CN116783286A - Rnps向免疫细胞的顺序传递 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了转染非粘附细胞的问题的解决方案。含有乙醇和等渗盐溶液的方法和组合物用于将化合物和组合物递送到哺乳动物细胞。

Description

RNPS向免疫细胞的顺序传递
相关申请
根据35 U.S.C.§119(e)的规定，本申请要求2021年1月20日递交的美国临时申请第63/139,649号的优先权，该专利申请的全部内容通过引证在此并入本文。
序列表通过引证并入本文
文件名为“048831-528001WO_Sequence_Listing_ST25.txt”的序列表通过引证在此全部并入本文，该序列表是2022年1月20日创建的，大小为4096字节。
技术领域
本申请涉及向哺乳动物细胞传递试剂用于免疫治疗。
背景技术
不同细胞类型之间细胞转染效率纯在差异。已经证明，使用常规方法转染悬浮细胞(例如，非粘附细胞)是十分困难的。因此，需要便于转染这种细胞的组合物和方法。
发明内容
本发明提供了一种用于体外细胞治疗应用的免疫细胞工程化的解决方案。这里描述的组合物和方法促进细胞工程化技术，所述细胞工程化技术能够实现需要复杂修饰和高水平细胞功能的下一代细胞治疗产品。如本文所述，SOLUPORETM传递方法是一种简单、快速和高效地将货物传递到初代免疫细胞，同时保持细胞活性和功能性的非病毒方式。该方法包括处理过的细胞的细胞膜的基于醇的瞬时透化。此外，以这种方式工程化的细胞，例如工程化的免疫细胞，如T细胞，降低了T细胞衰竭的可能性，从而使其能够用于复杂的治疗需求。
在各方面，本文提供了一种包含至少两种外源性货物的免疫细胞。例如，所述外源货物包括T细胞受体α常数(TRAC)核糖核蛋白(RNP)或分化簇7(CD7)RNP。
在实施方案中，所述外源性货物是顺序传递的。
在进一步的实施例中，与参照免疫细胞相比，免疫细胞的生存能力增加。
本文还提供了通过非粘附免疫细胞的质膜传递至少两种外源性货物的方法，其中该方法包括提供非粘附细胞群体；以及使细胞群与一定体积的等渗水溶液接触，所述水溶液包括外源货物和浓度大于0.2％(v/v)的醇，例如2-20％(v/v)的乙醇。在实施方案中，所述至少两种外源性货物被顺序传递。在其它实施例中，所述至少两种外源性货物包括核糖核蛋白(RNP)、核酸、蛋白质或其任何组合。
例如，外源货物包括T细胞受体α常数(TRAC)核糖核蛋白(RNP)或分化簇7(CD7)RNP。
外源货物或“有效载荷”是一种术语，用于描述通过水溶液穿过细胞质膜并进入细胞内部的化合物，例如RNP或组合物。
术语“外源性”是指来自或源自细胞外的货物(或有效载荷)，例如免疫细胞，而不是源自免疫细胞内的内源性制剂。
在一些实施方案中，本发明的免疫细胞包含至少两种或多种外源性货物(例如，3、4、5、6、7、8、9或10种外源性货物)。外源货物包括核糖核蛋白(RNP)、核酸、蛋白质或其任何组合。
本文还提供了一种通过非粘附免疫细胞的质膜传递至少两种外源性货物(或“外源性货物”)的方法。因此，该方法包括提供非粘附细胞群体，并使细胞群体与一定体积的等渗水溶液接触，该水溶液包括有效载荷和浓度大于0.2％(v/v)的醇。
例如，醇浓度约为0.2％(v/v)或更高，或醇浓度约为0.5％(v/v)或更高，或醇浓度约为2％(v/v)或更高。或者，醇浓度为5％(v/v)或更高。在其他实施例中，醇浓度为10％(v/v)或更高。
例如，所述醇包括乙醇，例如，10％的乙醇或者更多。在一些实施例中，所述水溶液包括20-30％的乙醇，例如，27％的乙醇。在其他实施例中，RNP的传递包括10％的乙醇。
在一些实施例中，水溶液包括醇，并且所述醇可包括乙醇。在其他实施例中，所述水溶液包含大于10％的乙醇、20-30％的乙醇或大约27％的乙醇。在一些实施例中，水溶液包含12.5-500mM氯化钾(KCl)或约106mM的KCl。
用于将外源性货物传递至细胞的水溶液包含盐，例如浓度在12.5-500mm之间的氯化钾(KCl)。例如，溶液相对于哺乳动物细胞(如人类T细胞)的细胞质是等渗的。这种示例性等渗传递溶液为106mM KCl。
在其他实施例中，所述水溶液可包括5％至30％的乙醇浓度(例如，0.2％至30％)。所述水溶液可包括75％至98％的H2O、2％至45％的乙醇、6至91mM的蔗糖、2至500mM的KC1、2至35mM的醋酸铵和1至14mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)(HEPES)中的一种或多种。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和27％乙醇。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和10％乙醇。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和5％乙醇。例如，所述传递溶液含有106mM KCl和2％乙醇。
示例性非粘附/悬浮细胞包括原代造血干细胞(HSC)、T细胞(例如，CD3+细胞、CD4+细胞、CD8+细胞)、自然杀伤(NK)细胞、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、人脐血CD34+细胞、B细胞或诸如Jurkat T细胞系的细胞系。非粘附细胞的表面可以是基本上融合，例如融合率大于75％。细胞融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计(或计算)的百分比，例如，10％的融合意味着10％的表面(例如组织培养血管)被细胞覆盖，100％意味着它被完全覆盖。例如，非粘附细胞可以向下旋转，通过真空或组织培养基从细胞群顶部抽吸，或通过抽吸或真空从血管底部移除。这些细胞可以形成单层细胞。例如，对于10、25、50、75、90、95或100％汇合的细胞。
在实施方案中，非粘附细胞包括外周血单核细胞。在一些实施例中，非粘附细胞包含免疫细胞(例如，T淋巴细胞)。
该方法涉及将传递溶液中的外源性货物(例如，至少两种外源性货物)传递至包含单层的非粘附细胞群。例如，所述单层细胞与水传递溶液的喷雾接触。该方法将有效载荷/货物(化合物或组合物)传递到细胞的细胞质中，其中，与通过电穿孔或核感染传递的有效载荷相比，细胞群具有更高的存活率，这是Soluporation系统的一个显著优点。
在某些实施方案中，非粘附细胞/悬浮细胞的单层驻留在膜过滤器上。在一些实施方案中，在用传递溶液的喷雾接触细胞单层后振动膜过滤器。在向细胞喷洒传递溶液之前、期间和/或之后，可振动或搅动膜过滤器。
