ES2900560T3 - Terapia génica. - Google Patents

Abstract

Uso de ciclosporina H (CsH) para aumentar la eficiencia de la transducción de una población aislada de células por un vector viral y, opcionalmente, aumentar la eficiencia de la edición de genes de la población aislada de células transducidas por el vector viral, donde el vector viral está pseudotipado para entrar en las células a través de un mecanismo dependiente de endocitosis y/o donde el vector viral es un vector pseudotipado de VSV-g.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia génica

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la modificación genética de células. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de compuestos para mejorar la transducción de células por vectores virales y para mejorar la edición de genes de células.

Antecedentes de la invención

El sistema hematopoyético es una jerarquía compleja de células de diferentes linajes celulares maduros. Estos incluyen células del sistema inmunológico que ofrecen protección contra patógenos, células que transportan oxígeno a través del cuerpo y células involucradas en la cicatrización de heridas. Todas estas células maduras se derivan de un conjunto de células madre hematopoyéticas (HSC por sus siglas en inglés) que son capaces de autorrenovarse y diferenciarse en cualquier linaje de células sanguíneas. Las HSC tienen la capacidad de reponer todo el sistema hematopoyético.

El trasplante de células hematopoyéticas (HCT por sus siglas en inglés) es una terapia curativa para varios trastornos heredados y adquiridos. Sin embargo, el HCT alogénico está limitado por la escasa disponibilidad de donantes compatibles, la mortalidad asociada con el procedimiento alogénico, que se relaciona principalmente con la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD por sus siglas en inglés), y las complicaciones infecciosas provocadas por el profundo y duradero estado de disfunción de inmunidad.

Los enfoques de terapia génica basados en el trasplante de HSC autólogas modificadas genéticamente ofrecen una seguridad y eficacia potencialmente mejoradas sobre el HCT alogénico. Son particularmente relevantes para los pacientes que carecen de un donante compatible.

El concepto de terapia génica con células madre se basa en la modificación genética de un número relativamente pequeño de células madre. Éstas persisten a largo plazo en el cuerpo mediante la autorrenovación y generan un gran número de progenie genéticamente "corregida". Esto asegura un suministro continuo de células corregidas durante el resto de la vida del paciente. Las células madre hematopoyéticas son dianas particularmente atractivas para la terapia génica, ya que su modificación genética se transmitirá a todos los linajes de células sanguíneas a medida que se diferencien. Además, las HSC pueden obtenerse de forma fácil y segura, por ejemplo, de la médula ósea, la sangre periférica movilizada y la sangre del cordón umbilical.

La modificación génica eficaz a largo plazo de las HSC y su progenie requiere una tecnología que permita la integración estable del ADN correctivo en el genoma, sin afectar la función de las HSC. En consecuencia, el uso de la integración de sistemas virales recombinantes tales como Y-retrovirus, lentivirus y espumavirus ha dominado este campo (Chang, A.H. et al. (2007) Mol. El r. 15: 445-456). Ya se han logrado beneficios terapéuticos en ensayos clínicos basados en yretrovirus para la inmunodeficiencia combinada grave de adenosina desaminasa (ADA-SClD por sus siglas en inglés; Aiuti, A. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 360: 447-458), inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (SCID-X1 por sus siglas en inglés; Hacein-Bey-Abina, S. et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 355-364) y síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS por sus siglas en inglés; Boztug, K. et al. (2010) N. Engl. J. Med. 363: 1918-1927). Además, se han empleado lentivirus como vehículos de administración en el tratamiento de la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD por sus siglas en inglés; Cartier, N. et al. (2009) Science 326: 818-823), y muy recientemente para la leucodistrofia metacromática (MLD por sus siglas en inglés; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158) y WAS (Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151). No obstante, aunque los lentivirus se encuentran entre las mejores plataformas disponibles para la transducción celular, persisten dificultades con los métodos empleados para la modificación genética de células, en particular células madre y progenitoras hematopoyéticas. Por ejemplo, para que la terapia génica sea eficaz, se debe lograr una transferencia génica eficaz a las células diana sin inducir efectos perjudiciales sobre sus propiedades biológicas.

Muchos métodos existentes exhiben una permisividad de células diana subóptima, ya que pueden requerirse altas dosis de vector, tiempos de transducción prolongados y cultivo ex vivo para alcanzar niveles de transducción clínicamente relevantes. Esto sigue siendo un obstáculo para el campo, ya que puede dar lugar a producciones de vectores a gran escala engorrosas, costosas y no siempre sostenibles y comprometer la calidad celular debido a protocolos prolongados de transducción ex vivo.

Entre los efectos secundarios notificados en los ensayos de terapia génica, la neutropenia prolongada debido al injerto retardado de células modificadas ex vivo es la principal causa de morbilidad y mortalidad relacionadas con el tratamiento. El retraso en la recuperación puede deberse al cultivo ex vivo del producto de terapia celular, que normalmente dura más de 60 horas (Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158). La evidencia experimental acumulada sugiere que las células madre y progenitoras hematopoyéticas cultivadas pierden progresivamente el potencial de injerto por reclutamiento en el ciclo celular y pérdida de moléculas de adhesión, lo que impide su localización en el nicho e impulsa el compromiso y la diferenciación del linaje. El aumento de las eficiencias de transducción permitiría en última instancia disminuir la cantidad de vector requerida para la transferencia de genes clínicamente relevante y también acortar el tiempo de cultivo ex vivo. Aunque se ha avanzado en la mejora de los protocolos de transducción, por ejemplo, los inventores han demostrado previamente que se puede lograr una mejora en la eficiencia de la transducción de las células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante el uso de ciclosporina A (documento WO2015162594), sigue habiendo una necesidad de enfoques adicionales para mejorar la modificación genética de células con vectores virales.

Breve descripción de la invención

Los inventores han descubierto sorprendentemente que la ciclosporina H (CsH) se comportó mucho mejor que la ciclosporina A para mejorar la transducción de células, incluidas las células madre y progenitoras hematopoyéticas. CsH proporcionó una eficiencia de transducción de casi el 100% y hasta 3 copias de vector por genoma después de una sola aplicación ("golpe") del vector lentiviral con una multiplicidad moderada de infección de 10. Estos hallazgos se realizaron en las células madre y progenitoras hematopoyéticas derivadas de sangre periférica movilizadas clínicamente relevantes, y se observó que la CsH no produjo un efecto perjudicial sobre las propiedades biológicas de las células. Los inventores también encontraron que se mantenían altos niveles de transducción in vivo en células madre y progenitoras hematopoyéticas de repoblación a largo plazo y, además, se encontró que la CsH superaba la restricción lentiviral inducida por IFN basal y de tipo I en estas células. También se descubrió que los efectos de la CsH mejoraban aún más cuando se combinaban con otros compuestos de acción temprana como la rapamicina y la prostaglandina E2. Además, los inventores encontraron que CsH aumentaba la eficiencia de transducción en células madre y progenitoras hematopoyéticas no estimuladas, en células T activadas y cuando se usaba un vector lentiviral defectuoso en integrasa (IDLV por sus siglas en inglés). La CsH también mejoró la eficacia del direccionamiento génico en células madre y progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas, particularmente en la fracción CD34++CD133+CD90 más primitiva. Además, la CsH podría usarse para reducir la dosis de IDLV durante la transducción sin comprometer la eficacia del direccionamiento en las células T humanas primarias.

La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización, el uso es para aumentar la eficiencia de la transducción de una población aislada de células por un vector viral y, opcionalmente, aumentar la eficiencia de la edición de genes de la población aislada de células transducidas por el vector viral, donde el vector viral está pseudotipado para entrar en las células a través de un mecanismo dependiente de endocitosis y/o donde el vector viral es un vector pseudotipado de VSV-g. Preferiblemente, el vector viral es un vector no integrante (por ejemplo, un vector lentiviral de integración defectuosa, IDLV).

En una realización, la edición de genes usa una o más nucleasas con dedos de zinc, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN por sus siglas en inglés) y/o sistemas CRISPR/Cas.

En una realización, las células son células madre y/o progenitoras hematopoyéticas. En otra realización, las células son células T. En una realización, las células T son células T CD4+. En una realización, las células T son células T CD3+. En una realización, la población aislada de células comprende células CD34++ CD38-.

En una realización preferida, las células son células humanas.

En una realización, las células son células estimuladas. En otra realización, las células son células no estimuladas. En una realización, el vector viral es un vector retroviral. En una realización preferida, el vector viral es un vector lentiviral.

En una realización, el vector lentiviral se deriva de VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV o lentivirus visna. En una realización preferida, el vector lentiviral se deriva del VIH-1. El vector derivado de VIH-1 puede derivar, por ejemplo, de cualquiera de las cepas de VIH-1 NL4-3, IIIB_LAI o HXB2_LAI (X4-tropico), o BAL (R5-tropico), o una quimera de las mismas.

En una realización, el vector viral es un vector no integrante. En una realización, el vector viral es un vector lentiviral defectuoso en la integración (IDLV), por ejemplo, un vector defectuoso en la integración derivado del VIH-1.

En una realización, el vector viral es un vector gamma-retroviral.

En una realización, el vector se "empareja" con la célula huésped. Por "emparejado" debe entenderse que la cápside del vector se deriva de un virus que infecta naturalmente a un cierto tipo de huésped (por ejemplo, las cápsides del VIH son "emparejadas" con los humanos). Por tanto, en una realización, un vector para uso en células madre y/o progenitoras hematopoyéticas humanas no comprende proteínas de la cápside distintas de las derivadas de un virus de inmunodeficiencia humana.

En una realización preferida, el vector viral es un vector pseudotipado de VSV-g. El vector viral está pseudotipado para entrar en las células a través de un mecanismo dependiente de endocitosis.

En una realización, se incrementa el porcentaje de células transducidas por el vector. En otra realización, se incrementa el número de copias vectoriales por célula. Tanto el porcentaje de células transducidas por el vector como el número de copias del vector por célula pueden incrementarse al mismo tiempo.

En una realización, la eficacia de edición de genes aumenta en células madre hematopoyéticas primitivas. En una realización, la eficacia de edición de genes aumenta en células CD34++CD133+CD90.

En una realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 1-50 |jM. En otra realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 5-50 j M. En otra realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 10-50 j M.

En otra realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 1-40, 5-40 o 10-40 ^j M. En otra realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 1-30, 5-30 o 10-30 j M. En otra realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 1-20, 5-20 o 10-20 j M. En otra realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 1-15, 5-15 o 10-15 ^j M.

En otra realización, la CsH está a una concentración de aproximadamente 1-15, 2-14, 3-13, 4-12, 5-11, 6-10 o 7-9 j M). Por ejemplo, la concentración de CsH puede ser aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 ^j M. En una realización preferida, la concentración de CsH es aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 ^j M. En una realización particularmente preferida, la concentración de CsH es aproximadamente 10 ^j M. En una realización, la población de células se pone en contacto con CsH en combinación con otro agente capaz de aumentar la eficacia de la transducción.

En una realización, la población de células se pone en contacto con CsH en combinación con rapamicina o un derivado de la misma.

En una realización, la población de células se pone en contacto con CsH en combinación con prostaglandina E2 o un derivado de la misma. En una realización preferida, el derivado de prostaglandina E2 es 16-16 dimetil prostaglandina E2.

En una realización, la población de células se pone en contacto con CsH en combinación con estaurosporina o un derivado de la misma.

En una realización, la población de células se pone en contacto con CsH en combinación con rapamicina o un derivado de la misma, y prostaglandina E2 o un derivado de la misma.

En una realización, el método incluye una etapa adicional de enriquecimiento de la población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas. La etapa de enriquecimiento de la población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas se puede llevar a cabo antes de poner en contacto la población de células con CsH. Alternativamente, o adicionalmente, la etapa de enriquecimiento de la población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas se puede llevar a cabo después de transducir la población de células con un vector.

El método también puede incluir etapas de lavado. La etapa de lavado se puede utilizar para eliminar sustancialmente la CsH del medio. La etapa de lavado se puede llevar a cabo después de transducir la población de células con un vector. Alternativamente, o adicionalmente, la etapa de lavado se puede llevar a cabo antes de transducir las células.

En una realización, la población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas se obtiene a partir de sangre periférica movilizada, médula ósea o sangre de cordón umbilical.

En una realización, las células transducidas se administran a un sujeto como parte de un procedimiento de trasplante autólogo de células madre. En otra realización, las células transducidas se administran a un sujeto como parte de un procedimiento de trasplante alogénico de células madre.

Descripción de los dibujos

Figura 1 Protocolos de transducción basados en ciclosporina A (CsA) y rapamicina (Rapa) más cortos en comparación con el estándar clínico actual. (A) Esquema del enfoque experimental que compara los diferentes protocolos de transducción utilizando dos LV de grado clínico y células CD34++ derivadas de la médula ósea (BM por sus siglas en inglés). (B-C) El porcentaje de transducción (TD) y el número de copias de vector (VCN por sus siglas en inglés) por célula, así como (D) el número de unidades formadoras de colonias (CFU (por sus siglas en inglés)-GM, BFU) contadas 14 días después de la siembra se muestran para las células transducidas con LV que codifican IDUA o ARSA. Los datos son la media ±SEM de tres experimentos independientes por triplicado cada uno, los valores de p son para ANOVA unidireccional con comparación múltiple de Bonferonni versus DMSO, * para p <0,05, ** para p <0,01.

Figura 2 Los protocolos de transducción más cortos, en particular en presencia de CsA, mejoran el injerto de HSPC in vivo. (A-B) Análisis de sangre periférica en ratones NSG en diferentes momentos después del trasplante: (A) niveles de injerto evaluados como porcentaje de células CD45++ humanas sobre el total de células mononucleares sanguíneas (eje y) en ratones de diferentes grupos de tratamiento (indicados en el eje x), (B) porcentajes de linajes celulares B, T y mieloides humanos (hCD19+, hCD3+ y hCD13+, respectivamente) dentro de las células CD45++ humanas se muestran a lo largo del tiempo. (C) VCN y (D) niveles de injerto de células CD45++ humanas en la médula ósea (BM) y el bazo se muestran 20 semanas después del trasplante. Todos los valores se expresan como media ±SEM. Los valores p son para ANOVA de una vía con la comparación múltiple de Bonferroni.

Figura 3

CsA conserva las HSC primitivas ex vivo independientemente de la transducción. La composición de la subpoblación de CD34++ HSPC derivadas de BM se midió utilizando la estrategia de activación mostrada en (A) 16 horas y (B) 72 horas después de la transducción en presencia o ausencia de CsA. Los datos representan la media ±SEM de tres experimentos independientes. Los valores p son para ANOVA de una vía con la comparación múltiple de Bonferroni.

Figura 4

CsA reduce la proliferación de HSPC y conserva la quiescencia en cultivo. Las células CD34++ derivadas de BM se tiñeron con un tinte rojo fluorescente que se puede usar para monitorear las divisiones celulares individuales, como se muestra en (A). La intensidad de fluorescencia media (MFI por sus siglas en inglés) del colorante se monitoreó a lo largo del tiempo mediante FACS en la población total de CD34++ (B) y dentro de las diferentes subpoblaciones a (C) 16 horas y (D) 72 horas de cultivo. (E) El estado del ciclo celular y (F) los niveles de ROS de HSPC derivadas de BM se evaluaron en presencia o ausencia de CsA 48 horas después de la transducción. Los datos representan la media ±SEM de tres experimentos independientes. Los valores p son para ANOVA de una vía con la comparación múltiple de Bonferroni.

Figura 5 CsH es un potenciador potente y no tóxico de la transducción del vector lentiviral (LV) en células madre hematopoyéticas.

(A, B) Se transdujeron células CD34++ derivadas de CB humanas con un LV que expresa un ARNhc contra CypA o un control no silenciador a una MOI de 100 y se verificó la eliminación (KD por sus siglas en inglés) de CypA mediante Western blot (A) y por expresión de ARNm (B). Los niveles de CypB se monitorearon como control de la especificidad del ARNi (A, B). (C) El impacto del agotamiento se evaluó luego transduciendo las células con un segundo LV a una MOI de 10 y evaluando la eficiencia de transducción por FACS en términos de células GFP+ y por VCN. (D) Sangre de cordón humano (CB) (media ±SEM; n = 20; ANOVA de una vía con comparación múltiple de Bonferroni, * p<0,05, ** p<0,01, **** p<0,0001), (E) células de sangre periférica movilizada (mPB por sus siglas en inglés) - CD34++ (media ±SEM, n = 4, prueba de Mann Whitney, * p<0,05) o (F) HSPC murina (mHSPC) (media ±SEM, n = 8, prueba de rango con signo de Wilcoxon) , * p = 0,0078) se transdujeron con un VSV-g PGK-GFP/BFP WT LV en una multiplicidad de infección (MOI por sus siglas en inglés) de 1 unidad transductora (TU por sus siglas en inglés)/célula 293T en presencia 0 ausencia de CsA o CsH 8 |^jM. Se evaluaron los porcentajes de células transducidas y el número de copias del vector/genoma humano (VCN(por sus siglas en inglés)/genoma) a los 5 o 14 días después de la transducción, respectivamente. El impacto de CsA y CsH en (G) apoptosis (media ±SEM; n = 6; prueba de Kruskal-Wallis ajustada de Dunn, ns = no significativo) y (H) proliferación celular (media ±SEM; n = 4; prueba de Kruskal-Wallis ajustada de Dunn, * p <0,05) se evaluó en células hCB-CD34++ 48 horas después de la transducción. (K) Las eficiencias de transducción en las diferentes subpoblaciones se midieron en células CB- o mPB-CD34++ humanas transducidas con LV a una MOI de 1 (media ±SEM, n = 4, prueba de Mann Whitney frente a cada DMSO, * p<0,05). (N) Se evaluó la composición y el estado del ciclo celular de las células hCB- o mPB-CD34++ transducidas en presencia de CsH 48 horas después de la transducción. (I,J) Se transdujeron HSPC derivadas de hCB- y mPB- en presencia de diferentes combinaciones de fármacos con LV a una MOI de 1 o 10. (O) Se transdujeron células hCB-CD34++ con un yRV pseudotipado de VSV-g a MOI = 10 con o sin CsH 8 j M (media ±SeM, n = 4, prueba de Mann Whitney, * p <0,05). (L) v Cn recuperado de células mPB-CD34++ transducidas con IDUA-LV de grado clínico a un MOI de 50 14 días después de la transducción in vitro. (M) VCN recuperado de la sangre periférica de ratones NSG- 8 semanas después del trasplante con células mPB-CD34+ humanas transducidas con IDUA-LV de grado clínico a un MOI de 50, representado como un aumento de veces frente al grupo de 2 golpes.

