CN113710811A - T细胞基因表达的非病毒修饰 - Google Patents

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Abstract

提供了一种脂质混合组合物，其包含可电离脂质、结构脂质例如DSPC、甾醇和表面活性剂例如聚山梨醇酯80、聚氧乙烯(10)硬脂醚、聚氧乙烯(20)硬脂醚或D‑α‑生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。脂质混合组合物特别适用于转染难以转染的细胞和维持这些细胞的活力。脂质混合组合物特别适合离体T细胞转染。

Description

T细胞基因表达的非病毒修饰
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月15日提交的美国临时申请62/833,993；2019年6月13日提交的62/861,220和2019年10月19日提交的62/923,525的优先权。
背景
(a)领域
所公开的主题一般涉及将核酸递送至活细胞，特别是活T淋巴细胞(T细胞)，同时保持它们的活力。
(b)相关现有技术
为了治疗目的改变基因表达可以通过将脂质纳米颗粒(LNP)中的核酸递送至细胞来实现。外源mRNA有望成为产生体内蛋白质表达的一种手段，并且当由LNP而不是病毒载体递送时，可以避免病毒递送所带来的副作用和安全问题。
嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR)是一种现已批准用于人类的靶向免疫疗法(KymriahTMtisagenlecleucel和YescartaTM axicabtagene ciloleucel)。该过程使用来自接受治疗的受试者的细胞，选择并富集T细胞，然后使用病毒载体改造这些细胞以表达嵌合抗原受体(CAR)。细胞返回受试者，导致免疫治疗1。
尽管CAR治疗取得了成功，但存在以下问题：a)并非所有处理过的T细胞都具有CAR，b)在转染的T细胞上表达的CAR量存在差异，c)接受CAR的患者经常已进行多轮化疗，这意味着更难富集的较少的健康T细胞，并且4)细胞因子释放综合征(CRS)患者的发病率很高(46％或更高)2,3。CRS患者需要重症监护病房级别的护理，并需要使用强大且昂贵的免疫疗法例如托珠单抗(ActemraTM)进行治疗。
已经尝试了基于病毒的至T细胞转化，但是其是劳动密集型、昂贵的并且造成制造和监管挑战。载体设计和开发需要时间，因为合适的载体决定了转导的效率。此外，病毒制造方法价格昂贵，因为它们受到高度监管、需要大量设备和劳动密集型(每个患者一个批次)。
基于病毒的转染还带来病毒基因组可能随机插入人类基因组的风险，并且需要患者离开医院以在专门的病毒制造场所收获和处理T细胞。
另一种T细胞转化技术使用电穿孔和环状DNA来修正T细胞蛋白表达。然而，电穿孔的细胞可能需要很长时间才能增殖，这表明T细胞的健康已受到该过程的影响。最近的一项研究表明，与LNP介导的mRNA递送相反，电穿孔后T细胞的存活率为31％1。“睡美人CART疗法”就是这样一种电穿孔方式，但在2018年被搁置4,5。
比电穿孔破坏性更小的非病毒方法将推进T细胞介导的免疫疗法治疗，同时保持T细胞活力和受试者健康。
发明概述
根据一个实施方案，提供了一种脂质混合组合物，其包括35-55Mol％的可电离脂质、5-25Mol％的结构脂质、25-40Mol％的甾醇和0.1-3Mol％的表面活性剂。根据另一个实施方案，组合物与核酸混合以形成脂质颗粒。根据另一个实施方案，提供了用于将核酸转染到靶细胞中的脂质混合组合物。根据另一个实施方案，提供了一种脂质混合组合物，其中所述转染在离体发生。
根据另一个实施方案，提供了一种脂质混合物，其中结构脂质是DSPC。在另一个实施方案中，DSPC以10-20Mol％存在。在又一个实施方案中，DSPC以20Mol％存在。在另一个实施方案中，提供了一种脂质混合物，其中表面活性剂是聚氧乙烯(10)硬脂醚。根据另一个实施方案，提供了一种脂质混合物，其中表面活性剂是聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。在另一个实施方案中，表面活性剂是D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。
在本发明的实施方案中，可电离脂质是任何可电离脂质。在一些实施方案中，可电离脂质是BOCHD-C3-DMA。在本发明的一些实施方案中，可电离脂质是Dlin-MC3-DMA。在本发明的一些实施方案中，可电离脂质是DODMA。在本发明的一些实施方案中，可电离脂质是KC2(DLin-KC2-DMA)。在其他一些实施方案中，可电离脂质是C12-200。
在本发明的实施方案中，可电离脂质为40-50Mol％，结构脂质为10-20Mol％DSPC，甾醇为37-39Mol％，表面活性剂为1-3Mol％。
在本发明的进一步实施方案中，可电离脂质包含50Mol％，结构脂质包含10Mol％DSPC，甾醇包含37.5Mol％胆固醇，并且表面活性剂包含2.5Mol％聚氧乙烯(10)硬脂醚。
在其他实施方案中，可电离脂质包含40Mol％，结构脂质包含20Mol％DSPC，甾醇包含37.5Mol％胆固醇，并且表面活性剂包含2.5Mol％聚氧乙烯(10)硬脂醚。
在本发明的其他实施方案中，公开了一种脂质混合组合物，其中可电离脂质包含40Mol％，结构脂质包含20Mol％DSPC，甾醇包含38.5Mol％胆固醇，并且表面活性剂包含1.5Mol％聚山梨醇酯80。在其他实施方案中，可电离脂质为50Mol％，结构脂质为10Mol％DSPC，甾醇为37-40Mol％，表面活性剂为约0.5Mol％至2.5Mol％。在本发明的实施方案中，表面活性剂包含约2.5Mol％的聚氧乙烯(10)硬脂醚。在本发明的实施方案中，表面活性剂包含约1.5Mol％的聚山梨醇酯80。在本发明的实施方案中，表面活性剂包含约0.5Mol％的聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。在本发明的实施方案中，表面活性剂包含约0.5Mol％的D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。
在本发明的实施方案中，本发明细胞的脂质混合组合物特别适用于T细胞转染。
在本发明的实施方案中，提供了一种体外处理T细胞的方法，包括从体液中分离T细胞，并使所述细胞与包封在根据本发明的实施方案的脂质混合组合物中的核酸治疗剂接触。
在本发明方法的实施方案中，当进行接触时，T细胞即将开始或处于对数生长期。在实施方案中，从细胞培养的第3天至第7天进行接触。在优选的实施方案中，在细胞培养的第3天进行接触。在另一个实施方案中，在细胞培养的第7天进行接触。
根据以下对所选实施方案的详细描述，其主题的特征和优点将变得更加明显，如附图所示。将意识到，所公开和要求保护的主题能够在各个方面进行修改，所有这些都不脱离权利要求的范围。因此，附图和描述在本质上被认为是举例说明性的，而不是限制性的，并且主题的全部范围在权利要求中阐述。
附图的简要说明
通过以下详细描述并结合附图，本公开内容的进一步特征和优点将变得明显，其中：
图1是活化后分离的T细胞的生长(细胞计数)随时间的线性图；
图2是条形图，其显示在活化后7天在暴露48小时的六种不同脂质混合组合物的BOCHD-C3-DMA LNP中用2μg mRNA/500000个细胞处理的活CD4+/CD8+T细胞中的相对GFP蛋白表达；
图3是条形图，其显示在活化后7天在暴露48小时的五种不同脂质混合组合物的MC3 LNP中用2μg mRNA/500000个细胞处理的活CD4+/CD8+T细胞中的相对GFP蛋白表达；
图4是条形图，其显示负选择的T细胞中由用CT10、CT22和脂质混合物A组合物配制的mRNA脂质纳米颗粒(LNP)介导并通过ELISA就基因表达进行分析的总GFP表达。所有三种组合物的可电离脂质均为BOCHD-C3-DMA；
图5是来自20-75岁的两性不同供体的mRNA处理的T细胞中GFP表达的分布图。数据点的不同形状和/或模式代表不同的供体，每个的细胞群用5种不同的脂质混合组合物脂质混合物A、CT7、S11、CT10、CT22进行测试；
图6是条形图，显示了在2μg mRNA/500,000个细胞的剂量和10的N/P比率下，由BOCHD-C3-DMA LNP中的mRNA介导的活T细胞中的相对GFP表达。使用负选择或正选择方案从新鲜全血中分离来自同一供体的原代人T细胞，并使用三重活化剂活化；
图7是直方图，显示细胞群具有某些特征，如通过活原代人T细胞的流式细胞术测量的，所述活原代人T细胞在活化后7天用三种不同脂质混合组合物的mRNA LNP处理48小时。从上到下，直方图代表来自CD8+分离(大圆点)、CD4+分离(水平浅色条纹)、仅全T分离CD8+细胞(较小圆点)、仅全T分离CD4+细胞(水平深条纹)、来自全T分离的所有T细胞(深灰色)和最后未处理的细胞(浅半透明灰色)的GFP表达。可电离脂质为BOCHD-C3-DMA；
图8是条形图，显示了源自LNAP处理的活CD4+/CD8+T细胞的相对GFP蛋白表达。第一个标记为DOPE LNAP的条包含结构脂质DOPE代替DSPC，而第二个标记为DSPC LNAP(CT22)的条具有DSPC作为结构脂质。两种脂质混合组合物在IL、结构脂质、胆固醇和聚山梨醇酯80的比率方面对应于Lipid Mix CT22；
图9是条形图，显示了由具有两种不同DSPC摩尔比的四种不同组合物在活化的、转染的T细胞中的GFP表达；
图10是两个条形图，第一个显示在活化后7天在48小时内用2μgmRNA/500000个细胞处理的活CD4+/CD8+T细胞中的相对GFP蛋白表达，并且其中可电离脂质是BOCHD-C3-DMA、DODMA、KC2或MC3之一。第二个是分离的人T细胞的LNP介导的转染的图示，如通过活力(黑色条)和GFP表达(灰色条)测量的，使用500ng LNAP/125000个CT10组合物的细胞，使用BOCHD-C2-DMA或C12-200作为可电离脂质；
图11是一系列条形图，显示了包含40Mol％可电离脂质、20Mol％DSPC、40-x Mol％胆固醇和x Mol％稳定剂的脂质混合组合物的结果，其中x＝0.5、1.5或2.5Mol％；标记为A(i)和(ii)的条形图是使用稳定剂Brij S10在分离的原代人T细胞中编码eGFP的mRNA LNP的转染效率(i)和MFI(ii)；条形图B(i)和(ii)是使用稳定剂Brij S20的转染效率(i)和MFIii)；条形图C(i)和(ii)是使用稳定剂Tween80的转染效率(i)和MFI(ii)；条形图D(i)和(ii)是使用稳定剂TPGS-1000(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)的转染效率(i)和MFI(ii)；
图12是条形图，显示以N/P 10用mRNA LNP(包括x轴中引用的脂质混合组合物)在活化后7天处理的CD4+/CD8+T细胞的活力，活细胞通过流式细胞术确定(使用活/死染色剂FVS 570)。所有三种组合物的可电离脂质是BOCHD-C3-DMA；
图13是显示了三个测量值的一系列条形图，即在用BOCHD-C3-DMA或MC3作为可电离脂质起始T细胞扩增后3天或7天将T细胞暴露于CT10 LNAP之后的％GFP+活全T细胞、GFPMFI和T细胞活力；
图14是使用BOCHD-C3作为CT10组合物中的可电离脂质的来自15个不同供体的在活化后第3天暴露于LNAP的活全T细胞中GFP％表达的图示；
图15是使用BOCHD-C3(黑色条)或MC3(灰色条)作为CT10组合物中的可电离脂质在第7天暴露于LNAP的来自6个不同供体的活全T细胞中GFP％表达的图示；
图16是两个条形图，示出了在五种条件下以N/P 8含有IL与CT10组合物的mRNA-LNP介导的分离的原代人T细胞、新鲜T细胞、在第三天处理的冷冻T细胞和在第四天处理的冷冻T细胞、静置和在第3天处理的冷冻T细胞、静置和在第4天处理的冷冻T细胞中的转染效率和GFP表达；
图17是一系列线图，显示了用以4-12的N/P在CT10组合物中的含有BOCHD-C3-DMA作为IL的mRNA-LNP转染的分离的原代人T细胞中的GFP表达。在活化后3天或7天以125ng或500ng的包封的mRNA/125000个细胞向T细胞施用mRNA-LNP后48小时通过流式细胞术测量的转染效率、活力和GFP MFI；
图18是在T细胞活化后3天由不同剂量的以N/P 8含有脂质BOCHD与CT10组合物的mRNA-LNP介导的分离的原代人T细胞中GFP表达的图示。
图19是一组条形图，显示了在添加CT10 LNAP后2、4、7或14天通过流式细胞术测量的活T细胞的GFP％和GFP MFI；
图20是条形图，显示在处理48小时后分析的由包含CT10脂质组合物的mRNA脂质纳米颗粒(LNP)介导的负选择T细胞中的总EPO表达。收获T细胞并针对细胞溶质EPO裂解T细胞，并针对分泌的EPO对培养基上清液取样。对于测试组合物，可电离脂质为BOCHD-C3-DMA或DLin-MC3-DMA，对照为未处理的T细胞和由ELISA试剂盒制造商提供的血清对照(
