CN1302115C - 电穿孔用缓冲溶液及上述溶液的使用方法 - Google Patents
电穿孔用缓冲溶液及上述溶液的使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种悬浮动物细胞或人的细胞和溶解生物活性分子的缓冲液，以便使用电流将所述生物活性分子引入细胞中，和使用电流和缓冲溶液将生物活性分子引入动物细胞或人的细胞中的方法。在25℃，pH值从pH7至pH8之间变化时，发明的缓冲溶液的缓冲能力至少为20mmol*1-1*pH-1，离子强度至少为200mmol*1-1。在相应的方法中使用这种类型的缓冲溶液能将生物活性分子以高度的转染效率同时又能以低细胞死亡率引入动物细胞及人的细胞中。在所述缓冲溶液中可以成功地转染不同的细胞类型，特别是具有低活性的静止与活跃的分裂细胞。
Description
本发明涉及一种悬浮动物细胞或人的细胞和溶解生物活性分子的缓冲液，以便使用电流将所述生物活性分子引入细胞中和使用电流将生物活性分子引入动物细胞或人的细胞中的方法，包括缓冲溶液的使用。
发明背景
将生物活性分子，例如DNA，RNA或蛋白质引入活细胞中是研究这些分子的生物功能的重要手段。将外来分子引入细胞的优选方法是电穿孔法，这种方法与其它方法不同，它通过转移试剂只对靶细胞的生物结构产生轻微的永久变化。电穿孔过程中，通过短暂电流将外来分子从水溶液引入细胞中，其中，在短暂电脉冲作用下可以使细胞膜被外来分子渗透。由于细胞膜中形成了短暂的“小孔”，如果需要的话，最初进入细胞质的生物活性分子已经能在细胞质中产生有待研究的作用。然而在将DNA引入真核细胞的情况中，DNA必须进入细胞核，这样才能表达遗传信息。在分裂细胞的情况中，这可能在细胞分裂期间发生，其中，核膜暂时溶解后，DNA被动地进入细胞核。然而在研究静态或弱分裂细胞例如原代动物细胞时，DNA不会以这种方式进入细胞核，因此这里不能使用相应的方法或者至少使用相应的方法是十分费力的。而且，特别是在将DNA引入动物细胞中时，所谓的转染，由于细胞的不稳定性，经常会发生特殊的问题，这是由于细胞的存活率是影响转染效率的一个重要参数。
现有技术水平
在过去，经常使用细胞培养基(Anderson等，J.Biochem.Biophys.Meth.22，207)或使用磷酸盐缓冲的盐溶液或HEPES(Potter等(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7161；Fromm等(1985)，Nature 319，791)来摄取动物细胞和DNA分子。然而，动物细胞电穿孔期间(Shimizu等(1986)，Med.Immunol.11，105；Riggs等(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，5602)，也使用非缓冲或弱缓冲的甘露糖醇或蔗糖溶液。这种非缓冲或弱缓冲溶液的缺点在于，使用这些溶液会增加细胞死亡率并大大降低转染效率(Yan等(1998)，Bio Techniques24，590)。
因此Yan等(1998)使用由100Mm HEPES，137mM NaCl，4mM Na2HPO4和6mM葡萄糖构成的缓冲溶液进行电穿孔。从人的主动脉获得的平滑肌细胞当然可以成功地在这种缓冲溶液中转染，但转染率只有15％，存活率只有10至20％。而且，Yan等使用的缓冲溶液的最佳电压脉冲只能达到500V，因此没有指示说明这种缓冲溶液是否也能用于直接转染入细胞核要求使用较高的电压脉冲。然而，在任何情况下，在这种缓冲溶液中得到的转染率太低，不能满足更高的要求。
许多情况中，使用具有低离子强度因而具有低导电率的缓冲溶液来避免由于高电流而产生的细胞损伤。细胞损伤可以在使用具有高导电率的缓冲溶液，尤其是使用较长时间的高电压脉冲的过程中观察到。
Friedrich等，1998(Bioelectrochem.and Bioenerg.47，103)证明，由于水的电解，电穿孔过程中的电流会引起电极附近的pH值变化。pH值的变化使从样品池的铝电极中释放细胞毒性Al3+离子，因此增加了细胞死亡率。作者建议缩短脉冲持续时间来提高转染效率。没有给出使用缓冲液发生任何变化的信息。
经常在电穿孔缓冲液中加入二价阳离子如Mg2+。镁离子有助于DNA与细胞表面结合，因此提高了转染率。然而，这似乎仅适用于Mg2+浓度达到10mM的情况，因为在较高浓度时，主要产生的是负效应，例如由于DNA分子的电荷的中和作用而导致电泳减弱或电导率增加使缓冲液变热(Xie and Tsong(1993)，Biophys，J.65，1684；Neumann等(1982)，EMBO J.1，841；Klenchin等(1991)，Biophys.J.60，804)。
而且已经提出缓冲液的组分应与细胞内的环境相匹配，从而增加细胞的存活率。因此，应使用与细胞质相对应的钾浓度高、钠浓度低的缓冲溶液来防止电穿孔过程中通过细胞膜中形成的小孔进行物质交换时细胞内Na+/K+比率的任何破坏(varn den Hoff等(1995)，Methods in Mol.Biol.48，第15章，185-197)。然而，使用场强度高于1300V/cm的脉冲时，检测到转染效率降低。
然而，到目前为止所描述的所有缓冲溶液都具有缺点，当使用这些缓冲溶液时得到的转染效率较低和/或缓冲液不适用于静态或弱分裂细胞的电穿孔过程。
发明的描述
因此，本发明的目的在于，提供一种能在获得较高转染效率的同时维持低细胞死亡率的电穿孔用缓冲溶液，以及开发一种相应的方法。
