNA、反义RNA、tRNA或RNA适配体。在某些实施方式中，生物分子是蛋白质或RNA-蛋白质复合物。
在某个实施方式中，还提供了一种将DNA分子递送至细胞的方法，包括将电脉冲应用于包含DNA分子和细胞的样品中，所述样品位于渗透压为270至330mOsmol/kg之间的水溶液中。在某些实施方式中，渗透压抑制了细胞中的cGAS-STING激活。在某些实施方式中，DNA为双链DNA。
附图说明
图1a-i表明在人类原代T细胞中，降低cGAS-STING的激活水平对于非病毒性dsDNA递送至关重要。a，电转后72小时细胞数量变化倍数。将1μg质粒(3.5kb)、双链DNA(1.4kb)、单链DNA(1.4kb)、双链寡核苷酸(99bp)、单链寡核苷酸(99bp)或MOCK电转至T细胞中。EP代表电转(Electroporation)。b，对电转的T细胞进行Western blot实验，结果显示质粒和dsDNA刺激的细胞中，STING及其下游信号通路TBK1和IRF3激活。c-d，RT-qPCR检测干扰素刺激基因(c)和炎症因子(d)。细胞在电转后4小时收集。e，电转后72小时细胞数量变化倍数。首先用靶向AAVS1位点、STING或cGAS的Cas9/gRNA作为核糖核蛋白(RNP)刺激人类T细胞。电转后72小时，将1μg指定DNA电转至STING KO或cGAS KO或AAVS1-KO细胞中。dsCAR为2.9kb的双链DNA，ssCAR为2.9kb的单链DNA。f，GFP效率和细胞存活的热图。GFP质粒被用于优化电转缓冲液和程序。转染后24小时收集数据。推荐的商业电转条件P3-EO115用黑框标出。g，(上)固定电转后T细胞的共聚焦图像，绿色标记细胞骨架，蓝色标记细胞核，红色为带有cy5标记的1.35kb DNA。(下)DNA的亚细胞分布的定量。方括号中为定量的细胞数量。h，电转后72小时，FACS分析1μgEF1α-GFP dsDNA(3.2kb)电转的T细胞，结果显示使用BO14-EO138的电转条件提高了转染效率(左图)，增强了荧光强度(右图)，并增加了绝对GFP细胞数量(下图)。i，指定电转参数和载体，qPCR分析电转后的T细胞。基于BO14的电转大大降低了干扰素和炎症调节基因的表达。在Rab11a位点有针对性地整合GFP(也参见图8a)。使用1μg供体dsDNA。所有图表的P值是通过student t检验计算的。*p<0.05**p<0.01***p<0.001，n≥2。Error bar表示均值±标准差。
图2a-h表明，基于BO14的dsDNA核递送在各种应用中导致了增强的敲入(Knock-in,KI)率。a，基于BO14的1μg dsDNA模板核递送敲入效率增加(左图)和敲入细胞数增多(右图)，且适用于各种基因座。Rab11a、CLTA和AAVS1位点的数据在电转后3天收集，FBL位点在电转后6天收集，TRAC位点由于供体DNA的表达类似质粒，数据在电转后14天收集。另请参见图8.b，供体修饰进一步提高了基于BO14的递送系统中的KI效率(左图)和敲入细胞数(右图)。指定修饰的0.5μg Rab11a位点dsDNA或1μg CLTA位点dsDNA，与相应的RNP复合物共电转。数据在电转后3天收集。c，确定BO14转染系统的关键组分。五种组分独立或混合添加至基础缓冲液B中。选择0.4μg针对Rab11a位点的dsDNA，并在电转后3天测量数据。d，非病毒基因组将CD19CAR靶向TRAC位点。3μg RNP复合物与指示剂量的2.9kb CD19 CAR dsDNA模板共电转入人类原代T细胞中。在电转后5天进行CAR表达和细胞计数的FACS分析。另请参见图9.e，CD19-CAR T细胞与CD19+Nalm6肿瘤细胞或CD19-/-Nalm6细胞以指定比例共培养后，进行细胞杀伤分析。f，BO14得到的CAR-T细胞和AAV1得到的CAR-T细胞的特异性抗原细胞因子产生。阴性对照代表与CD19-/-Nalm6细胞系一起培养的CAR-T细胞。另请参见图9c.g，NCG小鼠接种了2.5×105个CD19+Nalm6细胞，随后接种5×105CAR-T细胞。肿瘤负担以生物发光信号来定量(每组n＝2)。h，用Kaplan-Meier法对不同CAR-T细胞或PBS对照组(Ctrl)治疗的小鼠的生存进行分析(每组n＝7)。所有图表的P值通过t检验计算。*p<0.05**p<0.01***p<0.001，n≥3。Error bar表示均值±标准差。
图3a-b显示，在原代T细胞中cGAS/STING通路对细胞的DNA感知至关重要。a,使用两个sgRNAs在人类原代T细胞中有效敲低cGAS和STING的验证。b,cGAS/STING下游通路的qPCR结果。细胞在电转后4小时收集。
图4a-d显示，STING抑制剂在T细胞中对DNA诱导的免疫反应影响较小。a-b,人类原代T细胞在电转前用一种STING抑制剂——1μM H151预处理16小时。电转后72小时进行计数。c,ISG56和IFNB1的qPCR实验结果显示，STING抑制剂处理后基因表达持续存在。DMSO代表二甲基亚砜，作为溶剂对照。d,人类单核细胞系THP-1在HSV-1刺激前，用指定剂量的H151进行预处理。qPCR结果显示ISG56和IFN-β对STING抑制剂H151剂量依赖。
图5a-c显示，两次电转对T细胞不耐受。a,Western blot结果显示，通过siRNA可有效敲低STING。b,与质粒DNA电转前，用siSTING处理细胞的细胞存活率分析。c,在电转后3天进行细胞计数，并通过将结果与输入细胞数相除计算倍数变化。人类原代T细胞对于单次电转可耐受，三天细胞增长了5倍，而两次电转细胞不增长，表明两次电转对于T细胞不可行。n＝3。
图6a-b显示，电转条件的筛选验证。a,基于初次筛选，使用多个T细胞供体验证了两种缓冲液BO14和AO11。使用0.4μg pMAX质粒与指定的缓冲液和电转程序进行电转。在电转后1天，计算和测量GFP阳性细胞和平均荧光强度。共测试了四个不同供体的T细胞。b,随着时间推移的转染效率分析。使用0.4μg pMAX质粒与指定的缓冲液和电转程序进行电转。在电转后1、3和5天进行转染效率的测定与计算。共测试了四个不同供体的T细胞。
图7a-b显示，BO14介导的核递送有助于减轻人类原代T细胞中DNA诱导的免疫反应。a,对使用指定的EP条件和载体进行电转的T细胞的qPCR检测。BO14缓冲液介导的电转极大降低了干扰素和炎症反应基因的表达。b,Western blot检测STING激活。细胞在电转后4小时收集以进行分析。
图8a-c显示，BO14介导的核递送增强了多个位点的大片段靶向插入。a,将GFP序列插入外显子以构建融合蛋白。b,将EF1α启动子驱动的GFP插入TRAC位点。c,将GFP序列插入AAVS1位点的内含子中。下面列出了靶向插入的代表性FACS图。dsDNA为1μg，Rab11a、CTLA和AAVS1位点的数据在电转后3天收集，FBL位点的数据在电转后6天收集，TRAC位点的数据在电转后14天收集。
图9a-c显示，BO14介导的核递送促进了CAR-T细胞的产生。a,在TRAC位点的CD19BBz CAR敲入策略。在HDR模板的5'端添加了一个15bp截短的Cas9靶标序列(tCTS)。dsDNA的5'端经过5'磷硫酸酯(PS)修饰和C6-聚乙二醇10(PEG)修饰。b,FACS图显示有效的CAR表达(～32％)和高达97％的TCRα基因敲除效率。c,图.2f的分选策略和原始FACS图。
图10A-E显示，在293T细胞系中优化的EP方法使质粒递送效率增强。A，在293T细胞系中，GFP质粒被用于优化电转过程。在转染后24小时通过流式细胞术分析GFP表达和细胞存活率。数据来自一次实验。B，验证293T细胞中质粒递送效率。在转染后24小时，通过流式细胞术评估细胞存活率和转染效率(GFP表达和MFI)。TSF-CM130代表商业(Lonza)SF缓冲液和EP程序CM130。SF-EW113代表商业SF缓冲液与EW113 EP程序的搭配。自制EP缓冲液命名为BO11。数据来自三次独立实验，显示为平均值±标准差(n＝3)。C，(顶部)使用针对EGFP位点的CRISPR质粒pX330，自制EP缓冲液基因敲除效率增强。(底部)与商业试剂盒相比，px330质粒(1.0μg剂量)在转染后7天的KO效率示例。基因敲除效率通过在转染后7天测量EGFP阴性细胞来确定。D,(顶部)与商业试剂盒对比RNP递送。在293T细胞系中，通过递送靶向EGFP的RNP，将自制EP方法和商业试剂盒进行比较。(底部)与商业试剂盒相比，转染后7天，RNP的KO效率示例(RNA/Cas9比例为5∶1，Cas9用量为1.5μg)。基因敲除效率通过在转染后7天测量EGFP阴性细胞来确定。数据显示为平均值±标准差(n＝5)，代表五次独立实验。E,在293T细胞系中，比较RNP转染后72小时，优化的自制EP方法与商业试剂盒的针对VEGFA的KO效率和细胞存活率。数据显示为平均值±标准差(n＝3)，代表了三次独立实验。P<0.05；，P<0.01；，P<0.001；通过单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计。