Figura 6 Caracterización de la capacidad de CsH para mejorar la transducción del LV. (A) Los macrófagos humanos derivados de monocitos (MDM por sus siglas en inglés) preexpuestos o no a Vpx (media de ±SEM, n = 3) y (B) se transdujeron células T CD3+ o CD4+ primarias con una MOI de 1 en presencia o ausencia de 8 j M CsA/H (media ±SEM, n = 8, prueba de rango con signo de Wilcoxon frente a DMSO = 1, ** p = 0,0078). (C-H y J-L) células CD34++ humanas de diferentes fuentes se transdujeron con diferentes vectores como se indica, en presencia o ausencia de CsA o CsH y se evaluaron las eficiencias de transducción 5 días después de la transducción. Por ejemplo, las células hCB-CD34++ se transdujeron a una MOI de 50 con un vector LV defectuoso en integrasa (IDLV) con o sin CsH (H). (I) Los intermedios de replicación del círculo de late-RT y 2LTR se midieron en células CB-CD34++ transducidas con un MOI 100 de LV a las 6 o 24 horas después de la transducción (media ±SEM, n>3). Las eficiencias de transducción se evaluaron 5 días después de la transducción. (M, N) Eficiencia de transducción (M) y apoptosis (N) en células CB-CD34++ humanas en presencia de diferentes concentraciones de CsH (media ±SEM, n = 2). Los datos representan la media ±SEM de tres experimentos independientes. Los valores p son para ANOVA de una vía con la comparación múltiple de Bonferroni.

Figura 7 Las ciclosporinas contrarrestan un bloqueo inducible por IFN a la entrada del vector mediada por VSV-g. (A) THP-1 (media ±Se M; n = 10; ANOVA de una vía con comparación múltiple de Bonferroni, * p<0,05, *** p<0,001; prueba de Mann Whitney, m p = 0,0007), (B) K562 (media ±SEM, n = 8) y (C) células CD34++ derivadas de CB humanas (media ±SEM; n = 6; ANOVA de una vía con comparación múltiple de Bonferroni, ** p = 0,0051; prueba de Mann Whitney, $p = 0,02) se preestimularon o no con 1000 Ul/ml de IFNa humano durante 24 horas seguido de transducción con un LV a una MOI de 1 en presencia o ausencia de CsA/H 8 |jM. (D) Células THP-1 preestimuladas con IFNa humano y transducidas con RV anfo-pseudotipado con o sin CsH (media ±SEM, n = 4). (E) THP-1 (media ±SEM, n = 4); y (F) células CD34++ derivadas de C^b humanas (media ±SEM, n>4) fueron preestimuladas o no con IFNa durante 24 horas seguido de transducción con un BaEV-TR LV a una MOI de 0,5-1 en presencia o ausencia de CsA/H. Las eficiencias de transducción se evaluaron mediante FACS 5 días después de la transducción.

La Figura 8 CsH aumenta la edición de genes en HSPC humanas y murinas. (A) El porcentaje de subpoblaciones de CD34+ derivadas de CB humanas GFP+ editadas genéticamente o Lin-HSPC murinas se evaluó 3 días después de la nucleofección. (B) La composición de la subpoblación de CB-CD34+ se evaluó mediante FACS 3 días después de la nucleofección. Los datos representan la media ±SEM de dos experimentos independientes.

La Figura 9 CsA no altera los perfiles de integración del LV en la HSPC humana. Los sitios de integración lentiviral se recuperaron del ADN genómico extraído de las HSPC CD34+ derivadas de CB transducidas a una MOI de 100 en presencia o ausencia de CsA. La distribución del genoma de los sitios de integración identificados (IS por sus siglas en inglés) se muestra en el diagrama de circos. El genoma humano está representado por los cromosomas 1 a 22, x y y en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior (círculo exterior). El círculo central representa todos los IS con su abundancia reflejada en la altura del pico con picos verdes correspondientes a IS de las células transducidas de control y rojos a los de las células transducidas en presencia de CsA. Los histogramas azules dentro del círculo interior representan la importancia de la diferencia entre los dos grupos (DMSO v. CsA), cuanto más alto es el histograma, más significativa es la diferencia. La banda roja se establece en el umbral de p <0,1 y los histogramas que la cruzan pueden considerarse significativos.

Figura 10 CsH aumenta la transferencia de genes y la edición en HSPC humanas repobladas por SCID a largo plazo. (A) Esquema experimental de los diferentes protocolos de transducción utilizando un LV de grado clínico y células CD34+ derivadas de mPB humana. (B) El número de unidades formadoras de colonias (CFU) mieloides y eritroides se evaluó in vitro (media ±SEM; n = 8; prueba de Kruskal-Wallis ajustada de Dunn frente a 2golpes CFU totales, *p< 0,05). (C) VCN/genoma se midieron en la médula ósea (BM) a las 18 semanas (media ±SEM; n = 8; Kruskal-Wallis ajustado de Dunn, *p<0,05, ***p<0,001). (D, E) Los niveles de injerto se evaluaron como porcentaje de células CD45+ humanas sobre el total de células mononucleares sanguíneas (eje y) en la sangre periférica de ratones de diferentes grupos de tratamiento (indicado en el eje x) (media ±SEM; n>11; Kruskal-Wallis ajustado de Dunn, ns = no significativo). (F) Los niveles de injerto de células CD45+ humanas en la BM se muestran 18 semanas después del trasplante (media ±SEM; n>11; Kruskal-Wallis ajustado por Dunn, **p<0,01). (G) Esquema del protocolo de edición de genes para células CD34+ derivadas de CB humanas. (H) Porcentaje de células editadas medidas dentro de las subpoblaciones indicadas 3 días después de la edición (media ±SEM; n = 7, prueba de Mann-Whitney, *p<0,05, *p<0,05). (I) Injerto de células CD45+ humanas en sangre periférica (PB por sus siglas en inglés) en los momentos indicados después del trasplante de células CB-CD34+ editadas (n = 5). (J) Porcentaje de edición de genes por reparación impulsada por homología (HDR por sus siglas en inglés) medido dentro de células humanas en ratones de (I). (K) Porcentaje de células editadas con genes humanos y eficiencia de edición en la BM de ratones de (J).

Figura 11 La CsH aumenta la transducción de LV y las eficiencias de edición de genes en las HSPC que repueblan SCID. Se transdujeron células CD34+ derivadas de mPB humana con un LV de grado clínico comparando diferentes protocolos de transducción. Se midieron VCN/genoma en (A) cultivo líquido (LC por sus siglas en inglés) y (B) CFU a granel 14 días después de la transducción (media ±SEM, n = 2). (C) VCN/genoma se midieron en la sangre periférica (PB) de ratones NSG 8 semanas después del trasplante (media ±SEM, n>4, prueba de Kruskal-Wallis ajustada de Dunn, *p<0,05, ***p<0,001). (D) VCN y (E) niveles de injerto de células CD45+ humanas en el bazo (SPL) se muestran 18 semanas después del trasplante (media ±SEM, n>6; prueba de Kruskal-Wallis ajustada de Dunn, **p<0,01, ***p< 0,001). (F) Los porcentajes de linajes de células B humanas y mieloides (hCD19+ y hCD33+ respectivamente) dentro de células CD45+ humanas se muestran en la médula ósea (BM) de ratones a las 18 semanas. (G) Composición de subpoblación de células CB-CD34+ humanas tratadas de la Figura 10J medida por citometría de flujo 3 días después de la electroporación (n = 7). (H) Eficiencia de edición medida por ddPCR en células CD34+ HSPC, CD19+ B y CD33+ mieloides clasificadas de ratones en la Figura 10K 19 semanas después del trasplante (Prueba de Mann-Whitney). (I) Porcentaje de las subpoblaciones indicadas medidas dentro de las células humanas injertadas en la BM de los ratones de la Figura 10K.

Figura 12 Las ciclosporinas contrarrestan un bloqueo de restricción lentiviral inducible por IFN también en HSPC. (A) Las células THP-1 eliminadas en FPR1 se transdujeron con un LV a MOI 1 /- 8 ^j M CsH. Las eficiencias de transducción se evaluaron mediante FACS 5 días después de la segunda transducción (media ±SEM, n = 4, prueba de Mann Whitney frente a cada control DMSO, *p<0,05). Células (B) THP-1, (C) K562 y (D) CD34+ derivadas de CB fueron preestimuladas con 1000 UI/mL de IFNa humano durante 24 horas seguidas de transducción solo para HSPC humana con LV a una MOI de 1 en presencia o ausencia de CsA/H 8 |jM. La regulación al alza de genes seleccionados estimulados por IFN (ISG por sus siglas en inglés) se evaluó mediante RT-qPCR (media ±SEM, n = 2-3).

Descripción detallada de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

Los términos "que comprende", "comprende" y "compuesto por", como se usan en el presente documento, son sinónimos de "que incluye" o "incluye"; o "conteniendo" o "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen miembros, elementos o pasos adicionales no enumerados. Los términos "que comprende", "comprende" y "compuesto por" también incluyen el término "que consiste en".

En un aspecto, la invención proporciona el uso de ciclosporina H (CsH) para aumentar la eficiencia de transducción de una población aislada de células por un vector viral y, opcionalmente, aumentar la eficiencia de edición de genes de la población aislada de células transducidas por el vector viral, donde el vector viral está pseudotipado para entrar en las células mediante un mecanismo dependiente de endocitosis y/o donde el vector viral es un vector pseudotipado de VSV-g.

El aumento de la eficiencia de la transducción se refiere a un aumento en la transducción de las células (por ejemplo, células madre hematopoyéticas y/o células progenitoras; o células T) en presencia de un agente (por ejemplo, CsH o un derivado del mismo), en comparación con la transducción lograda en ausencia del agente, pero bajo condiciones sustancialmente idénticas por lo demás. Por lo tanto, una mayor eficiencia de la transducción puede permitir que se reduzca la multiplicidad de infección (MOI) y/o el tiempo de transducción requerido para lograr una transducción eficaz. En una realización, se incrementa el porcentaje de células transducidas por el vector. En otra realización, se incrementa el número de copias vectoriales por célula. Preferiblemente, ambos se logran al mismo tiempo.

Se conocen en la técnica métodos para determinar el porcentaje de células transducidas por un vector. Los métodos adecuados incluyen citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS por sus siglas en inglés) y microscopía de fluorescencia. La técnica empleada es preferiblemente una que sea susceptible de automatización y/o cribado de alto rendimiento.

Por ejemplo, una población de células puede transducirse con un vector que alberga un gen reportero. El vector puede construirse de manera que el gen reportero se exprese cuando el vector transduzca una célula. Los genes reporteros adecuados incluyen genes que codifican proteínas fluorescentes, por ejemplo, proteínas fluorescentes verde, amarillo, cereza, cian o naranja. Una vez que la población de células ha sido transducida por el vector, tanto el número de células que expresan como el que no expresan el gen reportero puede cuantificarse usando una técnica adecuada, tal como FACS. A continuación, se puede calcular el porcentaje de células transducidas por el vector.

Alternativamente, se puede usar PCR cuantitativa (qPCR) para determinar el porcentaje de células transducidas por un vector que no alberga un gen reportero. Por ejemplo, pueden seleccionarse colonias individuales de células (por ejemplo, células CD34+) de un cultivo semisólido y puede realizarse qPCR en cada colonia por separado para determinar el porcentaje de colonias positivas para el vector entre las analizadas.

También se conocen en la técnica métodos para determinar el número de copias del vector. La técnica empleada es preferiblemente una que sea susceptible de automatización y/o cribado de alto rendimiento. Las técnicas adecuadas incluyen PCR cuantitativa (qPCR) y enfoques basados en transferencia Southern.

El aumento de la eficiencia de la edición de genes puede referirse a un aumento en el número de células (por ejemplo, células madre hematopoyéticas y/o células progenitoras; o células T) en las que se ha editado un gen o sitio diana (por ejemplo, interrumpido, reemplazado, eliminado o tenía una secuencia de ácido nucleico insertada dentro o en ella) de la manera deseada después de la transducción de una población de células con un vector viral en presencia de un agente (por ejemplo, CsH o un derivado del mismo), en comparación con lo logrado en ausencia del agente pero en condiciones sustancialmente idénticas por lo demás. Por lo tanto, una mayor eficiencia de la edición de genes puede permitir que se reduzca la multiplicidad de infecciones (MOI) y/o el tiempo de transducción requerido para lograr una edición de genes eficaz. Los métodos para determinar si se ha editado un gen o sitio diana se conocen en la técnica. En el contexto de la edición de genes, por ejemplo, usando un sistema CRISPR/Cas, preferiblemente el vector usado para transducir la población de células es un vector no integrante (por ejemplo, un vector lentiviral de integración defectuosa, IDLV).

Ciclosporina H

La ciclosporina H (CsH, CAS No. 83602-39-5) es un undecapéptido cíclico que tiene la siguiente estructura:

Se sabe que la CsH antagoniza selectivamente el receptor del péptido formilo, sin embargo, a diferencia de la ciclosporina A (CsA), la CsH no se une a la ciclofilina para provocar inmunosupresión. CsA media la inmunosupresión como un complejo con la peptidil-prolil isomerasa ciclofilina A (CypA) del huésped. Esto inhibe la fosfatasa calcineurina dependiente de Ca2+ y la consiguiente activación de citocinas proinflamatorias como IL-2 (Sokolskaja, E. et al. (2006) Curr. Opin. Microbiol. 9: 404-8).

Las soluciones de CsH para usar en la presente invención pueden prepararse usando métodos rutinarios conocidos en la técnica.

La concentración a la que se aplica CsH o un derivado de la misma a una población de células puede ajustarse para diferentes sistemas de vectores para optimizar la eficiencia de la transducción y/o la edición de genes. Los métodos para determinar la eficiencia de la transducción y la edición de genes se han descrito anteriormente. Por lo tanto, una persona experta puede seleccionar una concentración adecuada de CsH o un derivado de la misma para maximizar el aumento en la eficiencia de la transducción y/o la edición de genes mientras se minimiza cualquier toxicidad usando los enfoques descritos en el presente documento.

Los derivados de CsH pueden identificarse usando métodos conocidos en la técnica para determinar la eficiencia de la transducción y/o la edición de genes. Por ejemplo, se pueden emplear métodos para determinar el porcentaje de células que son transducidas por un vector, o métodos para determinar el número de copias del vector por célula. Estos métodos se han descrito anteriormente. El método empleado es preferiblemente uno que sea susceptible de automatización y/o cribado de alto rendimiento de derivados de CsH candidatos. Los derivados de CsH candidatos pueden formar parte de una biblioteca de derivados de CsH.

Rapamicina

La rapamicina (CAS No. 53123-88-9, también conocida como Sirolimus) es un macrólido producido por Streptomyces hygroscopicus. La rapamicina tiene la siguiente estructura:

La rapamicina es un agente inmunosupresor aprobado para su uso en la prevención del rechazo de aloinjertos. La rapamicina ejerce su efecto inmunosupresor mediante la unión e inhibición de la peptidil-prolil isomerasa FKBP12 del huésped (Harding, M.W. et al. (1989) Nature 341: 758-60; Siekierka, J.J. et al. (1989) Nature 341: 755-7).

Por derivado de rapamicina, debe entenderse que la rapamicina se modifica mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la técnica, preferiblemente para mejorar propiedades tales como estabilidad y actividad, mientras que aún conserva su función de aumentar la eficiencia de transducción y/o eficiencia de edición de genes de una población aislada de células.

Prostaglandina E2

La prostaglandina E2, que también se conoce como dinoprostona, es una prostaglandina natural que tiene la estructura:

Puede usarse prostaglandina E2 o un derivado de prostaglandina E2, de acuerdo con la invención, en combinación con CsH para aumentar la eficiencia de transducción y/o la eficiencia de edición de genes de una población aislada de células.

En una realización, el derivado de prostaglandina E2 es 16,16-dimetil prostaglandina E2.

Por derivado de prostaglandina E2, debe entenderse que la prostaglandina E2 se modifica mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la técnica, preferiblemente para mejorar propiedades tales como estabilidad y actividad, al tiempo que conserva su función de aumentar la eficiencia de transducción y/o eficiencia de edición de genes de una población aislada de células.

Estaurosporina

La estaurosporina es un producto natural originalmente aislado de Streptomyces staurosporeus. Muestra actividad como inhibidor de las proteínas quinasas mediante la prevención de la unión de ATP a la quinasa.