这种目的可以通过使用本发明的缓冲溶液实现，该缓冲溶液在25℃，pH值在7至8之间时，缓冲能力至少为20mmol*1-1*pH-1，离子强度至少为200mmol*1-1。使用这种缓冲溶液能通过电穿孔的方法将生物活性分子引入动物或人的细胞中，转染率可以达到93％，同时细胞死亡率低。在这种缓冲溶液中可以成功地转染各种细胞类型，尤其是静态及弱分裂细胞。而且，这种缓冲溶液能使用场强度至少为2000V/cm的高电压脉冲，这种高电压脉冲能直接将DNA分子转染到原代动物和人的细胞核中。本发明的缓冲液具有有利性能的一个决定性因素在于高缓冲能力与高离子强度相结合。缓冲能力β说明由一TPH单位改变缓冲溶液的pH所需的蛋白分解物的数量(β＝dC*dpH-1，其中dC＝加入的酸或碱的量，dpH＝pH值的变化)。溶液的离子强度I可以使用公式I＝0.5∑ci*zi 2计算(ci＝以mol/l表示的离子浓度，zi＝离子电荷)。本发明中给出的缓冲物质的离子强度使用“Java BufferCalculator”程序(Twigger & Beynon，1998)计算。在此范围中，可根据不同的细胞类型与要求优化缓冲溶液的组分。
优选的实施例中，缓冲溶液的缓冲能力在22与80mmol*1-1*pH-1之间，优选40与70mmol*1-1*pH-1之间。离子强度的范围在200与500mmol*1-1之间，优选在250与400mmol*1-1之间则尤为有利。通常，缓冲能力与离子强度之间有一种最佳关系，取决于细胞类型及其它实验条件，这两种参数之间有一种相互作用。
另一个优选实施例中，缓冲溶液至少含有10mmol*1-1镁离子(Mg2+)，优选为15至20mmol*1-1镁离子。与迄今为止的发现相反，惊奇地发现，本发明的缓冲溶液中，Mg2+即使浓度很高也能增加转染率，转染率的增加程度要远远超过同时轻微提高离子强度所能解释的范围。这种情况中，缓冲液可以含有氯化镁(MgCl2)和/或硫酸镁(MgSO4)。
所提供的一个特别有利的实施例中，如果与细胞的细胞质相比，本发明的缓冲液具有较低浓度的钾离子(K+)，优选为2至6mmol*1-1K+，以及较高浓度的钠离子(Na+)，优选为100至150mmol*1-1 Na+。因此，本发明的缓冲液与细胞内Na+/K+比不匹配，而是在这方面存在细胞外比。然而，令人惊讶的是，这种比例对细胞没有负面影响，但是却大大提高了转染率及细胞存活率。
作为有利因素，本发明的缓冲溶液含有HEPES和/或Na2HPO4/NaH2PO4作为缓冲物质。然而，Tris/HCl或K2HPO4/KH2PO4也可以用作缓冲物质。而且，缓冲溶液还可以含有附加组分，例如氯化钠、琥珀酸钠、甘露糖醇、葡萄糖、乳糖酸钠和/或肽。
下面提及了6组缓冲系统，每种缓冲体系根据不同的细胞类型进行优化，这些系统是本发明特别有利的缓冲溶液组合物的实施例。然而，其它组合物也可能在本发明的范围内，因此这些实施例不应被理解成是一种限制。
1)4-6mM KCl，10-20mM MgCl2以及120-160mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)
2)4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，5-25mM HEPES以及120-160mMNa2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)
3)4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，50-160mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)以及5-100mM乳糖酸钠或者5-100mM甘露糖醇或者5-100mM琥珀酸钠或者5-100mM氯化钠。
4)4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，5-25mM HEPES，50-160mMNa2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)以及5-100mM乳糖酸钠或者5-100mM甘露糖醇或者5-100mM琥珀酸钠或者5-100mM氯化钠。
5)4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，80-100mM NaCl，8-12mM葡萄糖，0.3-0.5mM Ca(NO3)2，20-25mM HEPES以及50-100mM tris/HCl或者30-50mMNa2HPO4/NaH2PO4(pH7.2)。
6)0.1-3.0mM MgCl2，50-200mM K2PHO4/KH2PO4(pH 6.5)和/或1-50mM甘露糖醇和/或1-50mM琥珀酸钠。
本发明的目的可以进一步通过使用电流将生物活性分子引入动物或人的细胞中的方法实现，该方法包括在缓冲溶液中悬浮细胞和溶解生物活性分子，并向悬浮液施加电压，在25℃，pH值在7至8变化时，缓冲液的缓冲能力至少为20mmol*1-1*pH-1，离子强度至少为200mmol*1-1。使用这种方法，可以通过电穿孔将生物活性分子引入动物细胞及人的细胞中，转染效率可以达到93％，同时细胞死亡率低。可以成功地转染各种细胞类型，尤其是静态及弱分裂细胞。
在相关的权利要求书中给出了本发明的方法与缓冲溶液组分相关的其它优点，并能从前述说明中推论出来。