图11A-C显示，经过优化的电转方法以及CRISPR在细胞系中的高效递送。(A)在U-2OS、Jurkat、K562和Raw264.7细胞系中，比较通过优化的自制电转方法与商业试剂盒获得的细胞存活率和转染效率。细胞存活率和转染效率(GFP表达和MFI)在转染后24小时通过流式细胞仪评估。数据以三个或更多独立实验的平均值±标准偏差呈现。(B和C)通过经过优化的自制电穿孔协议，比较了靶向TRAC的px330质粒(B)和RNP(C)核酸递送后的KO效率、插入/缺失率和细胞存活率，与商业试剂盒在Jurkat细胞系中进行比较。数据以平均值±标准偏差呈现，代表了三个或更多独立实验。
图12A-F显示，经过优化的电转以及在小鼠原代细胞中进行RNP递送的测试。(A和B)在小鼠原代T细胞中通过BO基础缓冲液增强质粒递送(A)和RNP递送(B)。P3代表Lonza商业缓冲液，DN100是推荐的电转程序。在A中使用了GFP质粒，在B中使用了靶向CD90的Cas9/gRNA。在转染后24小时过流式细胞仪评估细胞存活率、转染效率(GFP表达和MFI)通。通过测量CD90阴性T细胞来衡量的KO效率，并通过流式细胞仪在小鼠原代T细胞中测定RNP递送后72小时的细胞存活率。数据显示为平均值±标准差(n＝3)，代表了三次独立实验。(C)在原代小鼠巨噬细胞中通过BO基础缓冲液增强质粒递送。P2-DO100代表Lonza推荐的缓冲液和电转程序。。数据显示为平均值±标准差(n＝4)，代表了四次独立实验。(D-F)在人类原代T细胞中通过BO基础缓冲液增强mRNA递送(D，F)和RNP递送(E)。在D中使用0.5μgGFP mRNA，在RNP递送后24小时收集数据。通过测量TRAC-阴性T细胞来衡量的KO效率，并通过流式细胞仪在RNP(E)和Cas9 mRNA/sgRNA(F)转染后72小时(Cas9mRNA/sgRNA为96小时)测定的细胞存活率。
图13A-B显示了基于缓冲液B的HDR增强效果。在Jurkat细胞系中(A)和293T(B)中，Cas9介导的HDR靶向RAB11a基因座的效果。将1μg的dsDNA供体和3μg靶向Rab11a基因座的RNP电转入细胞中，数据在电转后72小时通过FACS收集。
图14a-d显示，将mRNA电转至人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)中的优化和测试。a和b，使用GFP mRNA在人类CD34+HSPCs中系统优化电穿孔(EP)过程。通过流式细胞仪在电穿孔后12小时分析中位荧光强度(MFI)和GFP阳性细胞数量。数据来自两次或三次重复实验的平均值。黑框表示来自Lonza的商业标准。BO14、BO11或AO41代表不同的优化电穿孔缓冲液。c和d，使用BO11缓冲液和DG135电穿孔程序的新电穿孔系统显示了人类HSPCs中荧光强度的三倍增加(c)和相似数量的转染细胞(d)。
图15显示，在CAR-T细胞构建中常用的递送方法的示意图。传统的电转引发了强烈的STING激活并导致严重的细胞毒性。cGAS或STING敲除可以帮助防止STING激活并促进细胞存活。新鉴定的电转条件有助于增强细胞核递送，从而减轻cGAS-STING的激活，促进细胞存活和靶向插入。
图16A-D显示，等渗渗透压对dsDNA递送最为理想。
图17A-B显示，在Jurkat细胞中，更高的渗透压改善了mRNA递送。
图18A-C显示，在人类原代细胞中，更高的渗透压改善了mRNA递送。
详细描述
定义
以下描述阐述了本技术的示例实施方式。需要注意的是，本描述并不旨在限制本公开的范围，而是作为示例实施方式提供。
电转缓冲液
一般而言，通过电转等方式递送外源多核苷酸到靶细胞效率较低。当靶细胞为哺乳动物细胞时，面临的另一挑战是由外源多核苷酸引起的细胞毒性。关于这种细胞毒性的机制尚不清楚。有人认为胞浆中存在的双链DNA本身会引发免疫反应。因此，为了减少或避免细胞毒性，将外源多核苷酸直接传递到细胞核内是可采取的方案。然而，与传递到细胞质相比，直接传递到细胞核的效率更低。
发明者探索了由电转DNA引起的细胞毒性机制。当质粒或双链DNA(dsDNA)被转染到T细胞中时，观察到了与cGAMP相互作用的磷酸化干扰素应答刺激蛋白1(p-STING)及其下游信号分子磷酸化TBK1(p-TBK1)和磷酸化IRF3(p-IRF3)的强烈激活。同时观察到了在环状GMP-AMP合酶(cGAS)-STING信号通路下游，炎症细胞因子和I型干扰素(IFN)基因表达。
为了进一步确认细胞毒性是否是通过cGAS-STING信号通路介导的，发明人使用Cas-CRISPR技术敲除了cGAS和STING的表达。结果表明，与对照细胞相比，在电转dsDNA后cGAS或STING基因敲除细胞存活率显著增加。因此，这些结果证明，cGAS-STING介导的免疫激活是电转引起细胞死亡的主要原因，抑制这一信号通路可以减轻毒性，从而提高电转效率。
cGAS是一种胞浆DNA传感器，不与细胞核DNA发生反应。因此，研究者设计了另一种方法来减少细胞毒性，即通过促进多核苷酸的核递送。核递送将绕过胞浆cGAS的监视。为此，发明人进行了电转缓冲液的高通量筛选，并确定了缓冲液B。当与商业细胞培养基Opti-MEMTM培养基以不同比例结合时，缓冲液B在各种哺乳动物细胞中实现了最高效的DNA核递送。值得注意的是，缓冲液B包括琥珀酸盐和甘露醇，这被确定为其促进外源多核苷酸核摄取的高效的原因。发明人进一步确定，在Opti-MEM中，糖(例如葡萄糖)和谷氨酰胺类似物(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)是成功的原因。还出乎意料地发现，高盐浓度(例如缓冲液A的90mMNaCl)对某些形式的多核苷酸的核摄取有害。
Opti-MEMTM介质是Fisher Scientific公司商业上提供的一种低血清培养基。它是一种改进的最小必需培养基(MEM)，可以将胎牛血清的补充减少至少50％，而不改变生长速率或形态。与本技术相关的主要成分列于表1中。Opti-MEMTM培养基包括i-肌醇、Ca(NO3)2.4H2O、丙酮酸钠、葡萄糖和GlutaMAX(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。
根据本公开的一种实施方式，提供了一种包括琥珀酸盐、甘露醇、糖、谷氨酰胺或其类似物以及/或抗氧化剂的水溶液。在一些实施方式中，糖从葡萄糖、蔗糖和肌醇中选择。
根据本公开的另一实施方式，提供了一种包括小于80mM NaCl或更好地小于70mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM或20mM NaCl的水溶液，该水溶液对电转是有用的。在一些实施方式中，水溶液包括糖、谷氨酰胺或其类似物以及抗氧化剂。在一些实施方式中，水溶液进一步包括琥珀酸盐和/或甘露醇。在一些实施方式中，糖从葡萄糖、蔗糖和肌醇中选择。
琥珀酸，如琥珀酸钠、琥珀酸钾和琥珀酸镁，被认为能够增加细胞存活率。在一些实施方式中，水溶液包括至少为5mM、10mM、15mM、20mM或25mM的琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)。在一些实施方式中，水溶液包括不超过50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM或10mM琥珀酸(例如琥珀酸钠)。
甘露醇被认为能够促进同源定向DNA修复。结果表明，甘露醇改善了外源多核苷酸通过胞质进入细胞核的转移。在一些实施方式中，水溶液包括浓度至少为5mM、10mM、15mM、20mM或25mM甘露醇。在一些实施方式中，水溶液包括浓度不超过50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM或10mM的甘露醇。
水溶液中包含的糖被认为能够优化溶液的渗透压，以实现最佳的电转和核摄取。在一些实施方式中，糖从葡萄糖、蔗糖和肌醇中选择。在一些实施方式中，水溶液包括浓度至少为5mM、10mM、15mM、20mM或25mM的糖。在一些实施方式中，水溶液包括浓度不超过50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的糖。在一些实施方式中，水溶液包括浓度至少为5mM、10mM、15mM、20mM或25mM的D-葡萄糖。在一些实施方式中，水溶液包括浓度不超过50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的D-葡萄糖。在一些实施方式中，水溶液包括浓度至少为5mM、10mM、15mM、20mM或25mM的蔗糖。在一些实施方式中，水溶液包括浓度不超过50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的蔗糖。在一些实施方式中，水溶液包括浓度至少为5mM、10mM、15mM、20mM或25mM的肌醇。在一些实施方式中，水溶液包括浓度不超过50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的肌醇。