Figure BDA0003302919550000081
IVD Human Epo ELISA和
Figure BDA0003302919550000091
Human Serum Controls)；
图21是条形图，显示负选择的T细胞中由包含CT10、CT22和脂质混合物A组合物的mRNA LNP介导并在处理48小时后进行分析的总重组人促红细胞生成素(EPO)表达。收获T细胞并针对细胞溶质EPO裂解T细胞，并针对分泌的EPO对培养基上清液取样。所有三种组合物的可电离脂质均为BOCHD-C3-DMA；
图22是由以N/P 8含有脂质BOCHD-C3-DMA与CT10组合物的mRNA-LNP介导的分离的原代人T细胞中CD19 CAR表达的图示，显示了使用125ng的包封的mRNA/125000个细胞三重活化后3天添加LNP后12、24和48小时通过流式细胞术测量的转染效率和MFI；
图23是一系列条形图，显示了由以N/P 8含有脂质BOCHD与CT10或CT14组合物的mRNA-LNP介导的分离的原代人T细胞中的CD19 CAR表达。转染效率，MFI使用125ng或500ng的包封的mRNA/每125000个细胞活化后3天将mRNA-LNP给予T细胞；
图24是定制CAR质粒的遗传结构，显示了含有抗CD19-h(BB)-eGFP-第二代CAR(T7Mut)基因盒的pcDNA3.1克隆载体。质粒图谱是使用
Figure BDA0003302919550000092
Viewer4.1.9创建的。该质粒被线性化用于体外转录并加帽以生成编码在人类T细胞中表达的抗CD19-h(BB)-eGFP-第二代嵌合抗原受体(CAR)的定制mRNA。
详细描述
本发明提供了脂质混合组合物、它们在产生核酸治疗剂和其他寡聚物例如肽的脂质混合组合物中的用途，以及使用这些脂质混合物和所得脂质混合组合物来克服转染抗性细胞类型的方法。
在另一方面，本发明的脂质混合组合物被提供用于与核酸治疗剂混合以产生脂质核酸颗粒，该颗粒增强核酸向靶细胞或组织的递送，与更传统的脂质混合组合物或脂质核酸颗粒(例如由市售脂质混合物例如LipofectamineTM或TransfectamineTM转染剂制成的那些)相比具有更低的毒性。
在另一方面，本发明提供脂质混合组合物，其包括可电离脂质、一种或多种结构脂质、胆固醇和特定表面活性剂。
在另一方面，根据本发明的脂质混合组合物用于配制核酸和肽治疗剂，用于治疗中枢神经系统疾病，或用于细胞重编程，或用于人T细胞的离体转化。
“脂质”是指结构不同的一组有机化合物，它们是脂肪酸衍生物或甾醇，或者可以是如类脂质(例如C12-200)中的类脂质材料，并且其特征在于不溶于水但可溶于许多有机溶剂。
“脂质颗粒”。本发明提供了由上述脂质混合组合物制造的脂质颗粒。脂质颗粒代表脂质混合组合物和治疗剂的物理组织。脂质纳米颗粒(“LNP”)是一种小的、半到完全有组织的脂质颗粒。脂质核酸颗粒或LNAP通常是脂质、核酸、胆固醇和稳定剂的球形组装体。元素的正负电荷、比率以及亲水性和疏水性决定了脂质颗粒在组分方向和LNAP尺寸方面的物理结构。脂质颗粒的结构组织可能导致如脂质体中的具有最小双层的水性内部6，或它可能具有如固体核酸脂质纳米颗粒中的固体内部7。可能存在单一或多重形式的磷脂单层或双层8。LNAP是脂质颗粒或LNP的一个亚组，因为指定了包含核酸。
如本文所用，“N/P”是可电离脂质的胺基团的摩尔数与核酸的磷酸基团的摩尔数之比。在本发明的实施方案中，N/P比率为4至12，最优选的比率为N/P 8-10。在一个实施方案中，N/P比率为10。在一个优选实施方案中，N/P比率为8。
“脂质混合组合物”是指组分的类型、组分的比率以及总组分与核酸有效载荷的比率。例如，40Mol％可电离脂质、20Mol％结构脂质、17Mol％甾醇和2.5Mol％表面活性剂的脂质混合组合物将是一种脂质混合组合物。核酸组分与该脂质混合组合物缔合以以预定比率(例如可电离脂质胺(N)与核酸磷酸比率(P)为N/P 4、N/P 6、N/P 8、N/P 10、N/P 12或其他相关的特定N/P比率)形成脂质核酸颗粒或LNP。
当提及体外细胞时，“活力”是指继续生长、分裂以及继续生长和分裂的能力，如对于细胞类型或组织培养株来说是正常的那样。细胞活力受恶劣条件或处理的影响。细胞活力在离体治疗或肠胃外施用中至关重要。
“可电离脂质”。脂质颗粒包括可电离的脂质。如本文所用，术语“可电离脂质”是指当pH低至脂质的可电离基团的pKa以下时呈阳离子或变得可电离(质子化)但在较高pH值时更呈中性的脂质。在低于pKa的pH值下，脂质能够与带负电荷的核酸(例如，寡核苷酸)缔合。如本文所用，术语“可电离脂质”包括在pH降低时带正电荷的两性离子脂质，以及在选择性pH，例如生理pH下携带净正电荷的多种脂质种类中的任一种。此类脂质包括但不限于N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；1,2-二油酰-3-二甲氨基丙烷(DODAP),N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)；3-(N-(N',N'-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol),和N-(1,2-二肉豆蔻基氧丙基-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)。
在其他优选的实施方案中，可电离脂质是氨基脂质。在本发明的优选实施方案中，可电离脂质是1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲氨基)丁酸酯盐酸盐(“BOCHD-C3-DMA”)。该化合物公开于美国公开申请第2013323269号。在其他优选实施方案中，可电离脂质是三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或“MC3”)。在其他优选实施方案中，可电离脂质是2,2-二亚油基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA或“KC2”)。在其他优选实施方案中，可电离脂质是(1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇))或“C12-200”。
在其他实施方案中，适用于本发明脂质纳米颗粒的阳离子脂质包括但不限于：DLenDMA；98N12-5；reLNP；如美国专利公开20120295832A1中所述的KL 22，HGT5001，也称为CCBene；HGT4003、HGT5000、HGT5001、HGT5002，均由Ball，R等人在PCT公开号WO2020047061A1和WO2013/14910中公开，以及Derosa，Frank等人在US10507183BB中公开；美国专利公开第20180333366A1号中提到的Lipidoid，如Payne等人在美国专利号US10399937BB中所述的ATX-002；如美国专利号10,383,952B2中的ATX-57、ATX-58、ATX-81、ATX-88，2-(1,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)肼基)-N,N-二甲基乙烷-1-胺)、4-(二甲氨基)-N',N'-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基丁烷酰肼、2-(二((9Z,12,Z)-十八-9,12-二烯-1-基)氨基)乙基4-(二甲氨基)丁酸酯、2-(二((9Z,12Z)-十八-9,12)-二烯-1-基)氨基)乙基和4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁酸酯，如美国专利公开号2019292130A1中所述的。
可用于本发明的其他合适的氨基脂类还包括在PCT专利公开号WO 2009/096558中描述的那些。代表性的氨基脂质包括1,2-二亚油基氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫基-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA),1-亚油酰基-2-亚油基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP),1,2-二亚油基氧基-3-三甲氨基丙烷氯化盐(DLin-TMA·Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲氨基丙烷氯化盐(DLin-TAP·Cl)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ),3-(N,N-二亚油基氨基)-l,2-丙二醇(DLinAP),3-(N,N-二油基氨基)-l,2-丙二醇(DOAP),1,2-二亚油基氧基-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA),2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[l,3]-二氧戊烷(DLin-K-DMA),1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLin-DMA)和1,2-二油基氧基-3-二甲氨基丙烷(DODMA)。
在其他实施方案中，使用Almarsson,Orn And Lawlor,Ciaran Patrick在US20180000953中提及的可电离脂质，例如3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-十三烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25),2-(9氧)-N,N-二甲基-3-[(9Z,2Z)--十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinD MA)、(2R)-2-(9氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z-,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-氨基(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-(9氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,1-2Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))。
存在于本发明的组合物和脂质颗粒的实施方案中的可电离脂质优选包含约35至约55Mol％，或更优选40至约50Mol％的量。
结构脂质也称为“辅助脂质”或“中性脂质”。本发明的组合物和脂质颗粒包含占组合物约10至20Mol％的一种或多种结构脂质。据信合适的结构脂质支持颗粒的形成。结构脂质是指在生理pH下以阴离子、不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任何一种。代表性的结构脂质包括二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、二酰基磷脂酰甘油、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。
示例性结构脂质包括两性离子脂质，例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个优选的实施方案中，结构脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
在另一个实施方案中，结构脂质是在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括磷脂酰甘油，例如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、心磷脂、磷脂酰肌醇、二酰磷脂酰丝氨酸、二酰磷脂酸和与中性脂质连接的其他阴离子修饰基团。其他合适的结构脂质包括糖脂(例如，单唾液酸神经节苷脂GM1)。
稳定剂包含在脂质混合组合物和脂质核酸实施方案中以确保混合物在其他尚未完全了解的作用中的完整性。稳定剂是一类破坏或帮助形成分子间疏水-亲水相互作用的分子。稳定剂的实例包括：聚山梨醇酯(Tweens)和稳定化脂质组合，包括聚山梨醇酯和麦芽糖苷、烷基多糖苷、山梨糖醇酯(Spans)、聚氧乙烯烷基酯、聚氧乙烯烷基醚、泊洛沙姆和PEG缀合的脂质。根据本发明的实施方案优选的稳定化脂质包括：
BrijTMS10，也称为聚氧乙烯(10)硬脂醚，BrijTMS20，也称为聚氧乙烯(20)硬脂基醚，BrijTML23，也称为聚氧乙烯(23)月桂基醚，BrijTM35，线性分子式：(C2H4O)nC12H26O，CAS号：9002-92-0；BrijTML4，也称为聚氧乙烯(4)月桂基醚聚山梨酯80或