本发明的缓冲溶液特别适用于实施电穿孔方法，使用这种方法可以将生物活性分子引入细胞中，使用的电压脉冲的场强达到2至10Kv*cm-1，持续时间为10至200μs，电流密度至少为2A*cm-2。使用高电压脉冲就能直接将DNA转染动物及人的细胞核中，并通过短的脉冲避免不可逆的膜损伤。由于是短的高电压脉冲，缓冲溶液的高离子强度和导电率不会导致任何不利的溶液变热，因此除了分裂细胞外，静态及弱分裂细胞也可以以高效率、低死亡率转染。缓冲溶液的高离子强度与短高电压脉冲的相互作用会使小孔有效张开，其中强烈的缓冲效应也能弥补pH值的剧烈波动。
在所述电压脉冲后，使用本发明的缓冲溶液也可以以特别有利的方式不间断的施加电流，电流密度在2至14A*cm-2之间，优选达到5A*cm-2，持续时间为1至100ms，优选达到50ms。本发明缓冲溶液的高缓冲能力能在持久的第二次脉冲过程中减少电极附近pH值的变化，这有利于DNA的电泳，因此可以有效地降低细胞死亡率。
使用本发明的方法，通过在动物或人的细胞核中施加电流可以优化生物活性分子的转染。在这种情况下，可以以高效率将核酸、蛋白质或肽引入静态或分裂的动物细胞或人的细胞中。本发明的缓冲溶液还能通过支持高电压脉冲将核酸、蛋白质或肽引入原代细胞中。
核酸还可与肽、蛋白质或其它生物活性分子以复合物或以化合物的形式存在于缓冲溶液中。
本发明的方法尤其适用于原代人血细胞，人血的多能前体细胞，原代人成纤维细胞和内皮细胞以及肌细胞或黑素细胞的转染。
根据本发明的方法产生的细胞特别适用于诊断和/或分析方法以及用于先体对后体内基因治疗的医药产品的生产。
表1给出了本发明的缓冲溶液的具体组合物，每个组合物都针对不同的应用或细胞类型进行了优化，并被证实在高转染率与降低细胞死亡率方面特别有利。然而，在本发明的范围内也可以有其它组合物，因此这些实施例不应被理解为限制。
表1
| 缓冲液# | 磷酸钠[mmol/l] | 磷酸钾[mmol/l] | 甘露糖醇[mmol/l] | KCl[mmol/l] | MgCl2[mmol/l] | HEPES1)[mmol/l] | 琥珀酸钠[mmol/l] | 葡萄糖[mol/l] | 乳糖酸钠[mmol/l] | NaCl[mmol/l] | 谷氨酸钠[mmol/l] | Ca(NO2)2[mmol/l] | 其他 | pH值 | 肽 |
| 1 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0 | 7.2 | |
| 2 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0 | 7.2 | MEEDTPPKKKRKVEDL，25μM |
| 3 | 50 | 0 | 0 | 5 | 1 | 0 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 4 | 50 | 0 | 0 | 5 | 10 | 0 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 5 | 50 | 0 | 0 | 5 | 10 | 0 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | MEEDTPPKKKRKVEDL，25μM |
| 6 | 140 | 0 | 0 | 5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 7 | 160 | 0 | 0 | 5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 8 | 120 | 0 | 40 | 5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 9 | 120 | 0 | 40 | 5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | MEEDTPPKKKRKVEDL，25μM |
| 10 | 100 | 0 | 80 | 5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 11 | 90 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 12 | 120 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 13 | 120 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | MEEDTPPKKKRKVEDL，25μM |
| 14 | 90 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 15 | 120 | 0 | 0 | 5 | 15 | 0 | 0 | 0 | 0 | 12.5 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 16 | 120 | 0 | 0 | 5 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 17 | 140 | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 | 11.5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.28 | |
| 18 | 0 | 150 | 5 | 0 | 2.5 | 0 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.49 | |