谷氨酰胺或其类似物被认为能够促进细胞健康和活力。在一些实施方式中，谷氨酰胺或其类似物从L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺中选择。在一些实施方式中，水溶液包括至少50mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L、150mg/L、160mg/L、170mg/L、180mg/L、190mg/L、200mg/L、210mg/L、220mg/L、230mg/L、240mg/L、250mg/L、260mg/L、270mg/L、280mg/L、290mg/L或300mg/L的谷氨酰胺或其类似物。在一些实施方式中，水溶液包括不超过1000mg/L、900mg/L、850mg/L、800mg/L、750mg/L、700mg/L、650mg/L、600mg/L、650mg/L、600mg/L、550mg/L、500mg/L、480mg/L、460mg/L、440mg/L、420mg/L、400mg/L、380mg/L、360mg/L、340mg/L、320mg/L、300mg/L、280mg/L、260mg/L、240mg/L、220mg/L、200mg/L、180mg/L、160mg/L、140mg/L、120mg/L或100mg/L的谷氨酰胺或其类似物。在一些实施方式中，水溶液包括至少50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L、450mg/L、500mg/L、550mg/L、600mg/L、650mg/L、700mg/L、750mg/L或800mg/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在一些实施方式中，水溶液包括不超过1000mg/L、900mg/L、850mg/L、800mg/L、750mg/L、700mg/L、650mg/L、600mg/L、550mg/L、500mg/L、480mg/L、460mg/L、440mg/L、420mg/L、400mg/L、380mg/L、360mg/L、340mg/L、320mg/L、300mg/L、280mg/L、260mg/L、240mg/L、220mg/L、200、或200mg/L的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
“抗氧化剂”指的是一种能够减缓或防止其他分子氧化的分子。氧化是一种化学反应，将电子从一种物质转移到氧化剂。氧化反应可以产生自由基、启动链反应，使蛋白质治疗变得不稳定，最终影响产品的活性。抗氧化剂通过清除自由基中间体，终止这些链反应，并通过自身氧化抑制其他氧化反应。因此，抗氧化剂通常是还原剂、螯合剂和氧清除剂，如丙酮酸盐、乙酰半胱氨酸、柠檬酸、EDTA、DPTA、硫醇、抗坏血酸或多酚。抗氧化剂不限于抗坏血酸(AA，E300)、硫代硫酸盐、蛋氨酸、生育酚(E306)、丙基没食子酸(PG，E310)、叔丁基对羟基苯醌(TBHQ)、酚羟基丙酸酯(BHA，E320)和对羟基苯甲醚(BHT，E321)。
在一些实施方式中，抗氧化剂是丙酮酸盐(例如，丙酮酸钠)。在一些实施方式中，抗氧化剂是乙酰半胱氨酸。在一些实施方式中，水溶液包括浓度至少为0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM的丙酮酸钠。在一些实施方式中，水溶液包括浓度不超过0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.35mM、0.3mM、0.25mM、0.2mM或0.15mM的丙酮酸钠。在一些实施方式中，水溶液包括浓度至少为0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM的乙酰半胱氨酸。在一些实施方式中，水溶液包括浓度不超过0.6mM、0.5mM、0.4mM、0.35mM、0.3mM、0.25mM、0.2mM或0.15mM的乙酰半胱氨酸。
在一些实施方式中，水溶液还包括Na2HPO4和/或NaH2PO4。在溶液中Na2HPO4和/或NaH2PO4的合适浓度可以为20mM至200mM、30mM至180mM、40mM至160mM、50mM至150mM、60mM至130mM、70mM至110mM、80mM至95mM，没有限制。
在一些实施方式中，水溶液还包括KCl、MgCl2或MgSO4、Ca(NO3)2、氨基酸、酚红和/或HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)。在一些实施方式中，水溶液的pH为6.8至7.6、6.9至7.5、7至7.4、7.1至7.3、7.15至7.25，或约为7.3，没有限制。在一些实施方式中，水溶液还包括血清。
在一些实施方式中，水溶液中包含少量或无NaCl，例如浓度不超过80mM的NaCl，或浓度不超过70mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM或25mM的NaCl。
在一些实施方式中，水溶液包括浓度为5mM至30mM的琥珀酸钠、1mM至30mM的甘露醇、3mM至30mM的葡萄糖、50mg/L至900mg/L的L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.1mM至0.6mM的丙酮酸钠，并且包含不超过60mM的NaCl。
在一些实施方式中，水溶液包括浓度为8mM至25mM的琥珀酸钠、3mM至25mM的甘露醇、5mM至25mM的葡萄糖、100mg/L至700mg/L的L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.2mM至0.5mM的丙酮酸钠，并且包含不超过50mM NaCl。
在一些实施方式中，水溶液包括浓度为10mM至20mM的琥珀酸钠、5mM至20mM的甘露醇、8mM至20mM的葡萄糖、200mg/L至500mg/L的L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.3mM至0.4mM的丙酮酸钠，并且包含不超过40mM NaCl。
电转RNA和蛋白质的缓冲液渗透压
在另一项令人惊讶的发现中，发明者证明了电转缓冲液的渗透压对大分子的递送有重要影响。例如，对于双链DNA(dsDNA)，较高的渗透压往往会降低转染效率(图16B-C)。然而，较低的渗透压对靶细胞的存活率更为不利(图16D)。因此，最佳的渗透压位于等渗点左右(约为300mOsmol/kg)，示例参见图16A。
适用于dsDNA的条件对RNA并不合适。对于培养的Jurkat细胞和人体原代T细胞，电转缓冲液的较高渗透度(例如，超过330mOsmol/kg)对转染效率和靶细胞的生存能力都是有益的(图17-18)。据推测，这样的相关性也适用于通过电转向细胞输送蛋白质。
根据本公开的一种实施方式，提供了一种将RNA或蛋白质递送至细胞的方法，包括在渗透压高于300mOsmol/kg、或高于310mOsmol/kg、320mOsmol/kg、330mOsmol/kg、340mOsmol/kg或350mOsmol/kg的水溶液中对包含RNA或蛋白质和靶细胞的样品施加电脉冲。
在一些实施方式中，该溶液的渗透压为310mOsmol/kg到600mOsmol/kg。在一些实施方式中，该溶液的渗透压为310mOsmol/kg到600mOsmol/kg、550mOsmol/kg、500mOsmol/kg、450mOsmol/kg、400mOsmol/kg或350mOsmol/kg。在一些实施方式中，该溶液的渗透压为320mOsmol/kg到600mOsmol/kg、550mOsmol/kg、500mOsmol/kg、450mOsmol/kg、400mOsmol/kg或350mOsmol/kg。在一些实施方式中，该溶液的渗透压为330mOsmol/kg到600mOsmol/kg、550mOsmol/kg、500mOsmol/kg、450mOsmol/kg、400mOsmol/kg或350mOsmol/kg。在一些实施方式中，该溶液的渗透压为340mOsmol/kg到600mOsmol/kg、550mOsmol/kg、500mOsmol/kg、450mOsmol/kg、400mOsmol/kg或350mOsmol/kg。
在某些实施例中，溶液的渗透压范围为350mOsmol/kg至600mOsmol/kg，550mOsmol/kg，500mOsmol/kg，450mOsmol/kg或400mOsmol/kg。在某些实施例中，溶液的渗透压范围为360mOsmol/kg至600mOsmol/kg，550mOsmol/kg，500mOsmol/kg，450mOsmol/kg或400mOsmol/kg。在某些实施例中，溶液的渗透压范围为370mOsmol/kg至600mOsmol/kg，550mOsmol/kg，500mOsmol/kg，450mOsmol/kg或400mOsmol/kg。在某些实施例中，溶液的渗透压范围为380mOsmol/kg至600mOsmol/kg，550mOsmol/kg，500mOsmol/kg，450mOsmol/kg或400mOsmol/kg。在某些实施例中，溶液的渗透压范围为390mOsmol/kg至600mOsmol/kg，550mOsmol/kg，500mOsmol/kg，450mOsmol/kg或400mOsmol/kg。在某些实施案例中，溶液的渗透压范围为400mOsmol/kg至600mOsmol/kg，550mOsmol/kg，500mOsmol/kg或450mOsmol/kg。