待传递到细胞中的溶液的体积可以是任意单位，例如喷雾，例如水性颗粒上的多个液滴。相对于单个细胞或相对于融合或基本融合(例如，至少75％，至少80％融合，例如，85％，90％，95％，97％，98％，100％)细胞群的暴露表面积描述所述体积。例如，每个细胞的体积可以在6.0x 10-7微升和7.4x 10-4微升之间。每个细胞的体积在4.9x 10-6微升和2.2x10-3微升之间。每个细胞的体积可以在9.3x 10-6微升和2.8x 10-5微升之间。每个细胞的体积约为1.9x 10-5微升，大约在10％以内。每个细胞的体积在6.0x 10-7微升和2.2x 10-3微升之间。体积可以在2.6x 10-9微升/平方微米的暴露表面积和1.1x 10-6微升/平方微米的暴露表面积之间。体积可以在5.3x 10-8微升/平方微米的暴露表面积和1.6x 10-7微升/平方微米的暴露表面积之间。每平方微米暴露表面积的体积约为1.1x 10-7微升。
在本说明书中，术语“大约”指的是在给定数量或者度量的10％以内。
细胞融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计(或计算)的百分比，例如，10％的融合意味着10％的表面(例如组织培养血管)被细胞覆盖，100％意味着它被完全覆盖。例如，贴壁细胞在组织培养孔、平板或烧瓶的表面上二维生长。非粘附细胞可以向下旋转，通过真空或组织培养基从细胞群顶部抽吸，或通过抽吸或真空从血管底部移除。
有效载荷(外源性货物)可以包括小化学分子，肽或蛋白质，或核酸。小化学分子可小于1,000Da。化学分子可包括MitoTrackerg Red CMXRos，碘化丙啶，甲氨蝶呤和/或DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)。肽可以是约5,000Da。肽可以包括艾卡拉肽(商品名为Kalbitor，其是一种具有60个氨基酸的多肽，用于治疗遗传性血管性水肿并在心胸手术中预防失血)、利拉鲁肽(以商品名Victoza上市销售用于治疗II型糖尿病，以商品名Saxenda上市销售用于治疗肥胖)和艾替班特(商品名为Firazyer，其是一种肽模拟物，用于治疗遗传学血管性水肿的急性发作)。小干扰性核糖核酸(siRNA)分子的长度可以是大约20-25个碱基对，或者可以是大约10,000-15,000Da。所述siRNA分子可以减少任意一种基因产物的表达，例如，降低临床相应目标基因或者模型基因的基因表达，例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA、GAPDHsiRNA-FITC、亲环蛋白B siRNA、和/或核纤层蛋白siRNA。蛋白质治疗剂可以包括肽、酶、结构蛋白质、受体、细胞蛋白质，或者循环蛋白质、或者其片段。所述蛋白质或者多肽是大约100-500,000Da，例如，是1,000-150,000Da。
所述有效载荷(或者“外源性货物”)可以包括治疗剂。治疗剂，例如，药物，或者活性试剂指的是任意对治疗或者诊断目的有效的化合物，该术语可以被理解为任意能够对患者施用治疗疾病的化合物。因此，治疗剂可以包括蛋白质、肽、抗体、抗体片段和小分子。美国专利第7,667,004号(通过引证在此全部并入本文)中描述的治疗剂可被用于这里所描述的方法中。所述治疗剂可以包括顺式铂氨、阿斯匹林、斯达汀(例如，匹伐他汀、阿伐他汀、洛弗斯特丁、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀、丙嗪盐酸、氯丙嗪盐酸、甲硫哒嗪盐酸、硫酸多粘菌素B、二氯羟喹、苯氟雷司盐酸和苯基偶氮吡啶二胺盐酸)和氟苯氧丙胺中的至少一个。所述有效载荷可以包括诊断剂。所述诊断剂可以包括可检测的标记或者标记物，诸如次甲基蓝、专利蓝和靛氰绿中的至少一种。所述有效载荷可以包括荧光分子。所述载荷物可以包括可检测的纳米颗粒。所述纳米颗粒可以包括量子点。
所述有效载荷(“外源性货物”)包括醇类。术语“醇类”指的是一种包括附着于至少一个碳原子的羟基(-OH)功能性基团的多原子有机化合物。所述醇类可以是一元醇并且可以包括至少一个碳原子，例如，甲醇。所述醇可以包括至少两个碳原子(例如乙醇)。在其他方面，所述醇类包括至少三个碳原子(例如异丙醇)。所述醇类可以包括至少四个碳原子(例如，丁醇)，或者至少七个碳原子(例如，苯甲醇)。示例性的有效载荷可以仅仅包括50％(v/v)的醇类，更优选的，所述有效载荷包括2-45％(v/v)的醇类，5-40％的醇类，和10-40％的醇类。所述有效载荷可以包括20-30％(v/v)的醇类。
最优选的，所述有效载荷可以包括25％(v/v)的醇类。作为选择，所述有效载荷可以包括2-8％(v/v)的醇类，或者2％的醇类。所述醇类可以包括乙醇并且所述有效载荷包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述乙醇。示例性的方法可以包括甲醇当作所述醇类，并且所述有效装载可以包括5，10，20，25，30，或者40％(v/v)的所述甲醇。所述有效装载可以包括2-45％(v/v)的甲醇，20-30％(v/v)，或者25％(v/v)的甲醇。优选的，所述有效装载可以包括20-30％(v/v)的甲醇。进一步地中作为选择，所述醇类是丁醇并且所述有效装载可以包括2、4或者8％(v/v)的丁醇。
在本主题内容的一些方面，所述有效载荷是一种等渗溶液或者缓冲液。
根据本发明主题内容，所述有效载荷可以包括至少一种盐。所述盐选自NaC1、KC1、Na2HPO4、C2H3O2NH4和KH2PO4中的一种。例如，KCl浓度范围为2mM至500mM。在一些优选的实施方案中，所述浓度大于100mM，例如106mM。根据本主题内容的示例性方法，有效载荷可包括糖(例如，蔗糖或双糖)。根据示例性方法，有效载荷包含小于121mM的糖、6-91mM或26-39mM的糖。此外，有效载荷包括32mm糖(例如蔗糖)。任选地，所述糖是蔗糖，有效载荷包括6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8或89.6mM蔗糖。