Figure BDA0003302919550000151
也称为聚山梨酯80，以及Myrj52，也称为聚氧乙烯(40)硬脂酸酯。合适的稳定剂包括聚山梨酯80(也称为Tween 80，IUPAC名称2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)oxolan-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基十八-9-烯酸乙酯)，Myrj52(聚氧乙烯(40)硬脂酸酯，CAS编号：9004-99-3)、BrijTMS10(聚氧乙烯(10)硬脂醚，CAS编号：9005-00-9)、BrijTMS20(聚氧乙烯(20)硬脂醚，CAS编号：9005-00-9)、Brij 35(聚氧乙烯单月桂基醚，CAS[9002-92-0])、BrijTML4(聚乙二醇十二烷基醚、聚氧乙烯(4)月桂基醚，CAS编号9002-92-0)和TPGS-1000(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，CAS编号：9002-96-4)。稳定剂可以混合和组合使用。
在一些实施方案中，表面活性剂占总脂质混合物的约0.1至5Mol％。在一些实施方案中，表面活性剂占总脂质混合物的约0.1至3Mol％。在一些实施方案中，表面活性剂占总脂质混合物的约0.5至2.5Mol％。在一些实施方案中，表面活性剂为约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等等。
优选的脂质混合组合物中包括甾醇，由其制成的脂质颗粒包括甾醇，例如胆固醇和植物甾醇。在本发明的脂质混合物中，在一些实施方案中，胆固醇以最终脂质混合物的约30至50Mol％存在。优选地，胆固醇以最终脂质混合物的约35至41Mol％存在。在各种优选实施方案中，胆固醇以约29.5、39.5、38.5和37.5Mol％存在。甾醇包括结构上与胆固醇家族相关的分子、类似物，包括天然或合成来源。可以有效地使用改性的和天然存在的植物甾醇代替胆固醇。Patel Sidharth等人描述了一些增强细胞系中使用LNP的mRNA递送的天然存在的甾醇6。
肽。本发明的脂质混合组合物和脂质颗粒可用于肽的全身或局部递送。如本文所用，术语“治疗性肽”意在包括其递送到细胞中引起期望效果的任何氨基酸链。肽是氨基酸的短链，长度为2到50个氨基酸，与具有较长链(50个氨基酸或更多)的蛋白质相反，通常具有三级和/或四级结构。肽中的氨基酸通过被称为肽键的键按序列相互连接。在一些实施方案中，所述肽被核酸包封。
核酸。本发明的脂质混合组合物和脂质颗粒可用于核酸的全身或局部递送。如本文所用，术语“核酸治疗剂”(NAT)意在包括任何寡核苷酸或多核苷酸，其递送到细胞中产生期望的效果。含有多达50个核苷酸的片段通常称为寡核苷酸，更长的片段称为多核苷酸。在特定实施方案中，本发明的寡核苷酸长度为8-50个核苷酸。在本发明的实施方案中，寡核苷酸长度为996至4500个核苷酸，如在信使RNA的情况下。在本发明的其他实施方案中，信使RNA是自扩增mRNA。目前，越来越多的临床前和临床研究正在积极探索NAT。这些NAT包括用于靶向多种疾病例如癌症、传染病、遗传疾病和神经退行性疾病的基因治疗的脱氧核糖核酸、互补脱氧核糖核酸、完整基因、核糖核酸、寡核苷酸和核酶。NAT已在OnpattroTMpatisirin中显示出临床效用。自扩增mRNA和其他mRNA(WT和碱基修饰的)正在被评估为用于传染病的疫苗(用于COVID-19的mRNA-1273，用于切昆贡亚热的mRNA 1944)、罕见疾病(用于甲基丙二酸血症的mRNA-3704)。
如本文所述，核酸治疗剂(NAT)在脂质颗粒形成期间被并入脂质颗粒。可以以这种方式并入多于一种核酸治疗剂。“LNAP”是指脂质纳米颗粒中的NAT。
存在于根据本发明的脂质颗粒中的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文使用的核酸可以是单链DNA或RNA，或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂交体。双链DNA的例子包括结构基因、包含控制和终止区的基因，以及自我复制系统，例如病毒或质粒DNA。双链RNA的例子包括siRNA和其他RNA干扰试剂。单链核酸包括反义寡核苷酸、引导RNA，包括CRISPR-Cas9gRNA、核酶、microRNA、mRNA和三链形成寡核苷酸。可以将多于一种核酸(例如mRNA和引导RNA一起，或各自的不同类型)掺入脂质颗粒。
质粒DNA是在本发明的实施方案中配制的优选核酸。质粒是细胞内与染色体DNA分开的DNA分子，并且可以独立复制。质粒大小范围从小于1000个核苷酸到数万个核苷酸。最常见的形式是小的环状双链DNA。可合成质粒并将其递送至哺乳动物细胞以用于治疗目的。合成质粒用作分子克隆中的载体，用于驱动宿主生物体内重组DNA序列的复制。质粒可以通过使用物理方法例如电穿孔或本发明中的化学方法的转化、通过脂质颗粒增强转染引入细胞。本发明的这些脂质混合组合物与物理技术相比具有若干优点，包括i)在细胞和组织系统中的高生物相容性和低毒性，ii)相对易于制造，iii)亲脂性基质对在聚合物系统中观察到的侵蚀现象较不敏感，iv)由于它们不被免疫系统发觉而体内循环半衰期增加。
因此，在一个实施方案中，核酸治疗剂(NAT)是质粒或环状核酸构建体或线性化DNA。在一个实施方案中，NAT是mRNA或自扩增mRNA。
在一些情况下，核酸编码与配体(例如重组受体)和参与代谢途径的分子或其功能部分特异性结合的基因改造受体。或者，参与代谢途径的分子是重组分子，包括外源实体。基因改造受体和参与代谢途径的分子可由一种核酸或两种或更多种不同的核酸编码。在一些实例中，第一核酸可能编码与配体特异性结合的基因改造受体，而第二核酸可能编码参与代谢途径的分子。
核酸可以被构建为从相同启动子共表达多个分开的肽链。转录物可能有编码多于一种最终产品(例如两种最终产品)的潜力。核酸中的至少一种可具有分隔编码分子的内部核糖体结合位点(IRES)，使得基因改造受体和参与代谢途径的分子在相同启动子的控制下表达。“内部核糖体进入位点”(IRES)是一种核苷酸序列，它允许在信使RNA(mRNA)序列的中间进行翻译起始作为蛋白质合成的一部分。在一些实施方案中，核酸包括一个或多个核糖体跳跃序列，例如小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽，使得这两个或多个肽链或其他产物可以以与相同启动子可操作地连接的形式表达，但作为分开的链产生。
在一些情况下，单个启动子可以指导在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因的RNA的表达，所述两个或三个基因被编码自切割肽的序列(例如，2A序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶)的序列彼此隔开。
在一些实施方案中，基因改造或重组受体和/或参与代谢途径的重组或改造分子的表达或活性是组成性的；在一些实施方案中，一种或多种这样的表达或活性被改造成条件性的，例如，被一种或多种天然或非天然事件或分子诱导或抑制。
在一些实施方案中，受体和/或分子的表达在组成型启动子、增强子或反式活化子的控制下。在一些实施方案中，表达在条件启动子、增强子或反式活化子的控制下。
在一些实例中，分子或受体(通常是分子)的表达在一种或多种特定条件、事件或发现或以相对较高水平发现的分子时(特别是在身体部位、疾病、活化状态或组织中)是条件性的(例如被诱导或抑制，如通过诱导型启动子或其他元件)。例如，在一些实例中，启动子可以通过缺氧、缺乏葡萄糖或其他缺乏营养的条件诱导或抑制。参见例如Cao等人(2001)Gene Ther.,8:1357-1362和Dachs等人(2000)Eur.J.Cancer,36:1649-1660和Greco等人(2002)Gene Ther.,9:1403-1411。在其他表达控制类型中，表达受活化或增殖事件的调控。示例性的诱导系统是那些可被NFkappaB、NFAT或Nur77活化的系统。
在一些实施方案中，可以通过用调节因子例如强力霉素、四环素或其类似物处理细胞来控制本文所述的任何肽或核酸的表达。
在调节因子的存在下诱导或减少表达的转录调节剂结构域的具体实例包括但不限于在以下转录调节剂中发现的转录调节剂结构域：Tet-OnTM转录调节剂；Tet-OffTM转录调节剂、Tet-OnTM高级转录调节剂和Tet-OnTM3G转录调节剂；所有这些都可以从ClontechLaboratories,Mountain View,Calif获得。
在一些实施方案中，合适的启动子包括例如CMV、RNA聚合酶(pol)III启动子，包括但不限于(人和鼠)U6启动子、(人和鼠)H1启动子和(人和鼠)7SK启动子，包括其条件变体。在一些实施方案中，还可以制备包含源自例如不同类型的RNA聚合酶(pol)III启动子的元件的杂合启动子。在一些实施方案中，启动子序列可以是自然界中不存在的序列，只要它在真核细胞例如哺乳动物细胞中起作用。
术语“核酸”还指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的磷酸-糖-主链寡核苷酸、其他核苷酸、核苷酸类似物及其组合，并且可以是单链、双链或包含双链和单链序列的部分，视情况而定。信使RNA可以被修饰或未修饰、碱基修饰，并且可以包括不同类型的加帽结构，例如Cap1。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯键联(例如3'-5'和2'-5')、反向键联(例如3'-3'和5'-5')、分支结构或核苷酸间类似物连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。多核苷酸具有相关的反离子，例如H+、NH4+、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。多核苷酸可由核苷酸间、核碱基和/或糖类似物组成。
如本文所用，“核酸”是含有核碱基序列的聚合物或聚合物片段，其具有由核苷酸或其类似物形成的主链。
根据本发明的一些实施方案的脂质颗粒可以通过电子显微术表征。具有基本上实心的核的本发明颗粒具有如通过电子显微术所见的电子致密核。一种这样的结构在Cullis等人的美国专利号9,758,795中公开。电子密度的定义为使得实心核颗粒的投影面积的内部50％的面积平均电子密度(如2-D cryo EM图像中所见)不小于在颗粒外围的最大电子密度的x％(x＝20％,40％,60％)。电子密度计算为感兴趣区域的图像强度与不含纳米颗粒的区域中的背景强度的差异的绝对值。
可以使用确定溶液中的颗粒大小的装置(例如MalvernTMZetasizerTM)来评估本发明的脂质颗粒的大小。颗粒具有约15至约300nm的平均粒径。在一些实施方案中，平均粒度大于300nm。在一些实施方案中，脂质颗粒具有约300nm或更小、250nm或更小、200nm或更小、150nm或更小、100nm或更小、或50nm或更小的直径。在一个实施方案中，脂质颗粒具有约50至约150nm的直径。与较大的颗粒相比，较小的颗粒通常表现出增加的体内循环寿命。在一个实施方案中，脂质颗粒具有约15至约50nm的直径。离体应用不需要像体内应用那样小的颗粒。
混合。根据本发明的实施方案的脂质颗粒可以通过标准T管混合技术、湍流混合、研磨混合、搅拌促进顺序自组装或所有元素的被动混合与元素自组装成纳米颗粒来制备。已经开发了多种方法来配制含有遗传药物(LNAP)的脂质纳米颗粒(LNP)。例如，Ansell、Mui和Hope的美国专利第5,753,613号和Saravolac等人的美国专利第6,734,171号公开了合适的方法。这些方法包括在乙醇的存在下将预先形成的脂质颗粒与核酸治疗剂(NAT)混合，或将溶解在乙醇中的脂质与含有NAT的水性介质混合。
微流体两相液滴技术已被应用于生产用于药物递送的单分散聚合物微粒或生产用于包封细胞、蛋白质或其他生物分子的大囊泡。已经证明了使用流体动力学流动聚焦(一种常见的微流体技术来提供试剂的快速混合)来产生受控大小的单分散脂质体。
一般而言，诸如混合时的相对脂质和NAT浓度以及混合速率的参数难以使用当前的配制程序来控制，导致所产生的NAT的特性在制备内和之间发生变化。自动微混合仪器例如NanoAssemblrTM仪器(Precision NanoSystems Inc,Vancouver,Canada)能够快速和受控地制造纳米药物(脂质体、脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒)。NanoAssemblrTM仪器通过微流体混合盒实现纳米颗粒的受控分子自组装，其允许纳升、微升或更大规模的纳米颗粒组分的毫秒级混合，并允许定制或并行化。小规模的快速混合允许对颗粒合成和质量的可重现控制，这在大型仪器中是不可能的。
优选的方法结合仪器诸如微流体混合装置如NanoAssemblrTMSparkTM、IngniteTM或其前身、BenchtopTM和BlazeTM，以实现形成过程中使用的近100％的核酸在一步中被包封在颗粒中。在一个实施方案中，脂质颗粒通过一种工艺制备，通过该工艺，在形成工艺中使用的核酸的约90％至约100％被包封在颗粒中。