Células madre y progenitoras hematopoyéticas

Una célula madre puede diferenciarse en muchos tipos de células. Una célula que puede diferenciarse en todos los tipos de células se conoce como totipotente. En los mamíferos, solo el cigoto y las células embrionarias tempranas son totipotentes. Las células madre se encuentran en la mayoría, si no en todos, los organismos multicelulares. Se caracterizan por la capacidad de renovarse a través de la división de células mitóticas y diferenciarse en una amplia gama de tipos de células especializadas. Los dos tipos generales de células madre de mamíferos son las células madre embrionarias que se aíslan de la masa celular interna de los blastocistos y las células madre adultas que se encuentran en los tejidos adultos. En un embrión en desarrollo, las células madre pueden diferenciarse en todos los tejidos embrionarios especializados. En los organismos adultos, las células madre y las células progenitoras actúan como un sistema de reparación para el cuerpo, reponiendo células especializadas, pero también manteniendo la renovación normal de los órganos regenerativos, como la sangre, la piel o los tejidos intestinales.

Las células madre hematopoyéticas (HSC) son células madre multipotentes que pueden encontrarse, por ejemplo, en sangre periférica, médula ósea y sangre del cordón umbilical. Las HSC son capaces de autorrenovarse y diferenciarse en cualquier linaje de células sanguíneas. Son capaces de recolonizar todo el sistema inmunológico y los linajes eritroide y mieloide en todos los tejidos hematopoyéticos (como médula ósea, bazo y timo). Proporcionan la producción de por vida de todos los linajes de células hematopoyéticas.

Las células progenitoras hematopoyéticas tienen la capacidad de diferenciarse en un tipo específico de célula. Sin embargo, a diferencia de las células madre, ya son mucho más específicas: se las empuja a diferenciarse en su célula "objetivo". Una diferencia entre las células madre y las células progenitoras es que las células madre pueden replicarse indefinidamente, mientras que las células progenitoras solo pueden dividirse un número limitado de veces. Las células progenitoras hematopoyéticas se pueden distinguir rigurosamente de las HSC solo mediante un ensayo funcional in vivo (es decir, trasplante y demostración de si pueden dar lugar a todos los linajes sanguíneos durante períodos de tiempo prolongados).

Las células madre y progenitoras hematopoyéticas de la invención comprenden el marcador de superficie celular CD34 (indicado como CD34+).

Fuente de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC por sus siglas en inglés)

Puede obtenerse una población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas a partir de una muestra de tejido.

Por ejemplo, se puede obtener una población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas a partir de sangre periférica (por ejemplo, sangre periférica fetal y adulta), sangre del cordón umbilical, médula ósea, hígado o bazo. Preferiblemente, estas células se obtienen de sangre periférica o médula ósea. Pueden obtenerse tras la movilización de las células in vivo mediante tratamiento con factor de crecimiento.

La movilización se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, G-CSF, plerixáforo o combinaciones de los mismos. Otros agentes, como los AINE y los inhibidores de la dipeptidil peptidasa, también pueden ser útiles como agentes movilizadores.

Con la disponibilidad de los factores de crecimiento de células madre GM-CSF y G-CSF, la mayoría de los procedimientos de trasplante de células madre hematopoyéticas se realizan ahora usando células madre recogidas de la sangre periférica, en lugar de la médula ósea. La recolección de células madre de sangre periférica proporciona un injerto más grande, no requiere que el donante sea sometido a anestesia general para recolectar el injerto, resulta en un tiempo más corto para el injerto y puede proporcionar una tasa de recaída más baja a largo plazo.

La médula ósea se puede recolectar mediante métodos de aspiración estándar (ya sea en estado estacionario o después de la movilización), o usando herramientas de recolección de próxima generación (por ejemplo, Marrow Miner). Además, las células madre y progenitoras hematopoyéticas también pueden derivarse de células madre pluripotentes inducidas.

Características HSC

Las HSC son típicamente de bajo perfil de dispersión frontal y lateral mediante procedimientos de citometría de flujo. Algunos son metabólicamente inactivos, como lo demuestra el etiquetado de rodamina que permite la determinación de la actividad mitocondrial. Las HSC pueden comprender ciertos marcadores de superficie celular como CD34, CD45, CD133, CD90 y CD49f. También pueden definirse como células que carecen de la expresión de los marcadores de superficie celular CD38 y CD45RA. Sin embargo, la expresión de algunos de estos marcadores depende de la etapa de desarrollo y el contexto específico de tejido de las HSC. Algunas HSC llamadas "células de población lateral" excluyen el colorante Hoechst 33342 detectado por citometría de flujo. Así, las HSC tienen características descriptivas que permiten su identificación y aislamiento.

Marcadores negativos

El CD38 es el marcador negativo único más establecido y útil para las HSC humanas.

Las HSC humanas también pueden ser negativas para marcadores de linaje tales como CD2, CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD24, CD36, CD56, CD66b, CD271 y CD45RA. Sin embargo, es posible que estos marcadores deban usarse en combinación para el enriquecimiento de HSC.

Por "marcador negativo" debe entenderse que las HSC humanas carecen de la expresión de estos marcadores.

Marcadores positivos

CD34 y CD133 son los marcadores positivos más útiles para las HSC.

Algunas HSC también son positivas para marcadores de linaje tales como CD90, CD49f y CD93. Sin embargo, es posible que estos marcadores deban usarse en combinación para el enriquecimiento de HSC.

Por "marcador positivo" debe entenderse que las HSC humanas expresan estos marcadores.

En una realización, las células madre y progenitoras hematopoyéticas son células CD34+ CD38-.

Células diferenciadas

Una célula diferenciada es una célula que se ha vuelto más especializada en comparación con una célula madre o una célula progenitora. La diferenciación ocurre durante el desarrollo de un organismo multicelular cuando el organismo cambia de un solo cigoto a un sistema complejo de tejidos y tipos de células. La diferenciación también es un proceso común en los adultos: las células madre adultas se dividen y crean células hijas completamente diferenciadas durante la reparación de tejidos y el recambio celular normal. La diferenciación cambia drásticamente el tamaño, la forma, el potencial de membrana, la actividad metabólica y la capacidad de respuesta a las señales de una célula. Estos cambios se deben en gran parte a modificaciones altamente controladas en la expresión génica. En otras palabras, una célula diferenciada es una célula que tiene estructuras específicas y realiza ciertas funciones debido a un proceso de desarrollo que implica la activación y desactivación de genes específicos. Aquí, una célula diferenciada incluye células diferenciadas del linaje hematopoyético como monocitos, macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, células dendríticas, células T, células B y células NK. Por ejemplo, las células diferenciadas del linaje hematopoyético se pueden distinguir de las células madre y las células progenitoras mediante la detección de moléculas de la superficie celular que no se expresan o que se expresan en menor grado en células indiferenciadas. Ejemplos de marcadores de linaje humano adecuados incluyen CD33, CD13, CD14, CD15 (mieloide), CD19, CD20, CD22, CD79a (B), CD36, CD71, CD235a (eritroide), CD2, CD3, CD4, CD8 (T) y CD56 (NK).

Células T

Las células T (o linfocitos T) son un tipo de linfocito que juega un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, como las células B y las células asesinas naturales (células NK), por la presencia de un receptor de células T (TCR) en la superficie celular.

En una realización, las células T son células T CD4+. En otra realización, las células T son células T CD3+.

Aislamiento y enriquecimiento de poblaciones de células.

El término "población aislada" de células, como se usa en el presente documento, puede referirse a la población de células que se han eliminado previamente del cuerpo. Una población aislada de células puede cultivarse y manipularse ex vivo o in vitro usando técnicas estándar conocidas en la técnica. Posteriormente, una población aislada de células puede reintroducirse en un sujeto. Dicho sujeto puede ser el mismo sujeto del que se aislaron originalmente las células o un sujeto diferente.

Una población de células puede purificarse selectivamente para las células que exhiben un fenotipo o característica específicos, y de otras células que no exhiben ese fenotipo o característica, o lo exhiben en un grado menor. Por ejemplo, una población de células que expresa un marcador específico (como CD34) puede purificarse a partir de una población inicial de células. Alternativamente, o además, se puede purificar una población de células que no expresa otro marcador (como CD38).

Al "enriquecer" una población de células para un cierto tipo de células, debe entenderse que la concentración de ese tipo de células aumenta dentro de la población. La concentración de otros tipos de células puede reducirse concomitantemente.

La purificación o el enriquecimiento pueden dar como resultado que la población de células sea sustancialmente pura de otros tipos de células.

La purificación o el enriquecimiento de una población de células que expresan un marcador específico (por ejemplo, CD34 o CD38) se puede lograr usando un agente que se una a ese marcador, preferiblemente de manera sustancialmente específica a ese marcador.

Un agente que se une a un marcador celular puede ser un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD34 o anti-CD38.

El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos capaces de unirse a una diana seleccionada, e incluye anticuerpos monoclonales y policlonales Fv, ScFv, F(ab') y F(ab')2, anticuerpos diseñados que incluyen anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados, y anticuerpos seleccionados artificialmente producidos mediante presentación de fagos o técnicas alternativas.

Además, en la invención también se pueden utilizar alternativas a los anticuerpos clásicos, por ejemplo, "avicuerpos", "avímeros", "anticalinas", "nanocuerpos" y "DARPins".

Los agentes que se unen a marcadores específicos pueden etiquetarse de manera que sean identificables usando cualquiera de varias técnicas conocidas en la técnica. El agente puede estar etiquetado de forma inherente o puede modificarse conjugando una etiqueta al mismo. Por "conjugar" debe entenderse que el agente y la etiqueta están enlazados operativamente. Esto significa que el agente y la etiqueta están unidos entre sí de una manera que permite que ambos lleven a cabo su función (por ejemplo, unirse a un marcador, permitir la identificación fluorescente o permitir la separación cuando se colocan en un campo magnético) sustancialmente sin obstáculos. Los métodos adecuados de conjugación son bien conocidos en la técnica y serían fácilmente identificables por el experto.

Una etiqueta puede permitir, por ejemplo, que el agente etiquetado y cualquier célula a la que esté unido se purifique de su entorno (por ejemplo, el agente puede estar etiquetado con una cuenta magnética o una etiqueta de afinidad, como avidina), detectado o ambos. Los marcadores detectables adecuados para su uso como etiqueta incluyen fluoróforos (por ejemplo, proteínas fluorescentes verde, cereza, cian y naranja) y etiquetas de péptidos (por ejemplo, etiquetas His, etiquetas Myc, etiquetas FLAG y etiquetas HA).

En la técnica se conocen varias técnicas para separar una población de células que expresan un marcador específico. Estos incluyen tecnologías de separación basadas en perlas magnéticas (por ejemplo, separación basada en perlas magnéticas de circuito cerrado), citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), purificación de etiquetas de afinidad (por ejemplo, utilizando columnas o perlas de afinidad, como columnas de biotina para separar los agentes etiquetados con avidina) y técnicas basadas en microscopía.

También puede ser posible realizar la separación usando una combinación de diferentes técnicas, como una etapa de separación basada en perlas magnéticas seguida de la clasificación de la población resultante de células para uno o más marcadores adicionales (positivos o negativos) por citometría de flujo.

La separación de grado clínico se puede realizar, por ejemplo, usando el sistema CliniMACS® (Miltenyi). Este es un ejemplo de una tecnología de separación basada en perlas magnéticas de circuito cerrado.

También se prevé que las propiedades de exclusión de colorantes (por ejemplo, población lateral o etiquetado con rodamina) o actividad enzimática (por ejemplo, actividad ALDH) se pueden usar para enriquecer las células madre hematopoyéticas.

Edición de genes

El término "edición de genes" se refiere a un tipo de ingeniería genética donde se inserta, elimina o reemplaza un ácido nucleico en una célula. La edición de genes se puede lograr usando nucleasas diseñadas, que pueden dirigirse a un sitio deseado en un polinucleótido (por ejemplo, un genoma). Dichas nucleasas pueden crear roturas de doble cadena específicas del sitio en ubicaciones deseadas, que luego pueden repararse mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ por sus siglas en inglés) o recombinación homóloga (HR por sus siglas en inglés), dando como resultado mutaciones dirigidas.

Dichas nucleasas se pueden administrar a una célula diana usando vectores virales. La presente invención proporciona métodos para aumentar la eficiencia del proceso de edición de genes.

Los ejemplos de nucleasas adecuadas conocidas en la técnica incluyen nucleasas con dedos de zinc (ZFN por sus siglas en inglés), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) y el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR por sus siglas en inglés)/Cas (Gaj, T. et al. (2013) Trends Biotechnol. 31: 397-405; Sander, J.D. et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32: 347-55).

También se pueden emplear meganucleasas (Silve, G. et al. (2011) Cur. Gene Ther. 11: 11-27) como nucleasas adecuadas para la edición de genes.

El sistema CRISPR/Cas es un sistema de unión de ADN guiado por ARN (van der Oost et al. (2014) Nat. Rev. Microbiol.

12: 479-92), donde el ARN guía (ARNg) puede seleccionarse para permitir que un dominio Cas9 se dirija a una secuencia específica. Los métodos para el diseño de ARNg se conocen en la técnica. Además, las proteínas Cas9 totalmente ortogonales, así como los complejos de ribonucleoproteína Cas9/ARNg y las modificaciones de la estructura/composición del ARNg para unir diferentes proteínas, se han desarrollado recientemente para tener como diana simultánea y direccionalmente a diferentes dominios efectores a los sitios genómicos deseados de las células (Esvelt y col. (2013) Nat. Methods 10: 1116-21; Zetsche, B. et al. (2015) Cell pii: S0092-8674 (15) 01200-3; Dahlman, J.E. et al. (2015) Nat. Biotechnol. 2015 5 de octubre. Doi: 10.1038/nbt.3390. [Publicación electrónica antes de la impresión]; Zalatan, J.G. et al. (2015) Cell 160: 339-50; Paix, A. et al. (2015) Genetics 201: 47-54) y son adecuados para su uso en la invención.

Vectores

Un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Los vectores usados para transducir las células en la presente invención son vectores virales.

En una realización, los vectores virales son vectores retrovirales. En una realización preferida, los vectores virales son vectores lentivirales.

En una realización, los vectores lentivirales se derivan de VIH-1, VIH-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV o lentivirus visna. En una realización, el vector viral es un vector gamma-retroviral.

Por "vector derivado de" un cierto tipo de virus, debe entenderse que el vector comprende al menos un componente parte derivable de ese tipo de virus.

Vectores retrovirales y lentivirales

Un vector retrovírico puede derivarse o ser derivado de cualquier retrovirus adecuado. Se ha identificado una gran cantidad de retrovirus diferentes. Los ejemplos incluyen el virus de la leucemia murina (MLV por sus siglas en inglés), el virus de la leucemia de células T humanas (HTLV por sus siglas en inglés), el virus del tumor mamario del ratón (MMTV por sus siglas en inglés), el virus del sarcoma de Rous (RSV por sus siglas en inglés), el virus del sarcoma de Fujinami (FuSV por sus siglas en inglés), el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV por sus siglas en inglés), virus del osteosarcoma murino FBR (FBR MSV por sus siglas en inglés), virus del sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV por sus siglas en inglés), virus de la leucemia murina de Abelson (A-MLV por sus siglas en inglés), virus 29 de la mielocitomatosis aviar (MC29 por sus siglas en inglés) y virus de la eritroblastosis aviar (AEV por sus siglas en inglés). Se puede encontrar una lista detallada de retrovirus en Coffin, J.M. et al. (1997) Retrovirus, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 758-63.

Los retrovirus se pueden dividir ampliamente en dos categorías, "simples" y "complejos". Los retrovirus pueden dividirse aún más en siete grupos. Cinco de estos grupos representan retrovirus con potencial oncogénico. Los dos grupos restantes son los lentivirus y los spumavirus. Se presenta una revisión de estos retrovirus en Coffin, J.M. et al. (1997) Retrovirus, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 758-63.

La estructura básica de los genomas de retrovirus y lentivirus comparten muchas características comunes tales como una LTR 5' y una LTR 3'. Entre estos se encuentra una señal de empaquetamiento que permite empaquetar el genoma, un sitio de unión del cebador, sitios de integración para permitir la integración en el genoma de una célula huésped y genes gag, pol y env que codifican los componentes de empaquetamiento; estos son polipéptidos necesarios para el ensamblaje de partículas virales. Los lentivirus tienen características adicionales, como las secuencias rev y RRE en el VIH, que permiten la exportación eficiente de transcripciones de ARN del provirus integrado desde el núcleo al citoplasma de una célula diana infectada.

En el provirus, estos genes están flanqueados en ambos extremos por regiones llamadas repeticiones terminales largas (LTR por sus siglas en inglés). Los lTr son responsables de la integración y transcripción proviral. Las LTR también sirven como secuencias potenciadoras-promotoras y pueden controlar la expresión de los genes virales.

Las LTR en sí mismas son secuencias idénticas que se pueden dividir en tres elementos: U3, R y U5. U3 se deriva de la secuencia única del extremo 3' del ARN. R se deriva de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN. U5 se deriva de la secuencia única del extremo 5' del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes retrovirus.

En un genoma gag de vector retroviral defectuoso, pol y env pueden estar ausentes o no ser funcionales.

En un vector retroviral típico, al menos parte de una o más regiones codificantes de proteínas esenciales para la replicación pueden eliminarse del virus. Esto hace que el vector viral sea defectuoso en la replicación. Porciones del genoma viral también se pueden reemplazar por una biblioteca que codifica restos moduladores candidatos enlazados operativamente a una región de control reguladora y un resto reportero en el genoma del vector para generar un vector que comprende restos moduladores candidatos que es capaz de transducir una célula huésped diana y/o integrando su genoma en un genoma huésped.

Los vectores lentivirus son parte del grupo más grande de vectores retrovirales. Se puede encontrar una lista detallada de lentivirus en Coffin, J.M. et al. (1997) Retrovirus, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 758-63. En resumen, los lentivirus se pueden dividir en grupos de primates y no primates. Los ejemplos de lentivirus de primates incluyen, pero no se limitan a virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia humana adquirida (SIDA); y virus de inmunodeficiencia de simios (VIS). Ejemplos de lentivirus que no son de primates incluyen el prototipo "virus lento" del virus visna/maedi (VMV por sus siglas en inglés), así como el virus de la artritisencefalitis caprina (CAEV por sus siglas en inglés) relacionado, el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV por sus siglas en inglés) y el virus la inmunodeficiencia felina descrita más recientemente (FIV por sus siglas en inglés) y virus de inmunodeficiencia bovina (BIV por sus siglas en inglés).