在实施方案中，用于穿过免疫细胞的质膜传递外源性货物的方法还包括传递至少两种外源性货物(或“两种有效载荷”)。所述外源性货物包括核酸、小分子、蛋白质、多肽或其组合。例如，核酸包括信使核糖核酸(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其任何组合。在一些实施方案中，免疫细胞包括两种外源性货物、3种外源性货物、4、5、6、7、8、9或10种外源性货物。在实施方案中，所述至少两种外源性货物被顺序传递。例如，顺序传递可能指传递一件外源性货物，然后传递第二、第三或第四件外源性货物。例如，本发明的免疫细胞(包含外源性货物)随后可进一步被操纵以包含第二外源性货物。如本文所用，术语“操纵”可指用于细胞内传递的任何已知转染方法，包括SOLUPORETM传递方法、膜破坏方法(电穿孔、声穿孔、磁检测、光操作)或基于载体的方法(脂质纳米粒)。例如，电穿孔包括一种细胞内传递方法，其中向细胞施加电场以增加细胞膜通透性(也称为电转移)。
在其他方面，本文提供了一种通过非粘附细胞的细胞质膜传递外源性货物的方法，该方法包括以下步骤：提供非粘附细胞群，并使用至少两种细胞内传递方法，所述方法选自：(i)将细胞群与一定体积的等渗水溶液相接触，所述水溶液包括外源性货物和浓度大于0.5％(v/v)的醇，从而将两种外源性货物传递至免疫细胞。例如，水溶液包含醇，并且所述醇包含乙醇。水溶液中的醇浓度大于0.2％(v/v)，或大于0.5％(v/v)，或大于2％(v/v)，或大于5％(v/v)，或大于10％(v/v)，在一些实施例中，水溶液包含20-30％乙醇，例如27％乙醇。
从以下对其优选的实施方案及其权利要求书的描述中，本发明的其他特征和优点将显而易见。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文只描述了合适的方法和材料。本文引用的所有已发布的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文引用的通过登录号表示的Genbank和NCBI文件通过引用全部并入本文。本文引用的所有其他已出版参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用并入本文。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意在限制。
附图简要说明
图1A-1D是条形图，显示了使用SOLUPORETM传递方法有效功能化T细胞。图1A显示了从3个供体向T细胞传递GFP mRNA后24小时的GFP表达和细胞活力。传递表示为细胞的总百分比。图1B是线状图，显示了从1个供体向T细胞递送GFP mRNA后的投影增殖曲线，显示n＝2的平均值。处理的细胞和未处理的对照细胞在增殖方面没有观察到显著差异(Wilcoxon配对符号秩检验)。图1C显示了GFP mRNA和CD19CAR mRNA的共递送的图，n＝3/1供体。图1D显示了分别传递TRAC和CD7 RNP以及随后传递TRAC RNP 2天后传递CD7RNN的图，并在传递CD7 RNP后第5天进行分析，n＝3/1供体。
(传递系统)
图2A和2B是条形图，显示分别来自研究平台传递系统和临床使用平台的所有3种蛋白质均为阴性的百分比群体分别为46±7和38±9(3个供体，3个技术重复)；分别如图2A和2B所示。/>研究平台传递系统和临床平台的性能相当，其他技术的三次编辑率不超过10％。
图3是用于同时递送RNP的实验设计的示意图。以2:1的比例以0.4μg/μL(相当于每1x106个细胞3.3μg)的浓度制备Cas9RNP–TRAC sgRNA；用0、5、10和15％的乙醇和RNP制备S缓冲溶液，并在传递系统上用每种乙醇浓度的S缓冲溶液进行实验。
图4描绘了来自用靶向CD3的抗体染色的细胞的代表性流式细胞术(框体显示活细胞)。未经处理的(UT)细胞显示出>93％的CD3阳性，在研究平台传递系统递送TRAC RNP后，CD3阳性率降低。在处理的样品中观察到两个不同的群体，左边的群体(框起来的部分)指的是CD3染色阴性的那些细胞。在传递溶液中，在不存在乙醇的样品中阴性细胞群体的数量从大约59％增加到存在乙醇的样本中的约67％。在发生Cas9蛋白沉淀之前，乙醇的存在量是有限的(0.4μg/μL Cas9 RNP时乙醇含量大于20％)。
图5A是显示通过研究平台传递系统传递TRAC RNP(2:1的Cas9摩尔比；3.3μg/1x106细胞)72小时后，活化T细胞中平均CD3阴性群体(±标准偏差)的条形图(每个条件重复2-3次)。随着传递溶液中货物的加入，乙醇浓度不断增加。CD3编辑水平随着乙醇浓度的增加而适度增加(0％EtOH-58％至15％EtOH-66％)。
图5B是显示通过研究平台传递系统递送TRAC-RNP后72小时各组CD3阴性表达的平均值、标准偏差、平均值的标准误差和变异系数的表。
图6是条形图，描绘了在乙醇浓度增加时、以及由递送前、递送后(第3天)和递送后(第一天)组成的时间点上的存活率百分比。
图7A-7C是显示人原代T细胞中CRISPR/RNP编辑的线状图。图7A显示了使用TRAC-RNP(μg/1x106细胞)的CD3阴性剂量反应。图7B显示了使用CD7 RNP(μg/1x106细胞)的CD7阴性剂量反应。图7C显示了使用β-2微球蛋白(B2m)RNP(μg/1x106细胞)的HLA阴性剂量反应。观察到多个TRAC(CD3)、CD7、B2M(HLA)RNP的编辑成功，存活率>80％。
图8是条形图，显示了在编辑期间T细胞表型被保留。
具体实施方案
本文提供的是细胞工程技术，该细胞功程技术使需要复杂修饰和高水平细胞功能的下一代细胞治疗产品成为可能。
自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗在患有某些液体肿瘤的复发或难治性癌症患者队列中显示出前所未有的疗效和持久的反应，迄今已获得两项CAR T产品批准(Ahmad A、Uddin S、Steinho M.CAR-T细胞疗法：支持其被批准用于治疗急性淋巴细胞白血病和大b细胞淋巴瘤的临床研究综述。国际分子科学杂志2020；21:3906)。这些细胞产品产生的概念验证目前正在推动离体细胞治疗领域的研究、开发和商业活动达到重要水平。
病毒转导一直是细胞工程中最常用的方法，这些首批获批的CAR T细胞疗法是使用病毒载体进行工程设计的。然而，病毒载体的局限性是众所周知的。专门的病毒制造工艺加上对制造能力可用性的限制，使扩大规模以满足商业需求成为一项重大挑战(Levine B,Miskin J,Wonnacott K,Keir C.Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy.MolTher 2017；4:92-101)。从开始生产病毒到批量释放用于细胞治疗的GMP载体的时间可能是漫长而昂贵的。病毒递送系统也容易受到载体介导的遗传毒性的影响，例如破坏正常基因的随机插入、意外的致癌基因激活或插入突变，导致不良的免疫原性和严重的副作用(David R,Doherty A.Viral Vectors:The road to reducing genotoxicity.ToxicolSci 2017；155:315-25)。此外，对病毒载体货物包装能力的限制进一步限制了它们在下一代细胞治疗产品工程中的适用性，下一代的细胞治疗产品需要复杂的修饰才能成功地解决实体瘤和同种异体产品(Rafiq S,Hackett C,Brentjens R.Engineering strategies toovercome the current roadblocks in CAR T cell therapy.Nat Rev Clin Oncol2020；17:147-67)。