一种适用的溶液可以通过混合常用或目前公开的缓冲液(例如，BO14、BO11、B-ICSGG和B-2xICSGG及其衍生物)与电解质或非电解质(例如有机分子，如糖、氨基酸、聚合物)来制备。
一种适用于制备所需渗透压的水溶液的示例缓冲液，包括琥珀酸盐、甘露醇、从葡萄糖、蔗糖和肌醇中选择的糖、谷氨酰胺或其类似物，以及抗氧化剂。
在某些实施方式中，糖为D-葡萄糖。在某些实施方式中，谷氨酰胺或其类似物选自L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺组。在某些实施方式中，琥珀酸盐为琥珀酸钠、琥珀酸钾或琥珀酸镁。在某些实施方式中，抗氧化剂为丙酮酸钠或乙酰半胱氨酸。在某些实施方式中，缓冲液还包括Na2HPO4和NaH2PO4。在某些实施例中，缓冲液还包括血清。在某些实施例中，缓冲液中的NaCl浓度小于80mM，小于70mM、60mM或50mM NaCl则更好。
在以上的“电转缓冲液”标题下，描述了缓冲液的各种额外示例。在一个特定的示例中，缓冲液包括浓度为5mM至30mM的琥珀酸钠，1mM至30mM的甘露醇，3mM至30mM的葡萄糖，50mg/L至900mg/L的L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，0.1mM至0.6mM的丙酮酸钠，并且包括浓度小于60mM的NaCl。
在某些实施方式中，可以通过非电解质剂(例如下表A中列出的试剂)来调整缓冲液的渗透压。
表A.用于调整渗透压的非电解质剂示例
试剂(非电解质) 示例浓度
葡萄糖 10mM-300mM
蔗糖 10mM-300mM
果糖 10mM-300mM
甘露醇 10mM-200mM
山梨醇 10mM-300mM
乳糖 10mM-200mM
海藻糖 10mM-300mM
甘油 10mM-300mM
PEG300 10mM-300mM
PEG400 10mM-300mM
PEG600 10mM-200mM
甘氨酸 10mM-300mM
脯氨酸 10mM-300mM
牛磺酸 10mM-200mM
甜菜碱 10mM-300mM
硼酸 10mM-300mM
通常情况下，这些试剂的示例浓度已在表A中提供。在这些浓度下，缓冲液的渗透压可以在300-600mOsmol/kg的范围内调整。实际使用的浓度可以根据实验测得的所需渗透压来确定。
在一些实施方式中，非电解质剂的浓度为10mM到200mM或300mM。在一些实施方式中，非电解质剂的浓度为20mM到200mM或300mM，30mM到200mM或300mM，40mM到200mM或300mM，50mM到200mM或300mM，60mM到200mM或300mM，70mM到200mM或300mM，80mM到200mM或300mM，90mM到200mM或300mM，或100mM到200mM或300mM。
在一些实施方式中，非电解质剂的浓度为10mM到100mM。在一些实施方式中，非电解质剂的浓度为20mM到100mM，30mM到100mM，40mM到100mM，50mM到100mM，60mM到100mM，70mM到100mM，80mM到100mM，或90mM到100mM。
在一些实施方式中，缓冲液的渗透压可以通过非电解质剂进行调整，例如表B中列举的那些。
表B.用于调整渗透压的电解质剂示例
试剂(电解质) 示例浓度
NaCl 5mM-90mM
KCl 5mM-90mM
MgCl2 3mM-40mM
CaCl2 3mM-40mM
Ca(NO3)2 3mM-40mM
MgSO4 5mM-40mM
NaHCO3 5mM-90mM
这些试剂的示例浓度已在表B中提供。通常情况下，在这些浓度下，缓冲液的渗透压可以在300-480mOsmol/kg的范围内调整。实际使用的浓度可以根据所需的渗透压来确定，这些数据可以通过实验得到。
在一些实施方式中，电解质剂的浓度为3mM到40mM或90mM。在一些实施方式中，电解质剂的浓度为4mM到40mM或90mM，5mM到40mM或90mM，6mM到40mM或90mM，7mM到40mM或90mM，8mM到40mM或90mM，9mM到40mM或90mM，10mM到40mM或90mM，12mM到40mM或90mM，14mM到40mM或90mM，15mM到40mM或90mM，17mM到40mM或90mM，19mM到40mM或90mM，或20mM到40mM或90mM。
在一些实施方式中，电解质剂的浓度为3mM到30mM。在一些实施方式中，电解质剂的浓度为4mM到30mM，5mM到30mM，6mM到30mM，7mM到30mM，8mM到30mM，9mM到30mM，10mM到30mM，12mM到30mM，14mM到30mM，15mM到30mM，17mM到30mM，19mM到30mM，或20mM到30mM。
在一些实施方式中，溶液的pH值为6到8，6.1到8，6.2到8，6.3到8，6.4到7.9，6.5到7.8，6.6到7.7，6.8到7.6，6.9到7.5，7到7.4，7.1到7.3，7.15到7.25或约为7.3，没有限制。
在一些实施方式中，该方法用于将RNA分子递送到靶细胞，包括原核细胞和真核细胞，可能是哺乳动物细胞，如包括人类细胞在内的动物细胞。在一些实施方式中，靶细胞是免疫细胞，如T细胞或NK细胞。在一些实施方式中，RNA是mRNA分子，或siRNA，shRNA，rRNA或tRNA。在一些实施方式中，该方法用于将蛋白质递送到靶细胞。在一些实施方式中，该方法用于递送RNA-蛋白质复合物，没有限制。
类似地，还提供了将DNA分子递送至靶细胞的方法，其中渗透压尽可能接近等渗(例如，在270和330mOsmol/kg之间，或在280和320mOsmol/kg之间，或在290和310mOsmol/kg之间，或在295和305mOsmol/kg之间)。等渗的渗透压可能有助于减轻由DNA分子激活的胞内cGAS-STING信号传递/激活。在一些实施方式中，DNA是dsDNA。对所需渗透压有用的组合和方法已在上述描述中提供。
电转方法
递送多核苷酸到目标细胞的方法，例如电转，也是提供的。在一个实施方式中，提供了一种递送多核苷酸到细胞的方法。在一些实施方式中，该方法涉及将电脉冲应用于包括多核苷酸和细胞的样品的水溶液中。
正如在实验例子中所证明的，利用了目前的技术，可以将各种类型的多核苷酸有效地传递到细胞核中。在一些实施方式中，多核苷酸是DNA或RNA。在一些实施方式中，DNA是单链DNA或双链DNA。在一些实施方式中，RNA是siRNA、sgRNA或单链或双链RNA。在一些实施方式中，RNA是以RNA-蛋白质复合物的形式提供的。
在一些实施方式中，该细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，该细胞是免疫细胞，例如自然杀伤(NK)细胞、T细胞、巨噬细胞或单核细胞，没有限制。
在一些实施方式中，该方法涉及将电脉冲应用于包含已用药物处理的细胞和多核苷酸的样品中，或与抑制cGAS-STING途径的药物处理下进行。在一些实施方式中，该方法是在此处所述的水溶液中进行的。
在一些实施方式中，药物是针对cGAS或STING蛋白的siRNA或抗体。制备抑制性RNA和抗体的方法是众所周知的，并可以有效地传递到细胞以发挥它们的抑制功能。在一些实施方式中，药物在电转后的某个时间被移除，例如在1小时、2小时、6小时、12小时、一天、2天、3天、7天、14天、一个月或两个月后，没有限制。
可以使用商业可获得的设备和系统生成电脉冲，包括本文中测试的设备，如4D-nucleofector(Lonza)。每个设备都配备有适用于特定应用的适当电转程序，可以进一步调整。使用和调整技术在熟练的技术员能力范围之内。
在一些实施方式中，该方法导致多核苷酸进入细胞的细胞核。
示例
以下示例旨在演示本公开内容的特定实施方式。在本公开内容实践时，以下示例中披露的技术效果优良，应该由熟悉该技术领域的人员知悉，因此可以被视为构成其实践的具体模式。然而，在了解本公开内容的基础之上，技术领域的专业人员应该认识到，在所披露的具体实施方式可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下，进行多种修改和变更，仍然可以获得相似或相同的结果。
示例一：通过在非病毒核靶向DNA递送中减轻cGAS-STING激活提高基因组编辑效率的方法
本示例演示了在人类原代T细胞中递送DNA引起的毒性是通过cGAS-STING介导的。为了减少T细胞中DNA递送引起的毒性，本示例系统地研究了电转条件，并确定了一种缓冲液组合物，可以通过增强DNA核递送达到规避细胞质cGAS-STING监测的效果。与商业标准相比，经鉴定的BO14缓冲液在电转DNA模板后，导致重编程的CAR-T细胞数增加了五倍。此外，与通过AAV制备的CAR-T相比，使用BO14缓冲液制备的CAR-T在体外和体内均显示出更强的肿瘤杀伤活性。
方法