La familia de lentivirus se diferencia de los retrovirus en que los lentivirus tienen la capacidad de infectar células en división y no en división (Lewis, P et al. (1992) EMBO J. 11: 3053-8; Lewis, P.F. et al. (1994) J. Virol. 68: 510-6). Por el contrario, otros retrovirus, como MLV, no pueden infectar células que no se dividen o que se dividen lentamente, como las que forman, por ejemplo, tejido muscular, cerebral, pulmonar y hepático.

Un vector lentiviral, como se usa en este documento, es un vector que comprende al menos una parte componente derivable de un lentivirus. Preferiblemente, ese componente está involucrado en los mecanismos biológicos mediante los cuales el vector infecta células, expresa genes o se replica.

El vector lentiviral puede ser un vector de "primate". El vector lentiviral puede ser un vector "no primate" (es decir, derivado de un virus que no infecta principalmente a primates, especialmente a seres humanos). Ejemplos de lentivirus que no son de primates pueden ser cualquier miembro de la familia de lentiviridae que no infecte naturalmente a un primate.

Como ejemplos de vectores basados en lentivirus, a continuación, se describen vectores basados en VIH-1 y VIH-2. El vector VIH-1 contiene elementos que actúan en cis que también se encuentran en retrovirus simples. Se ha demostrado que las secuencias que se extienden hacia el marco de lectura abierto de gag son importantes para el empaquetamiento del VIH-1. Por lo tanto, los vectores de VIH-1 a menudo contienen la parte relevante de gag donde se ha mutado el codón de iniciación de la traducción. Además, la mayoría de los vectores del VIH-1 también contienen una parte del gen env que incluye el RRE. Rev se une a RRE, lo que permite el transporte de ARNm de longitud completa o empalmados individualmente desde el núcleo hasta el citoplasma. En ausencia de Rev y/o RRE, los ARN de VIH-1 de longitud completa se acumulan en el núcleo. Alternativamente, se puede usar un elemento de transporte constitutivo de ciertos retrovirus simples como el virus del mono Mason-Pfizer para aliviar la necesidad de Rev y RRE. La transcripción eficaz del promotor LTR del VIH-1 requiere la proteína viral Tat.

La mayoría de los vectores basados en VIH-2 son estructuralmente muy similares a los vectores de VIH-1. De manera similar a los vectores basados en VIH-1, los vectores de VIH-2 también requieren RRE para el transporte eficiente de los ARN virales de longitud completa o empalmados individualmente.

En un sistema, el vector y las construcciones auxiliares son de dos virus diferentes, y la homología de nucleótidos reducida puede disminuir la probabilidad de recombinación. Además de los vectores basados en los lentivirus de primates, también se han desarrollado vectores basados en FIV como alternativa a los vectores derivados del genoma patógeno del VIH-1. Las estructuras de estos vectores también son similares a las de los vectores basados en VIH-1. Preferiblemente, el vector viral usado en la presente invención tiene un genoma viral mínimo.

Por "genoma viral mínimo" debe entenderse que el vector viral ha sido manipulado para eliminar los elementos no esenciales y retener los elementos esenciales con el fin de proporcionar la funcionalidad requerida para infectar, transducir y administrar una secuencia de nucleótidos de interés para una célula huésped diana. Se pueden encontrar más detalles de esta estrategia en WO 1998/017815.

Preferiblemente, el vector plasmídico usado para producir el genoma viral dentro de una célula huésped/célula empacadora tendrá suficiente información genética lentiviral para permitir empaquetamiento de un genoma de ARN, en presencia de componentes empaquetadores, en una partícula viral que es capaz de infectar una célula diana, pero es incapaz de una replicación independiente para producir partículas virales infecciosas dentro de la célula diana final. Preferiblemente, el vector carece de un gen gag-pol y/o env funcional y/u otros genes esenciales para la replicación. Sin embargo, el vector plásmido usado para producir el genoma viral dentro de una célula hospedadora/célula empacadora también incluirá secuencias de control reguladoras de la transcripción unidas operativamente al genoma lentiviral para dirigir la transcripción del genoma en una célula hospedadora/célula empacadora. Estas secuencias reguladoras pueden ser las secuencias naturales asociadas con la secuencia viral transcrita (es decir, la región 5' U3), o pueden ser un promotor heterólogo, como otro promotor viral (por ejemplo, el promotor CMV).

Los vectores pueden ser vectores autoinactivantes (SIN por sus siglas en inglés) en los que se han eliminado las secuencias potenciadoras y promotora vírica. Los vectores SIN se pueden generar y transducir células que no se dividen in vivo con una eficacia similar a la de los vectores de tipo salvaje. La inactivación transcripcional de la repetición terminal larga (LTR) en el provirus SIN debería evitar la movilización por el virus competente para la replicación. Esto también debería permitir la expresión regulada de genes de promotores internos eliminando cualquier efecto de acción cis de la LTR.

Los vectores pueden ser de integración defectuosa. Los vectores lentivirales de integración defectuosa (IDLV) se pueden producir, por ejemplo, empaquetando el vector con integrasa catalíticamente inactiva (como una integrasa de VIH que lleva la mutación D64V en el sitio catalítico; Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-7; Naldini, L. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93: 11382-8; Leavitt, A.D. et al. (1996) J. Virol. 70: 721-8) o modificando o eliminando secuencias att esenciales del vector LTR (Nightingale, S.J. et al. (2006) Mol. Ther. 13: 1121-32), o por una combinación de los anteriores.

Vectores derivados del VIH

Los vectores derivados del VIH para su uso en la presente invención no están particularmente limitados en términos de la cepa del VIH. Se pueden encontrar numerosos ejemplos de secuencias de cepas de VIH en la base de datos de secuencias de VIH (http://www.hiv.lanl.gov/content/in-dex).

Por ejemplo, un vector derivado de VIH-1 puede derivarse de cualquiera de las cepas de VIH-1 NL4-3, IIIB_LAI o HXB2_LAI (X4-tropic), o BAL (R5-tropic), o una quimera de las mismas. Preferiblemente, los vectores derivados de VIH-1 se derivan de la construcción de empaquetamiento que expresa pM-DLg/pRRE Gag-Pol (US 7629153; US 8652837; Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-7; Follenzi, A. et al. (2002) Methods Enzymol. 346: 454-65).

Un vector derivado del VIH-2 puede derivarse, por ejemplo, de la cepa ROD del VIH-2.

Nucleótido de interés

El vector usado en la presente invención preferiblemente comprende un nucleótido de interés.

Preferiblemente, el nucleótido de interés da lugar a un efecto terapéutico.

Los NOI (por sus siglas en inglés) adecuados incluyen, pero no se limitan a secuencias que codifican enzimas, citocinas, quimiocinas, hormonas, anticuerpos, moléculas antioxidantes, moléculas similares a inmunoglobulinas diseñadas, anticuerpos monocatenarios, proteínas de fusión, moléculas inmunocoestimuladoras, moléculas inmunomoduladoras, ARN antisentido, microARN, ARNhc, ARNip, ARN guía (ARNg, por ejemplo, utilizado en conexión con un sistema CRISPR/Cas), ribozimas, secuencias diana de miARN, un mutante negativo en transdominio de una proteína diana, toxinas, toxinas condicionales, antígenos, proteínas supresoras de tumores, factores de crecimiento, factores de transcripción, proteínas de membrana, receptores de superficie, moléculas anticancerígenas, proteínas y péptidos vasoactivos, proteínas antivirales y ribozimas, y derivados de los mismos (tales como derivados con un grupo reportero asociado). Los NOI también pueden codificar enzimas activadoras de profármacos.

Un ejemplo de NOI es la cadena de beta-globina que puede usarse para terapia génica de talasemia/anemia de células falciformes.

Los NOI también incluyen aquellos útiles para el tratamiento de otras enfermedades que requieren corrección genética no urgente/electiva en el linaje mieloide, tales como: enfermedad granulomatosa crónica (CGD (por sus siglas en inglés), por ejemplo, el transgén gp91phox), defectos de adhesión de leucocitos, otros trastornos de fagocitos en pacientes sin infecciones graves en curso y síndromes hereditarios de insuficiencia de la médula ósea (por ejemplo, anemia de Fanconi), así como inmunodeficiencias primarias (SCID por sus siglas en inglés).

Los NOI también incluyen aquellos útiles en el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosómico e inmunodeficiencias.

La aplicabilidad de la invención a las células T también facilita su aplicación en terapias celulares que se basan en la infusión de células T modificadas en pacientes, incluidas estrategias anticancerígenas (como el uso de células CAR-T diseñadas) y enfoques basados en infusión de células T de donantes universales. Por lo tanto, los NOI también pueden incluir, por ejemplo, receptores de antígenos quiméricos (CAR por sus siglas en inglés).

Composición farmacéutica

Las células se pueden formular para la administración a sujetos con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y diluyentes adecuados incluyen soluciones salinas isotónicas, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, y contienen potencialmente albúmina de suero humano.

La manipulación del producto de terapia celular se realiza preferiblemente de acuerdo con los Estándares Internacionales FACT-JACIE para terapia celular.

Trasplante de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas

La presente invención proporciona ciclosporina H (CsH) para su uso en terapia génica, donde la terapia génica está mediada por un vector viral, donde el vector viral está pseudotipado para entrar en las células a través de un mecanismo dependiente de endocitosis y/o donde el vector es un vector pseudotipado VSV-g

El uso puede ser parte de un procedimiento de trasplante de células, por ejemplo, un procedimiento de trasplante de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas.

El trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) es el trasplante de células madre sanguíneas derivadas de la médula ósea (en este caso conocido como trasplante de médula ósea) o sangre. El trasplante de células madre es un procedimiento médico en los campos de la hematología y la oncología, que se realiza con mayor frecuencia para personas con enfermedades de la sangre o de la médula ósea, o ciertos tipos de cáncer.

Muchos receptores de HSCT son pacientes con mieloma múltiple o leucemia que no se beneficiarían de un tratamiento prolongado con quimioterapia o que ya son resistentes a ella. Los candidatos para HSCT incluyen casos pediátricos en los que el paciente tiene un defecto congénito, como inmunodeficiencia combinada grave o neutropenia congénita con células madre defectuosas, y también niños o adultos con anemia aplásica que han perdido sus células madre después del nacimiento. Otras afecciones tratadas con trasplantes de células madre incluyen la anemia de células falciformes, el síndrome mielodisplásico, el neuroblastoma, el linfoma, el sarcoma de Ewing, el tumor desmoplásico de células redondas pequeñas y la enfermedad de Hodgkin. Más recientemente, se han desarrollado procedimientos no mielosupresores, o los denominados "minitrasplantes", que requieren dosis más pequeñas de quimioterapia preparativa y radiación. Esto ha permitido realizar un HSCT en ancianos y otros pacientes que de otro modo se considerarían demasiado débiles para soportar un régimen de tratamiento convencional.

Se puede administrar una población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas como parte de un procedimiento de trasplante de células madre autólogas.

Se puede administrar una población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas como parte de un procedimiento de trasplante de células madre alogénicas.

El término "procedimiento de trasplante de células madre autólogas" como se usa en este documento se refiere a un procedimiento donde la población inicial de células (que luego se transducen de acuerdo con un método de la invención) se obtiene del mismo sujeto al que se le administra la población de células transducidas. Los procedimientos de trasplante autólogo son ventajosos ya que evitan los problemas asociados con la incompatibilidad inmunológica y están disponibles para los sujetos independientemente de la disponibilidad de un donante compatible genéticamente.

El término "procedimiento de trasplante de células madre alogénicas" como se usa en este documento se refiere a un procedimiento donde la población inicial de células (que luego se transducen de acuerdo con un método de la invención) se obtiene de un sujeto diferente al que se le administra la población de células transducidas. Preferiblemente, el donante se emparejará genéticamente con el sujeto al que se administran las células para minimizar el riesgo de incompatibilidad inmunológica.

Las dosis adecuadas de poblaciones de células transducidas son tales que sean terapéutica y/o profilácticamente eficaces. La dosis a administrar puede depender del sujeto y la condición a tratar, y puede ser determinada fácilmente por una persona experta.

Las células progenitoras hematopoyéticas proporcionan un injerto a corto plazo. Por consiguiente, la terapia génica mediante la administración de células progenitoras hematopoyéticas transducidas proporcionaría un efecto no permanente en el sujeto. Por ejemplo, el efecto puede limitarse a 1-6 meses después de la administración de las células progenitoras hematopoyéticas transducidas. Una ventaja de este enfoque sería una mayor seguridad y tolerabilidad, debido a la naturaleza autolimitada de la intervención terapéutica.

Tal terapia génica de células progenitoras hematopoyéticas puede ser adecuada para el tratamiento de trastornos adquiridos, por ejemplo, cáncer, donde la expresión limitada en el tiempo de un nucleótido de interés anticanceroso (potencialmente tóxico) puede ser suficiente para erradicar la enfermedad.

La invención puede ser útil en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO 1998/005635. Para facilitar la referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: cáncer, inflamación o enfermedad inflamatoria, trastornos dermatológicos, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación y respuesta de fase aguda, caquexia, anorexia, infección aguda, infección por VIH, estados de shock, reacciones de injerto contra huésped, enfermedad autoinmune, lesión por reperfusión, meningitis, migraña y antitrombosis dependiente de aspirina; crecimiento, invasión y diseminación tumoral, angiogénesis, metástasis, malignidad, ascitis y derrame pleural maligno; isquemia cerebral, cardiopatía isquémica, osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, asma, esclerosis múltiple, neurodegeneración, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, accidente cerebrovascular, vasculitis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; periodontitis, gingivitis; psoriasis, dermatitis atópica, úlceras crónicas, epidermólisis ampollosa; ulceración corneal, retinopatía y cicatrización de heridas quirúrgicas; rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, anafilaxia; reestenosis, insuficiencia cardíaca congestiva, endometriosis, aterosclerosis o endosclerosis.

Además, o como alternativa, la invención puede ser útil en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO 1998/007859. Para facilitar la referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: actividad de proliferación/diferenciación de citocinas y células; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (por ejemplo, para el tratamiento de la inmunodeficiencia, incluida la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana; regulación del crecimiento de linfocitos; tratamiento del cáncer y muchas enfermedades autoinmunes, y para prevenir el rechazo de trasplantes o inducir la inmunidad tumoral); regulación de la hematopoyesis, por ejemplo tratamiento de enfermedades mieloides o linfoides; promover el crecimiento de hueso, cartílago, tendón, ligamento y tejido nervioso, por ejemplo, para curar heridas, tratamiento de quemaduras, úlceras y enfermedad periodontal y neurodegeneración; inhibición o activación de la hormona estimulante del folículo (modulación de la fertilidad); actividad quimiotáctica/quimiocinética (por ejemplo, para movilizar tipos de células específicos a sitios de lesión o infección); actividad hemostática y trombolítica (por ejemplo, para el tratamiento de la hemofilia y el accidente cerebrovascular); actividad antiinflamatoria (para tratar, por ejemplo, choque séptico o enfermedad de Crohn); como antimicrobianos; moduladores de por ejemplo metabolismo o comportamiento; como analgésicos; tratamiento de trastornos por deficiencia específicos; en el tratamiento de p. psoriasis, en medicina humana o veterinaria.

Además, o como alternativa, la invención puede ser útil en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO 1998/009985. Para facilitar la referencia, ahora se proporciona parte de esa lista: actividad inhibidora de macrófagos y/o inhibidora de células T y, por tanto, actividad antiinflamatoria; actividad antiinmune, es decir, efectos inhibidores contra una respuesta inmune celular y/o humoral, incluida una respuesta no asociada con inflamación; inhibir la capacidad de los macrófagos y las células T para adherirse a los componentes de la matriz extracelular y la fibronectina, así como la expresión del receptor fas regulado positivamente en las células T; inhibir la reacción inmune no deseada y la inflamación, incluida la artritis, incluida la artritis reumatoide, la inflamación asociada con hipersensibilidad, reacciones alérgicas, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades del colágeno y otras enfermedades autoinmunes, inflamación asociada con aterosclerosis, arteriosclerosis, enfermedad cardíaca aterosclerótica, lesión por reperfusión, paro cardíaco, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, síndrome de dificultad respiratoria u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación asociada con úlcera péptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del tracto gastrointestinal, fibrosis hepática, cirrosis hepática u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades oto-rino-laringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epididimoorquitis, infertilidad, traumatismo orquideal u otros relacionados con el sistema inmunológico d enfermedades testiculares, disfunción placentaria, insuficiencia placentaria, aborto habitual, eclampsia, preeclampsia y otras enfermedades ginecológicas inmunes y/o relacionadas con la inflamación, uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, por ejemplo retinitis o edema macular cistoide, oftalmia simpática, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inmunitarios e inflamatorios de la enfermedad fondus degenerativa, componentes inflamatorios del trauma ocular, inflamación ocular causada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo después de una operación de filtración de glaucoma, reacción inmune y/o inflamatoria contra implantes oculares y otras enfermedades oftálmicas inmunes e inflamatorias relacionadas, inflamación asociada con enfermedades autoinmunes o afecciones o trastornos donde, tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en cualquier otro órgano, inmunidad y/o supresión de la inflamación sería beneficioso, enfermedad de Parkinson, complicación y/o efectos secundarios del tratamiento de la enfermedad de Parkinson, encefalopatía relacionada con el VIH compleja demencia relacionada con el SIDA, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades degenerativas enfermedades, afecciones o trastornos del SNC, componentes inflamatorios de stokes, síndrome pospoliomielítico, componentes inmunes e inflamatorios de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, Síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia gravis, pseudotumor cerebral, Síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorios de compresión del SNC o traumatismos del SNC o infecciones del SNC, componentes inflamatorios de atrofias y distrofias musculares, y enfermedades, afecciones o trastornos inmunitarios e inflamatorios del sistema nervioso central y periférico, inflamación postraumática, shock séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de la cirugía, trasplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios del trasplante, complicaciones inflamatorias y/o inmunes y efectos secundarios de la terapia génica, por ejemplo debido a una infección con un portador viral, o inflamación asociada con el SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmune humoral y/o celular, para tratar o mejorar enfermedades proliferativas de monocitos o leucocitos, por ejemplo leucemia, al reducir la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o tratamiento del rechazo del injerto en casos de trasplante de células naturales o artificiales, tejidos y órganos como córnea, médula ósea, órganos, lentes, marcapasos, naturales o artificiales tejido de la piel.