Cullis等人的美国专利号9,758,795和9,943,846描述了使用小体积混合技术的方法和由此衍生的新制剂。Ramsay等人的美国专利号10,342,760描述了使用小体积混合技术和产品来制备不同材料的更先进方法。Walsh等人的美国专利号10,159,652公开了对要混合的元素具有不同路径和孔的微流体混合器。Wild、Leaver和Taylor的美国专利公开号20180111830AA公开了具有一次性无菌路径的微流体混合器。Wild、Leaver和Taylor的美国专利号10,076,730公开了分叉环形微流体混合几何结构及其在微混合中的应用。Chang、Klaassen、Leaver等人的美国专利公开号2020023358AA公开了一种可编程自动微混合器及其混合芯片。Wild和Weaver的美国设计编号D771834、D771833、D772427和D803416和Chang等人的D800335、D800336和D812242公开了用于由Precision NanoSystems Inc.销售的混合器仪器的具有微通道和混合几何形状的混合筒。
在本发明的实施方案中，用于生物微流体混合的装置用于制备本发明的脂质颗粒和治疗性脂质混合组合物。该装置包括第一和第二试剂流，它们被送入微流体混合器，并且脂质颗粒从出口收集，或者在其他实施方案中，进入无菌环境。
第一流包括在第一溶剂中的治疗剂。合适的第一溶剂包括治疗剂可溶于其中并且可与第二溶剂混溶的溶剂。合适的第一溶剂包括水性缓冲液。代表性的第一溶剂包括柠檬酸盐和醋酸盐缓冲液。
第二流包括在第二溶剂中的脂质混合材料。合适的第二溶剂包括可电离脂质可溶于其中并且可与第一溶剂混溶的溶剂。合适的第二溶剂包括1,4-二恶烷、四氢呋喃、丙酮、乙腈、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、酸和醇。代表性的第二溶剂包括90％乙醇水溶液或无水乙醇。
在本发明的一个实施方案中，合适的装置包括一个或多个微通道(即，其最大尺寸小于1毫米的通道)。在一个实例中，微通道的直径为约20至约300μm。在实例中，微通道的至少一个区域具有主要流动方向和具有其中限定的至少一个凹槽或突起的一个或多个表面，该凹槽或突起具有与主要方向形成一个角度的取向(例如，交错的人字形混合器)，如美国专利公开号20040262223AA中所述的，或美国专利公开号2018093232AA中描述的分叉环形流。为了达到最大混合速率，在混合区域之前避免过度的流体阻力是有利的。因此，装置的一个实例具有尺寸大于1000微米的非微流体通道，以将流体输送到单个混合通道。
自动化程度较低的微流体混合方法和仪器例如在Zhang，S.等人8和StroockA.，等人9中公开的那些方法和仪器也可用于产生本发明的脂质混合组合物。更多涉及T型管混合的原始系统在Jeffs、LB等人10中公开。
本发明的脂质颗粒可用于在体外或体内向细胞递送治疗剂。在特定实施方案中，治疗剂是核酸，其使用本发明的核酸-脂质颗粒递送至细胞。核酸可以是siRNA、miRNA、LNA、质粒或复制子、mRNA或单个基因。在其他实施方案中，治疗剂是肽，其使用本发明的肽-脂质颗粒递送至细胞。所述方法和脂质混合组合物可容易地适用于递送用于治疗将从此类治疗中受益的任何疾病或病症的任何合适的治疗剂。
在某些实施方案中，本发明提供将核酸引入细胞(即转染)的方法。转染是分子生物学中常用的一种技术，用于将核酸治疗剂(或NAT)从细胞外引入细胞内空间以用于所递送基因的转录、翻译和表达的目的。转染效率通常被定义为i)总处理群体中显示所递送基因的阳性表达的细胞百分比，如通过蛋白质定量方法例如活细胞成像(用于检测荧光蛋白)、流式细胞术或ELISA测量的，或ii)由处理的细胞表达的蛋白质的强度或量。这些方法可以通过使本发明的颗粒或脂质混合组合物与细胞接触足以发生细胞内递送的时间段来进行。
典型的应用包括使用众所周知的程序来提供siRNA的细胞内递送以敲低或沉默特定的细胞靶标。或者，应用包括递送编码治疗上有用的多肽的DNA或mRNA序列。以这种方式，通过提供缺乏或缺失的基因产物来提供对遗传疾病的治疗。本发明的方法可以在体外、离体或体内实施。例如，本发明的脂质混合组合物还可用于使用本领域技术人员已知的方法在体内将核酸递送至细胞。在另一个实例中，本发明的脂质混合组合物可用于将核酸递送至离体的患者细胞样品，然后返回给患者。
下面描述了通过本发明的脂质组合物递送核酸治疗剂。
对于体内施用，药物组合物优选肠胃外施用(例如，关节内、静脉内、腹膜内、皮下、鞘内、皮内、气管内、骨内或肌肉内)。在特定实施方案中，药物组合物通过推注静脉内、鞘内或腹膜内施用。其他施用途径包括局部(皮肤、眼睛、黏膜)、口腔、肺部、鼻内、舌下、直肠和阴道。
对于离体应用，优选将药物组合物施用于已从生物体中取出的生物样品，然后将细胞洗涤并返回到生物体中。生物体可以是哺乳动物，尤其可以是人。例如，该过程用于细胞重编程、基因修复、免疫治疗。药物产品是经过修饰的细胞。目前市售的用于免疫肿瘤学应用的细胞产品的例子是用于B细胞前体急性淋巴细胞白血病的KymriahTM和用于B细胞淋巴瘤的YescartaTM。这种离体疗法也称为CAR-T疗法，其中带有CD19靶向的嵌合抗原受体的修饰的T细胞攻击患者的CD19呈递癌细胞。白血病是儿科患者死亡的主要原因。CAR-T疗法的使用对患者的无癌症康复具有变革性意义。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用编码嵌合抗原受体(CAR)的mRNA修饰人T细胞以产生CAR-T细胞产物以输回患者体内的方法，而无需递送核酸的任何病毒方法。与用于编程细胞的病毒相比，非病毒递送可以是一种用于调节T细胞的更安全的技术。
在相关实施方案中，本发明提供了一种调节T细胞受体以识别和破坏存在于患者的肿瘤细胞表面上的新抗原的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种调节靶多核苷酸或多肽的表达的方法。这些方法通常包括将细胞与本发明的与能够调节靶多核苷酸或多肽的表达的核酸缔合的脂质颗粒接触。如本文所用，术语“调节”是指改变靶多核苷酸或多肽的表达。调节可以意味着增加或增强，或可以意味着降低或减少。
在相关实施方案中，本发明提供了治疗以受试者中多肽的过表达为特征的疾病或病症的方法，包括向受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂选自siRNA、microRNA、反义寡核苷酸和能够表达siRNA、microRNA或反义寡核苷酸的质粒，其中siRNA、microRNA或反义RNA包含与编码多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸，或其互补物。
在相关实施方案中，本发明提供了治疗以受试者中多肽的表达不足为特征的疾病或病症的方法，包括向受试者提供本发明的药物组合物，其中治疗剂选自mRNA、自扩增RNA(SAM)、自复制DNA或质粒，包括特异性编码或表达表达不足的多肽或其互补物的核酸治疗剂。
在实施方案中，本文描述的药物组合物的脂质混合组合物可以通过任何已知的或以后根据药理学原理开发的方法来制备。通常，此类制备方法包括将活性组分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助组分结合的步骤。
根据本公开内容的药物组合物可以成批地、作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性组分的离散量的药物组合物。活性组分的量通常可以等于将施用于受试者的活性组分的剂量和/或此类剂量的方便部分，包括但不限于此类剂量的一半或三分之一。
在另一个实施方案中，该组合物用于生产高级治疗医药产品(ATMP)或细胞和基因治疗产品。本文所述的组合物可被视为辅助材料。
根据本公开内容的药物组合物中活性组分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的组分的相对量可以变化，这取决于被治疗的受试者的身份、尺寸和/或状况并且进一步取决于组合物的施用途径。例如，组合物可包含0.1％至99％(w/w)的活性组分。
药物制剂可另外包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，其包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，如适合于所需的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams and Wilkins,Baltimore,MD,2006)。
在一些实施方案中，脂质颗粒的粒度可以增加和/或减少。粒度的变化可能能够帮助对抗生物反应，例如但不限于炎症，或者可以通过改变生物分布来增加递送给哺乳动物的NAT的生物效应。大小也可用于确定靶组织，较大的颗粒被快速清除，而较小的颗粒则到达不同的器官系统。
用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、表面活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可任选地包括在本发明的药物制剂中。
在一些实施方案中，示例性质粒或其他NAT编码选自以下的蛋白或酶：人生长激素、促红细胞生成素、1-抗胰蛋白酶、酸性α葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶A、羧肽酶N、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、α-氨基葡萄糖乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、N-乙酰氨基葡萄糖-4-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、葡萄糖脑苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶、肝素-N-硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS 1)、精氨酸琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)、精氨酸酶1(ARG1)、囊性纤维化跨膜电导调节子(CFTR)、运动神经元存活(SMN)、因子VIII、因子IX、大范围核酸酶如TALENS、Cas9和自我复制的RNA，以及低密度脂蛋白受体(LDLR)。
在研究或筛选平台的背景下，可以将其他质粒或核酸应用于使用本发明的基于细胞的系统。这些包括为了诱导细胞的特定生理或功能变化而引入遗传物质，例如在用于产生诱导性多能干细胞的重编程过程中。在这种情况下，特定基因(称为Yamanaka因子)被引入患者来源的体细胞，其触发细胞逆转为干细胞样状态。这些使细胞能够无限分裂并成为多能性(能够分化为许多其他下游细胞类型)，其可用于研究和临床应用。本发明的脂质颗粒可以增强这些和类似的遗传操作步骤，以提高在使用诱导干细胞时通常使用的过程的效率。
在优选的实施方案中，核酸是由双链脱氧核糖核酸组成的质粒。质粒是一种位于细胞的细胞质中的遗传结构(与传统细胞遗传学所涉及的核酸相反)，其可以独立于染色体进行复制，通常是一条小的环状DNA链。这是一种合成的哺乳动物遗传构建体，用作操纵细胞中的遗传功能的治疗选择。质粒还可用于创建用于医学研究的新型细胞或动物模型。质粒是分子生物学中的一个重要工具，并且作为一种新兴的治疗方法，因为它们i)易于操作和分离，ii)能够自我复制以规模化生产，iii)长期稳定性，iv)在一系列生物体和应用中的功能性。除了复制起点(或没有，取决于预期用途)之外，改造的质粒还将具有限制酶识别位点以允许打破环以引入新的遗传物质，以及选择性标记诸如抗生素抗性基因。质粒可为约1000个碱基对(bp)至约20千碱基对(kbp)。
如本文所用，术语“约”被定义为意指所述数字的+/-10％。它用于表示所需的目标浓度可能是例如40Mol％，但由于混合不一致性，实际百分比可能相差+/-5Mol％。
如本文所用，术语“基本上”被定义为所述数字的+/-5％。它用于表示所需的目标浓度可能是例如40Mol％，但由于测量或混合不一致性，实际百分比可能相差+/-5Mol％。
如本文所用，术语“核酸”被定义为旨在对疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防具有直接作用，或对恢复、纠正或改变生理学功能具有直接作用，或作为研究试剂的物质。在优选的实施方案中，核酸是寡核苷酸。在优选的实施方案中，治疗剂是核酸治疗剂，例如RNA多核苷酸。在优选的实施方案中，治疗剂是双链环状DNA(质粒)。