原代人类T细胞的分离和培养。使用新鲜全血(SAILY BIO)从健康供体中分离了人类T细胞。简而言之，通过Ficoll(GE)密度离心，使用SepMate管(STEMCELL)富集了外周血单核细胞(PBMCs)。使用EasySep Human T Cell分离试剂盒(STEMCELL)，按照制造商的说明从PBMC中分离出CD3+T细胞。CD3/CD28 dynabeads(Thermo Fisher)∶分离的T细胞(1∶3)激活三天。CD3+T细胞在X-Vivo15培养基(Lonza)中培养，添加了5％胎牛血清(FBS)(Gibco)，50ng/ml人类IL-2，10ng/ml IL-7(Peprotech)和1％青霉素/链霉素。电转后，T细胞在含有100ng/ml IL-2的培养基中培养。电转后每隔2-3天，添加新鲜培养基，以及新鲜的IL-2至终浓度达到100ng/ml。
HDR模板制备
双链DNA(dsDNA)。通过PCR扩增HDR模板的同源臂和插入物。所有HDR模板片段通过Gibson组装法(TransGen Biotech)连接，并进行序列验证。每50μl反应使用1pg质粒作为PCR模板，并经过柱纯化以制备dsDNA。
5'端修饰的HDR模板通过PCR扩增和修改的引物制备。具有5'磷酸硫酰基键和胺基C6的引物从Sangon Biotech(中国上海)订购。Bis-PEG10-NHS酯从Broadpharm(BP-22588)订购，并与带有5'胺基C6基团和5'磷酸硫酰基键的引物在1mM的×1硼酸缓冲液(LEAGENE，IH0217)中室温下过夜孵育。然后通过超滤管Amicon Ultra-0.5(Millipore)对修饰的引物进行脱盐。通过1％琼脂糖凝胶电泳确认扩增的HDR模板的大小和纯度。使用DNA Clean&Concentrator PCR纯化试剂盒(ZYMO，D4034)纯化PCR产物。使用nanodrop(Thermo Fisher)测定HDRT的浓度。
单链DNA。使用Guide-it Long ssDNA Production System(Takara Bio，632644)制备ssDNA。一般来说，使用一个普通引物和一个5'-磷酸化标记的引物来扩增目标DNA。磷酸化标记的DNA链进一步被消化，产生的ssDNA被纯化并在琼脂糖胶上鉴定。
单链寡核苷酸(ssODN)和双链寡核苷酸(dsODN)。ssODN由Sangon Biotech(中国上海)合成。通过在混合缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，20mM NaCl)中杂交两个互补的ssODN，然后通过PCR进一步扩增以生成大量dsODN。
电转(EP)。T细胞刺激后的三天，使用4D-nucleofector(Lonza)对细胞进行电转。通常，0.6-3ⅹ106细胞在20μL的EP缓冲液中悬浮，然后与RNP或siRNA或DNA修复模板混合。将细胞混合物转移到一个20μl电转杯中，在指定的EP程序下进行电转。除非另有说明，否则按照Lonza为人类T细胞推荐的P3-EO115条件下进行电转。电转后，每个电转杯中加入80μl预热的培养基，并在37℃下让细胞静置10分钟，然后转移到96孔板中。每次电转使用100ng化学合成的siRNA(GenScript)。预先以1∶5摩尔比下使Cas9蛋白与sgRNA形成复合物从而制备RNPs。在HDR实验中，在RNP与细胞混合之前，将0.5-3μg供体DNA添加到RNP复合物中。
电转缓冲液
通过混合各个成分制备了基本缓冲液A和基本缓冲液B(表1)。基本缓冲液O是调整到pH 7.2的Opti-MEM培养基。制备的基本缓冲液通过0.2μm过滤膜进行过滤和灭菌。然后将基本缓冲液B或A与Opti-MEM以不同的比例混合。在缓冲液B中制备的五种成分的最终浓度如下：0.13mM肌醇，0.4mM硝酸钙，0.25mM丙酮酸钠，10mM-D葡萄糖，1％ GlutaMAX。混合的电转缓冲液可以在4℃保存长达6个月。
表1.缓冲系统中的成分
缓冲液A 缓冲液B Opti-Mem(主要成分)
5mM KCl 5mM KCL 23.8mg/L i-肌醇
15mM MgCl2 15mM MgCl2 50mg/L Ca(NO3)2.4H2O
90mM NaCl 25mM琥珀酸钠 27.5mg/L丙酮酸钠
10mM葡萄糖 25mM甘露醇 2.58g/L D-葡萄糖
0.4mM Ca(NO3)2 120mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7.2 332.5mg/L L-谷氨酰胺
40mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 7.2 调整pH至7.2 110mM NaCl
调整pH至7.2 氨基酸
酚红
HEPES
血清
pH 7.0～7.4
流式细胞分析。流式细胞分析在Agilent NovoCyte Flow Cytometer上进行。在96孔平板上进行GFP的表达和绝对细胞计数。对于绝对细胞计数，取20-50μL细胞悬液，并在FACS缓冲液中稀释2-4倍。为了检测CD19BBz-CAR的表达，将5×105细胞与0.5μg CD19-Fc(R&D Systems)在40μL FACS缓冲液中(PBS+0.1％ BSA+1％青霉素/链霉素)孵育30分钟，然后在冰上用FITC-IgG-Fc、APC-TCRα/β抗体(Biolegend)染色20分钟。染色的细胞在NovoCyte流式细胞仪上检测，并使用Novo Express软件进行分析。进行细胞内染色以检测IFN-γ和TNF-α的表达水平。AAV-CAR T和BO14-CAR T细胞与FFluc-GFP NALM-6以1∶1比例共培养1小时。在染色前向共培养中添加2μM Monensin(Biolegend)，并在染色前再培养5小时。首先进行CAR染色，然后进行固定和渗透作用。IFN-γ和TNF-α的抗体孵育30分钟，细胞通过流式细胞仪进行分析。DNA在原代T细胞中的亚细胞分布分析
dsDNA标记。将20μg dsDNA(1350bp)与Cy5 Label-IT试剂盒(Mirus Bio)的10μL试剂在37℃孵育1小时，然后进行柱纯化(ZYMO RESEARCH)。纯化的DNA经NanoDrop定量，在-20℃避光储存。用1μg标记的dsDNA对1×106人类原代T细胞进行转染，细胞在电转后10分钟收集以进行下游分析。
染色和共聚焦分析。将细胞在室温下用4％甲醛固定10分钟，并使用鬼笔环肽染色。染色的细胞用PBS重悬至50-100μL，并在显微镜玻片上用离心10分钟，离心力为500g。离心后，在玻片上加入1滴含DAPI封片剂(Sigma，F6057)，并用盖玻片盖住。使用Zeiss LSM880共聚焦显微镜在60倍油目镜下随机选择视野，根据Cy5荧光调整焦距，定位和拍摄Cy5标记的dsDNA。DAPI用于标记细胞核，鬼笔环肽用于标记细胞骨架，Cy5用于追踪DNA分布。通过手动计数获得其核定位比率。使用Zeiss ZEN 2.3图像处理软件的图像分析工具计算Cy5标记的dsDNA在细胞核内和整个细胞中的平均荧光强度。
实时荧光定量PCR
在电转后4小时，收集5×105细胞用于RNA提取(Magen,#R4122-03)和使用HiScript IIQ Select RT SuperMix(Vazyme,#R223-01)制备cDNA。实时荧光定量使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme#Q711-02)在Bio-Rad CFX Connect 96孔板上进行，按照说明进行。每个指定基因的表达水平均用GAPDH作为内参标准化。
细胞系与培养条件
Nalm6细胞和THP1细胞(BNBIO，中国)在含有10％ FBS(AusGeneX)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的RPMI1640培养基中培养。HEK293T17细胞(ATCC)在含有10％ FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。
通过使用携带GFP-P2A-luciferase的lentivirus感染Nalm6构建Nalm6-luciferase-GFP细胞系(FFluc-GFP Nalm6-CD19+)。筛选表达GFP的细胞，并进行进一步扩增以进行后续实验。通过使用携带针对CD19的sgRNA和spCas9的lentivirus进行CD19敲除而制备Nalm6-luciferase-GFP-CD19敲除细胞系(FFluc-GFP Nalm6-CD19-)。通过FACS分选出CD19阴性细胞以构建对照细胞系。通过TIDE进行DNA分析以确认CD19的基因切除。
Western blot分析
5×105-1×106细胞使用含有蛋白酶抑制剂的冰冷RIPA缓冲液(Beyotime)裂解，并在冰上孵育15分钟。在13,000g的条件下，以4℃离心5分钟后收集蛋白上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime)测定蛋白浓度。蛋白通过10％ SDS-PAGE分离，随后使用指定的抗体进行免疫印迹分析。
转染CAR T细胞的AAV1制备