| 19 | 0 | 150 | 5 | 0 | 2.5 | 0 | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.49 | MEEDTPPKKKRKVEDL，25μM |
| 20 | 0 | 150 | 5 | 0 | 0.5 | 0 | 11.5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 6.49 | |
| 21 | 90 | 0 | 0 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 50mM甜菜碱 | 7.2 | |
| 22 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 50mM甜菜碱 | 7.2 | |
| 23 | 90 | 0 | 5 | 5 | 10 | 20 | 24 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 24 | 110 | 0 | 0 | 0 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 20mM脯氨酸 | 7.2 | |
| 25 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 20mM脯氨酸 | 7.2 | |
| 26 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 20mM柠檬酸盐 | 7.2 | |
| 27 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 200mM抗坏血酸盐 | 7.2 | |
| 28 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0.2％DMSO | 7.2 | |
| 29 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 5mM谷胱甘肽 | 7.2 | |
| 30 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 2mMNAD* | 7.2 | |
| 31 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0.5％Ficol 1400 | 7.2 | |
| 32 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 2mM二硫苏糖 | 7.2 |
| 醇 | |||||||||||||||
| 33 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0 | 7.2 | zVAD-FMK，20μM |
| 34 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0 | 7.2 | GKPTADDQHSTPKKKRKVED25μM |
| 35 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0 | 7.2 | PSSDDEATASQHSTPPKKKR-KVED，25μM |
| 36 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0 | 7.2 | (PNA)*GKPTADDQHSTPKKK-RKVED，25μM |
| 37 | 30 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.42 | 0 | 7.2 | (PNA)*PSSDDEATADSQHST-PKKKRKVED，25μM |
| 38 | 50 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 0 | 11 | 0 | 100 | 0 | 0.4 | 0 | 7.2 | |
| 39 | 0 | 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 10 | 0 | 0 | 5mM谷胱甘氨1mMEDTA | 7.24 | |
| 40 | 140 | 0 | 0 | 5 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | MEEDTPPKKKRKVEDL 25μM |
| 41 | 90 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 24 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | |
| 42 | 90 | 0 | 0 | 5 | 10 | 20 | 24 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7.2 | MEETPPKKKRKVEDL，25μM |
对各个缓冲溶液的应用实施例参考下列附图进行了详细说明。
附图说明
参考附图对本发明进行了详细说明。
图中，
图1是以缓冲溶液的缓冲能力及离子强度为函数，原代人内皮细胞的转染效率和存活率的图示。