Además, o como alternativa, la invención puede ser útil en el tratamiento de la p-talasemia, enfermedad granulomatosa crónica, leucodistrofia metacromática, trastornos de mucopolisacaridosis y otros trastornos de almacenamiento lisosómico.

Como se mencionó anteriormente, la aplicabilidad de la invención a las células T también facilita su aplicación en terapias celulares que se basan en la infusión de células T modificadas en pacientes, incluidas las estrategias anticancerígenas (tales como el uso de células CAR-T diseñadas) y enfoques basados en la infusión de células T de donantes universales. Por tanto, además, o como alternativa, la invención puede ser útil en la prevención de la enfermedad de injerto contra huésped.

Kit

La CsH o un derivado de la misma y/o las poblaciones de células se pueden proporcionar en recipientes adecuados. El kit también puede incluir instrucciones de uso.

Método de tratamiento

Debe apreciarse que todas las referencias aquí al tratamiento incluyen tratamiento curativo, paliativo y profiláctico; aunque en el contexto de la invención las referencias a la prevención se asocian más comúnmente con el tratamiento profiláctico. Se prefiere el tratamiento de mamíferos, particularmente humanos. Tanto los tratamientos humanos como los veterinarios están dentro del alcance de la divulgación.

Las características y realizaciones preferidas de la invención se describirán ahora a modo de ejemplos no limitativos. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, bioquímica, biología molecular, microbiología e inmunología, que están dentro de las capacidades de una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Estas técnicas se explican en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Cap. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. y Kahn, A. (1996) Aislamiento y secuenciación de Ad N: Técnicas esenciales, John Wiley & Sons; Polak, J.M. y McGee, J.O'D. (1990) Hibridación in situ: Principios y práctica, Oxford University Press; Marcha, M.J. (1984) Síntesis de oligonucleótidos: Un enfoque práctico, IRL Press; y Lilley, D.M. y Dahlberg, J.E. (1992) Métodos en enzimología: Estructuras de ADN Parte A: Síntesis y análisis físico del ADN, Academic Press.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y métodos

Vectores

Se prepararon stocks de lentivirus (LV) de tercera generación, se concentraron y titularon como se describió previamente (Dull, T. et al. (1998) J Virol 72: 8463-8471; Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet 25: 217-222). Brevemente, los vectores LV auto-inactivadores (SIN) se produjeron usando el vector de transferencia pCCLsin.cPPT.hPGK.eGFP.Wpre, el plásmido de empaquetamiento pM-DLg/pRRE, que expresa Rev pCMV-Rev y el pMD2 que codifica la envoltura de VSV-g. Plásmidos .VSV-G. El vector lentiviral defectuoso en integrasa (IDLV) se produjo como se describió anteriormente (Lombardo, A. et al. (2007) Nat Biotechnol 25: 1298-1306) sustituyendo el plásmido de empaquetamiento pMDLg/pRRE por pMD.Lg/pRRE.D64VInt. El vector calvo, un LV normal producido omitiendo el plásmido que codifica Env durante la producción del vector, se produjo como control negativo. Durante la producción del vector, la construcción de Env fue sustituida por pcDNA3.1 (Invitrogen Inc.). Para mutantes de cápside SINLV, los vectores se produjeron como se describió anteriormente, excepto que el pMDLg/pRRE de tipo salvaje se reemplazó con un plásmido de empaquetamiento que alberga una mutación puntual específica en la región codificante de p24 como sigue: pMDLg/pRRE-N74D; pMDLg/pRRE-P90A. Todos los plásmidos de empaquetamiento modificados se compraron de GenScript Inc. Para pseudotipar LV con la envoltura de retrovirus de babuino mutante, pMD2.VSV-G se reemplazó por BaEV-TR durante la producción del vector como se describió previamente (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221-1231). El vector retroviral SIN (SIN-RV) se produjo como se describió anteriormente (Montini, E. et al. (2006) Nat Biotechnol 24: 687-696) usando como vector de transferencia RVrkat43.2MLV GFP, el plásmido de empaquetamiento pCM-gag-pol y el plásmido pMD2.VSV-G que codifica la envoltura VSV-g o pseudotipado con la glicoproteína de envoltura anfotrópica (AmphoRV). El vector de inmunodeficiencia de simios (VIS) se produjo como se describió previamente (Mangeot, P.E. et al. (2002) Mol Ther 5: 283-290) usando un vector de transferencia SIV-GFP, plásmido de empaquetamiento SIV3+ y pseudotipado VSV-G. Las plantillas de donantes de AAV6 para HDR se generaron a partir de una construcción que contenía repeticiones terminales invertidas de AAV2, producidas por un método de triple transfección y purificadas por ultracentrifugación en un gradiente de cloruro de cesio como se describió previamente (Wang, L. et al. (2015) Mol Ther 23: 1877-1887). MolMed (Milán, Italia) produjo ARSA e IDUA LV de grado clínico utilizando un proceso validado a gran escala como se informó anteriormente (Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158).

Células

Líneas celulares

Las células 293T de riñón embrionario humano (HEK293T) así como las líneas celulares de leucemia mielógena K562 humana se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Sigma). Las células THP-1 humanas se mantuvieron en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Lonza). Ambos medios se suplementaron con suero bovino fetal al 10% (FBS por sus siglas en inglés; Gibco), penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y glutamina al 2%.

Células primarias

Se aislaron células humanas HSPC CD34+, células T CD4+ o CD3+ y monocitos CD14+ mediante selección de perlas magnéticas positivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi) de sangre del cordón umbilical (CB) o de células mononucleares recolectadas con el consentimiento informado de voluntarios sanos de acuerdo con la Protocolo aprobado por el Comité de Ética Institucional (TIGET01). De lo contrario, las células CD34+ de CB, médula ósea (BM) o G-CSF de sangre periférica movilizada (mPB por sus siglas en inglés) se adquirieron directamente de Lonza o Hemacare. Las células T CD4+ se activaron en RPMI, suplementadas con FBS al 10%, penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 mg/ml), glutamina al 2%, fitohemaglutinina (PHA por sus siglas en inglés) (2 mg/ml, Roche) e IL-2 (300 UI/ml, Novartis) durante tres días y mantenido en RPMI, suplementado con FBS al 10%, penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 mg/ml), glutamina al 2% e IL-2 (300 Ul/ml). De lo contrario, las células T CD3+ se estimularon utilizando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD3 y CD28 humanos (Dynabeads human T-activator CD3/CD28; Invitrogen), siguiendo las instrucciones de los fabricantes, y se cultivaron en Medio Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) (GIBCO- BRL) suplementado con penicilina, estreptomicina, FBS al 10% y 5 ng/ml de IL-7 e IL-15 (PeproTech). Los macrófagos derivados de monocitos (MDM) se diferenciaron de los monocitos CD14+ aislados en DMEM complementado con 10% de FBS, penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 mg/ml), 2% de glutamina y 5% de suero humano AB (Lonza) por siete días.

Todas las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada con CO2 al 5% a 37°C.

Transducción

Se cultivaron células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC) derivadas de CB humanos en medio StemSpan sin suero (StemCell Technologies) suplementado con penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 |jg/ml), 100 ng/ml factor de células madre humanas recombinantes (rhSCF por sus siglas en inglés), 20 ng/ml de trombopoyetina humana recombinante (rhTPO por sus siglas en inglés), 100 ng/ml de ligando Flt3 humano recombinante (rhFlt3 por sus siglas en inglés) y 20 ng/ml de IL6 humana recombinante (rhIL6 por sus siglas en inglés) (todos de Peprotech) 16 hasta 24 horas antes de la transducción. A continuación, las HSPC se transdujeron a una concentración de 1x106 células por mililitro con SINLV pseudotipado con glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) durante 16 horas a la multiplicidad de infección (MOI) indicada en el mismo medio. Se colocaron células CD34+ de sangre periférica movilizadas con médula ósea y G-CSF en cultivo en pocillos tratados con cultivo no tejido recubiertos con retronectina (T100A Takara) en medio CellGro (Cell Genix) que contenía un cóctel de citocinas: 60 ng/ml de IL-3, 100 ng/ml de TPO, 300 ng/ml de SCF y 300 ng/ml de FLT-3L (todos de Cell Peprotech). A continuación, se transdujeron las células con la dosis indicada de vectores durante 14-15 horas en el mismo medio que contiene citocinas. Después de la transducción con un reportero de golpe único LV, las células se lavaron y se mantuvieron en medio libre de suero suplementado con citocinas como se indicó anteriormente hasta leer el porcentaje de células positivas por FACS, después de lo cual se mantuvieron en IMDM suplementado con FBS al 10%, 25 ng/ml de rhSCF, 5 ng/ml de rhIL6-3, 25 ng/ml de rhFlt3 y 5 ng/ml de rhTPO durante otros siete días antes del análisis del número de copias del vector. En el protocolo que prevé dos rondas de transducción, seleccionadas para aplicación clínica, las células se lavaron durante 10 horas en medio CellGro SCGM suplementado con citocinas y se sometieron a un segundo golpe de transducción en las mismas condiciones que el primero, como se informó anteriormente (Biffi, A.et al. (2013) Science 341: 1233158). Al final de la transducción, las células se contaron y recolectaron para ensayos clonogénicos, citometría de flujo y estudios in vivo. Las células restantes se sembraron en suero bovino fetal (FBS) IMDM al 10% con citocinas (IL-3, 60 ng/ml; IL-6, 60 ng/ml; SCF, 300 ng/ml) y se cultivaron durante un total de 14 días. Posteriormente, se recolectaron células para estudios moleculares y bioquímicos. Las HSPC no estimuladas se transdujeron recién aisladas en medio StemSpan suplementado con penicilina (100 UI/ml), estreptomicina (100 jg/ml) durante 16-24 horas y luego se mantuvieron en presencia de citocinas humanas y 10 jM del inhibidor de la transcriptasa inversa 3TC (SIGMA) para evitar la posterior transducción debida a la estimulación de citocinas.

Se transdujeron MDM 7 días después de la diferenciación. Los linfocitos T se transdujeron a una concentración de 106 células/ml, después de 2-3 días de estimulación. Las células se expusieron al vector durante 16-20 horas.

Compuestos

Se resuspendieron ciclosporina A (CsA), ciclosporina H (CsH) y rapamicina (todas de Sigma-Aldrich) y se almacenaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadieron al medio de transducción a la concentración indicada y se lavaron con el vector 16-20 horas después. Cuando se describió, se añadió prostaglandina E2 (dinoprostona de Yonsung) a una concentración final de 10 jM ) dos horas antes de la transducción del LV.

PCR mediada por amplificación lineal y secuenciación

Se realizó la PCR mediada por amplificación lineal (LAM por sus siglas en inglés) en ~ 300 ng de ADN extraído de células cultivadas. Brevemente, se realizaron 100 ciclos de amplificación previa por PCR lineal de uniones vectorgenoma, seguidos de captura magnética del ADN diana biotinilado mediante perlas magnéticas acopladas a estreptavidina, cebado con hexanucleótidos, digestión de restricción usando enzimas MluCl, HpyCHIV4 y Acil, y ligación a un casete de enlazador complementario del sitio de restricción. A continuación, el producto de ligación se amplificó mediante dos PCR anidadas con cebadores específicos para la repetición terminal larga (LTR) del vector y las secuencias del casete de enlace. Los amplicones LAM-PCR se separaron en un sistema de electroforesis de microchip Shimadzu MultiNA para evaluar la eficacia de la PCR y el patrón de bandas para cada muestra. Los cebadores y los protocolos térmicos de PCR utilizados se han descrito previamente (Schmidt, M. et al. (2007) Nat Methods 4: 1051­ 1057). A continuación, los productos de LAM-PCR se purificaron mediante perlas AmpureXP y se cuantificaron con un fluorómetro Qubit ™ (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). 40 ng de producto de PCR se volvieron a amplificar con cebadores Fusion-LTR (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNNNNNNXXXXXXACCCTTTTTAGTCAGTGTGGA) y Fusion-LC (CAGGGACTTCAGTGTGGAAGGAGGACTCC NNNNNNNNNNNNXXXXXXXXgatctgaattcagtggcacag), que contienen ocho etiquetas de nucleótidos (X) que permiten que las muestras tengan un código de barras tanto en el LTR como en el lado del casete del enlazador de los amplicones, secuencias específicas que permiten la secuenciación de extremos emparejados con el sistema Illumina MiSeq y una secuencia aleatoria de 12 nucleótidos (N) secuencia para aumentar la separación de grupos. La PCR se realizó utilizando Qiagen TAQ DNA Polymerase en las siguientes condiciones: 95 °C durante 2 min y 95 °C durante 45 s 58 °C durante 45 s y 72 °C durante 1 min, durante 12 ciclos, seguido de una incubación adicional de 5 min a 72 °C. Los productos lAM-PCR con código de barras se cuantificaron mediante cuantificación fluorométrica y se ensamblaron en bibliotecas en proporciones equimolares y se evitó la repetición de pares idénticos.

Análisis del sitio de inserción común

Se identificaron sitios de inserción comunes (CIS por sus siglas en inglés) significativos utilizando un enfoque de ventana deslizante (Abel, U. et al. (2007) PLoS One 2: e570) y la prueba de Grubbs para valores atípicos para el análisis del sitio de inserción (IS por sus siglas en inglés) (Biffi, A. et al. (2011) Blood 117: 5332-5339). Para el método de ventana deslizante, el paquete R (última actualización de agosto de 2012) se aprovechó utilizando la función "Cluster" que devolvió la lista de entrada original de IS con campos de anotación adicionales como "CIS max order" que representa el número máximo de integraciones contenidas en cada CIS y "Cluster ID" que representa una ventana genómica donde se agrupan uno o más intervalos CIS. Para el método centrado en genes, se utilizó la anotación de genes RefSeq (archivo de formato de características generales descargado de UCSC Genome Browser, versión hg19, NCBI Build 37) y se calculó la longitud de transcripción promedio para cada símbolo de gen. Luego, se realizó la prueba de Grubbs en busca de valores atípicos para comparar la frecuencia de integración de cada gen objetivo con respecto a la frecuencia media de todos los genes objetivo del conjunto de datos. Para comparar las distribuciones de IS recuperadas de las células transducidas en presencia de DMSO frente a las transducidas en presencia de CsA, extrajimos la cobertura de IS sobre ventanas de 5 Mb deslizando 1 Mb sobre todo el genoma. Luego calculamos el cambio de veces log2 para cada ventana, comparando CsA con DMSO.

Edición de genes de células humanas y de ratón

Se generaron plantillas de donantes de LV para HDR usando construcciones de transferencia autoactivantes de tercera generación derivadas del VIH. Se prepararon reservas de IDLV y se titularon como se describió previamente (Lombardo, A. et al. (2007) Nat Biotechnol 25: 1298-1306). Para los experimentos de edición de genes en HSPC de ratón, se cruzaron ratones Gt (ROSA) 26Sortm1.1 (CAG-cas9 *, - EGf P) Fezh/J con ratones SCID-X1 C57B6 humanizados, que tienen un knock-in de un IL2RG humano mutado en lugar del gen Il2rg murino (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411). Las HSPC se purificaron de ratones donantes de 8 semanas de edad mediante selección de Lin utilizando el kit de agotamiento de células de linaje de ratón (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las ceúlas Lin se cultivaron a una concentración de 106 células/ml en StemSpanmedium sin suero (StemCell Technologies) que contenía penicilina, estreptomicina, glutamina, 200 ng/ml de proteína recombinante B18R (eBiovision) y una combinación de citocinas de ratón (20 ng/ml de IL-3, 100 ng/ml de SCF, 100 ng/ml de Flt-3L, 50 ng/ml de TPO, todos de Peprotech). Las células Lin se preestimularon durante 2 horas y luego se transdujeron con IDLV que comprende una plantilla de donante para corregir IL2RG (más un casete reportero para rastrear las células editadas) y expresar el ARNg afín para editar IL2RG bajo el control del promotor constitutivo PollII U6 (secuencia genómica reconocida: TTCCACAGAGTGGGTTAAAGcgg) (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411). Después de 24 horas de transducción a MOI 100 en presencia o no de CsH, las células se lavaron con PBS y luego se cultivaron in vitro durante 3 días adicionales para cuantificar la fracción de células editadas mediante citometría de flujo. Para los experimentos de edición de genes en HSPC humana, se estimularon 106 células CD34+/ml en medio StemSpan sin suero (StemCell Technologies) suplementado con penicilina, estreptomicina, glutamina, SR-1 1 |^jM (Biovision), UM171 50 |^jM (STEMCell Technologies), PGE2 10 j M añadida solo al comienzo del cultivo (Cayman) y citocinas humanas de acción temprana (SCF 100 ng/ml, Flt3-L 100 ng/ml, TPO 20 ng/ml e IL-6 20 ng/ml; todos adquiridos de Peprotech) (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411). La transducción con IDLV se realizó a MOI 100, en presencia o no de CsH, después de 2 días de preestimulación. Plantillas de donantes de IDLV con homologías para el locus AAVS1 (que codifican un casete reportero PGK.GFP; (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-240) o teniendo como diana al intrón 1 de IL2RG (que codifica el ADNc correctivo de IL2RG; (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411) se utilizaron como se indica. Después de 24 horas desde la transducción, las células se lavaron con PBS y se electroporaron (P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit, programa EO-100; Lonza) con 1,25 ^j M de ribonucleoproteínas (RNP por sus siglas en inglés). Las RNP se ensamblaron incubando a una proporción molar de 1:1,5 proteína cas9 s.p. (Integrated DNA Technologies) con cr: tracrRNA sintético (Integrated DNA Technologies) durante 10' a 25 °C. Se añadió potenciador de electroporación (Integrated DNA Technologies) antes de la electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias genómicas reconocidas por los ARNg son las siguientes: TCACCAATCCTGTCCCTAGtgg para el locus AAVS1 y ACTGGCCATTACAATCATGTggg para el intrón 1 IL2RG. La eficiencia de la edición de genes se midió a partir de células cultivadas in vitro 3 días después de la electroporación. Para las células editadas con AAVS1, la edición mediante reparación dirigida por homología (HDR) se cuantificó mediante citometría de flujo midiendo el porcentaje de células que expresan el marcador GFP. Para las células editadas con IL2RG, la HDR se cuantificó mediante análisis de PCR de gotitas digitales diseñando cebadores y sonda en la unión entre la secuencia del vector y el locus objetivo y en las secuencias de control utilizadas como normalizador (genes TTC5 humanos) como se describió anteriormente (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411).