如本文所用，术语“药剂”通过它对细胞、组织或器官的生物学效应具有直接影响的事实进行定义。药剂包括但不限于多核苷酸、蛋白质、肽、多糖、无机离子和放射性核素。核酸试剂的实例包括但不限于反义寡核苷酸、核酶、microRNA、mRNA、核酶、tRNA、tracrRNA、sgRNA、snRNA、siRNA、shRNA、ncRNA、miRNA、mRNA、预缩合DNA、pDNA或适体。核酸药剂用于沉默基因(例如使用siRNA)、表达基因(例如使用mRNA)、编辑基因组(例如使用CRISPR/Cas9)和重编程细胞以用于返回给原始生物体(例如重编程免疫细胞以用于癌症治疗的离体细胞疗法)。用于ATMP(高级治疗医药产品)的辅助材料可视为一种药剂。
在本公开内容中，以非限制性意义使用词语“包括”以表示包括该词语之后的项目，但不排除未具体提及的项目。应当理解，在包括或可以包括特定特征或变量或参数的实施方案中，替代实施方案可以由或基本上由这些特征或变量或参数组成。通过不定冠词“一个/种”对元素的引用并不排除存在多于一个/种元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个/种且仅一个/种元素。
在本公开内容中，通过端点陈述的数值范围包括包含在该范围内的所有数字，包括所有完整数字、所有整数和所有分数中间体(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等)。在本公开内容中，单数形式“一个/种”和“该”包括多个所指对象，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及包含“一种化合物”的组合物包括两种或更多种化合物的混合物。在本公开内容中，术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用，除非内容另有明确规定。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起主导作用的淋巴细胞亚型。通过细胞表面上T细胞受体的存在，可以将T细胞与其他白细胞(例如B细胞或自然杀伤细胞)区分开来。T细胞的主要类别包括辅助(CD4+)、细胞毒性(CD8+)、记忆和调节性T细胞。
关于T细胞培养物的对数生长期是指例如细胞经历快速扩增的时间，大约在活化后5天或6天。通过细胞计数的突然增加可以观察到对数期，这种快速扩增可以用作开始制备用于T细胞治疗的LNP的时间点。在本发明的实施方案中，T细胞可以以不同方式被活化。下面举例说明了使用抗CD3/CD28/CD2抗体的三重活化方法，但双重活化在我们的研究中也有效。使用抗CD3/CD28抗体进行双重活化。当前临床使用的方案采用双重活化方案。
在某些情况下，T细胞可以源自从诱导多能干细胞(IPSC)11或胚胎干细胞(ESC)12的分化。
用于通过本发明的方法转化的T细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。T细胞通常是从来源于哺乳动物受试者的生物组织(例如外周血或动脉血)中分离出来的。在一些实施方案中，从中分离细胞的受试者患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法。
在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。组织来源包括直接取自受试者的血液、组织、淋巴和其他组织来源，以及由一个或多个处理步骤(例如分离、离心、洗涤和/或孵育)产生的样品。
衍生T细胞的组织来源可以是血液或血液来源的组织来源，或单采血液组分法或白细胞去除术产品。示例性组织来源包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、淋巴结、脾脏或其他淋巴组织。在一些实施方案中，细胞获自与需要治疗的最终受试者不同的物种。
细胞的分离可包括更多制备或基于非亲和性的细胞分离。在一些情况下，洗涤、离心和/或在一种或多种药剂的存在下孵育细胞，例如，以去除或富集某些组分。
在一些情况下，来自受试者的循环血液的细胞通过单采血液组分法或白细胞去除术获得。可以洗涤血细胞以除去血浆部分，并在随后的处理步骤中使用合适的缓冲液或培养基。在一些实施方案中，细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤。在一些方面，洗涤步骤根据制造商的说明(例如，Spectrum Krosflo,GE
Figure BDA0003302919550000331
Flux)通过切向流过滤(TFF)进行。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如不含Ca++/Mg++的PBS。
从组织来源分离T细胞可能涉及基于密度的细胞分离方法，包括通过裂解红细胞并通过PercollTM或FicollTM梯度离心从外周血制备白细胞。其他方法包括基于一种或多种特定表面标记物在细胞中的表达或存在来分离不同的细胞类型。
T细胞的特定亚群，例如一种或多种表面标记物阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+,CD62L+,CCR7+,CD27+,CD127+,CD4+,CD8+,CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)，可以通过阳性或负选择技术进行分离。作为一个例子，CD3+、CD28+T细胞可以使用CD3/CD28偶联的磁珠(例如，
Figure BDA0003302919550000341
M-450CD3/CD28T Cell Expander)进行正选择。CD4+或CD8+选择步骤可用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。或者，可以进行针对CD4+辅助细胞的选择。在某些情况下，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-,CD45RA+,CD62L+,CD4+T细胞。在其他情况下，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在其他情况下，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。
也可以使用亲和磁性分离技术来分离细胞群。待分离的细胞与磁响应颗粒或微粒例如顺磁珠(例如，DynabeadsTM(Clontech)或MACSTM(Miltenyi)珠)一起孵育。磁响应材料附着于结合配体，该结合配体特异性结合存在于需要分离的细胞、多个细胞或细胞群上的表面标记物。
取决于偏好，T细胞可以通过正选择或负选择过程从组织来源中分离。例如，可从Vancouver,Canada的StemCell Technologies获得这两种试剂盒。
出于治疗目的，分离或分开使用执行转化T细胞所需的分离、细胞制备、分开、加工、孵育中的一种或多种的装置进行。在一些方面，系统用于在封闭或无菌环境中执行这些步骤中的每一个。在一个实例中，该系统是如美国专利公开号20110003380A1中所描述的系统。分离和/或其他步骤可以使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)完成。参见，例如，Klebanoff等人.(2012)J Immunother.35(9):651-660,Terakura等人.(2012)Blood.1:72-82,和Wang等人.(2012)J Immunother.35(9):689-701。可以通过流式细胞术收集和富集所需的细胞群，其中针对多种细胞表面标记物染色的细胞被携带在流体流中。其他方法包括FACS或与基于FACS的检测系统结合的微机电系统(MEMS)芯片(参见，例如，WO2010/033140)。
T细胞孵育和处理可以在培养容器中进行，例如用于培养或培育细胞的室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋、槽或其他容器。刺激条件或试剂包括能够活化TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种试剂，例如配体。孵育可以如Riddell等人的美国专利号6,040,177中所述进行。T细胞培养物可以通过添加非分裂外周血单核细胞(PBMC)，(例如，对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群包含至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；和孵育培养物进行扩增。
T细胞刺激条件包括适合人T淋巴细胞生长的温度，例如25至37摄氏度。任选地，孵育还可以包括作为饲养细胞的非分裂EBV转化的淋巴母细胞(LCL)的支持性群体，与初始T细胞的比率为10:1。
通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例用于举例说明本发明而不是限制其范围。
方法
从人全血中分离原代T细胞并扩增
除非另有说明，否则所有试剂均购自STEMCELL Technologies,Vancouver,Canada。此外，除非另有说明，否则所有生物制品都是人类来源的或人类特异性的。
冻干的人IL-2(“IL-2”)(Peprotech Inc.，Montreal，Canada)在生物安全柜中在不含钙或镁的无菌1XPBS中重构至0.1mg/ml的浓度。将50μl的这种IL-2添加到50mL的ImmunoCult-XFTMT细胞扩增培养基生成用于T细胞的培养基。将含有ACDA抗凝剂的7-30mL人外周全血置于生物安全柜中的无菌50mL聚丙烯锥形管中。
使用EasySepTMDirect人T细胞分离试剂盒从血液样品分离T细胞。首先将50μl/mL的Isolation CocktailTM和随后50μl/mL的EasySepTMRapidSpheresTM添加到血液管中，将其轻轻混合并在室温(RT)下孵育5分钟。将管置于EasySepTM50MagnetTM装置中并在室温下孵育10分钟。将富集的细胞悬液移液到新的无菌50mL聚丙烯管中，并重复RapidSpheresTM过程。
将这种双重富集的细胞悬液移液到新的无菌50mL聚丙烯锥形管中，并在室温下以300g离心10分钟。去除上清液，并将细胞沉淀重悬在10mL PBS中，并以300g再离心10分钟以从细胞洗涤任何剩余的上清液。再次去除上清液，并将细胞重新悬浮在预热的完全T细胞培养基中。抽取样品，并进行细胞活力的台盼蓝排除测试(Thermo Fisher)。
根据负选择方案活化T细胞
血液取自健康人类供体并与抗凝剂ACDA组合。全T细胞负选择试剂盒EasySepTMDirect人T细胞分离试剂盒用于分离CD4+和CD8+T细胞。将细胞维持在补充有IL-2的ImmunoCult-XFTMT Cell Exp培养基中。在分离当天，细胞用三重活化剂ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2 T Cell Activator活化。
根据正选择方案活化T细胞
血液取自健康人类供体并与抗凝剂ACDA组合。使用LymphoprepTM密度梯度离心制备PBMC悬浮液。然后使用EasySepTM人CD3正选择试剂盒II从PBMC悬浮液中正选择T细胞。细胞表达IL-2。在分离当天，细胞用三重活化剂ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2T CellActivator活化。
T细胞的冷冻和解冻
从健康人类供体抽取的血液与抗凝剂ACDA组合。全T细胞负选择试剂盒EasySepTMDirect人T细胞分离试剂盒用于分离CD4+和CD8+T细胞。使用
Figure BDA0003302919550000371
CS10冷冻保存细胞并储存在液氮中。解冻时，将细胞维持在补充了人重组IL2(Peprotech)的ImmunoCult-XFTMT Cell Exp培养基中。在解冻当天，细胞用如下面的实施例所示的双重或三重活化剂活化。
T细胞的活化/扩增细节
在完全T细胞培养基(ThermoFisher)中将AT细胞悬液稀释至106个细胞/ml，并通过每毫升T细胞培养基添加25μl的ImmunoCultTM人CD3/CD28(双重)T Cell ActivatorTM或ImmunocultTM人CD3/CD28/CD2(三重)T Cell ActivatorTM活化细胞。在放大倍数下通过每日细胞计数监测细胞生长。细胞用完全T细胞培养基稀释以维持约106个细胞/mL的浓度。大约在第5、6或7天，T细胞进入对数生长期，并发生快速扩增。图1示出了10天的T细胞扩增反应。
为了确认T细胞处于对数期，测量CD25表达并且其必须大于80％，如通过流式细胞术(BD Biosciences)评估的，并且细胞的扩增也可以通过如图1所示的绘制随时间变化的T细胞总数量来监测。
将核酸治疗剂(NAT)微流体混合到脂质纳米颗粒(LNP)中以形成脂质核酸颗粒(LNAP):
脂质混合组合物溶液在乙醇中通过将来自单个脂质储备液的规定量的脂质(见表1)在乙醇中组合来制备。脂质从Avanti Polar Lipids或Sigma购买，或签订合同合成。脂质混合物的组分如下：