通过在HEK293FT细胞中使用polyethyleneimine(PEI)进行AAV2/CD19BBz、AAV1血清型质粒和辅助质粒的三次转染来制备AAV1。在72小时收集细胞上清液和细胞沉淀进行AAV提纯。AAV通过碘二醇密度梯度进行纯化。简言之，细胞沉淀通过反复冻融循环释放病毒，然后通过benzonase核酸酶(Sigma)处理以去除gDNA和RNA。为了从上清液中收集AAV，依次添加0.0233g/ml NaCl和0.085g/ml Polyethylene Glycol 8000。将混合物在4℃下以6600rpm离心15分钟，然后悬浮在1×GB缓冲液(0.5M NaCl、0.1M MgCl2、0.1M Tris pH7.6)中。向含有AAV的悬浮沉淀中加入不连续梯度的碘二醇，并在48000rpm条件下离心2小时。在40-60％层中通过注射器提取AAV，并通过Millipore Amicon超滤管(Millipore)浓缩。通过ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行qPCR检测CAR，以确定病毒滴度。为了生成AAV-CAR T细胞，电转RNP刺激T细胞，在电转后10分钟，添加MOI＝5×105的AAV1-CAR。细胞在AAV1感染后1-2小时内洗涤。
体外杀伤实验
使用FFluc-GFP Nalm6-CD19+作为靶抗原细胞，使用FFluc-GFP Nalm6-CD19-作为对照细胞。效应细胞(AAV-CAR；BO14-CAR)与靶细胞或对照细胞在含有1×104个靶细胞或对照细胞的总体积为150μL的Nalm-6培养基的96孔U底板中以指定的E/T比例三重共培养。18小时后，使用Luciferase Assay System(Promega)和酶标仪(MD SpectraMax i3x)测定荧光素酶测定强度。根据曲线计算肿瘤细胞数量。
小鼠体内系统肿瘤模型
6-8周的NOD/SCID/IL-2Rγnull小鼠(Gempharmatech，中国)通过尾静脉注射2×105个FFluc-GFP Naml6细胞接种。肿瘤细胞注射后4天，AAV-CAR或BO14-CAR T细胞以每动物5×105的剂量注射。在成像前，将4.5毫克D-萤光素钾盐(Meilunbio，中国)腹腔注射到每只动物中。生物发光成像使用SI Imaging AmiX Imaging System(Spectral InstrumentsImaging，美国)和Living Image软件(Spectral Instruments Imaging)进行，以获取成像数据。遵循所有相关的动物使用指南和伦理法规。
结果
通过非病毒重编程原代人类T细胞，提供了一种安全、快速且无病毒的CAR-T细胞制备方法。与lentivirus介导的随机整合或使用AAV作为模板进行位点特异整合的CAR构建不同，CAR-T细胞的非病毒重编程节省了为供体DNA递送制备lentivirus或AAV的过程，并且可以快速用于制备程序的开发。然而，阻碍非病毒传递的最大障碍在于在电转后DNA供体的细胞毒性和递送至人类T细胞相对较低的递送效率。
为了解决这个问题，我们首先探讨了电转DNA引起的T细胞毒性的机制。在健康细胞中，DNA只存在于线粒体和细胞核。环状GMP-AMP合酶(cGAS)检测到胞浆中的DNA并通过干扰素刺激因子(STING)信号启动先天免疫应答。我们假设cGAS-STING对于触发DNA电转诱导的T细胞毒性在人类T细胞中是必需的。
为验证这一假设，我们首先确定哪种类型的DNA对原代人类T细胞最为有害。包括一个3.5kb质粒、一个1.4kb的线性双链DNA(dsDNA)、一个1.4kb的单链DNA(ssDNA)、一个99-mer的双链寡核苷酸(dsODN)和一个99-mer的单链寡核苷酸(ssODN)在内的五种类型的DNA被电转至T细胞中，然后统计细胞数量。与MOCK电转(MOCK EP)相比，dsDNA和质粒显示出约14-17倍的细胞丢失(图1a)。相反，序列与dsDNA相同的ssDNA，只触发了轻微的细胞丢失(1.6倍)。较短的序列，如dsODN或ssODN，没有引起显著的细胞丢失(图1a)。
为了确定细胞丢失是否是由cGAS-STING激活引起的，我们检查了STING磷酸化(p-STING)及其下游信号通路phosp-TBK1(p-TBK1)和phosp-IRF3(p-IRF3)。与MOCK EP对照相似，dsODN、ssODN和ssDNA都没有表现出对其激活，而转染质粒和dsDNA的T细胞则显示出p-STING、p-TBK1和p-IRF3的强烈激活(图1b)。STING激活的一个特征是其下游产生炎症细胞因子和类型I干扰素(IFN)基因表达。与免疫印迹结果一致，转染质粒或dsDNA的细胞中，类型I IFN和炎症细胞因子的标志性报告基因IFNβ1、IFN诱导基因56(ISG56)和干扰素γ诱导蛋白10(IP10)分别上调(图1c-d)。
接下来，我们探讨DNA诱导的T细胞毒性是否可以通过基因敲除cGAS-STING介导的免疫应答途径来挽救。对cGAS或STING的sgRNA进行筛选，并在DNA电转之前有效地敲除cGAS和STING表达(图1e)。与以AAVS1为靶点的不匹配gRNA对照相比，cGAS或STING敲除细胞在挑战dsDNA或质粒时分别显示出3倍至16倍的细胞数量增加(图1e)。对cGAS或STING敲除细胞进行DNA电转后，STING下游炎症和I型干扰素途径的分析显示特征基因的激活显著减少(图3b)。
为了测试这一情况是否也适用于小鼠，我们从cgas或sting null小鼠中分离T细胞，并用1μg的质粒进行电转。小鼠cgas-/-或sting-/-T细胞显示出野生型17.5倍的存活细胞，并且cGAS-STING下游基因表达显著减少。为了确认STING是关键因素，我们恢复了全长STING或带有C88/91A或C88/91S突变的STING，这是一个众所周知的棕榈酰化位点。从sting-/-小鼠分离的T细胞被感染了逆转录病毒，随后进行质粒转染。与对照相比，恢复全长STING显著诱导了的细胞死亡和标志基因的上调。有趣的是，带有C88/91A或C88/91S突变的STING表达仍然显示出显著的细胞死亡，表明STING棕榈酰化对T细胞死亡并非至关重要。综合这些数据，这表明cGAS-STING激活是原代人类T细胞中dsDNA电转引起的细胞丢失的主要原因。
cGAS-STING通路对于先天免疫应答和其他生物学功能至关重要。我们接下来尝试通过小分子抑制剂H151或siRNA介导的敲降来瞬时抑制这一通路。不幸的是，H151处理未能挽救DNA诱导的细胞死亡，与此一致，DNA转染的T细胞中IFNβ和ISG56上调(图4a-c)。值得注意的是，经过H151处理的THP1细胞在挑战单纯疱疹病毒1型(HSV-1)时呈现出阳性的剂量响应，这是一种DNA病毒，这表明H151或cGAS-STING在T细胞中可能具有不同的功能(图4d)。事实上，众所周知，H151的功能是阻止STING的棕榈酰化，在先天免疫细胞(如巨噬细胞)中干扰素依赖的信号通路激活非常重要。然而，在T细胞中，STING的棕榈酰化对于与STING相关的细胞死亡并非必不可少。然后，我们使用siRNA进行瞬时STING敲降(图5a)。STING减弱的T细胞在DNA电转后显示出升高的细胞存活率(图5b)。虽然siRNA策略可以挽救DNA造成的细胞丢失，但二次电转递送siRNA在各组中都未有较好的耐受，如在MOCK EP对照中甚至在二次电转后也几乎没有细胞生长(图5c)。
cGAS是一种胞浆DNA感应器，不与细胞核DNA反应。因此，另一种策略是促进DNA的核递送，从而绕过胞浆cGAS感应器的监视。为了实现这一目标，我们对不同的电转缓冲液和程序组合进行了高通量筛选，以在人类原代T细胞中实现DNA的核递送(图1f)。使用转染效率和细胞生长作为指标，我们鉴定了几种具有比商业推荐的Lonza P3缓冲液和EO115程序更强的质粒递送的缓冲液/程序组合(图6a-b)。
在三种电转条件中，BO14缓冲液搭配EO138程序具有最高数量的GFP表达细胞，远远高于商业缓冲液(图6a-b)。然后我们在电穿孔后立即测量了1.35kb的Cy-5标记的dsDNA的细胞分布。细胞分别在BO14缓冲液或P3缓冲液下进行电转，并使用Phalloidin和DAPI染色来标记细胞骨架和细胞核。对400多个细胞的定量分析显示，与基于P3的递送相比，BO14缓冲液具有84.6％的核递送效率，而P3缓冲液则为69.5％。此外，在通过BO14条件递送时，与P3商业缓冲液相比，相同电转程序下的细胞核荧光强度比例也较高，分别为74.1％vs51.3％和52.5％vs 39.6％，分别对应于EO138程序和EO115程序(图1g)。
与增强的核递送一致，经BO14介导的电转处理的细胞，其dsDNA编码EF1α启动子和EGFP的表达，在GFP细胞数量和表达水平上均较商业P3缓冲液更为显著(图1h)。为了确定BO14缓冲液促进的核递送是否能缓解cGAS-STING激活，我们检查了cGAS-STING下游通路。STING磷酸化水平及其下游报告基因IFN-β、ISG56和IP10均下调(图1i和图7a-b)，表明增强的核DNA递送减轻了cGAS-STING免疫应答途径，从而促进了T细胞的存活。