Trasplante de HSPC humano en ratones NSG

Se adquirieron ratones NOD-SCID-IL2Rg -/-(NSG) en el laboratorio Jackson. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Ospedale San Raffaele (IACUC 784) y se comunicaron al Ministerio de Salud y las autoridades locales de acuerdo con la ley italiana. Se preestimularon y transdujeron células CD34+ derivadas de médula ósea humana como se describió anteriormente con IDUA-LV a una MOI de 100 en presencia o no de DMSO, CsA y/o rapamicina como se indica. Se preestimularon y transdujeron células mPB CD34+ humanas como se describió anteriormente con IDUA-LV a una MOI de 50 en presencia o no de DMSO, CsH y/o 16-16 dimetil prostaglandina E2 o su combinación como se indica. Después de la transducción, se infundieron 2-5 x 105 células en la vena de la cola de ratones NSG de 8-10 semanas de edad irradiados subletalmente (dosis de radiación: 200 cGy para ratones que pesan 18-25 gy 220 cGy para ratones de más de 25 g de peso). Las células transducidas y no transducidas también se cultivaron in vitro durante 14 días para un análisis adicional. A continuación, se utilizaron células cultivadas in vitro y células BM aisladas de ratones trasplantados en el momento del sacrificio para cuantificar el VCN mediante qPCR.

Ensayo de células formadoras de colonias

Los ensayos de células formadoras de colonias se realizaron sembrando 8 x 102 HSPC humanas transducidas en presencia de los diferentes compuestos en un medio basado en metilcelulosa (Methocult GF4434; Stem Cell Technologies). Quince días después, las colonias se puntuaron mediante microscopía óptica para determinar el número de colonias y la morfología. c FU-E y BFU-E se puntuaron como colonias eritroides, mientras que CFU-G, CFU-M y CFU-GM y CFU-GEMM se puntuaron como colonias mieloides. Además, se extrajeron colonias individuales para análisis molecular.

Citometría de flujo

Todos los análisis citométricos se realizaron utilizando el instrumento FACSCanto III y los instrumentos LSRFortessa (BD Biosciences) y se analizaron con el software FACS Express (De Novo Software).

Células transducidas

La expresión de GFP o BFP en células transducidas se midió 5-7 días después de la transducción. Los MDM adherentes se separaron raspando en PBS-EDTA 5 mM, se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía suero bovino fetal (FBS) al 2%. Las células que crecieron en suspensión se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2%. Para medir la composición de la subpoblación de HSPC, las células se recolectaron 16 o 72 horas después de la transducción, se incubaron con anticuerpos bloqueadores de receptores antihumanos durante 15 min a 4 °C y luego se tiñeron durante 20 min a 4 °C con anticuerpos antihumano CD34, CD38, CD45RA, CD90 o antihumano CD34, CD133, CD90 (para los anticuerpos, consulte la Tabla 3). Para excluir las células muertas del análisis, se añadieron 10 ng/ml de 7-aminoactinomicina D (7-AAD).

Colonias humanas

Se recogieron células humanas diferenciadas de CFC (por sus siglas en inglés) de una única placa (conjunto de colonias) y se mezclaron en una única suspensión celular. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2%. Para la inmunotinción, las células se incubaron con anticuerpos bloqueadores del receptor antihumano durante 15 min a 4 °C y luego se tiñeron durante 20 min a 4 °C con anticuerpos anti-CD235a humano y CD33 (para los anticuerpos, ver Tabla 3). Para excluir las células muertas del análisis, las células se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía 10 ng/ml de 7-aminoactinomicina D (7-AAD).

Sangre periférica de ratones

Para cada ratón, se añadieron 250 |jl de sangre periférica a 15 |jl de PBS que contenía 45 mg/ml de EDTA. Para la inmunotinción, primero se incubó un volumen conocido de sangre completa (100 jl) con anticuerpos bloqueantes anti­ receptor F^oyIN/^m humano (Cd16/Cd32) durante 15 min a 4 °C y luego se incubó en presencia de anticuerpos monoclonales (para anticuerpos, ver Tabla 3) durante 20 min a 4 °C. Los eritrocitos se eliminaron mediante lisis con la estación de trabajo TQ-Prep (Beckman-Coulter) en presencia de un volumen igual de FBS (100 ml) para proteger los glóbulos blancos.

Médula ósea

Las células de BM se obtuvieron lavando los fémures en una solución de PBS al 2% de FBS. Las células (1 x 106 células) se lavaron, se resuspendieron en 100 j l de PBS que contenía FBS al 2% y se incubaron con anticuerpos bloqueantes anti-receptor humano (Cd16/Cd32) durante 15 min a 4°C. Luego se realizó la tinción con anticuerpos monoclonales (para anticuerpos, ver Tabla 3) durante 20 min a 4 °C. Las células se lavaron y finalmente se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2%.

Bazo

En primer lugar, se rompieron los bazos y la suspensión celular resultante se pasó a través de un filtro de nailon de 40 jm y se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría que contenía EDTA 2 mM y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5%. Las células se incubaron con anticuerpos bloqueantes anti-receptor humano (Cd16/Cd32) durante 15 min a 4 °C y luego se tiñeron con anticuerpos monoclonales anti-humanos (para anticuerpos, ver Tabla 3) durante 20 min a 4 °C. Finalmente, las células se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2%.

Citometría de flujo Ki67 y Hoechst

Las células se lavaron y fijaron usando tampón BD Cytofix (Cat. # 554655), lavado y permeabilizado con BD Perm 2 (Cat. # 347692), se lavó y se tiñó con anticuerpo Ki67 conjugado con PE (BD) y finalmente se resuspendió en tampón BD Cytofix con Hoechst a 1 |jg/ml. A continuación, las células se analizaron en una máquina BD LSRII con un láser UV. Ensayo de proliferación celular

Las células se tiñeron con Cell Proliferation Dye eFluor® 670 (Affimetrix, eBioscience) después de 24 horas de preestimulación de citocinas y antes de la transducción celular. Este tinte fluorescente se une a cualquier proteína celular que contenga aminas primarias y, a medida que las células se dividen, el tinte se distribuye por igual entre las células hijas, lo que puede medirse como la mitad sucesiva de la intensidad de fluorescencia del tinte. En diferentes puntos de tiempo después de la transducción, las células se recolectaron y analizaron mediante citometría de flujo. El tinte de proliferación celular eFluor® 670 tiene un pico de excitación de 647 nm y puede ser excitado por la línea láser roja (633 nm). Tiene una emisión máxima de 670 nm y se puede detectar con un filtro de paso de banda 660/20 (equivalente a APC, Alexa Fluor® 647 o eFluor® 660).

Cuantificación de ROS (por sus siglas en inglés)

Las células se tiñeron con CM-H2DCFDA (Thermo Fisher Scientific) que se difunde pasivamente en las células donde sus grupos acetato son escindidos por esterasas intracelulares y su grupo clorometilo reactivo con tiol reacciona con glutatión intracelular y otros tioles. La oxidación subsiguiente produce un aducto fluorescente que queda atrapado dentro de la célula y se monitorea usando un citómetro de flujo. Se añadieron N-acetil-L-cisteína (NAC, de SIGMA) y peróxido de hidrógeno (H2O2, SIGMA) con la sonda fluorescente a una concentración de 1 mM y 10 mM, respectivamente.

Extracción de ARN, qPCR y análisis de expresión génica

La extracción de ARN de las células se realizó usando el mini kit RNeasy Plus (Qiagen). Brevemente, las células se lisaron en tampón RLT plus, suplementado con beta-mercaptoetanol. A continuación, se extrajo el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARNm extraídos se retrotranscribieron utilizando el kit SuperScript Vilo (11754250; Invitrogen). Los análisis de Q-PCR se realizaron utilizando sondas TaqMan de Applied Biosystems (ver más abajo). Se ejecutó Q-PCR durante 40 ciclos usando el instrumento Viia 7 mientras que luego se usó el software Viia 7 para extraer los datos brutos (Ct). Para determinar la expresión génica, se calculó la diferencia (ACt) entre el ciclo umbral (Ct) de cada gen y el del gen de referencia aplicando un umbral igual. Los valores de cuantificación relativa se calcularon como la expresión de cambio de veces del gen de interés sobre su expresión en la muestra de referencia, mediante la fórmula 2-AACt. La expresión se normalizó utilizando el gen constitutivo HPRT1. Se utilizaron las siguientes sondas Taqman de Applied Biosystems: PPIA (Hs99999904_m1), PPIB (Hs00168719_m1), OAS1 (Hs00973637_m1), IRF7 (Hs01014809_g1), MX2 (Hs01550808_m1) y HPRT1 (Hs01003267_m1).

Intermedios de replicación

Se transdujeron células CD34+ derivadas de CB a una MOI de 100, en presencia o ausencia de CsA o CsH. Para analizar los intermedios de replicación viral, las células transducidas se lavaron y resuspendieron en tampón de lisis Monini (0,1% polioxietilen 10 lauril éter (Sigma), 0,1 mg/ml de proteinasa K (Promega)) (25 jl/1 x 105 células), se incubaron a 65 °C durante 2 h y se inactivaron por calor a 94 °C durante 15 min (Monini, P. et al. (1999) Blood 93: 4044­ 4058). La lisis de las células para recuperar los intermedios Late-RT y 2-LTR se realizó a las 6 o 24 horas después de la transducción, respectivamente. Los círculos de Late-RT y 2LTR se midieron mediante ensayo cuantitativo de PCR digital de gotas (dd-PCR por sus siglas en inglés) con los cebadores que se describen a continuación y se normalizaron utilizando el gen TERT humano.

Los cebadores para detectar productos de late-RT son:

LATE RT fw (sentido DU3): 5'-TCACTCCCAACGAAGACAAGATC-3 '(Matrai, J. et al. (2011) Hepatology 53: 1696-1707) LATE RT rv (5NC2 rev): 5'-GAGTCCTGCGTCGAGAGAG-3 '(Naldini, L. et al. (1996) Science 272: 263-267)

Los cebadores para detectar productos 2LTR son:

2LTR fw (2junct): 5'-CAGT GT GGAAAAT CT CT AGCAGT AC-3'

2LTR rv (J2 rev): 5'-GCCGTGCGCGCTTCAGCAAGC-3'

Los cebadores para detectar TELO son:

hTelo fw: 5'-GGCACACGTGGCTTTTCG-3' (Follenzi, A. et al. (2002) Methods Enzymol 346: 454-465)

hTelo rev: 5'-GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA-3'

Extracción de ADN genómico y qPCR

El ADN de los cultivos celulares y la sangre se extrajo usando un instrumento Maxwell 16 (Promega) o un micro kit de ADN para cultivos celulares y de sangre (Qiagen). Las copias de vector por genoma diploide (número de copia de vector, VCN) de los vectores lentivirales integrados se cuantificaron mediante PCR digital cuantitativa de gotitas (dd-PCR) utilizando los siguientes cebadores (sentido del VIH: 5'-TACTGACGCTCTCGCACC-3'; antisentido del VIH: 5'-TCTCGACGCAGGACTCG-3 ') y sonda (FAM 5'-ATCTCTCTCCTTCTAGCCTC-3 ') contra la región del sitio de unión del cebador de LV. La cuantificación de VCN del ADN lentiviral total (integrado y no integrado) se realizó como se describió anteriormente (Matrai, J. et al. (2011) Hepatology 53: 1696-1707) a los tres días posteriores a la transducción. El número de copias del genoma del vector retroviral transcrito de forma inversa (integrado y no integrado) se realizó mediante PCR digital cuantitativa de gotas (dd-PCR) discriminándolo del plásmido transferido de la transfección transitoria utilizando los siguientes cebadores: RT-rV; Sentido AU3: 5'-cGAGCTCAATAAAAGAGCCCAC-3', PBS antisentido: 5'-GAGTCCTGCGTCGGAGAGAG-3'. Los números de copias del vector y los intermedios de replicación se normalizaron al contenido de ADN genómico, que se evaluó utilizando el gen TERT humano. El análisis de VCN mediante dd-PCR implicó la cuantificación de los loci diana y de referencia mediante el uso de ensayos dúplex de diana y de referencia. En el software QuantaSoft™, el número de copias se determinó calculando la relación entre la concentración de la molécula objetivo y la concentración de la molécula de referencia, multiplicada por el número de copias de las especies de referencia en el genoma (normalmente 2).

Tabla 1. Reacciones de PCR para dd-PCR.

Western Blot

Se prepararon extractos de células completas a partir de HSPC como se describió anteriormente (Kajaste-Rudnitski, A. et al. (2011) J Virol 85: 5183-5196; Kajaste-Rudnitski, A. et al. (2006) J Biol Chem 281: 4624-4637). Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF mediante electrotransferencia y se transfirieron con un anticuerpo policlonal de ratón (Ab) producido contra CypA (Santa-Cruz Biotechnology). Se usó un Ac anti-actina (Sigma-Aldrich) como normalizador.

Análisis estadístico

En todos los estudios, los valores se expresan como media ± error estándar de la media (SEM por sus siglas en inglés). Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados o ANOVA para comparaciones múltiples, como se indica. Los porcentajes se convirtieron en log ODD para el análisis estadístico. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p <0,05.

T l Li ni r nih m n iliz r l i m rí fl

Resultados

Los protocolos abreviados basados en CsA y rapamicina logran de manera segura una eficiencia de transferencia de genes similar a la del estándar clínico actual y mejoran el injerto de HSPC

Se transdujeron células CD34+ derivadas de BM humana con un solo golpe de LV de grado clínico que expresaba IDUA o que expresaba ARSA con o sin los compuestos. Como control, las células se transdujeron con el protocolo de transducción clínica estándar actual, que consiste en dos golpes de transducción (TD) a un MOI de 100 de vector (Figura 1A). La CsA y la rapamicina pudieron aumentar la eficiencia de transducción de IDUA de grado clínico y ARSA-LV en comparación con el control de un solo golpe sin fármacos, alcanzando VCN comparable al estándar de oro de dos golpes in vitro (Figura 1B-C). Además, no se observaron alteraciones en la capacidad de formación de colonias (Figura 1D).

El análisis FACS de la sangre periférica (PB) de ratones NSG trasplantados con HSPC transducidas de un solo golpe mostró un mejor injerto de células CD45+ humanas en comparación con el protocolo clínico, particularmente con CsA, hasta 16 semanas después del trasplante (Figura 2A). Además, no se observaron alteraciones en las diferentes salidas de linaje (Figura 2B). Ambos protocolos permitieron una mejor transducción de HSPC de repoblación a largo plazo in vivo, ya que se lograron VCN/genoma humano comparable al estándar de oro de dos golpes en la BM y en el bazo de los ratones 22 semanas después del trasplante (Figura 2C). El período de cultivo ex vivo más corto mejoró per se el injerto de HSPC también en la BM y en el bazo de los ratones para todos los protocolos más cortos (Figura 2D).

Se ha demostrado previamente que la rapamicina no afecta el perfil del sitio de integración del LV en las HSPC humanas (Wang, C.X. et al. (2014). La rapamicina alivia la resistencia a la transducción de vectores lentivirales en células madre hematopoyéticas humanas y de ratón. (Blood). Evaluamos aquí el perfil de seguridad del protocolo de transferencia de genes basado en CsA en términos de perfil del sitio de integración LV. Aunque se recuperaron sistemáticamente más sitios de integración en presencia de CsA, de acuerdo con su capacidad para aumentar las copias de vector por célula, no detectamos diferencias significativas entre la distribución de los sitios de integración recuperados de HSPC transducidos en ausencia de presencia de CsA y en comparación con los numerosos estudios de IS obtenidos de ensayos recientes de terapia génica (Aiuti, A. et al. (2013) Science 341: 1233151; Biffi, A. et al. (2013) Science 341: 1233158) (Figura 9).