1,17-双(2-辛基环丙基)十七烷-9-基4-(二甲氨基)丁酸酯(有或没有)盐酸盐(BOCHD-C3-DMA)、中性脂质DOPE、胆固醇和稳定剂Myrj52(聚氧乙烯(40)硬脂酸盐)是脂质混合物A的组分。使用DODMA代替BOCHD-C3-DMA用于脂质混合物A-DODMA、DLin-Mc3-DMA用于脂质混合物A-MC3和DLin-KC2-DMA用于脂质混合物A-KC2。所有组合物中的中性脂质、胆固醇和稳定剂的比率列于表1中，并且在一些情况下，将0-0.1Mol％的DiD标记添加到组合物中用于后续制备脂质颗粒表征。该混合物是下面提到的脂质混合溶液。
对于可电离的脂质，纳米颗粒制剂缓冲液的pH值通常低于脂质的pKa。配制后，纳米颗粒可以悬浮在任何生理相关的缓冲液例如PBS、葡萄糖等中。
使用乙酸钠缓冲液将如下所述的信使RNA或质粒核酸治疗剂(NAT)稀释至所需浓度。然后通过使用
Figure BDA0003302919550000381
仪器运行两种流体来制备脂质核酸颗粒(LNAP)样品。简而言之，将32μL总体积的100mM醋酸钠缓冲液中的10-20μg核酸与16μL的37.5mM脂质混合溶液按照N/P比率(示出的实施例中的4、6、8、10或12)所需的进行混合。在仪器中制备的微流体混合脂质核酸颗粒(LNAP)立即用48μL的pH7.4的无Ca++和Mg++的1XPBS在水性输出孔中稀释。立即将这些LNAP收集到含有96μL的相同的pH7.4的缓冲液的微量离心管中。通过改良的RibogreenTM测定法(Quanti-iT RiboGreenTMRNA测定试剂盒，Fisher)测量包封效率。该信息用于确立所需的剂量。
以下实验中使用的核酸治疗模型药剂是：
Trilink Cleancap eGFP mRNA:目录号L-7601(Trilink Biotechnologies,SanDiego,CA)；Trilink Cleancap EPO mRNA:目录号L-7209(Trilink Biotechnologies)；Millipore Sigma TagRFP Simplicon RNA Kit:目录号SCR712(包含TagRFP RNA&B18RRNA)(Millipore Sigma Canada,Oakville Ontario)；具有EGFP报告子的CD19 CAR质粒购自Creative Biolabs(Shirley,NY)，并含有在pcDNA中的T7启动子(Mut)-信号肽-scFv-CD8铰链跨膜-4-1BB-CD3zeta-T2A-eGFP报告基因CAR盒(2353bp)。此定制CD19CAR质粒DNA模板的总大小约为7649–7661bp(见图26)。
编码CD19 scFv-h(BB±-eGFP报告基因盒的未修饰的CAR信使RNA(mRNA)转录物是通过使用Trilink Biotechnologies Inc的
Figure BDA0003302919550000391
AG方法使用野生型碱基体外转录并加帽(Cap1)合成的。这种未修饰的CAR mRNA转录物经过酶促聚腺苷酸化，然后进行DNase和磷酸酶处理。最终的mRNA转录产物经过硅膜纯化并以1mg/mL的浓度包装在1mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.4)的溶液中。这种定制的CD19 CAR质粒载体和CD19 CAR编码mRNA分别购自Creative Biolab和Trilink Biotechnologies Inc。
“IL”是可电离的脂质。在未指定的情况下，可电离脂质是BOCHD-C3-DMA。在其他情况下，如附图描述中标记或指出的，可电离脂质是实施例和附图中标记的DODMA、DLin-Mc3-DMA或DLin-KC2-DMA。
表1：脂质混合物的组分和比率
Figure BDA0003302919550000401
Figure BDA0003302919550000411
还使用更大的
Figure BDA0003302919550000412
(后来发布为具有先进特征但体积相似的“Ignite”)制造基于脂质的制剂以用于测试。简而言之，取决于12、10、8、6或4的N/P比率，使用100mM乙酸钠缓冲液(pH 4)将350μL的1mg/mL mRNA或pDNA稀释至0.05至0.3mg/mL的所需浓度。然后通过以3:1的流量比和12ml/分钟的总流速运行两种流体(即水性溶剂中的核酸和乙醇中的脂质混合物)制备脂质纳米颗粒样品。在微流体装置中混合后，将盒后脂质核酸颗粒样品稀释到含有三到40体积的pH7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液的无RNAse管中。最后使用AmiconTM离心过滤器(Millipore,USA)以3000RPM或使用TFF系统去除乙醇。一旦达到所需浓度，脂质核酸颗粒在无菌条件下使用200μm过滤器进行过滤灭菌。最终包封效率通过改良的RibogreenTM测定法测量。
在如上所述制备脂质颗粒之后，使用ZetaSizer Nano ZSTM(MalvernInstruments,UK)通过动态光散射(DLS)测定粒度(颗粒的流体动力学直径)。使用波长为633nm的He/Ne激光器作为光源。从在反向散射检测模式下进行的散射强度数据测量数据(测量角度＝173)。测量结果是每个样品各自两个循环的10次运行的平均值。Z-平均尺寸报告为粒度，并定义为谐波强度平均粒度。还使用Zetasizer Ultra(Malvern Instruments,UK)使用多角度动态光散射进行粒度测量。
本申请中描述的各种脂质混合物的核酸包封结果显示在表2中。观察到的颗粒属性对于mRNA或SARNA通常在68-122nm的范围内，并且对于质粒在73-153nm的范围内。所有制剂中均具有良好的包封性，其中尺寸变化或多分散性(PDI)低于0.3。
表2:在
Figure BDA0003302919550000421
Benchtop和Benchtop后续型号“IgniteTM”上制造的核酸LNP的物理化学特性
Figure BDA0003302919550000431
Figure BDA0003302919550000441
实施例1
除非另有说明，否则所有试剂均来自StemCell Technologies。使用负选择分离程序(EasySepTM人T细胞分离试剂盒)从完全人外周血中分离T细胞。T细胞活化和扩增使用补充有重组人IL-2的ImmunoCultTM人T细胞扩增培养基中的ImmunocultTM人CD3/CD28/CD2活化剂(Peprotech Inc.,Rocky Hill USA)进行。图1提供了典型T细胞生长曲线的表示。T细胞通常在活化后48-96小时进入对数生长期，该阶段的特征是24-72小时的快速增殖和代谢活动期然后随着细胞开始恢复到静止状态，生长曲线出现平台期。如图1所示，T细胞可以在对数生长期之前或期间(第3天)，或在对数生长期之后(第7天)暴露于脂质核酸。
我们使用三重T细胞活化方案(用包含抗CD3/CD28/CD2抗体的三重活化剂活化全T细胞)测试了新的脂质混合物的组合物相对标准脂质混合物A(均使用BOCHD-C3-DMA作为IL，除非另外指明)的LNP介导的mRNA递送和表达(体外)。
将LNP配制的EGFP mRNA(Trilink Biotechnologies,San Diego,CA)与1μg/mL重组人ApoE4(“ApoE”)(Peprotech Inc.)一起添加到1mL的完全T细胞培养基中的500000个T细胞中。
实现所需的mRNA剂量所需的LNAP体积是基于如通过改进的RibogreenTM测定法所确定的包封的mRNA的浓度计算的。通过台盼蓝(Sigma)排除法对T细胞进行计数并稀释至500000个细胞/mL。简而言之，在12孔板中，将1mL等分到每个孔中。在每个孔中添加ApoE至1ug/mL的终浓度。根据步骤1中的计算，添加所需量的mRNA LNP，在本例中为2μg，并将板孵育48小时。
测试不同的脂质混合组合物诱导转染的能力，如通过在T细胞中表达的GFP的几何平均荧光强度测量的(如通过流式细胞术测量的)。图2显示了与脂质混合物A相比，使用可电离脂质BOCHD-C3-DMA在10的N/P比率下不同LNP组合物S10、S11、CT10、CT7和CT22组合物(详情见表1)的增加的作用。图3显示了使用可电离脂质MC3在10的N/P比率下不同LNP组合物CT7、S11、CT10和CT22对％GFP阳性活CD4+/CD8+T细胞的作用。脂质混合物CT7、S11、CT10、CT22的转染水平高于脂质混合物A。
当定量测量GFP表达(以皮克计)时，结果如图4所示。CT10和CT22的表现比脂质混合物A好得多。
比较脂质混合物A、S11、CT7、CT10和CT22制剂对来自许多年龄20-75岁的两性人类供体的T细胞的相对作用，以检查受试者之间的变异性。图5是来自不同供体的mRNA处理的T细胞中GFP表达的分布图。暴露于脂质混合组合物发生在活化后的第7天、接近生长对数期结束或恰好在生长对数期之后。在测试的制剂中，固有的供体变异性似乎影响制剂性能，但是，在一种脂质混合物中具有低性能的供体通常具有在所有脂质混合物中的较低性能。对于所有供体与脂质混合物A相比，所有组合物CT7、S11、CT10和CT22具有更好的性能。一些制剂例如CT10或CT22在持续实现高转染效率的能力方面显得更加强大。
下表3显示了不同脂质混合组合物的几何平均荧光强度(MFI)。MFI可能是比GFP表达细胞百分比更精确的测量。下面显示的MFI描述了由递送的mRNA产生的eGFP水平。在第7天用脂质混合物ALNAP和LM02 LNAP转染的三重活化T细胞的MFI评分较低，表明转染和表达的较低成功率。用S10转染的那些显示MFI评分为6。最好的脂质混合组合物是S11、CT7、CT10和CT22，均具有10的评分。数据显示使用稳定剂(例如TPGS1000、BrjS10和Tween 80)制备的LNAP80比稳定剂Myrj52或甚至工业标准PEG-DMG-2K诱导了令人惊讶的更高的eGFP蛋白。
表3.使用BOCHD-C3-DMA作为可电离脂质由用mRNA配制的脂质混合组合物实现的平均荧光强度。
Figure BDA0003302919550000471
MC3和BOCHD-C3-DMA的结果是相当的。结果与使用抗CD3/CD28抗体的双重活化方案获得的结果一致。
实施例2
负或正选择方案对T细胞转染的影响
T细胞通过如上文的方法中所述的负选择或正选择方案进行处理，并在第7天以每500000个细胞2μg mRNA的剂量以N/P 10用CT10、CT22和S11脂质混合组合物处理。处理后48小时通过流式细胞术分析T细胞的基因表达。我们发现LNAP转染成功基本上不受T细胞分离过程的影响，尽管我们观察到使用负选择有轻微优势(图6)。
实施例3
使用流式细胞术对处理的T细胞进行下游处理和分析
从单个供体中取出T细胞的三种分离物并分成三组：全T细胞(所有T细胞)、单独的CD4+T细胞和单独的CD8+T细胞。在脂质颗粒mRNA暴露后48小时，通过将细胞悬浮液转移到预先标记的1.5mL管中并在4摄氏度以300xg离心10分钟来收获处理的T细胞。去除上清液，将沉淀重悬于PBS中。添加0.5ul量的BD HorizonTMFixable Viability Stain 575VTM(BDBiosciences)，并将混合物在黑暗中在室温孵育10分钟。细胞像之前一样再次离心，然后用1mL染色缓冲液(BSA，BD Pharminigen)洗涤两次，并将洗涤后的沉淀置于100μl BSA中。将以下抗体添加到处理的细胞的每个管中(2μl体积)：抗-CD25、抗CD8、抗CD4、(PerCP-Cy5.5小鼠抗人CD25、BV786小鼠抗人CD8克隆RPA-T8和APC-CyTM7小鼠抗人CD4克隆SK3，均来自BDPharmingen)。出于补偿目的，在仅GFP的样品和活力对照中，不添加抗体，而在单染色补偿管中，仅添加一种抗体。
将管在4℃下孵育30分钟，然后添加400μl染色缓冲液(BSA)，并再次离心细胞。将细胞用1mL染色缓冲液洗涤一次，并如步骤1中一样再次离心。将细胞沉淀重新悬浮在1mL染色缓冲液中，并添加到带有细胞过滤帽(Corning Falcon)的预先标记的流动管中。
如下产生T细胞群的直方图分析：对活的原代人T细胞进行流式细胞术。如图7所示，从上到下，直方图代表来自CD8+分离细胞、CD4+分离细胞、仅全T分离CD8+细胞、仅全T分离CD4+细胞、来自全T分离的所有T细胞和未经处理的细胞的GFP表达。左侧泳道显示使用脂质混合物A的GFP表达，中间泳道显示使用脂质混合物CT7的GFP表达，最右侧泳道显示使用脂质混合物S11的GFP表达。所有LNP组合物都含有BOCHD-C3-DMA作为可电离脂质(IL)。对于每个群体的门控，首先通过前向和侧向散射对细胞进行门控，然后排除双峰，并且通过使用Fixable Viability Stain 570(BD Biosciences)仅考虑活细胞。细胞用CD4和CD8抗体染色，这允许对每个亚群的门控。图7显示未处理的细胞是中性的，而处理过的T细胞的各种标记显示出升高且一致的GFP表达。
实施例4
活性取决于T细胞的精确脂质混合组合物-结构脂质