与病毒载体相关的规模、成本和安全性挑战促使人们对非病毒替代品的开发产生了兴趣。在任何一种细胞内递送方法中，更大的重复使用能力、灵活性和多功能性以适应不同的细胞类型和加快的制造时间表，同时避免与病毒载体相关的制造挑战、副作用和调节负担，都是有吸引力的(Stewart M,Sharei A,Ding X,Sahay G,Langer R,Jensen K.Invitro and ex vivo strategies for intracellular delivery.Nature 2016；538:183-92)。非病毒细胞内递送方法可大致分为两大类。第一种方法包括物理/机械方法，如电穿孔、声蒸发、磁感染、基因枪、显微注射和细胞挤压(Stewart M,Langer R,JensenK.Intracellular delivery by membrane disruption:Mechanisms,strategies,andconcepts(通过膜破坏的细胞内递送：机制、策略和概念).Chem Rev 2018；118:7409–531,Bono N,Ponti F,Mantovani D,Candiani G.Non-viral in vitro gene delivery:It isnow time to set the bar(非病毒体外基因传递：现在是时候设定标准了).Pharmaceutics 2020；12:183,和DiTommaso T,et al.Cell engineering withmicrofluidic squeezing preserves functionality of primary immune cells invivo(微流体挤压的细胞工程在体内保留了初级免疫细胞的功能).Proc Natl Acad SciUSA 2018；115:E10907–E10914)。然而，这些方法中的许多方法不适合细胞治疗制造过程。
第二类包括化学载体，如阳离子聚合物和脂质，包括脂质纳米颗粒，但迄今为止，这些化学方法的效率无法与病毒对应物相比，毒性仍然令人担忧(Azarnezhad A,SamadianH,Jaymand M,Sobhani M,Ahmadi A.Toxicological profile of lipid-basednanostructures:are they considered as completely safe nanocarriers？Crit RevToxicol 2020；50:DOI:148-176)。因此，电穿孔平台是目前用于细胞工程的最广泛使用的非病毒技术。
下一代免疫细胞产品可能同时经过病毒和非病毒修饰。第一项测试T细胞CRISPR-Cas9基因编辑安全性的人体试验是在病毒转导前通过电穿孔传递基因编辑工具，以传递CAR(Stadtmauer E,et.al.,CRISPR-engineered T cells in patients with refractorycancer.Science 2020；367:eaba7365)。然而，人们仍然担心电穿孔过程对免疫细胞的影响，包括持续的细胞内钙水平、基因表达谱的变化、增殖能力的降低和效力的降低(DiTommaso T et al.Cell engineering with microfluidic squeezing preservesfunctionality of primary immune cells in vivo.(微流体挤压的细胞工程在体内保留了初级免疫细胞的功能)Proc Natl Acad Sci USA 2018；115:E10907–E10914,Zhang M,etal.The impact of Nucleofection on the activation state of primary human CD4 Tcells(核感染对原代人CD4 T细胞活化状态的影响)J Immunol Methods 2014；408:123-31和Beane J,et al.Clinical Scale Zinc Finger Nuclease-mediated Gene Editing ofPD-1in Tumor Infiltrating Lymphocytes for the Treatment of MetastaticMelanoma(用于治疗转移性黑色素瘤的肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1的临床规模锌指核酸酶介导的基因编辑).Mol Ther 2015；23:1380-90)。
很明显，体外强大的免疫细胞增殖和效应子功能与体内抗肿瘤功能的改善相关，这突出了对不会对效应子细胞的这些关键质量属性产生负面影响的传递方法的需要(Ghassemi S,et al，减少体外培养提高了嵌合抗原受体(CAR)T细胞的抗白血病活性。CanImmunol Res 2018；6:1100-9和Finney O,et al.CD19 CAR T cell product and diseaseattributes predict leukemia remission durability.J Clin Invest 2019；129:2123-32).此外，为了确保生产在成本、时间和满足紧急临床需求方面是可行的，关键是要获得足够产量的可行转基因阳性细胞，以生产治疗患者的最终产品。因此，需要替代的方法，理想的细胞内递送方法可以将不同的货物转染到多种细胞类型，同时最大限度地干扰正常细胞功能。
据报道，一种使用递送系统的非病毒方法允许细胞膜的瞬时透化，以实现具有不同组成、性质和大小的货物(如大分子和核酸)的快速细胞内传递(O'DeaS,et al.Vector-free intracellular delivery by reversiblepermeabilization.PLoS ONE 2017；12)。在这里，/>传递系统被证明可以成功地促进mRNA和基因编辑工具(如CRISPR-Cas9)向原代人类T细胞的递送，并保持细胞活力。