DNA供体的核递送对同源定向修复(HDR)至关重要。我们接下来检测该系统是否能改善CRISPR/Cas9介导的靶向插入。我们选择了五个不同的位点，并测试了三种基因插入策略，包括靶向外显子或内含子，或插入由EF1a启动的EGFP(图8a-c)。在测试的五个不同位点中，基于BO14的非病毒递送相比于基于商业P3 dsDNA模板递送，在绝对靶向插入细胞数量上显示出约2-5倍增加(图2a和图8a-c)。先前的研究表明，供体模板修饰可以极大地提高HDR效率。为了确定我们的系统是否与DNA供体修饰兼容，我们合成了5'磷酸硫酸酯(PS)或5'PS和C6-聚乙二醇10(PEG)双修饰引物，并应用修饰引物生成5'修饰的DNA供体。我们观察到当供体用5'PS和PEG修饰时，靶向插入率和插入细胞数均适度但具有统计学意义的增加(图2b)，表明基于BO14递送对供体DNA修饰是兼容的，且无明显的细胞毒性。
BO14缓冲液由基础缓冲液B与opti-mem以1∶4的比例混合而成。为了确定在介导核递送中起关键作用的主要成分，我们逐一减去opti-mem中可能重要的成分，并逐一添加回基础缓冲液B。尽管每个成分相比于单独的基础缓冲液都显示出轻微的插入率增加，但所有五个成分的混合物(肌醇、硝酸钙、丙酮酸钠、葡萄糖、GlutaMAX，统称为“ICSGG”)显示出与BO14缓冲液相当的插入率和细胞数量(图2c)。因此，我们现在有了B+ICSGG电穿孔缓冲液的定义组成，以及类似的B+2xICSGG电穿孔缓冲液(表2)。
表2.组合缓冲液中的主要成分
成分 BO14 BO11 B-ICSGG B-2xICSGG
i-肌醇 19.04mg/L 11.9mg/L 23.8mg/L 47.6mg/L
Ca(NO3)2.4H2O 40mg/L 25mg/L 100mg/L 200mg/L
丙酮酸钠 22mg/L 13.75mg/L 27.5mg/L 55mg/L
D-葡萄糖 2060.4g/L 1287.75g/L 1801mg/L 3602g/L
L-谷氨酰胺 266mg/L 166mg/L 0 0
GlutaMAX 0 0 434mg/L 868mg/L
NaCl 5198.38mg/L 3248.99mg/L 0 0
嵌合抗原受体(CAR)重编程的T细胞是治疗多种血液恶性肿瘤的重要免疫疗法。最近的CAR-T细胞重编程研究发现，利用CRISPR/Cas9和腺相关病毒载体递送供体模板在内源TRAC位点中特异性插入CAR，相比于传统的lentivirus转导方法，可以提高功能性。
为了扩大我们系统的使用范围，我们将CD19特异性19BBz CAR构建插入TRAC位点，以便CAR的表达位于内源启动子(图9a)。具体来说，通过同源重组，将一个3kb的dsDNA与靶向TRAC位点的Cas9 RNP复合物一同电转，以实现CD19BBz CAR的位点特异性插入。我们观察到通过BO14介导的递送，CAR-T插入率可达32％，而通过P3缓冲液只有12％(图2d和图9b)，通过B+ICSGG介导的递送，CAR-T插入率可达47％。由BO14介导的电转产生的绝对CAR-T细胞数量也比P3介导的电转多2-5倍，表明BO14引起的毒性降低(图2d)，而通过B+ICSGG介导的电转可高达21倍。值得注意的是，本研究中使用的DNA模板量为1-2μg/每次，比先前报道的低4-5倍。这可以极大地简化生产过程，因为低剂量的DNA供体仍然可以获得高效的CAR-T细胞。为了测试新缓冲液是否会影响T细胞的适应性，我们比较了在P3或B+ICSGG缓冲液中电穿孔的人T细胞的增殖能力、分泌细胞因子(IFN-γ、IL9、TNFα)的能力以及耗竭标志物(PD1、LAG3、TIM3和CD154)。我们在EO115或EO138程序下模拟了T细胞电转后7天内的增殖，并发现细胞的存活和生长情况相似。在电转后6小时或24小时，对耗竭标志物和细胞因子的qPCR分析未发现缓冲液之间的任何差异。总体而言，这些数据显示，新的缓冲液介导的转孔能够生成高效的CAR-T细胞，而对T细胞适应性没有明显影响。
接下来，为了确定BO14介导的CAR-T靶插入是否具有功能性，我们将非病毒介导的方法与AAV介导的供体递送进行了比较。在两种情况下，CAR序列和RNP都相同，以遵循相同的整合策略。唯一的区别在于供体模板的递送方式。在非病毒介导的方法中，5'PS-PEG修饰的dsDNA与RNP一同电转，而在AAV介导的递送中，先电转RNP，然后加入AAV。相等数量的CAR-T细胞与表达CD19抗原的肿瘤细胞Nalm6-luciferase细胞或Nalm6-CD19 KO细胞进行共培养。当以5∶1比例孵育CAR-T与肿瘤细胞时，所有肿瘤细胞都被非病毒递送的CAR或AAV-CAR杀死；当以1∶1比例孵育时，BO14 CAR-T中剩余的肿瘤细胞比AAV-CAR多五倍，表明BO14生成的CAR-T的肿瘤杀伤效能等于或高于AAV-CAR(图2e)。
同样，B+ICSGG缓冲液也进行了非病毒递送测试，与AAV或lentivirus介导的递送进行了比较。在lentivirus介导的递送中，使用相同的CAR序列和纯化的lentivirus(MOI＝10)来感染人类T细胞。与lentivirus-CAR、AAV-CAR或P3-CAR相比，B+ICSGG-CAR在所有方法中表现出最高的CAR表达强度，并且在CAR-T阳性百分比方面显著优于lentivirus或基于P3的方法。长期跟踪CAR-T生产还显示，绝对数量上B+ICSGG-CAR T超过了lentivirus的数量。
非病毒递送的CAR具有更高的裂解效率，可能是由于TNF-α(抗肿瘤细胞因子)分泌水平较高(图2f和图9c)所致。最后，我们通过将等量的BO14-CAR T细胞或AAV-CAR T细胞移植到携带Nalm6肿瘤细胞的NCG小鼠中，确定了BO14生成的CAR-T细胞在体内具有抗肿瘤功能。CAR T注射后12天，注射BO14-CAR T细胞的小鼠的肿瘤负担减少了1.6倍，而注射AAV-CAR的动物则与体外杀伤结果一致(图2g)，并延长了生存时间(图2h)。综合这些数据表明，非病毒核靶向DNA递送能够产生大量且高质量的CAR-T细胞。
总的来说，这个例子描述了一种通过改善dsDNA的核递送来减轻cGAS-STING激活的简单而有效的非病毒基因工程策略。通过对比五种不同的修复模板DNA格式，我们发现与ssDNA、dsODN或ssODN相比，质粒和dsDNA是T细胞的死亡和cGAS-STING激活的主要原因(图1a-d)。对cGAS或STING进行基因干预可以挽救细胞死亡表型，并使其对DNA刺激具有耐受性，表明减弱cGAS-STING激活是有效解决非病毒基因编辑的关键方案(图1e)。尽管ssDNA只引发轻微的免疫反应和细胞死亡，但ssDNA可能会被内源脱氨酶突变，而且难以制备。因此，ssDNA可能不适合作为CAR-T工程的供体材料。
为了减轻STING的激活，我们系统地优化了电转系统，并确定了一种新的缓冲液BO14，显示出对dsDNA的核递送增强和cGAS-STING激活减少。新方法在人类T细胞中多个位点上表现出2-5倍的靶向插入(图2a)。通过BO14制备的的CAR T细胞插入率增加高达2倍，而绝对CAR-T细胞数量比基于商业的非病毒系统高出5倍。(图2d)。值得注意的是，BO14-CAR T细胞的抗肿瘤杀伤活性比通过AAV基因递送产生的CAR T细胞要强，可能是由于BO14-CAR T细胞分泌TNF-α水平更高(图2e-f)。
目前的方法在以下几个方面具有优势(图15)：1)增强的KI效率，2)通过减少对细胞的损伤来增加总的敲入，从而无需进一步的细胞富集，3)更高的肿瘤细胞杀伤活性，和4)更短工作的流程，在临床使用中得以快速制备。缓冲液优化可以增强靶向插入，为改善非病毒介导的基因编辑开辟了新的方向。
第2例：在其他细胞中测试基因递送
该示例测试了开发的缓冲液及其变体在各种类型细胞中进行靶向核递送DNA的使用。
新的电转(EP)方案，例如BO缓冲液与相应程序一起使用，用于递送质粒和RNP至293T细胞。正如在示例1中所示，BO14缓冲液包含基础缓冲液B与opti-mem以1∶4的比例混合。同样，BO11缓冲液包含基础缓冲液B与opti-mem以1∶1的比例混合。
如图10A-F所示，BO11在EO115和EW113程序下，与商业化的Lonza缓冲液(SF)相比，显著提高了293T细胞中的基因递送效率。
同样，将基于BO11缓冲液的新EP方法用于向U-2OS、jurkat和Raw264.7细胞系递送基因。如图11A-C所示，与商业缓冲液相比，此方法表现出更高的递送效率。
在另一项实验中，将EP方法(包括BO11和BO14)用于向小鼠原代T细胞和巨噬细胞递送RNP。如图12A-F所示，结果也表现出较高效率。
此外，进行了一项测试，以在Jurkat细胞中递送DNA，介导基于Cas9的HDR。如图13A-B所示，BP11缓冲液的效果明显优于商业缓冲液。
第3例：人类造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的mRNA递送
测试了在人类造血干细胞和祖细胞(HSPC)中，开发的缓冲液对递送mRNA的效率增加。
本例中使用了缓冲液BO11(1份缓冲液B和1份Opti-mem)。与商业标准(P3-Lonza)相比，BO11在将mRNA递送至HSPC核内方面实现三倍的增加。
使用GFP mRNA在人类CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPCs)中优化了BO11、BO14、AO41和P3的电转(EP)条件(图14a-b)。通过流式细胞术分析EP后12小时的中位荧光强度(MFI)和GFP阳性细胞数量。BO11在DG135电转程序下荧光强度增加三倍(图14c)，且与P3数量相当的转染细胞(图14d)。
第4例：渗透压对mRNA递送的影响