进行研究以测试不同组分的脂质混合组合物。通常，T细胞是使用负选择方案从人外周血细胞中分离出来的。在分离当天，细胞用三重活化剂活化。图8是条形图，显示了在活化后7天以2μgmRNA/500000个细胞的剂量用BOCHD-C3-DMA(N/P 10)LNP中的eGFP mRNA处理48小时的活CD4+/CD8+T细胞中的相对GFP蛋白表达。使用了组分的脂质混合物CT22比率，但结构脂质是DOPE或DSPC。
在不同细胞类型(例如神经元)中的早期研究表明偏爱DOPE作为结构脂质。然而，我们发现结构脂质DSPC在T细胞转染方面优于DOPE。表4列出了脂质混合组合物的组分和比率，其转染效率如图8所示。
表4.DOPE和DSPC在两种相似制剂中作为结构脂质
Figure BDA0003302919550000501
实施例5
对于T细胞，活性取决于精确脂质混合物组成-比率
转染的T细胞中的GFP表达如上述实施例4中所述进行测定。图9是条形图，显示了具有10Mol％(S11，CT7)或20Mol％(CT10，CT22)的DSPC的四种不同的脂质混合组合物对于活化的转染的T细胞中的GFP表达。在测试的组合物中，20Mol％的DSPC明显优于10％比率的DSPC；在两个比率之间观察到GFP表达量的20％到30％的差异。
选择的组分的重要性的另一个方面在图10中示出。如上方的条形图所示，显示可电离脂质的身份对脂质混合组合物的活性没有影响。组合相同的比率和材料，同时改变MC-3、KC2和BOCHD-C3-DMA之间可电离脂质的身份。这些可电离的脂质可以相互替代，而不会影响脂质混合组合物转染T细胞的活性。
实际上，如下方条形图所示，当在CT10脂质混合组合物中施用时，作为可电离脂质的类脂质C12-200在活力、表达GFP的T细胞的百分比和GFP MFI方面给出与BOCHD-C3-DMA相似的结果。
总之，在这些条件下，结构脂质的选择影响转染效率(％GFP+)，但可电离脂质的选择似乎没有影响。这显示了与可电离脂质相反，LNP组合物中的特定结构脂质作为主要影响因素对活性的令人惊讶的影响。
实施例6
对于T细胞，活性取决于精确脂质混合组合物-稳定脂质
按照上述一般程序从人全血中分离原代T细胞并活化/扩增。分离的T细胞在活化后三天暴露于配制的mRNA；在T细胞生长曲线中，这个时间点对应于恰好在生长对数期之前或在生长对数期。将包封在LNP中的125ng CleanCapTMEGFP(Trilink Biotechnologies，SanDiego，CA)mRNA(详细信息见下文)添加到含有1ug/mL重组体人类ApoE4(“ApoE”)(Peprotech Inc.,Montreal,Canada)的0.25mL完全T细胞培养基中的约125000个T细胞。
基于RibogreenTM测定结果计算T细胞处理所需的LNP体积。通过台盼蓝(Sigma)排除法对T细胞进行计数并稀释至500000个细胞/mL。简而言之，在48孔板中，将0.25mL等分到每个孔中。在每个孔中添加ApoE至1ug/mL的终浓度。基于体积计算，添加所需量的mRNALNP，并将板孵育48小时。
通过使用流式细胞术测量eGFP的几何平均荧光强度，测试脂质混合组合物诱导转染的能力。图11A(i)至D(ii)中显示了在各种条件下在分离的原代人T细胞中编码eGFP的mRNA LNP的转染效率(i)和平均荧光强度(ii)。脂质混合组合物定义为可电离脂质40Mol％、DSPC 20Mol％、胆固醇40-x Mol％、稳定剂x Mol％，其中x＝0.5、1.5或2.5Mol％。
如图11图A-D所示的不同的稳定剂的身份如下：图A(i)和(ii)是使用稳定剂BrijS10获得的数据，B(i)和(ii)是使用稳定剂Brij S20获得的数据，C(i)和(ii)是使用稳定剂Tween80获得的数据，而D(i)和(ii)是使用稳定剂TPGS-1000获得的数据。在所有情况下使用的可电离脂质是BOCHD-C3-DMA。在第0天使用三重活化剂分离和活化T细胞，在第3天暴露于配制的mRNA，并在第5天收获用于流式细胞术。
发现在活化后三天(对应于对数生长期的一开始)将细胞暴露于mRNA LNP对于所有测试的组合物导致大于80％的转染效率。还发现对于所使用的每种稳定剂，脂质混合组合物中稳定剂的Mol％影响如MFI所指示的总eGFP表达。对于每种稳定剂，诱导最大eGFP表达的Mol％用以下名称表示：脂质混合物CT10、脂质混合物CT34、脂质混合物CT22和脂质混合物CT14。
如通过MFI测量的，对于Brij S10，1.5Mol％是最佳比率；对于Tween80，1.5Mol％是最佳比率。对于Brij S20，0.5Mol％是最佳比率；对于TPGS-1000，0.5Mol％是最佳比率。
对具有不同链长的非离子表面活性剂的测试表明较短的聚氧乙烯链对于离体T细胞递送更好。
实施例7
脂质组合物对细胞活力的影响。
研究了在敏感对数期期间通过用含核酸的脂质组合物混合物处理T细胞对T细胞活力的影响。在对数生长期期间处理如先前实施例中活化的T细胞。处理后的T细胞活力显示在图12的条形图中。与“无处理”对照相比，脂质混合物A、S10、S11、CT10、CT7和CT22对T细胞活力没有负面影响。在一项未显示的单独研究中，我们发现TransfectamineTM实验室试剂在相似剂量下对这些细胞的毒性更大。
因此，可以在T细胞扩增期间进行处理并且增殖没有损失。
实施例8
用GFP mRNA LNPS处理活化的T细胞-T细胞活化状态对转染的影响
在根据上述方法制备的分离的原代人T细胞中测定由CT10组合物中以N/P 10含有脂质BOCHD-C3-DMA或MC3的mRNA-LNP介导的GFP表达。转染效率和几何平均荧光强度(MFI)在添加LNAP后48小时通过流式细胞术测量。在活化后3或7天，T细胞被给予125或500ng包封的mRNA LNP/125000个细胞，GFP测定的结果如图13所示。该测定使用两种剂量和使用两种不同的可电离脂质(BOCHD-C3-DMA和MC3)证明了CT10组合物LNAP在活化阶段之前或之后转染T的能力。显示了活T细胞中的GFP百分比和GFP MFI，并且其在第3天添加LNP时略高。注意，尽管在第三个和第六个条形图(活力)中的处理，T细胞的活力仍然很高。
实施例9
活性在不同供体中得到维持
从15个不同供体分离的T细胞在用CT10介导的eGFP mRNA处理后能够表达GFP。这项研究的结果如图14所示，证明在转染许多供体的T细胞方面取得了一致的成功。在另一项研究中，将行业标准品MC3在六名不同患者中与BOCHD-C3-DMA进行了比较。如图15所示，两种不同的可电离脂质之间在供体间的变异性方面似乎没有显著差异。这意味着在人类患者中可以预期得到一致的结果。
实施例10
冷冻保存对使用组合物的T细胞转染能力的影响，以及方法的优化
分离的原代人T细胞中的由以N/P8含有BOCHD-C3-DMA与CT10组合物的mRNA-LNP介导的GFP表达显示在图16中。通过流式细胞术在添加LNP后48小时测量转染效率、活力和GFPMFI。使用阴性分离程序(EasySepTM人T细胞分离试剂盒，Stemcell Technologies)从全血中分离T细胞。将一部分分离的T细胞立即置于Immunocult人T细胞扩增培养基中，并使用ImmunocultTM人CD3/CD28/CD2活化剂(Stemcell)活化。对于这部分细胞，在活化后3天将125ng包封在LNP中的mRNA添加到125000个细胞/孔。同时，分离的T细胞的其他部分被冷冻保存在液氮中。将冷冻保存的T细胞解冻并立即活化或在ImmunoCult T细胞扩增培养基上静置24小时随后使用ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2活化剂活化。在活化后3或4天，以125ng包封的mRNA/125000个细胞向T细胞给予mRNA-LNP。如图16所示，冷冻保存后T细胞转染的效率没有显著降低。相对于先前冷冻保存的T细胞中活化后第3天，在第4天进行处理有改善。
实施例11
N/P比率的影响
在添加LNP后48小时通过流式细胞术测量由以N/P 4-12含有BOCHD与CT10组合物的mRNA-LNP介导的分离的原代人T细胞中的转染效率、存活率和GFP MFI。简而言之，使用负选择方案从新鲜全血中分离原代人T细胞，并使用三重活化剂活化。在活化后3天或7天，用125ng或500ng包封的mRNA/125000个细胞向T细胞给予mRNA-LNP。测试结果如图17所示。在N/P为8或更高的所有情况下，MFI增加。在N/P 8和更高时，转染效率也增加。
实施例12
剂量反应和表达持续时间
使用上述方法中描述的三重活化方案分离和活化T细胞。图18显示了在活化后3天暴露于T细胞的不同剂量的mRNA-LNP介导的GFP表达。LNAP含有BOCHD-C3-DMA作为可电离脂质以及CT10组合物，并且mRNA以N/P 8配制。结果发现，即使是测试的最低剂量的包封的mRNA(62.5ng mRNA/500000个细胞)也能介导80％GFP+细胞的有效转染。增加剂量略微增加转染效率，并大大增加GFP MFI。这些结果表明LNP介导的转染在整个T细胞群中均匀发生，并且表达水平很容易通过LNAP的体积添加进行滴定。
在与上述类似的实验中，向T细胞施用mRNA-LNP并在添加LNP后长达14天监测GFP表达。如图19所示，在处理后第2天和第4天，GFP+活全T细胞的百分比超过90％。即使在第14天，也有一些GFP被表达。
实施例13
促红细胞生成素mRNA递送和表达
Figure BDA0003302919550000561
IVD人Epo ELISA双抗体夹心测定用于证明mRNA体外递送和活性。试剂购自Quantikine,Minneapolis,MN。该测定按照
Figure BDA0003302919550000562
ELISA人促红细胞生成素免疫测定方案REF DEP00包装说明书中的指示进行。简而言之，使用负选择方案从新鲜全血中分离原代人T细胞，并使用三重活化剂活化。在活化后7天，用2μg mRNA/500000个细胞和N/P 10的编码EPO的mRNA LNP处理细胞。在用mRNA LNP处理48小时后，收集T细胞并针对胞质EPO裂解T细胞和针对分泌的EPO对培养基上清液进行取样。使用
Figure BDA0003302919550000563
人血清对照。结果以mIU/mL显示在图20中。
实施例14
在原代人T细胞中显示使用EPO mRNA LNP的活性的脂质混合组合物的比较数据
先前使用负选择方案从新鲜人全血中分离的冷冻人T细胞被解冻并使用先前描述的三重活化剂活化。在活化后7天，向T细胞施用由ELISA(R&DSystems)测定CT10配制的编码重组人促红细胞生成素(EPO)的mRNA LNP(2μg mRNA/500000个细胞和N/P 10)。在用mRNALNP处理48小时后，收集T细胞并针对胞质EPO裂解T细胞和针对分泌的EPO对培养基上清液进行取样。结果如图21所示。在本申请中，由CT10和CT22组合物制成的LNP优于脂质混合物A组合物LNP。还发现用BOCHD-C3-DMA制造的LNP比MC3LNP导致更高水平的分泌的EPO。
实施例15
体外测试由以N/P 8含有脂质BOCHD-C3-DMA与CT10组合物的mRNA-LNP介导的分离的原代人T细胞中的CD19 CAR的表达，结果如图22所示。在第3天在添加LNP后24和48小时通过流式细胞术测量转染效率和MFI。使用阴性分离程序从全血中分离T细胞，并通过在ImmunoCultTM人T细胞扩增培养基中的三重活化进行T细胞活化和扩增。用125ng包封的mRNA/125000个细胞处理T细胞。如图18所示，CD19 CAR表达在体外在转染的T细胞中维持超过48小时。
实施例16
由以N/P 8含有脂质BOCHD与CT10组合物的mRNA-LNP介导的在分离的原代人T细胞中的CD19 CAR的表达。CAR载体pcDNA3.1抗CD19-h(BB Lambda)-EGFP-2nd-CAR(T7 Mut)7661bp是Creative BioLabs,NY,USA出售的商业产品。图23。
在添加LNP后24和48小时，通过流式细胞术测量转染效率、MFI和存活率。使用阴性分离和三重活化剂从全血中分离T细胞(在ImmunoCultTM人T细胞扩增培养基中)。在活化后3天用mRNA-LNPT施用T细胞，以125ng或500ng包封的mRNA/125000个细胞(在250uL培养基中)。测试了CT10和CT14组合物。图23中显示的数据来自一位供体，但在另一位供体的不同实验中也看到了类似的结果。
虽然上面已经描述了优选实施方案并且在附图中示出了优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说明显的是可以在不脱离本公开内容的情况下进行修改。这种修改被认为是包含在本公开范围内的可能的变体。
参考资料
1.Vairy,S.；Garcia,J.L.；Teira,P.；Bittencourt,H.,CTL019(tisagenlecleucel):CAR-T therapy for relapsed and refractory B-cell acutelymphoblastic leukemia.Drug design,development and therapy 2018,12,3885-3898.