外源性货物
递送到免疫细胞的外源性货物(或“有效载荷”)描述了通过水溶液穿过细胞质膜并进入细胞内部的化合物或组合物。外源货物可以包括核酸(例如，RNA(核糖核酸)、mRNA(信使RNA)或DNA(脱氧核糖核酸))、蛋白质或肽、小化学分子或其任何组合。小化学分子可以小于1000Da。小分子是质量小于2000道尔顿的化合物。小分子的分子质量优选小于1000道尔顿，更优选小于600道尔顿，例如，化合物小于500道尔顿、400道尔顿、300道尔顿、200道尔顿或100道尔顿。
在优选实施例中，外源货物包括核糖核蛋白(RNP)，例如TRAC(T细胞受体α常数)RNP或CD7(分化簇)RNP。
外源性货物的顺序传递
在实施方案中，所述至少两个外源性货物被顺序地传递。例如，顺序交付可能是指交付一个外源性货物，然后交付第二、第三或第四个外源性货物。例如，本发明的免疫细胞(包括外源性货物)然后可以进一步被操纵以包括第二外源性货物。如本文所用，术语“操纵”可指用于细胞内递送的任何已知转染方法，包括递送方法、膜破坏方法(电穿孔、声蒸发、磁检测、光操作)或基于载体的方法(脂质纳米颗粒)。
在优选实施例中，递送TRAC RNP，随后递送CD7 RNP。在其他实施例中，传递CD7RNP，然后传递TRAC RNP。
与货物的双重/多重递送一样，顺序递送提供了治疗优势，其中细胞可以被修饰以具有多种新特征，从而增强其靶向肿瘤细胞或有效杀死肿瘤细胞的能力。
在某些实施方案中，与顺序递送和/或对照(不包括外源性货物的免疫细胞)相比，外源性货物(例如，至少两个RNP)的顺序递送提供协同效应。例如，协同效应是当两种或两种以上的外源性货物被交付(例如，顺序交付)以产生大于其中任何一种货物本身的效应时产生的效应。
T细胞受体α常数(TRAC)
TRAC RNP被传递，随后，例如，随后2天，传递CD7 RNP.
TRAC-RNP传递后TCR表达的破坏是通过分化簇3(CD3)表达的损失/减少来测量的，例如，通过使用流式细胞术等标准方法检测CD3在细胞表面的存在。CD3与TCR(T细胞受体)形成表面复合物；通过对细胞进行CD3染色，检测TRAC敲除。通过CD7表达的损失/减少来测量CD7 RNP递送后分化簇7(CD7)表达的破坏，例如通过使用标准方法如流式细胞术检测细胞表面CD7的存在。
要求保护的发明优势，例如，RNP/RNP传递
在给定的细胞群体中重复转染过程是具有挑战性的，因为转染会对细胞造成压力。许多转染方法，如脂质转染和电穿孔，在不同程度上与细胞毒性有关，虽然一次转染事件是可以容忍的，但重复的转染事件会导致细胞活力显著降低和细胞死亡水平升高。即使是那些存活下来的细胞也可能受损，无法正确处理已经输送的外源性货物。
RNP是一种基因编辑工具，可以切割DNA，使DNA随后被细胞修复。细胞必须处于健康状态才能进行这种修复过程，同时保持活力。如果细胞受损，基因编辑成功进行的可能性就会降低。将RNP递送到细胞的转染过程必须具有低毒性，才能产生有活力且存在基因编辑的细胞。
传递系统提供了一种温和的转染过程，能够有效地将货物递送到细胞中。当使用/>系统递送RNP时，可以实现有效的基因编辑，同时保持高细胞活力。没有细胞应激使得可以以同样高的编辑效率和细胞活力水平进行第二次RNP转染过程。这意味着免疫细胞的复杂工程可以用于细胞治疗制造的目的。此外，如果起始材料是脆弱的，例如患者来源的细胞，如T细胞、NK细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，则使用温和的工艺进行复杂工程(如/>递送系统)是很重要的。其他起始材料，如iPSC衍生的T细胞或NK细胞也很脆弱，因此希望使用/>递送系统等系统在这些细胞中进行重复转染，这将对这些细胞造成最小的应力。
定义
为了理解本发明主题内容并为了构建所附专利权利要求书，本发明包括以下定义。本文中使用的缩写词在化学和生物领域中具有传统意义。
虽然在这里显示并描述了本发明的各种实施方案和方面，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是，这些实施方案和方面仅以举例的方式被提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以进行多种变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明时可以使用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文件或部分文件，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和专著，特此以引用的方式明确纳入其全部内容，以供任何用途。
“患者”或“有需要的受试者”是指动物中患有或有可能患有上述疾病的在世成员。在实施方案中，受试者是由可能自然患有该疾病的个体组成的成员。在实施方案中，受试者是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实施例包括啮齿类动物(如小鼠和大鼠)、灵长类动物(如狐猴、丛猴、猴子、猿和人类)、兔子、狗(如宠物狗、服务狗或工作狗，如警犬、军犬、赛狗或表演狗)、马(如赛马和工作马)、猫(如家养猫)，牲畜(如猪、牛、驴、骡子、野牛、山羊、骆驼和绵羊)和鹿。在实施方案中，受试者是人类。
术语“受试者”、“患者”、“个人”等并不局限于其本身，通常可以互换。也就是说，被描述为“患者”的个人不一定有特定的疾病，但可能只是寻求医疗建议。
过渡术语“包括”与“包含”、“含有”或“其特征在于”同义，具有包容性或开放性，不排除其他未引用的元素或方法步骤。相比之下，过渡短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或步骤上，以及那些对权利要求保护的发明的基本和新颖特征没有实质性影响的材料或步骤上。
在本文的说明书和权利要求书中，诸如“至少一个”或“一个或多个”之类的短语可以出现在元素或特征的连接列表之后。术语“和/或”也可能出现在两个或多个元素或特征的列表中。除非另有说明或者与使用该短语的上下文的意思相矛盾，否则该短语意指单独列出的任何元素或特征，或任何列出的元素或特征与任何其他元素或特征的组合。例如，短语“至少A和B中的一个；”、“A和B中的一个或多个；”、“A和/或B”分别表示“A单独、B单独或A和B一起”，类似的解释也适用于包含三个或三个以上项目的清单。例如，短语“至少A、B和C中的一个”、“A、B和C中的一个或多个”、“A、B和/或C”分别意指“A单独、B单独、C单独、A和B一起、A和C一起、B和C一起，或A和B和C一起”。此外，在上述和权利要求中使用术语“基于”旨在表示“至少部分基于”，从而也允许使用未引用的特征或元素。