本例发现，虽然缓冲液的等渗渗透压(约300mOsmol/kg)对dsDNA递送效率最佳，但至少需要330mOsmol/kg的渗透压才能实现RNA的高效递送。
首先，测试了电转缓冲液的渗透压对递送0.5μg编码GFP的dsDNA至原代小鼠T细胞的影响。测试的缓冲液的渗透压范围从190到512m Osmol/kg。如图16所示，随着渗透压的增加，转染效率(图16B)和荧光强度(图16C)下降，但存活率升高(图16D)。只有在大约等渗渗透压(约300mOsmol/kg)下，才能得到最高的GFP阳性细胞结果(图16A)。
其次，测试了一系列渗透压(158-500mOsmol/kg)的电转缓冲液，将其用于电转0.5μg编码GFP的mRNA至Jurkat细胞。当电转缓冲液的渗透压在330mOsmol/kg以上时，MFI显着增强(图17A)和存活率略微增加(图17A)。因此，这些数据表明，高渗透压促进了mRNA的递送。
重复此实验，将0.5μg编码GFP的mRNA递送至原代人类T细胞，得到类似的结果。当电转缓冲液的渗透压在330mOsmol/kg以上时，GFP阳性细胞(图18A)和MFI(图18B)显著增强，同时细胞存活率略有增加(图18C)。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的含义相同。
本文所描述的发明可以在没有明确披露的任何元素、限制的情况下适当实施。因此，例如，“包括”、“包含”、“含有”等术语应该被广泛阅读，没有限制。此外，本文使用的术语和表达方式是作为描述而非限制的术语，在使用这些术语和表达方式时并没有排除所示和描述的特征或其部分的任何等效物的意图，但承认在权利要求的发明范围内存在各种修改的可能性。
因此，应当理解，尽管本发明已通过优选实施方式和可选特征进行了具体披露，但技术领域的专业人员可以通过对所述发明所包含的材料、方法和示例进行修改、改进和变化，这样的修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。在这里提供的材料、方法和示例是优选实施方式的代表，是示例的，并不意味着对本发明范围的限制。
本发明在此被广泛和一般性地描述。在通用披露范围内的较窄物种和更一般性分组也构成本发明的一部分。这包括对发明的通用描述，以及通过保留性描述或负面限制从该类中移除任何主题的通用描述，无论被移除的材料是否在本文中被具体列举。
此外，当描述发明的特征或方面时涉及到Markush群组时，技术领域的专业人员将认识到，发明也因此在Markush群组的任何单个成员或子群组的术语中进行了描述。
本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均被明确地整体引用，其引用程度与每个文献被单独引用时的程度相同。如果存在冲突，将以本规范为准，包括其中的定义。
应理解，虽然本披露是与上述实施方式一同描述的，但前述描述和示例旨在说明，而非限制披露的范围。在本发明涉及的技术领域，其他在披露范围内的方面、优点和修改将对熟悉本发明的技术领域的人员而言是显而易见的。

Claims (36)

1.一种水溶液，包括琥珀酸盐、甘露醇，和葡萄糖、蔗糖和肌醇中的一种糖，谷氨酰胺或其类似物，以及抗氧化剂。
2.权利要求1所述的水溶液，其中糖为D-葡萄糖。
3.权利要求1或2所述的水溶液，其中谷氨酰胺或其类似物从L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、L-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺中选择。
4.前述任意权利要求所述的水溶液，其中琥珀酸盐为琥珀酸钠、琥珀酸钾或琥珀酸镁。
5.前述任意权利要求所述的水溶液，其中抗氧化剂为丙酮酸钠或乙酰半胱氨酸。
6.前述任意权利要求所述的水溶液，还包括Na2HPO4和NaH2PO4。
7.前述任意权利要求所述的水溶液，还包括血清。
8.前述任意权利要求所述的水溶液，其中包含浓度低于80mM的NaCl，或最好低于70mM、60mM或50mM NaCl。
9.权利要求8所述的水溶液，其中包括浓度为5mM至30mM的琥珀酸钠，浓度为1mM至30mM的甘露醇，浓度为3mM至30mM的葡萄糖，浓度为50mg/L至900mg/L的L-谷氨酰胺或L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，浓度为0.1mM至0.6mM的丙酮酸钠，并且包含低于60mM的NaCl。
10.一种将多聚核苷酸递送至细胞的方法，在权利要求1-9所述的任何一种水溶液中进行，包括将电脉冲施加于包含多聚核苷酸和细胞的样品上。
11.一种将多聚核苷酸递送至细胞的方法，包括将电脉冲施加于包含多聚核苷酸和细胞的样品中，所述样品置于包含浓度低于80mM NaCl的培养基中，或最好低于70mM、60mM或50mM NaCl的培养基中。
12.权利要求11所述方法中，培养基包括琥珀酸盐、甘露醇、一种糖、谷氨酰胺或其类似物，以及一种抗氧化剂。
13.权利要求10-12任意一条所述方法中，多聚核苷酸是DNA或RNA。
14.权利要求13所述方法中，DNA是单链DNA或双链DNA。
15.权利要求13所述方法中，RNA是siRNA、sgRNA、信使RNA或双链RNA、反义RNA、tRNA或RNA适配体。
16.权利要求15所述方法中，RNA以RNA蛋白复合物的形式提供。
17.权利要求10-16任意一条所述方法中，细胞是哺乳动物细胞。
18.权利要求17所述方法中，培养基中还包括抑制cGAS-STING通路的药剂。
19.权利要求18所述方法中，药剂为靶向cGAS或STING蛋白的siRNA或抗体。
20.利用权利要求10-19任意一条所述方法，使多聚核苷酸进入细胞核中。
21.一种将生物分子递送至细胞的方法，包括在渗透压高于310mOsmol/kg的水溶液中，将电脉冲施加于包含生物分子和细胞的样品中，其中生物分子可以是RNA分子、蛋白质或它们的组合。
22.权利要求21所述方法中，其中水溶液的渗透压高于320mOsmol/kg、330mOsmol/kg、340mOsmol/kg或350mOsmol/kg。
23.权利要求21或22所述方法中，渗透压低于600渗透压。
24.权利要求21-23任意一条所述方法中，水溶液符合权利要求1-9中的任何一项。
25.权利要求21-24任意一条所述方法中，水溶液包括用于调整水溶液渗透压的非电解质溶剂。
26.权利要求25所述方法中，非电解质溶剂组分从葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、海藻糖、甘油、PEG300、PEG400、PEG600、甘氨酸、脯氨酸、牛磺酸、甜菜碱和硼酸等中选择。
27.权利要求25或26所述方法中，非电解质溶液的浓度为10mM至300mM、20mM至300mM、30mM至300mM、40mM至300mM、50mM至300mM、10mM至200mM、20mM至200mM、30mM至200mM、40mM至200mM、50mM至200mM、10mM至100mM、20mM至100mM、30mM至100mM、40mM至100mM或50mM至100mM。
28.权利要求21-24任意一条所述方法中，水溶液包括用于调整水溶液渗透压的电解质溶剂。
29.权利要求28所述方法中，电解质溶剂组分从NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、Ca(NO3)2、MgSO4和NaHCO3等中选择。
30.权利要求28或29所述方法中，其中非电解质溶液的浓度为3mM至90mM，4mM至90mM，5mM至90mM，6mM至90mM，7mM至90mM，8mM至90mM，9mM至90mM，10mM至90mM，15mM至90mM，20mM至90mM，3mM至60mM，4mM至60mM，5mM至60mM，6mM至60mM，7mM至60mM，8mM至60mM，9mM至60mM，10mM至60mM，15mM至60mM，20mM至60mM，3mM至40mM，4mM至40mM，5mM至40mM，6mM至40mM，7mM至40mM，8mM至40mM，9mM至40mM，10mM至40mM，15mM至40mM，20mM至40mM，3mM至20mM，4mM至20mM，5mM至20mM，6mM至20mM，7mM至20mM，8mM至20mM，9mM至20mM，10mM至20mM，15mM至20mM。
31.权利要求21-30中任意一条所述方法中，水溶液的pH为7至7.4。
32.权利要求21-30中任意一条所述方法中，生物分子为siRNA、sgRNA、信使RNA、双链RNA、反义RNA、tRNA或RNA适配体。
33.权利要求21-30中任意一条所述方法中，生物分子为蛋白质或RNA-蛋白质复合物。
34.一种将DNA分子递送至细胞的方法，包括将电脉冲施加于包含DNA分子和细胞的样品中，所述样品置于渗透压在270至330mOsmol/kg之间的水溶液中。
35.权利要求34所述方法中，渗透压抑制了细胞中的cGAS-STING激活。
36.权利要求34或35所述方法中，DNA为双链DNA。
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