La CsA conserva las HSC primitivas ex vivo independientemente de la transducción

Para investigar las razones detrás del mayor injerto de células humanas observado para la condición de CsA, evaluamos el impacto de CsA en la composición de células madre in vitro. Se transdujeron células CD34+ derivadas de BM humana con SINLV-GFP a una m Oi de 10, en presencia o ausencia de CsA. El porcentaje de células madre y progenitoras primitivas se evaluó mediante FACS 16 horas después de la TD (Figura 3A). La exposición a CsA in vitro aumenta el porcentaje de los progenitores más primitivos y multipotentes, al tiempo que disminuye los más comprometidos. Es de destacar que no se observaron alteraciones en la diferenciación mieloide en cultivo a lo largo del tiempo. El porcentaje de células madre y progenitoras primitivas se evaluó mediante FACS 72 horas después de la TD (Figura 3B). La exposición a CsA in vitro aún aumentó el porcentaje de los progenitores más primitivos y multipotentes 3 días después de la TD.

Para investigar si tasas de proliferación más lentas podrían explicar la conservación de las células más primitivas en presencia de CsA, se tiñeron células CD34+ derivadas de BM humana con un colorante rojo fluorescente que puede usarse para monitorear divisiones celulares individuales. Después de esta tinción, las células se transdujeron con o sin CsA y se analizaron por FACS en diferentes momentos después de la TD para monitorear las tasas de proliferación celular (Figura 4A). CsA reduce significativamente la proliferación celular in vitro (Figura 4B). Los niveles de colorante de proliferación celular dentro de las diferentes subpoblaciones de HSPC se evaluaron mediante FACS 16 y 72 horas después de la transducción (Figura 4C-D). La CsA produjo una reducción igual de la proliferación celular en todas las subpoblaciones de HSPC que van desde los progenitores más comprometidos hasta las células más primitivas.

Las HSC primitivas se caracterizan por un estado de ciclo celular más inactivo. Investigamos si el aumento mediado por CsA de las HSC se asocia con una mayor fracción de células en la fase G0 del ciclo celular. Utilizamos una estrategia de tinción combinatoria basada en FACS que nos permite distinguir las células en las fases G0, G1, S y G2-M del ciclo celular. El tratamiento con CsA aumentó significativamente la proporción de células arrestadas en la fase G0 inactiva del ciclo (Figura 4D). Dado que el estrés oxidativo juega un papel crítico en la biología de las HSPC y se ha sugerido que la CsA afecta el equilibrio redox en las HSPC (Mantel, C.R. et al. (2015) Cell 161: 1553-1565), también evaluamos los efectos de CsA en los niveles de ROS en HSPC derivada de BM humana. En nuestro entorno experimental, la CsA no produjo alteraciones en los niveles de ROS medidos in vitro (Figura 4E). En conjunto, la disminución mediada por CsA en la proliferación de HSPC y el mantenimiento de la quiescencia podría contribuir potencialmente a preservar sus propiedades de células madre y producir un mayor injerto in vivo.

Una ciclosporina independiente de CypA revela un bloqueo temprano de la transducción del VI en las HSPC

Para abordar directamente el papel de CypA durante la transducción del LV y los efectos mediados por CsA en las HSPC humanas, eliminamos (KD por sus siglas en inglés) este cofactor del huésped en células CD34+ derivadas de CB usando ARNhc (Figura 5A-B) y evaluamos su impacto en la transducción. De acuerdo con un papel positivo de CypA durante la transducción del LV (Towers, G.J. et al. (2014) Cell Host Microbe 16: 10-18), KD de CypA condujo a una menor transducción en HSPC humana (Figura 5C). Estos resultados implican que la capacidad de CsA para aumentar la transducción del LV en HSPC es probablemente subóptima dado que también interferirá con esta interacción positiva del vector con CypA.

Luego probamos una isoforma natural de CsA, ciclosporina H (CsH), que no se une a CypA y no es inmunosupresora (Jeffery, J.R. (1991) Clin Biochem 24: 15-21). Sorprendentemente, la CsH aumentó la transducción del LV en las HSPC humanas y murinas, incluidas las HSPC derivadas de mPB clínicamente relevantes, significativamente más eficientemente que la CsA (Figura 5D-F; Figura 6M, N). Es importante destacar que este aumento en la transducción se produjo en ausencia de signos de toxicidad in vitro (Figura 5G). A diferencia de CsA, y en línea con la característica no inmunosupresora de CsH, no se observó retraso de proliferación en este caso (Figura 5H). Curiosamente, la CsH fue aditiva con otros dos compuestos de acción temprana, rapamicina (Rapa) (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352­ 362; Wang, C.X. et al. (2014). La rapamicina alivia la resistencia a la transducción de vectores lentivirales en células madre hematopoyéticas humanas y de ratón (Blood) y la prostaglandina E2 (PGE2; Zonari, E. et al. (2017). Efficient Ex Vivo Engineering and Expansion of Highly Purified Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Populations for Gene Therapy. Stem Cell Reports) pero no con CsA (Figura 5I-J), lo que sugiere que ambas ciclosporinas actúan sobre el mismo bloque de restricción lentiviral que, sin embargo, es diferente de los eventos tempranos dirigidos por Rapa y PGE2, respectivamente. Es importante destacar que la CsH aumentó significativamente las eficiencias de transducción en todas las subpoblaciones de CD34+, incluida la fracción más primitiva CD34+CD133+CD90+ (Figura 5K), y en SCID repoblando células CD34+ derivadas de mPB transducidas con un LV de grado clínico (Figuras 5L-M, 10 y 11) sin alterar la composición de la subpoblación y el estado del ciclo celular (Figura 5N). Cabe destacar que la CsH también mejoró de manera eficiente la transducción gammaretroviral en las HSPC (Figura 50), lo que sugiere que podría ser útil también para estrategias de terapia génica basadas en yRV (Ferrua, F. et al. (2017) Hum Gene Ther 28: 972-981).

También probamos el impacto de CsH en la transducción de LV en otros tipos de células. La CsH no alteró la transducción en macrófagos primarios derivados de monocitos humanos (MDM) (Figura 6A), independientemente de la restricción del LV mediada por SAMHD1 que puede aliviarse mediante la exposición previa de las células a la proteína accesoria del VIS Vpx (Berger, G. et al. (2011) Nat Protoc 6: 806-816). Por el contrario, vimos un ligero aumento en el porcentaje de células GFP+ en el contexto de células T CD4+ activadas (Figura 6B). Estos datos están en marcado contraste con lo que nosotros y otros hemos observado para CsA en estos compartimentos celulares, lo que subraya aún más cómo los efectos relacionados con CypA de CsA probablemente enmascaran otros beneficios potenciales de preintegración que puede tener en la transducción del LV. De hecho, el mutante de la cápside LV P90A independiente de CypA se benefició de CsA en un grado similar o incluso mayor en comparación con CsH (Figura 6C). Los niveles de transducción del LV mutante de la cápside N74D independiente de CPSF6 aumentaron en presencia de CsH (Figura 6D) descartando esta interacción cápside-huésped del mecanismo de acción de CsH. Es de destacar que el virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV) y los vectores derivados de yRV, que no interactúan con CypA (Fujita, M. et al. (2001) J Virol 75: 10527-10531; Sokolskaja, E. et al. (2006) Curr Opin Microbiol 9: 404-408), se beneficiaron de CsH pero también de CsA (Figura 6E), lo que confirma aún más el alivio independiente de CypA de la restricción del LV por ambas ciclosporinas. De acuerdo, y a diferencia de la CsA, la CsH fue capaz de aumentar la transducción del LV también en las HSPC no estimuladas (Figura 6G), así como de utilizar un LV defectuoso en integrasa (IDLV) (Figura 6H), probablemente debido al mantenimiento de la interacción beneficiosa de el vector con CypA en estos entornos experimentales. En línea con un efecto de preintegración anterior, CsH condujo a un aumento significativo en los intermedios de replicación del círculo de late-RT y 2LTR que no se vieron afectados por CsA (Figura 6I), como también informamos anteriormente (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362).

Todos los vectores usados en este trabajo hasta ahora se han pseudotipado con la glicoproteína de la envoltura VSV-g, que es la más comúnmente usada en el contexto de la terapia génica del LV (Cronin, J. et al. (2005) Curr Gene Ther 5: 387-398). Se ha demostrado que la rapamicina facilita la endocitosis de LV dependiente del pH mediada por VSV-g (Wang, C.X. et al. (2014). La rapamicina alivia la resistencia a la transducción de vectores lentivirales en células madre hematopoyéticas humanas y de ratón. (Blood). Para evaluar si la entrada de la partícula LV mediada por VSV-g podría estar involucrada en el aumento de la transducción inducido por CsH, generamos LV pseudotipado con la glicoproteína de la envoltura retroviral endógena de babuino modificada (BaEV-TR) que ingresa a través de la fusión mediada por receptor directamente en la membrana plasmática y se ha descrito previamente para transducir eficazmente varias células hematopoyéticas humanas primarias, incluidas las HSPC (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221­ 1231). Curiosamente, no se pudo detectar ningún beneficio claro para la transducción de LV pseudotipada de BaEV-TR en CB y HSPC derivada de mPB en presencia de CsH, mientras que CsA de hecho perjudicó la transducción en este escenario (Figura 6J-K). Ambas ciclosporinas no mejoraron la transducción del vector adenoasociado (AAV por sus siglas en inglés) (Figura 6L) independientemente de su entrada mediada por endocitosis a las células diana (Nonnenmacher, M. et al. (2012) Gene Ther 19: 649-658).

CsH aumenta la transducción de L V y la eficiencia de edición de genes en HSPC que repueblan SCID

Para evaluar la transducción mejorada con CsH en un entorno clínicamente más relevante, transducimos células mPB-CD34+ humanas con LV de grado clínico que expresa el transgén de alfa-L-iduronidasa (IDUA) (IDUA-LV), diseñado para tratar pacientes afectados por mucopolisacaridosis de tipo I (MPS-I) (Visigalli, I. et al. (2016) Hum Gene Ther 27: 813-829; Visigalli, I. et al. (2010) Blood 116: 5130-5139). Trasplantamos las células transducidas en presencia/ausencia de CsH, PGE-2 o su combinación en el modelo de ratón de xenoinjerto NSG de hematopoyesis humana para seguir la eficacia de injerto y transducción in vivo (Figura 10A). A modo de comparación, las células se transdujeron dos veces, como dicta el protocolo estándar actual. No se pudieron observar diferencias en la capacidad de formación de colonias entre las células de control y las tratadas con CsH/PGE-2 (Figura 10B). Sorprendentemente, una sola dosis de LV en presencia de CsH fue suficiente para producir un marcado genético significativamente más alto in vitro (Figura 11A, B), así como en HSC de repoblación a largo plazo y derivación de la progenie in vivo (Figura 10C; Figura 11C, D). Esto superó el estándar actual que consiste en dos rondas de transducción y logró un aumento de casi 10 veces en el marcado de genes a largo plazo in vivo en comparación con el grupo de control de transducción única. Aunque CsH y PGE-2 fueron aditivos in vitro también en este entorno (Figura 11A, B), así como durante la fase de injerto temprana in vivo (Figura 11C), sorprendentemente el beneficio combinatorio se perdió en la repoblación de HSC a largo plazo en el médula ósea y progenie en el bazo de los ratones (Figura 10C; Figura 11D). La exposición a CsH no alteró la capacidad de injerto a corto plazo de HSPC en comparación con el protocolo de dos golpes, mientras que los ratones trasplantados con células transducidas de control de un solo golpe mostraron un mayor injerto de células CD45+ humanas en comparación con el protocolo de dos golpes temprano a las 8 semanas posteriores al trasplante (Figura 10D), de acuerdo con la noción de que un cultivo ex vivo más corto preserva la capacidad de repoblación de HSPC (Zonari, E. et al. (2017) Stem Cell Reports 8: 977-990). La falta de tal beneficio en el contexto de las células tratadas con CsH podría estar relacionada con la transducción mejorada, ya que recientemente hemos demostrado que la transferencia de genes lentivirales afecta la recuperación de HSPC ex vivo y su injerto in vivo a corto plazo de una manera dependiente de la dosis debido a la activación mediada por vector de la cascada de señalización de p53 (Piras, F. et al. (2017) EMBO Mol Med 9: 1198-1211). De acuerdo, la exposición de células mPB-CD34+ a CsH sola no afectó al injerto temprano de HSPC en comparación con las células de control (Figura 10E). Es importante destacar que el mayor injerto asociado con un cultivo ex vivo más corto se recuperó a largo plazo en la BM y en el bazo de los ratones también para las células transducidas en presencia de CsH (Figura 10F; Figura 11E, F).

La disponibilidad subóptima de la plantilla de ADN del donante puede contribuir a una eficiencia de edición de genes deficiente mediante recombinación homóloga en HSPC humanas (Naldini, L. (2011) Nat Rev Genet 12: 301-315). IDLV y AAV son actualmente las plataformas de vectores más utilizadas para la entrega de ADN de donantes en protocolos de edición de genes (Naldini, L. (2015) Nature 526: 351-360). Como CsH mejoró la transducción de IDLV en HSPC humanas, probamos su efecto sobre la eficiencia de la edición de genes de HSPC mediada por IDLV (Figura 10G). Sorprendentemente, la entrega del IDLV del donante en presencia de CsH aumentó la eficiencia de edición de genes en HSPC humanas al doble (Figura 10H) sin alterar la composición relativa de las subpoblaciones hematopoyéticas tres días después del tratamiento (Figura 11G). Este aumento también se produjo en la fracción primitiva CD34+CD133+ CD90+ (Figura 10H), lo que sugiere que CsH favorece la edición en la fracción de repoblación a largo plazo de las HSPC. De hecho, las células editadas en presencia de CsH repoblaron eficazmente ratones NSG y la eficacia de direccionamiento significativamente mayor se mantuvo a largo plazo en sangre periférica, así como en la médula ósea de ratones (Figura 10I-K). Es importante destacar que el aumento en la eficacia del direccionamiento génico se confirmó en toda la progenie derivada de HSPC en la médula ósea (Figura 11H, I). Tomados en conjunto, estos resultados identifican a CsH como el potenciador de mejor rendimiento de la transferencia y edición de genes de HSPC descrito hasta ahora y apoyan firmemente su uso en la ingeniería genética de HSPC terapéuticos.

Las ciclosporinas contrarrestan un bloqueo inducible por IFN a la entrada del vector lentiviral dependiente de VSV-g

Con el fin de obtener una visión mecanicista con respecto a cómo CsH mejora la transferencia de genes y la edición en HSPC, aprovechamos la observación de que se ha informado que CsA mejora la transducción en células THP-1 monocíticas estimuladas con IFNa humano (Bulli, L. et al. (2016) J Virol 90: 7469-7480). Primero confirmamos que CsA rescata parcialmente la inhibición inducida por IFNa de la transducción de LV pseudotipada de VSV-g en células THP-1 (Figura 7 ^a ). En comparación, CsH rescató completamente la inhibición de IFNa (Figura 7A), lo que sugiere que CsH es más potente para aliviar el bloqueo antivírico mediado por IFN de tipo I. Además, el rescate de la infección es independiente del efecto inmunosupresor de CsA mediado por la inhibición de calcineurina (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362). El huésped diana de CsH mejor caracterizado es el receptor 1 del péptido formilo (FPR1 por sus siglas en inglés) involucrado en la migración de neutrófilos y las defensas antimicrobianas (de Paulis, A. et al. (1996) J Allergy Clin Immunol 98: 152-164; Prevete, N. et al. (2015) Pharmacol Res 102: 184-191). Sin embargo, FPR1 no está involucrado en la restricción mediada por IFNa que es inhibida por ciclosporinas, ya que el IFN continuó suprimiendo la transducción en células THP-1 empobrecidas para FPR1 (Figura 12A). Curiosamente, este comportamiento fue específico de la línea celular THP-1, ya que ni el tratamiento con IFNa ni con ciclosporina afectaron la transducción del LV en la línea celular de leucemia mielógena crónica K562 (Figura 7B), a pesar de que ambas células respondieron al IFNa de manera similar, evidenciado por la regulación positiva de genes estimulados por IFN de tipo I (ISG) (Figura 12B, C). Esto sugiere que los ISG y/o cofactores específicos del tipo celular están implicados en la transducción sensible a ciclosporina en ^t HP-1 y HSPC. Ambas ciclosporinas también rescataron la transducción del LV en HSPC humanas pretratadas con IFNa, teniendo la CsH de nuevo un efecto más potente en comparación con la CsA (Figura 7C; Figura 12D).

Los vectores pseudotipados con la glicoproteína de envoltura anfotrópica derivada de MLV permanecieron insensibles a la inhibición mediada por IFN de tipo I (Figura 7D), demostrando que la sensibilidad de restricción está influenciada por la envoltura viral. De acuerdo con un mecanismo de acción dependiente de la envoltura, LV pseudotipado con la glicoproteína de envoltura retroviral endógena de babuino modificada (BaEV-TR), que ingresa a través de la fusión mediada por receptor directamente en la membrana plasmática (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221­ 1231), permaneció insensible tanto al IFN de tipo I como a las ciclosporinas en las células THP-1 (Figura 7E). Es importante destacar que la transducción por LV pseudotipado de BaEV-TR no fue mejorada por el tratamiento con ciclosporina en HSPC y fue menos sensible a IFNa (Figura 7F). Tomados en conjunto, estos resultados son consistentes con un bloqueo inducido por IFN de tipo I a la entrada del LV mediada por VSV-g en las células THP-1 que también es activa y sensible a las ciclosporinas en las HSPC no tratadas.