图2是以缓冲溶液的缓冲能力及离子强度为函数，原代人淋巴细胞的转染效率和存活率的图示。
图3显示用H-2KK表达载体转染的原代人成纤维细胞的流或细胞分析，在此过程中，用Cy5-偶联的抗H-2KK抗体培养细胞，使用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)(FL-1，FL-2，FL-3＝荧光通道1，2，3；SSC＝侧面扩散，FSC＝向前扩散)进行分析。
图4显示用H-2KK表达载体转染的人平滑肌细胞的流式细胞分析，在此过程中，用Cy5-偶联的抗H-2KK抗体培养细胞，使用流式细胞仪(FACScalibur，BectonDickinson)(FL-1，FL-2，FL-3＝荧光通道1，2，3；SSC＝侧面扩散，FSC＝向前扩散)进行分析。
图5显示用GFP表达载体转染的原代人黑素细胞的流式细胞分析，在此过程中，使用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)(FL-2，FL-3，FL-4＝荧光通道2，3，4；SSC＝侧面扩散，FSC＝向前扩散)进行分析。
图6显示用GFP表达载体转染的人CML细胞系K562的流式细胞分析，在此过程中，使用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)(FL-2，FL-3，FL-4＝荧光通道2，3，4；SSC＝侧面扩散，FSC＝向前扩散)进行分析。
实施例
下列实施例说明了本发明，但不应被认为是限制性的。
实施例1
原代人内皮细胞的转染效率和存活率
为了研究以缓冲能力及离子强度为函数，电转染期间细胞的转染和存活率，用编码小鼠MHC1类蛋白质H-2KK的重链的载体转染原代人内皮细胞。
将分别具有5μg载体DNA的7×105细胞与各自的电穿孔缓冲液放在室温样品池，该样品池的极间间隙为2mm，用持续时间为100μs的1000V脉冲转染。另外，使用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水：10mM磷酸钠，pH7.2+137mM NaCl，离子强度＝161.5mM，缓冲能力＝4.8mM/pH)测定比较值。电穿孔后，立即使用400μl培养基将细胞冲洗出样品池，在37℃培养10分钟，然后转移到具有预热培养基的培养皿中。培养6小时后，用Cy5-偶联的抗-H-2KK抗体培养细胞，使用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)进行分析。
可以从图1看出，转染效率与存活率随缓冲能力和离子强度的增加而增加。与使用PBS对比溶液相比，每种情况都能获得更佳的测试值，但使用PBS对比溶液会出现极高的死亡率。一些缓冲溶液中，由于死亡率太高而不能用统计学方法计算这些值。
实施例2
原代淋巴细胞的转染效率和存活率
以缓冲能力及离子强度为函数，研究了转染过程中原代人淋巴细胞的转染率和存活率。
为此目的，分别将各自含有5μg H-2KK-表达载体-DNA的5×106细胞与各自的缓冲溶液置于室温的样品池中，该样品池的极间间隙2mm，用持续时间为100μs的1000V脉冲转染，接着再施加电流密度为4A*cm-2，40ms的电流。另外，使用PBS测定比较值(离子强度＝161.5mM，缓冲能力＝4.8mM/pH)。16小时后进行分析。
可以从图2明显的看出，细胞的存活率随着所使用的缓冲溶液的缓冲能力和离子强度的增加而增加。某些情况中，与对比溶液(PBS：40.1％的转染细胞，38.3％的活细胞)相比可以得到更佳的测试值。这里，与常规的溶液如培养基或PBS相比，通过选择本发明的合适的缓冲溶液也可以显著提高转染效率。
实施例3
原代人成纤维细胞的转染
图3显示用H-2KK表达载体转染的原代人成纤维细胞的FACScan分析。从表1缓冲溶液6中具有5μg载体DNA的5×105细胞置于室温样品池中，该样品池的极间间隙为2mm，用100μs的1000V脉冲转染，接着再施加6A*cm-2，33ms的电流。培养5小时后，用Cy5-偶联的抗-H-2KK抗体培养细胞，使用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)进行分析。用碘化丙锭染色测定死细胞的数量。93％的活细胞表达与很高转染效率相对应的H-2KK抗原。
实施例4
人平滑肌细胞的转染
图4示用H-2KK表达载体转染的人平滑肌细胞的FACScan分析。从表1缓冲溶液6中的具有5μg载体DNA的5×105细胞置于室温样品池中，该样品池的极间间隙为2mm，使用100μs的1000V脉冲转染，接着再施加5.6A*cm-2，40ms的电流。培养13.5小时后，用Cy5-偶联的抗-H-2KK抗体培养细胞，使用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)进行分析。使用碘化丙锭染色测定死细胞的数量。53.8％的活细胞表达与高转染效率相对应的H-2KK抗原。
实施例5
原代人原黑素细胞的转染
图5显示用GFP表达载体转染的原代人黑素细胞的FACScan分析。从表1缓冲溶液40中具有5μg pEGFP-C1载体(Clontech Lab)的5×105细胞置于室温样品池中，该样品池的极间间隙为2mm，用100μs的1000V脉冲转染，接着再施加6A*cm-2，33ms的电流。培养24小时后，使用流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson)进行分析。用磺化丙锭染色测定死细胞的数量。56.2％的活细胞表达了与很高转染率相对应的GFP。