如本文所使用的，“分离”或“纯化”的核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白质在通过重组技术生产时基本上不含其他细胞材料或培养基，或在化学合成时不含化学前体或其他化学品。纯化后的化合物至少占目标化合物重量(干重)的60％。优选地，制备物为至少75％、更优选至少90％、最优选至少99％(按重量计)的感兴趣化合物。例如，纯化的化合物是指所需化合物至少占总化合物重量的90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)。纯度可通过任何适当的标准方法进行测量，例如，通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱(HPLC)分析。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))或多肽不含在其自然状态下位于其侧链上的氨基酸序列或核酸序列。纯化还定义了可安全用于人类受试者的无菌程度，例如缺乏传染性或毒性物质。
相对于参照水平，所确定的水平可能会增加。如本文所用，相对于水平(例如，所述SOLUPORETM方法后T细胞的细胞因子释放、基因调节或代谢率)而言的术语“增加”指高于参照水平的任何百分比增加。在各种实施方案中，增加的水平可以是相对于参照水平，至少或者大约5％的增加、至少或者大约10％的增加、至少或者大约15％的增加、至少或者大约20％的增加、至少或者大约25％的增加、至少或者大约30％的增加、至少或者大约35％的增加、至少或者大约40％的增加，至少或者大约45％的增加、至少或者大约50％的增加、至少或者大约55％的增加、至少或者大约60％的增加、至少或者大约65％的增加、至少或者大约70％的增加、至少或者大约75％的增加、至少或者大约80％的增加、至少或者大约85％的增加、至少或者大约90％的增加，至少或大约增加95％。
相对于参照水平，所确定的水平可能会降低。如本文所用，相对于水平(例如，所述SOLUPORETM方法后T细胞的细胞因子释放、基因调节或代谢率)而言的术语“减少”是指相对于参照水平的任意百分比的减少。在各种实施方案中，减少的水平可以是指相对于控制水平，至少或大约减少5％、至少或大约减少10％、至少或大约减少15％、至少或大约减少20％、至少或大约减少25％、至少或大约减少30％、至少或大约减少35％、至少或大约减少40％，至少或大约减少45％、至少或大约减少50％、至少或大约减少55％、至少或大约减少60％、至少或大约减少65％、至少或大约减少70％、至少或大约减少75％、至少或大约减少80％、至少或大约减少85％、至少或大约减少90％，至少或大约减少95％。
上述增加或减少也可以表示为倍数差或对数差(例如，参见图12的相关性)。例如，基于2的对数(或log2)被用于沿着一个轴将结果标准化，该轴上的上调基因和下调基因的值相等。示例性计算如下所示：
处理的基因Avs参照＝7.0(过表达)；
参照基因B vs处理过的＝7.0或者，处理过的vs参照＝0.142(低表达)。
两者都以相同的强度过度表达或表达不足，然而，线性标度不能反映这种变化。或者，基因A上调7.0倍，基因2下调0.142倍。当以log2的形式表达时，基因A上调2.81倍，基因B下调-2.81倍。
实施例
以下实施例说明本发明的特定实施方案，并不意味着限制本发明的范围。
通过以下实施例和具体的步骤进一步说明了这里的实施方案。但是，这些实施例仅仅起到说明实施方案的目的，并不构成对本发明范围的限制。本申请全文中所引用的参考文献和公开的专利及专利申请通过引证全部并入本文。
实施例1：有效工程化原代人T细胞用于体外细胞治疗Applications Using the 传递方法
原代人T细胞的有效并且多功能性工程化
下一代免疫细胞疗法将需要复杂的编辑技术，其中可能包括细胞功能的添加和删除。因此，传递系统既能用于使用信使核糖核酸将某种功能性引入T细胞，也能使用CRISPR-Cas9蛋白-gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物删除某种功能。为了进一步检验平台的多功能性，这些货物以组合或顺序交付。
将GFP mRNA传递至来自三个人类供体的T细胞，并在转染后24小时检测GFP表达和细胞活力。在保留了高细胞活力的每个供体中GFP表达大于80％(图1A)。在传递GFP mRNA后T细胞的增殖与未处理的细胞的增殖保持相似(图1B)。
进一步审查了更为复杂的货物传递情况。当CAR mRNA与GFP mRNA共同传递时，在转染后24小时，超过57％的群体是GFP+/CAR+，再次保持了高细胞活力(图1C)。将靶向TRAC和CD7基因的CRISPR-Cas9-RNP复合物分别和顺序递送至T细胞。当单独传递时，在两种情况下，CD3和CD7在治疗人群中的表达均降低至约25％(图1D)。当传递TRAC RNP并在两天后接着传递CD7 RNP时，约5％的被处理细胞群体保留CD3+/CD7+表型，并且当在传递CD7 RNP后4天检查时，仍然保持高水平的生存能力(图1D)。
尽管复杂的制造和物流过程为药物制造创造了新的范式，但具有开创性意义的CAR T“活”药物还是取得了成功(Freitag F、Maucher M、Riester Z、Hudecek M.CAR-T细胞的新靶点和技术.Curr Opin Oncol 2020；32:510-517).然而，对于为一名患者生产一批产品的制造过程的成本和复杂性以及患者衍生材料的质量，已经吸取了惨痛的教训(Namuduri M，Brentjens RJ.增强CAR T细胞功效：迈向临床革命的下一步？Expert RevHematol 2020；13:533-543)。现在人们普遍认为，未来的关键重点领域必须包括优化液体肿瘤的细胞疗法、加快创新周期以能够应用于实体瘤以及转变制造工艺。据预测，无病毒方案可能在所有这些方面发挥关键作用，最终改善患者的就医途径(Freitag F，Maucher M，Riester Z，Hudecek M.CAR-T细胞的新靶点和技术。Curr Opin Oncol 2020；32:510-517)。此外，基因工程工具的持续进步意味着非病毒方法现在可以实现基因组靶向(Roth T等人，用非病毒基因组靶向重新编程人类T细胞功能和特异性。Nature 2018；559:405-9)。