2.Fitzgerald,J.C.；Weiss,S.L.；Maude,S.L.；Barrett,D.M.；Lacey,S.F.；Melenhorst,J.J.；Shaw,P.；Berg,R.A.；June,C.H.；Porter,D.L.；Frey,N.V.；Grupp,S.A.；Teachey,D.T.,Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T CellTherapy for Acute Lymphoblastic Leukemia.Crit Care Med 2017,45(2),e124-e131.
3.Frey,N.；Porter,D.,Cytokine Release Syndrome with Chimeric AntigenReceptor T Cell Therapy.Biol Blood Marrow Transplant 2018.
4.Porter,D.L.；Hwang,W.T.；Frey,N.V.；Lacey,S.F.；Shaw,P.A.；Loren,A.W.；Bagg,A.；Marcucci,K.T.；Shen,A.；Gonzalez,V.；Ambrose,D.；Grupp,S.A.；Chew,A.；Zheng,Z.；Milone,M.C.；Levine,B.L.；Melenhorst,J.J.；June,C.H.,Chimeric antigenreceptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsedrefractory chronic lymphocytic leukemia.Sci Transl Med 2015,7(303),303ra139.
5.Monjezi,R.；Miskey,C.；Gogishvili,T.；Schleef,M.；Schmeer,M.；Einsele,H.；Ivics,Z.；Hudecek,M.,Enhanced CAR T-cell engineering using non-viralSleeping Beauty transposition from minicircle vectors.Leukemia 2017,31(1),186-194.
6.Patel,S.；Ashwanikumar,N.；Robinson,E.；Xia,Y.；Mihai,C.；Griffith,J.P.；Hou,S.；Esposito,A.A.；Ketova,T.；Welsher,K.；Joyal,J.L.；Almarsson,
Figure BDA0003302919550000591
Sahay,G.,Naturally-occurring cholesterol analogues in lipid nanoparticles inducepolymorphic shape and enhance intracellular delivery of mRNA.NatureCommunications 2020,11(1),983.
7.Garg,S.；Heuck,G.；Ip,S.；Ramsay,E.,Microfluidics:a transformationaltool for nanomedicine development and production.J Drug Target 2016,24(9),821-835.
8.Zhang,S.-h.；Shen,S.-c.；Chen,Z.；Yun,J.-x.；Yao,K.-j.；Chen,B.-b.；Chen,J.-z.,Preparation of solid lipid nanoparticles in co-flowingmicrochannels.Chemical Engineering Journal 2008,144(2),324-328.
9.Stroock,A.D.；Dertinger,S.K.；Ajdari,A.；Mezic,I.；Stone,H.A.；Whitesides,G.M.,Chaotic mixer for microchannels.Science 2002,295(5555),647-51.
10.JEFFS,L.B.等人,A Scalable,Extrusion-Free Method for EfficientLiposomal
Encapsulation of Plasmid DNA.Pharmaceutical Research 2005,22(3),362-372.
11.Nianias,A.；Themeli,M.,Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-DerivedLymphocytes for Adoptive Cell Immunotherapy:Recent Advances andChallenges.Current hematologic malignancy reports 2019,14(4),261-268.
12.Iriguchi,S.；Kaneko,S.,Toward the development of true"off-the-shelf"synthetic T-cell immunotherapy.Cancer science 2019,110(1),16-22.
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.用于形成与核酸缔合的脂质颗粒的脂质混合组合物，用于将核酸转染到T细胞中，所述组合物包含约40-50Mol％的可电离脂质、约10-20Mol％的DSPC、约35-40Mol％的甾醇和约0.1-3Mol％的稳定剂。
2.权利要求1的脂质混合组合物，其中所述转染在离体或体外发生。
3.权利要求1或2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是聚氧乙烯(10)硬脂醚。
4.权利要求1或2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是聚山梨醇酯80。
5.权利要求1或2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是聚氧乙烯(20)硬脂醚。
6.权利要求1或2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。
7.权利要求1至6中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质是氨基脂质。
8.权利要求7的脂质混合组合物，其中所述氨基脂质选自BOCHD-C3-DMA、Dlin-MC3-DMA、DODMA和DLin-KC2-DMA。
9.权利要求1至6中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质是C12-200。
10.权利要求1至2中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质为40Mol％，所述结构脂质为20Mol％DSPC，所述甾醇为37-40Mol％，并且所述稳定剂为0.5Mol％至2.5Mol％，并且所述稳定剂选自2.5Mol％聚氧乙烯(10)硬脂醚、1.5Mol％聚山梨醇酯80、0.5Mol％TPGS 1000、2.5Mol％TPGS和2.5Mol％聚氧乙烯(10)硬脂醚。
11.权利要求1至2中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质为50Mol％，所述结构脂质为10Mol％DSPC，所述甾醇为37-40Mol％，并且所述稳定剂为约0.5Mol％至2.5Mol％，并且所述稳定剂选自2.5Mol％聚氧乙烯(10)硬脂醚、1.5Mol％聚山梨醇酯80、0.5Mol％TPGS 1000、2.5Mol％TPGS和2.5Mol％聚氧乙烯(10)硬脂醚。
12.权利要求1-11中任一项的脂质混合组合物，其中N/P比率为4-12。
13.权利要求12的脂质混合组合物，其中N/P比率为8-10。
14.体外处理T细胞的方法，包括从体液中分离T细胞，并使所述细胞与包封在权利要求1至13中任一项的脂质混合组合物中的核酸治疗剂接触。
15.权利要求14的方法，其中当进行接触时，所述T细胞处于由T细胞活化引发的对数生长期。
16.权利要求14的方法，其中所述T细胞刚刚开始活化后的对数生长期。
17.权利要求14的方法，其中所述T细胞处于活化后的对数生长期的末期。
18.权利要求14的方法，其中接触是在活化后的第3天至第7天进行的。
19.权利要求14的方法，其中接触是在活化后的第4天进行的。
20.权利要求14的方法，其中所述T细胞先前已被冷冻保存。
21.权利要求14的方法，其中当CD25阳性群体大于70％时进行接触。
22.处理通过分化其他哺乳动物细胞获得的T细胞并将所述细胞与包封在权利要求1至14中任一项的脂质混合组合物中的核酸治疗剂接触的方法。

Claims (27)

1.用于形成与核酸缔合的脂质颗粒的脂质混合组合物，该组合物包含约40-50Mol％的可电离脂质、约10-20Mol％的结构脂质、约35-40Mol％的甾醇和约0.1-3Mol％的稳定剂。
2.权利要求1-2中任一项的脂质混合组合物，其中所述结构脂质是DSPC。
3.权利要求2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是聚氧乙烯(10)硬脂醚。
4.权利要求2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是聚山梨醇酯80。
5.权利要求2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是聚氧乙烯(20)硬脂醚。
6.权利要求2的脂质混合组合物，其中所述稳定剂是D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯。
7.权利要求1的脂质混合组合物，用于将核酸转染到T细胞中。
8.权利要求1-7中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质是氨基脂质。
9.权利要求8的脂质混合组合物，其中所述氨基脂质选自BOCHD-C3-DMA、Dlin-MC3-DMA、DODMA和DLin-KC2-DMA。
10.权利要求1至7中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质是C12-200。
11.权利要求1-3中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质为40Mol％，所述结构脂质为20Mol％DSPC，所述甾醇为37-40Mol％，并且所述稳定剂为0.5Mol％至2.5Mol％。
12.权利要求1-3中任一项的脂质混合组合物，其中所述可电离脂质为50Mol％，所述结构脂质为10Mol％DSPC，所述甾醇为37-40Mol％，并且所述稳定剂为约0.5Mol％至2.5Mol％。
13.权利要求6的脂质混合组合物，其中所述稳定剂包含约2.5Mol％的聚氧乙烯(10)硬脂醚。
14.权利要求7的脂质混合组合物，其中所述稳定剂包含约1.5Mol％的聚山梨醇酯80。
15.权利要求8或9的脂质混合组合物，其中所述稳定剂包含约0.5Mol％。
16.权利要求1-15中任一项的脂质混合组合物，其中N/P比率为4-12。
17.权利要求16中任一项的脂质混合组合物，其中N/P比率为8-10。
18.权利要求2的脂质混合组合物，其中所述转染在离体、体外或体内发生。
19.体外处理T细胞的方法，包括从体液中分离T细胞，并使所述细胞与包封在权利要求1-18中任一项的脂质混合组合物中的核酸治疗剂接触。
20.权利要求19的方法，其中当进行接触时，所述T细胞处于由T细胞活化引发的对数生长期。
21.权利要求19的方法，其中所述T细胞刚刚开始活化后的对数生长期。
22.权利要求19的方法，其中所述T细胞处于活化后的对数生长期的末期。
23.权利要求20的方法，其中接触是在活化后的第3天至第7天进行的。
24.权利要求23的方法，其中接触是在活化后的第4天进行的。
25.权利要求23的方法，其中所述T细胞先前已被冷冻保存。
26.权利要求20的方法，其中当CD25阳性群体大于70％时进行接触。
27.处理通过分化其他哺乳动物细胞获得的T细胞并将所述细胞与包封在权利要求1-18中任一项的脂质混合组合物中的核酸治疗剂接触的方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022512578A (ja) 2018-10-09 2022-02-07 ザ ユニヴァーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 有機溶媒不含かつ劣化剤不含のトランスフェクション・コンピテント・ベシクルを含む組成物及びシステム並びにそれらに関連する方法
CA3200234A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Daryl C. Drummond Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016118724A1 (en) * 2015-01-21 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2017019935A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Modernatx, Inc. Multimeric mrna
WO2017049074A1 (en) * 2015-09-18 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
WO2017218704A1 (en) * 2016-06-14 2017-12-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018064755A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-12 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
WO2018119514A1 (en) * 2016-12-28 2018-07-05 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
WO2019152557A1 (en) * 2018-01-30 2019-08-08 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of agents to immune cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2971013B1 (en) * 2013-03-15 2020-08-19 The University Of British Columbia Lipid nanoparticles for transfection and related methods
CA2923705C (en) * 2013-10-09 2024-05-14 Nestec S.A. Compositions comprising citrulline and leucine and their use in the treatment of diabetes and metabolic syndrome
EP3532094A1 (en) * 2016-10-26 2019-09-04 CureVac AG Lipid nanoparticle mrna vaccines
US11583504B2 (en) * 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016118724A1 (en) * 2015-01-21 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2017019935A1 (en) * 2015-07-30 2017-02-02 Modernatx, Inc. Multimeric mrna
WO2017049074A1 (en) * 2015-09-18 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
WO2017218704A1 (en) * 2016-06-14 2017-12-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
WO2018064755A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-12 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
WO2018119514A1 (en) * 2016-12-28 2018-07-05 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
WO2019152557A1 (en) * 2018-01-30 2019-08-08 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of agents to immune cells

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