实施例6
人类CML细胞系K562的转染
图6显示用GFP表达载体转染的人CML细胞系K562的FACScan分析。从表1缓冲溶液42中的具有5μg pEGFP-C1载体(Clontech Lab)的5×105细胞置于室温样品池中，该样品池的极间间隙为2mm，用70μs的1000V脉冲转染，接着再施加4A*cm-2，10ms的电流。培养24小时后，使用流式细胞仪(FACScalibur，BectonDickinson)进行分析。使用磺化丙锭染色测定死细胞的数量。77.7％的活细胞表达与高转染效率相对应的GFP。
所用缩写列表
以下为所用的缩写除Duden中常用的外：
A 安培
APC 全藻蓝蛋白
CD 分化簇
cm 厘米
DNA 脱氧核糖核酸
FACScan 荧光激活细胞扫描
FCS 胎牛血清
FL 荧光
FSC 向前扩散
HEPES N-(2-羟乙基)-哌嗪-N’-(2-乙磺酸)
ml 毫升
mM 毫摩尔
msec 毫秒
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PE 藻红蛋白
PerCP 多甲藻素叶绿素蛋白
pH 氢离子浓度的负常用对数
RNA 核糖核酸
RPMI 罗斯韦尔·帕克纪念学会
SSC 侧面扩散
Tris 三-(羟甲基)-氨基甲烷-盐酸盐
μg 微克
μl 微升
μsec 微秒
V 伏特
Claims (41)
1.一种用于悬浮动物细胞或人的细胞和溶解生物活性分子以便使用电流将所述生物活性分子引入细胞中的缓冲溶液，在25℃，pH值从pH7至pH8之间变化时，该缓冲溶液的缓冲能力至少为20mmol*1-1*pH-1，离子强度至少为200mmol*1-1，该缓冲溶液含有钾离子浓度为2-6mmol*1-1K+，钠离子浓度为100-150mmol*1-1Na+。
2.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，其缓冲能力在22与80mmol*1-1*pH-1之间。
3.如权利要求1或2所述的缓冲溶液，其特征在于，其缓冲能力在40与70mmol*1-1*pH-1之间。
4.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，其离子强度在200与500mmol*1-1之间。
5.如权利要求1或4所述的缓冲溶液，其特征在于，其离子强度在250与400mmol*1-1之间。
6.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有至少10mmol*1-1镁离子。
7.如权利要求6所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有15至20mmol*1-1镁离子。
8.如权利要求6或7所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有氯化镁和/或硫酸镁。
9.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有HEPES，Na2HPO4/NaH2PO4，Tris/HCl和/或K2HPO4/KH2PO4作为缓冲物质。
10.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有附加组分，所述的附加组分包括氯化钠、琥珀酸钠、甘露糖醇、葡萄糖、乳糖酸钠和/或肽。
11.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有4-6mMKCl，10-20mM MgCl2以及pH为7.2的120-160mM Na2HPO4/NaH2PO4。
12.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有4-6mMKCl，10-20mM MgCl2，5-25mM HEPES以及pH为7.2的120-160mM Na2HPO4/NaH2PO4。
13.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，pH为7.2的50-160mM Na2HPO4/NaH2PO4以及5-100mM乳糖酸钠或者5-100mM甘露糖醇或者5-100mM琥珀酸钠或者5-100mM氯化钠。
14.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，5-25mM HEPES，pH为7.2的50-160mM Na2HPO4/NaH2PO4以及5-100mM乳糖酸钠或者5-100mM甘露糖醇或者5-100mM琥珀酸钠或者5-100mM氯化钠。
15.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，80-100mM NaCl，8-12mM葡萄糖，0.3-0.5mM Ca(NO3)2，20-25mM HEPES以及50-100mM tris/HCl或者pH为7.2的30-50mM Na2HPO4/NaH2PO4。
16.如权利要求1所述的缓冲溶液，其特征在于，所述缓冲溶液含有0.1-3.0mM MgCl2，pH为6.5的50-200mM K2PHO4/KH2PO4，1-50mM甘露糖醇和/或1-50mM琥珀酸钠。
17.一种使用电流将生物活性分子引入动物细胞或人的细胞中的方法，其特征在于，所述方法包括：