传递系统是作为一项先进技术开发的，旨在满足细胞治疗领域的开发和制造需求。本文介绍了该系统在一系列货物类型下的传递效率。该平台的一个重要特征是在不损害细胞活力的情况下支持多重传递和顺序基因编辑能力。如果要在液体肿瘤和固体肿瘤的自体细胞治疗中提高靶向性和疗效，细胞将需要使用可以与制造工艺相结合的步骤进行多次修饰。这可能涉及多路或顺序工程步骤。类似的要求适用于异基因方法，其中细胞排斥和GvHD意味着可能需要复杂的编辑。
病毒载体能力和电穿孔毒性的限制意味着这些模式可能不适合许多复杂的工程方案。此外，即使是研究级病毒载体的设计和生成也需要很长的准备时间，这意味着在开发阶段，时间可能比预期的要长。这与进展中的实体瘤新方法有关，其中靶向和疗效挑战意味着需要测试大量候选靶抗原和细胞效力增强。有必要以快速、高通量的方式评估大量细胞组成，如果完全依赖于病毒载体，这些组成可能会受到高度限制。因此，需要新的非病毒细胞内递送方式。本文报道的研究表明，该系统与液体肿瘤CAR T的优化以及在解决实体肿瘤方面取得重大进展所需的创新周期的加速相兼容。
如果细胞工程化要发挥作用，就必须保持细胞活力。该领域对开发替代的非病毒传递方法很感兴趣，这种方法既有效又对细胞温和。本文报道的研究表明，转染过程对细胞活力的影响最小。
总之，传递系统代表了一个有吸引力的非病毒传递平台，可以有效地设计T细胞，同时保持高水平的细胞活力，因此非常适合应对下一代细胞治疗产品的制造挑战。
这里使用的材料和方法
细胞分离和培养
使用淋巴预备密度梯度培养基(StemCell)从新鲜白细胞中分离PBMC，并用标准方法冷冻保存。解冻后，使用针对T细胞上细胞表面标记物的特异性抗体，例如可溶性CD3(克隆：OKT3)和CD28(克隆：15E8)抗体(均为Miltenyi Biotech)，每个100ng/ml，将PBMC启动(即刺激或激活)至T细胞。细胞在完整的培养基中培养3天，培养基由CTS优化器+补充剂(Gibco)和5％生理血清替代物(Nucleus Biologics)、1％L-谷氨酰胺和250IU/ml IL-2(CellGenix)组成。
使用传递系统转染
使用之前描述的方法进行转染(O'Dea S,Annibaldi V,Gallagher L,MulhollandJ,Molloy E,Breen C,Gilbert J,Martin D,Maguire M,Curry F.Vector-freeintracellular delivery by reversible permeabilization.PLoS ONE 2017；12.)。将细胞以每孔3.5x 105个细胞的量转移至96孔过滤器底板(安捷伦公司)上，或以每孔6x 106个细胞的速度转移至荚膜(阿维塔斯公司)。以350×g的速率离心120秒，从96孔板中移除培养基，并通过重力流从豆荚中移除培养基。将货物与传递溶液(32.5mM蔗糖、106mM氯化钾、5mM(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙基磺酸)(HEPES)在水中的溶液)混合，并将1μl或50μl的上述混合物分别输送到96孔板和荚膜中的细胞上。对于RNP和mRNA的传递，所述传递溶液还分别含有10％和12％v/v的乙醇。在室温下培养30秒后，添加50-2000μl 0.5倍磷酸盐缓冲盐溶液(68.4mM氯化钠、1.3mM氯化钾、4.0mM磷酸氢钠、0.7mM磷酸二氢钾)，30秒后添加完整培养基。
GFP mRNA、CAR mRNA和RNP复合物的传递
对于SOLUPORETM传递方法和电穿孔法，GFP mRNA和CD19 CAR mRNA(均来自TriLink生物技术公司)的最终浓度分别为每百万个细胞2微克和每1x106个细胞3.3微克。使用生物素结合的CD19-CAR检测试剂(购自Miltenyi Biotec公司)评估CD19-CAR表达，然后使用Steptavidin–PE和7-氨基放线菌素D(7AAD)作为活性染色剂。以3.3μg/1x106细胞的最终浓度递送Cas9蛋白(整合DNA技术)，并与2摩尔过量的引导RNA(gRNA)预复合(CRISPR相关内切酶Cas9(Cas9)–2.48μM和gRNA 4.96μM；整合DNA技术)。靶向人TRAC(T-细胞α受体)的gRNA序列是AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:1)并且靶向人CD7-的gRNA序列是GGAGCAGGTGATGTTGACGG(SEQ ID NO:2)。使用流式细胞计分析CD3和CD7(抗体克隆CD7-6B7,BioLegend)的表达。
扩增实验
用GFP mRNA转染后，根据使用说明书，使用NC玻片A8TM和溶液13(ChemoMetec)TM在NC-3000TM上计数T细胞。将样品调节至1x106个细胞/mL的活细胞密度，并将200μL转移到u型底的96孔板(Greiner)中。将细胞置于37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养72小时。然后对样品进行计数，以1x106个细胞/mL的活细胞密度在新鲜培养基中重新接种，并再孵育96小时。通过将5x106个活细胞的起始细胞数乘以3天内观察到的倍数生长来计算7天内的预计细胞生长，然后将该值乘以随后4天内观察的倍数生长。
流式细胞术分析
使用NovoCyte 3000进行刘氏细胞术。使用NovoExpress software(AceaBiosciences公司)进行数据检验。
数据统计
对细胞增殖数据进行Wilcoxon配对符号秩检验。
实施例2:在 传递系统上同时进行多个编辑
传递系统用于评估同时传递多个Cas9RNP后对多个靶位点的编辑。/>研究平台传递系统和临床平台(SUS)均用于这些实验。将来自3个健康供体的分离的CD3+细胞在TexMACS(Miltenyi Biotech)5％HAB(Valley Biomedical)中培养，并用TransAct(TA；Miltenyi生物技术公司)和120/mL IL-2(Cell Genix)活化3天。制备CRISPR Cas9 RNPs靶向TRAC(引导RNA序列：AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:1)),CD7(引导RNA序列：GGAGCAGGTGATGTTGACGG(SEQ ID NO:2))和β-2微球蛋白(B2m；引导RNA序列GGCCGAGATGTCTCGCTCCG(SEQ ID NO:3))位点(引导RNA与Cas9摩尔比为2：1)并传递到(3μg/1x106细胞)到活化细胞中(/>研究平台传递系统每次重复6x106细胞，临床平台每次重复20x106个细胞).