La CsH aumenta la eficiencia de edición de genes en HSPC humanas y murinas, así como en células T humanas primarias

Uno de los obstáculos para la edición eficiente de genes en HSPC humanas puede residir en la disponibilidad subóptima de la plantilla de ADN del donante (Naldini, L. (2011) Nat Rev Genet 12: 301-315). IDLV y los vectores adenoasociados (AAV) son actualmente las plataformas de vectores más utilizadas para vehículos de administración de ADN de donantes en protocolos de edición de genes (Naldini, L. (2015) Nature 526: 351-360). Dada la capacidad de CsH para aumentar también la eficiencia de transducción de IDLV en HSPC humanas y murinas, probamos sus efectos en el contexto de enfoques de edición de genes HSPC. Sorprendentemente, la administración del IDLV del donante en presencia de CsH aumentó la eficacia del direccionamiento génico en dos veces tanto en las HSPC murinas como en las humanas (Figura 8A-B). Este aumento se produjo en todas las subpoblaciones, incluida la fracción CD34+CD133+ CD90+ más primitiva, lo que sugiere que CsH podría favorecer la edición también en la fracción de repoblación a largo plazo de las HSPC, que se ha informado que es la más refractaria al direccionamiento génico mediado recombinación homóloga (HR) (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-240). No se observaron cambios significativos en la composición relativa de las subpoblaciones hematopoyéticas 3 días después del tratamiento, lo que sugiere que la inclusión de CsH durante el procedimiento de edición de genes no afectó negativamente la supervivencia y el crecimiento de las células más primitivas (Figura 8B, panel derecho). Además, el uso de CsH durante la edición de genes HSPC podría permitir el logro de niveles de edición de genes comparables al protocolo estándar actual con menos IDLV. Es de destacar que la CsH podría mejorar la eficacia del direccionamiento génico en las células T CD3+ primarias humanas, incluso cuando se reduce la cantidad de IDLV del donante.

Discusión

La mejora de la permisividad de HSPC a la transducción de LV sigue siendo crítica para la implementación de amplio rango de la terapia génica como una opción de tratamiento para varias enfermedades hereditarias. Nuestros esfuerzos por mejorar la eficiencia de la transducción de LV en las HSPC humanas han llevado a la identificación de ciclosporina A (CsA) como un potente potenciador de la transducción en este entorno (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362). Aquí hemos demostrado su eficacia y seguridad en condiciones de cultivo clínico utilizando HSPC derivadas de médula ósea (BM) y LV de grado clínico y hemos identificado la ciclosporina H (CsH) como un potenciador aún más potente de la transducción del LV, según la caracterización molecular del mecanismo por el cual estos compuestos mejoran la transducción de LV en las HSPC humanas.

Mostramos aquí que la CsA no solo mejora de forma segura la transducción de LV sino que también permite un mejor injerto de HSPc derivada de BM humana en el modelo de xenoinjerto NSG de reconstitución hematopoyética humana. Este beneficio probablemente esté relacionado con su capacidad para disminuir la proliferación de HSPC y preservar mejor las células más primitivas en cultivo, ya que se ha demostrado que tanto la inactividad como el cultivo ex vivo más corto mejoran el injerto de HSPC en otros entornos (Glimm, H. et al. (2000) Blood 96: 4185-4193; Kallinikou, K. et al. (2012) Hno. J Haematol 158: 778-787; Larochelle, A. et al. (2012) Blood 119: 1848-1855). También se ha demostrado que la CsA mejora el injerto de células CD34+ derivadas de CB humanas y Lin murino a través de su capacidad para amortiguar el estrés oxidativo dependiente de ciclofilina D (Mantel, C.R. et al. (2015) Cell 161: 1553-1565). No observamos beneficios similares en nuestros estudios previos utilizando HSPC derivados de CB (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362), potencialmente debido al hecho de que no aislamos ni cultivamos las células en presencia estricta de CsA como lo realizaron Mantel et al. Las células CD34+ derivadas de BM más inactivas podrían ser menos sensibles al estrés oxidativo ambiental, lo que refleja los beneficios de la CsA también en la exposición más corta solo durante el proceso de transducción ex vivo. Sin embargo, también podrían estar implicados mecanismos adicionales en este entorno de exposición más corto, ya que no pudimos detectar ningún impacto claro de CsA en los niveles de ROS en HSPC derivadas de BM.

Debido a preocupaciones de toxicidad relacionada con la función inmunosupresora de CsA, se han desarrollado y probado varios derivados de ciclosporina no inmunosupresores para varias aplicaciones (Peel, M. et al. (2013) Bioorg Med Chem Lett 23: 4485-4492). Sin embargo, la mayoría de estos todavía se unen también al factor huésped CypA, que hemos demostrado aquí que es importante para una transducción eficiente también en HSPC. De acuerdo con la noción de que una ciclosporina no inmunosupresora e independiente de CypA sería óptima, identificamos CsH, una isoforma natural de CsA (Jeffery, J.R. (1991) Clin Biochem 24: 15-21), como un potenciador aún más potente y menos tóxico de la transducción de LV en comparación con la CsA. Según nuestro conocimiento, la CsH es el potenciador más eficiente de la transferencia de genes HSPC descrito hasta ahora, como lo demuestra nuestra observación de que una sola ronda de transducción en presencia de CsH supera incluso el protocolo estándar de doble golpe en términos de eficiencia de transducción sin alterar el injerto de largo plazo de repoblación de HSPC. Una mayor optimización para reducir la dosis de vector cuando se usa CsH debería permitir un marcado genético alto, así como un injerto mejorado de HSPC. Esto será particularmente relevante en entornos de terapia génica en los que se requieren altos niveles de marcado genético pero difíciles de lograr, como las hemoglobinopatías, donde el gran y complejo casete de expresión del gen de la p-globina humana limita la producción de LV a escala clínica. La caracterización de los efectos mediados por CsH nos ha proporcionado una comprensión mucho mejor de los bloqueos de restricción de LV que se producen en las HSPC humanas, pero potencialmente también de manera más amplia en otras células hematopoyéticas humanas al desencadenar una respuesta antiviral. CsH compartió varias características con CsA, incluida la independencia de la cápside, pero también presentó algunas diferencias significativas. En particular, el LV defectuoso en integrasa (IDLV) se benefició de la CsH en las HSPC CD34+, y la CsH pudo aumentar la transducción del LV también en las HSPC inactivas, así como en las células T humanas primarias, en marcado contraste con lo que observamos anteriormente para la CsA (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362). Es muy probable que estas diferencias estén relacionadas con el impacto negativo que tiene CsA en la interacción vector-CypA que se conserva cuando se usa CsH. La CypA es un factor del huésped explotado por el VIH-1 durante las etapas de desencubrimiento viral, importación nuclear y posiblemente incluso integración a través de la interacción con la cápside viral (CA) (Towers, G.J. et al. (2014) Cel1Host Microbe 16: 10-18). En el contexto de la investigación del VIH-1, se sabe que la CsA tiene un impacto negativo en la infección lentiviral, ya que interrumpe la interacción entre CypA y la cápside viral (Sokolskaja, E. et al. (2006) Curr Opin Microbiol 9: 404-408; Towers, G.J. et al. (2014) Cell Host Microbe 16: 10-18). En estas premisas, el efecto positivo que tiene la CsA sobre la transducción de LV en las HSPC humanas probablemente se contrarreste por su interferencia negativa en el eje CypA-CA. De acuerdo con esta hipótesis, los L^v independientes de CypA mostraron también un beneficio temprano en presencia de CsA en HSPC (Petrillo, C. et al. (2015) Mol Ther 23: 352-362).

Recientemente se ha informado de la capacidad de CsA para superar un estado antivírico inducido por IFN en THP-1 (Bulli, L. et al. (2016) J Virol 90: 7469-7480), pero el mecanismo molecular sigue siendo difícil de alcanzar. Mostramos aquí que CsA, y más específicamente CsH, superan la restricción de LV inducida por IFN de tipo I también en el contexto de HSPC humanas. La capacidad de las ciclosporinas para superar la restricción de LV tanto en el estado estacionario como después de la estimulación con IFN de tipo I parece depender del tipo de glicoproteína de la envoltura utilizada para pseudotipar el vector. Mientras que el LV pseudotipado con VSV-g se benefició de las ciclosporinas, el pseudotipado del LV con la glicoproteína de envoltura modificada del retrovirus endógeno del babuino (BaEVTR) hizo que el vector fuera insensible a los efectos beneficiosos tanto de CsA como de CsH. Curiosamente, se ha sugerido que el pseudotipado de LV con la glicoproteína de la envoltura BaEVTR mejora significativamente las eficiencias de transducción del LV en células CD34+ humanas en comparación con los vectores pseudotipados de VSV-g, incluso en las HSPC no estimuladas (Girard-Gagnepain, A. et al. (2014) Blood 124: 1221-1231). Con base en los resultados presentados aquí y teniendo en cuenta el impacto positivo de la CsH en la transducción de LV también en las HSPC no estimuladas, esta diferencia también podría explicarse, al menos en parte, por la susceptibilidad del LV pseudotipado de VSV-g a un bloqueo de restricción sensible a ciclosporina en HSPC humanas.

Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que las ciclosporinas actúan tanto en una etapa temprana del ciclo de vida de LV como en el nivel de integración del vector y que los primeros efectos de la CsA probablemente estén enmascarados por su capacidad para interrumpir la interacción beneficiosa cápside de LV-CypA conservada cuando se usa CsH en su lugar. La participación de la vía endocítica sigue sin estar clara, ya que ambas ciclosporinas son aditivas con otros dos compuestos de acción temprana, rapamicina y PGE2, y se ha sugerido que ambos actúan al nivel de entrada mediada por VSV-g ((Wang, C.X. et al. (2014). La rapamicina alivia la resistencia a la transducción de vectores lentivirales en células madre hematopoyéticas humanas y de ratón. Blood; Zonari, E. et al. (2017). Efficient Ex Vivo Engineering and Expansion of Highly Purified Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Populations for Gene Therapy. Stem Cell Reports). Además, la entrada endocítica por sí sola no permite que los vectores se beneficien de las ciclosporinas en las HSPC, ya que estos compuestos no mejoraron la transducción del vector AAV6, CsA y CsH no se agregaron entre sí, lo que sugiere que ambas isoformas actúan sobre la misma vía(s) que restringen la transducción de LV en las HSPC. Además, el impacto negativo de CsA en la interacción cápside-CypA pareció predominar ya que se obtuvieron niveles de transducción similares a los de CsA sola combinando las dos ciclosporinas, lo que subraya aún más la importancia de esta interacción huésped-vector durante la transducción de LV en HSPC.

La diana huésped más caracterizada de CsH es el receptor 1 del péptido formilo (FPR1) (de Paulis, A. et al. (1996) J Allergy Clin Immunol 98: 152-164). FPR1 pertenece a la familia del receptor del péptido N-formilo (FPR) de receptores de reconocimiento de patrones (PRR por sus siglas en inglés) que regulan las respuestas inmunitarias innatas (Prevete, N. et al. (2015) Pharmacol Res 102: 184-191). La expresión de FPR se describió inicialmente en células inmunes y posteriormente en células no hematopoyéticas y ciertos tejidos, y recientemente se ha demostrado que están implicadas en la diferenciación de células madre neurales (Zhang, L. et al. (2017) Sci Rep 7: 206). Aunque hasta el momento no hay informes sobre la participación de FPR1 en la biología de las HSPC, algunas de las cascadas de señalización que puede desencadenar, como la señalización de PI3K-AKT, desempeñan funciones críticas en las HSPC (Lechman, E.R. et al. (2012) Cell Stem Cell 11: 799-811). Sin embargo, FPR1 no participa en el alivio de la restricción de LV mediado por ciclosporina en las HSPC.

En línea con su rango celular más amplio y su capacidad para aumentar también las eficiencias de transducción de IDLV, es probable que CsH permita mejorar el direccionamiento génico en las HSPC y las células T CD4+ humanas primarias, así como la reducción de la dosis de IDLV sin comprometer las eficiencias. Estos resultados hacen que las plataformas de edición basadas en IDLV sean una alternativa competitiva a otros métodos basados en AAV o la entrega de ADN de un donante mediada por oligonucleótidos (Schiroli, G. et al. (2017) Sci Transl Med 9: 411). En particular, existen preocupaciones con respecto a la inmunogenicidad de HSPC expuestas a AAV debido a que los pacientes con frecuencia albergan inmunidad adaptativa preexistente contra este vector de terapia génica. La CsH combinada con plataformas de edición basadas en IDLV podría proporcionar una solución para esta fracción de pacientes identificables y beneficiar significativamente a una amplia gama de enfoques terapéuticos de vanguardia, incluidas inmunoterapias y corrección genética de enfermedades hematopoyéticas monogénicas (Naldini, L. (2015) Nature 526: 351-360). Curiosamente, CsH pareció aumentar las eficiencias de direccionamiento, en particular en e1HSC más primitivas, previamente demostradas como más sensibles que los progenitores comprometidos a la citotoxicidad del procedimiento de direccionamiento génico y menos competentes en la realización de HDR, probablemente debido a su inactividad o ciclo lento (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235-240). La mayor permisividad para la entrega de genes permite el uso de dosis de vector de donante mucho más bajas, reduciendo así también el arresto del crecimiento y la apoptosis en respuesta al procedimiento de direccionamiento génico. Nuestro protocolo mejorado de edición de genes basado en CsH permitiría aumentar la cantidad potencialmente limitante de HSPC dirigidas para permitir una corrección eficaz y segura de defectos genéticos específicos en humanos. Además, a medida que se disponga de procedimientos mejorados para la expansión ex vivo de HSC, los enfoques combinatorios que incluyan también la mejora de la entrega del donante podrían aumentar el rendimiento general de células dirigidas a genes. De hecho, la PGE2 ya se ha utilizado en entornos de edición de genes HSPC para preservar las HSPC ex vivo (Genovese, P. et al. (2014) Nature 510: 235­ 240). La adición de CsH tiene el potencial de mejorar aún más el rendimiento global de las células editadas con genes. Además, la combinación de CsH con PGE2 también en el contexto de protocolos de terapia génica más canónicos tiene el potencial de mejorar significativamente los resultados clínicos en entornos en los que el vector terapéutico es particularmente ineficaz o se requieren altos números de copias para la eficacia terapéutica.

En general, hemos identificado una nueva ciclosporina capaz de contrarrestar de manera más eficaz y segura la restricción de LV inducible por IFN basal y de tipo I en células T y HSPC humanas primarias. Descubrir el mecanismo por el cual las ciclosporinas mejoran la transducción de LV y la entrega del donante tendrá implicaciones importantes para la terapia génica y las aplicaciones de edición. Además, nuestro hallazgo de que las ciclosporinas parecen contrarrestar también los efectos antivirales inducidos por el IFN tipo I en una gama más amplia de tipos de células puede contribuir a una mejor comprensión de los mecanismos inmunitarios innatos capaces de reducir la infección por VIH-1.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Uso de ciclosporina H (CsH) para aumentar la eficiencia de la transducción de una población aislada de células por un vector viral y, opcionalmente, aumentar la eficiencia de la edición de genes de la población aislada de células transducidas por el vector viral, donde el vector viral está pseudotipado para entrar en las células a través de un mecanismo dependiente de endocitosis y/o donde el vector viral es un vector pseudotipado de VSV-g.

2. El uso de la reivindicación 1, donde las células son:

(a) células madre y/o progenitoras hematopoyéticas; o

(b) células T, opcionalmente células T CD4+ y/o CD3+.

3. El uso de la reivindicación 1 o 2, donde el vector viral es un vector retroviral, preferiblemente un vector lentiviral.

4. El uso de cualquier reivindicación anterior, donde las células son células estimuladas.

5. El uso de cualquier reivindicación anterior, donde el porcentaje de células transducidas por el vector se aumenta y/o se aumenta el número de copias del vector por célula.

6. El uso de cualquier reivindicación anterior, donde la CsH está a una concentración de aproximadamente 1-50 |^jM.

7. El uso de cualquier reivindicación anterior, donde la población de células se pone en contacto con:

(a) CsH en combinación con rapamicina o un derivado de la misma; y/o

(b) CsH en combinación con prostaglandina E2 o un derivado de la misma, preferiblemente donde la población de células se pone en contacto con CsH en combinación con 16-16 dimetil prostaglandina E2.

8. Un método in vitro de transducción de una población de células que comprende los pasos de:

(a) poner en contacto la población de células con ciclosporina H (CsH); y

(b) transducir la población de células con un vector viral, donde el vector viral está pseudotipado para entrar en las células a través de un mecanismo dependiente de endocitosis y/o donde el vector viral es un vector pseudotipado de VSV-g,

de tal modo que aumenta la eficacia de la transducción de la población de células por el vector viral y, opcionalmente, aumenta la eficacia de la edición de genes de la población aislada de células transducidas por el vector viral.

9. El método de la reivindicación 8, donde las células son:

(a) células madre y/o progenitoras hematopoyéticas; o

(b) células T, opcionalmente células T CD4+ y/o CD3+.

10. El método de la reivindicación 8 o 9, donde el vector viral es un vector retroviral, preferiblemente un vector lentiviral.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde las células son células estimuladas.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde se aumenta el porcentaje de células transducidas por el vector y/o se aumenta el número de copias del vector por célula.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la CsH está a una concentración de aproximadamente 1 a 50 ^j M.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde la población de células se pone en contacto con:

(a) CsH en combinación con rapamicina o un derivado de la misma; y/o

(b) CsH en combinación con prostaglandina E2 o un derivado de la misma, preferiblemente donde la población de células se pone en contacto con CsH en combinación con 16-16 dimetil prostaglandina E2.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-14, que incluye un paso adicional de enriquecimiento de la población de células madre y/o progenitoras hematopoyéticas.

16. Ciclosporina H (CsH) para usarse en terapia génica, donde la terapia génica está mediada por un vector viral, donde el vector viral está pseudotipado para entrar en las células a través de un mecanismo dependiente de endocitosis y/o donde el vector viral es un vector VSV-g pseudotipado.