i.在缓冲溶液中悬浮细胞和溶解生物活性分子，在25℃，pH值从pH7至pH8之间变化时，该缓冲溶液的缓冲能力至少为20mmol*1-1*pH-1，离子强度至少为200mmol*1-1，
ii.对悬浮液施加电压。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液的缓冲能力在22与80mmol*1-1*pH-1之间。
19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液的缓冲能力在40与70mmol*1-1*pH-1之间。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液的离子强度在200与500mmol*1-1之间。
21.如权利要求17或20所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液的离子强度在250与400mmol*1-1之间。
22.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有至少10mmol*1-1镁离子。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有15至20mmol*1-1镁离子。
24.如权利要求22或23所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有氯化镁和/或硫酸镁。
25.如权利要求17所述的方法，其特征在于，该缓冲溶液含有的钾离子浓度为2至6mmol*1-1 K+，以及钠离子浓度为100至150mmol*1-1 Na+。
26.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有HEPES，Na2HPO4/NaH2PO4，Tris/HCl和/或K2HPO4/KH2PO4作为缓冲物质。
27.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有附加组分，所述的附加组分包括氯化钠、琥珀酸钠、甘露糖醇、葡萄糖、乳糖酸钠和/或肽。
28.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2以及pH为7.2的120-160mM Na2HPO4/NaH2PO4。
29.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，5-25mM HEPES以及pH为7.2的120-160mM Na2HPO4/NaH2PO4。
30.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，pH为7.2的50-160mM Na2HPO4/NaH2PO4以及5-100mM乳糖酸钠或者5-100mM甘露糖醇或者5-100mM琥珀酸钠或者5-100mM氯化钠。
31.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，5-25mM HEPES，pH为7.2的50-160mM Na2HPO4/NaH2PO4以及5-100mM乳糖酸钠或者5-100mM甘露糖醇或者5-100mM琥珀酸钠或者5-100mM氯化钠。
32.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有4-6mM KCl，10-20mM MgCl2，80-100mM NaCl，8-12mM葡萄糖，0.3-0.5mM Ca(NO3)2，20-25mM HEPES以及50-100mM tris/HCl或者pH为7.2的30-50mM Na2HPO4/NaH2PO4。
33.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中缓冲溶液含有0.1-3.0mMMgCl2，pH为6.5的50-200mM K2PHO4/KH2PO4，1-50mM甘露糖醇和/或1-50mM琥珀酸钠。
34.如权利要求17所述的方法，其特征在于，其中生物活性分子是通过施加场强度达到2至10Kv*cm-1、持续时间为10至200μs、电流密度至少为2A*cm-2的脉冲电压引入细胞中的。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，其中生物活性分子是通过在所述高电压脉冲之后不间断的施加电流引入细胞中的，该电流的电流密度为2至14A*cm-2，持续时间为1至100ms。
36.如权利要求34或35所述的方法，其特征在于，其中通过电流将生物活性分子转染到动物细胞或人的细胞中。
37.如权利要求17或34所述的方法，其特征在于，其中将核酸、蛋白质或肽引入静态或分裂的动物细胞或人的细胞中。
38.如权利要求17或34所述的方法，其特征在于，其中将核酸、蛋白质或肽引入原代动物细胞或人的细胞中。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，其中核酸与肽或蛋白质以复合物或者以化合物形式存在。
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，其中核酸与肽或蛋白质以复合物或者以化合物形式存在。
41.如权利要求17或34所述的方法，其特征在于，其中细胞是原代人血细胞、人血的多能前体细胞、原代人成纤维细胞和内皮细胞以及肌细胞或黑素细胞。
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