传递后，将细胞在37℃、5％CO2和95％湿度下培养4天(在第2天分裂)，然后通过蛋白质表达进行编辑分析。用抗CD3的抗体(TRAC-RNP，抗体克隆SK7，购自BioLegend公司)、CD7(CD7-RNP；CD7-SB7，购自BioLegend公司)和HLA(B2m-RNP；抗体克隆W6/32，购自BioLegends公司)对细胞进行染色，并使用流式细胞术评估表达。对于B2M KO，所使用的抗体是测量HLA ve反应的抗HLA APC，因为MHC-1具有结合肽的人类白细胞抗原(HLA)编码的α链和作为稳定支架的Beta-2微球蛋白(B2M)，并且B2M基因敲除导致HLA-1表面表达的损失。
研究平台传递系统和临床使用平台的所有3种蛋白质均为阴性的百分比群体分别为46±7和38±9(3个供体，3个技术重复)；分别参见图2A和2B。研究平台传递系统和临床平台的性能相当，其他技术的三次编辑率不超过10％。
醇(乙醇)对 传递系统输送后RNP编辑效率的影响
使用传递系统进行实验，以确定乙醇是否对递送后RNP编辑效率有影响。此外，在/>传递系统传递RNP后，进行实验以确定编辑的最佳乙醇浓度，例如，确定了允许最佳Cas9诱导编辑的最大乙醇浓度。乙醇的增加可以允许更大量的货物输送到细胞，从而允许更高的编辑效率。
用0、5、10和15％的乙醇和RNP制备Cas9 RNP–TRAC sgRNA摩尔比为2:1的浓度为0.4μg/μL(等于3.3μg每1x106个细胞；S缓冲液(32.5mM蔗糖；106mM氯化钾；5mM HEPES)的溶液，并在传递系统上用S缓冲溶液以各个乙醇浓度进行试验。实验设计如图3所示。
“S缓冲液”包括在4℃下持续5分钟的低渗生理缓冲溶液(78mM蔗糖、30mM KCl、30mM乙酸钾、12mM HEPES)(Medepalli K.et al.,Nanotechnology 2013；24(20)；通过引用整体并入本文)。在一些实施例中，在S缓冲液中用乙酸铵代替乙酸钾。S缓冲液在国际申请WO 2016/065341中进一步描述，例如，在[0228]-[0229]处，并通过引用将其全部并入本文。例如，在该系列实验中使用的S缓冲液包括32.5mM蔗糖；106mM氯化钾；和5mM HEPES。
结论：使用传递系统在递送后测试每种乙醇浓度下的CD3编辑效率(例如，监测TRAC-RNP)。参见图4，其描绘了用靶向CD3的抗体染色的细胞的代表性流式细胞术图(封闭活的群体)，并且图5A显示了条形图，其显示CD3编辑的水平随着乙醇浓度的增加而适度增加(0％EtOH-58％至15％EtOH-66％)，并且结果进一步总结在图5B的表中。
实施例3:在人原代T细胞中进行CRISPR/RNP编辑
进行了三个不同的实验，其中货物被传递进行一次编辑，货物被同时给药。
在人原代T细胞中评价CRISPR/RNP编辑。评估了CRISPR/RNPs在多个靶位点的单次编辑，编辑效率在60-80％之间，细胞活力在80-90％之间。参见图7A-7C。成功的编辑，通过RNP浓度范围(0.12；0.37；1.1；3.3和9.9μg每1x106铬细胞),对于TRAC(引导RNA序列：AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO:1)；CD3),CD7(引导RNA序列GGAGCAGGTGATGTTGACGG(SEQ ID NO:2)),和B2M(引导RNA序列GGCCGAGATGTCTCGCTCCG(SEQ ID NO:3)；HLA)观察到RNPs具有>80％存活性。
编辑过程中保留了T细胞表型
基因编辑在RNP传递后4小时内是明显的，因此在早期时间点保存干细胞表型至关重要。CD8+细胞是主要的细胞毒性T细胞，并且在CD4+辅助T细胞中观察到类似的趋势。参见图8(其中记录了4小时的时间点)。
在基因编辑窗口期间，使用传递系统的细胞显示出比核感染(NF；Lonza核感染)更高的干细胞样表型百分比。例如，早期时间点窗口可以包括3小时(参见，例如，Kim et al.Highly efficient RNA-guided genome editing in human cellsvia delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.Genome Res.2014；24(6):1012-1019，通过引用全文并入本文)，或者晚时间点窗口可以是基因编辑在24小时内完成的地方(参见，例如，Brinkman EK,et al.Kinetics and Fidelity of the Repair of Cas9-Induced Double-Strand DNA Breaks.Mol Cell.2018；70(5):801-813.e6；通过引用整体并入本文)。
其他实施方案
虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利、公开的美国专利申请、指定美国的PCT专利申请、公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。通过附录号引用的Genbank和NCBI附录均通过引用并入本文。本文引用的所有其他已出版参考文献、文件、手稿和科学文献均通过引用并入本文。这里引用的所有其他公开的参考文献、文件、文稿或者科技期刊均通过引用在此全部并入本文。如果发生矛盾，以本申请说明书及其定义的内容为准。另外，这里描述的材料、方法和实施例仅起到说明的目的，并不作为对本发明的限制。
虽然已经参考本发明的优选实施例具体地示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以对本发明的形式和细节进行各种改变。

Claims (7)

1.一种包含至少两种外源性货物的免疫细胞，其中所述外源性货物包含核糖核蛋白(RNP)、核酸、蛋白质或其任何组合。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述RNP包括T细胞受体α常数(TRAC)RNP或分化簇7(CD7)RNP。
3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中所述至少两个外源货物被顺序地传递。
4.根据权利要求1所述的免疫细胞，其中与参照免疫细胞相比，所述免疫细胞的活力增加。
5.一种通过非粘附免疫细胞的质膜传递至少两种外源性货物的方法，
提供非粘附细胞群体；和
使所述细胞群体与一定体积的等渗水溶液接触，所述水溶液包括所述外源货物和浓度大于0.2％(v/v)的醇。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，至少两种外源性货物被顺序传递。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述至少两种外源性货物包括核糖核蛋白(RNP)、核酸、蛋白质或其任何组合。
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