CN1024556C - 核酸衍生物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种核酸衍生物的新颖制备方法。该方法主要包括：(a)使单链核酸聚合物分级，使其分子大小限定在50-10，000个碱基对(或沉降定值为4S-13S)范围内；(b)退火，亦即使彼此互补的单链核酸聚合物形成双链的过程。本发明可工业化，且不产生公害等污染。由本发明的方法所制备的核酸衍生物具有很强的抗癌作用和其他生理活性作用，而且副作用小，可用作抗肿瘤剂、抗病毒剂等。

Description

本发明涉及医用核酸衍生物的一种新颖制备方法。
核酸是核糖等的糖结合在嘌呤环或者嘧啶环上，由磷酸介于它们之间，并以链相连而成。
核酸中的RNA（核糖核苷酸聚合物）是链状高分子化合物，它具有核糖作为糖，糖部分以磷酸二酯键相连结。在构成核酸的碱（例如肌苷、腺苷、胞苷、尿苷等）的嘌呤环或者嘧啶环部分，两条链以所谓互补的方式由氢键相连构成螺旋状的立体结构。由于这种含有二条链的核酸可期待具有有效的生理活性，因此迄今为止已对此进行了大量研究[Biochemical    and    Biophysical    Research    Communications    58（1974）等]。
在本说明书中，其中把作为合成双键RNA的多聚肌苷酸·多聚胞苷酸衍生物称为“poly    I·polyC”衍生物，而将其的构成单元，即多聚肌苷酸和多聚胞苷酸分别称为“poly    I”和“polyC”。
近年来，人们业已知道，各种天然或合成的双链RNA具有干扰素产生能（フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.58    1004（1967）。フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.58    2102（1967）。フィ-ルドウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.61    340（1968）。タィテルウ。Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.58    1719（1967）。フィ-ルドウ。J.Gen.Physiol.56    905（1970）。デクラ-ヶウ。Methods    in    Enzymology    78.291（1981）]。
综上所述，现归纳如下：
作为干扰素，诱导物的合成核酸衍生物一览表
（Ⅰ）均聚物·均聚物复合体（以poly    Ⅰ·polyC作为基体的双链核酸聚合物）
（1）改性碱
多聚肌苷酸·多聚（5-溴代胞苷酸），多聚肌苷酸·多聚（2-硫代胞苷酸），多聚（7-脱氮杂肌苷酸）·多聚胞苷酸，多聚（7-脱氮杂肌苷酸）·多聚（5-溴代胞苷酸）。
（2）改性糖
多聚（2′-叠氮肌苷酸）·多聚胞苷酸。
（3）改性磷酸
多聚肌苷酸·多聚[胞苷基（シチジン）-5′-硫代磷酸]。
（Ⅱ）交替变换共聚物
多聚（腺苷酸-尿苷酸）。
（Ⅲ）均聚物·共聚物复合体
多聚肌苷酸·多聚（胞苷、尿苷酸）;多聚肌苷酸·多聚（胞苷酸、4-硫代尿苷酸）。
（Ⅳ）合成核酸与聚阳离子的复合体
多聚肌苷酸·多聚胞苷酸·多聚-L-赖氨酸（称为“poly    I    CLC”）。
（Ⅴ）其他
多聚肌苷酸·多聚（1-乙烯基胞苷酸）。
如上所述，近年来已发表了许多有关双键RNA，特别是以poly    I·polyC作为基体的衍生物的报告。而且，有人综述了有关含有它们的一系列核酸衍生物及其结构活性[デクラ-クウ。Texas    Reports    on    Biology    and    Medicine    41    77（1982）]。
本发明人以现有技术为基础，发现，poly    I·polyC，以及以它 作为基体的各种衍生物，在以全部分子的大小分布作为沉降定值时，通过将该值调整为4S～13S（碱基数为50-10，000左右），则它们既保持了以下所述的生理活性，而其毒性又大为降低，对此本发明人提出了专利申请[特愿昭62-167433号，以及根据该申请提出的国内优先权声明]。
在上述研究的同时，为了高效率地取得上述目的物，本发明人对于下述操作进行了各种研究：
（1）将分子大小的分布统一在50-10，0000左右碱基数范围内的操作[在本说明书中，将分子大小的分布调整在一定范围内的操作称为“分级”。此外在本发明中，由于伴有低分子化现象，故分级也意味着“短链化”）;
（2）用二种单链核酸聚合物使之成双链核酸聚合物的操作（在本说明书中，称为“退火”（アニ-リング）。
表示核酸分子大小的单位常用的碱基对（或称“bp”），是由核酸的碱基数来表示其分子的大小（10bp系指具有10个碱基的双链聚合物）。在本说明书中，因为还要处理双链聚合物以外的核酸聚合物，故而使用“碱基数”的术语来代替bp（例如，所谓“10碱基数”则表示具有10个碱基的核酸聚合物）。
在要使核酸分子的大小特定时，则广泛地使用通常的沉降定值（S值），本发明人把具有已知分子大小的双链DNA（M13噬菌体片段）作为对照群，采用下述的使用凝胶过滤柱的高效液相色谱法（HPLC）或者电泳法，通过与其对照群进行比较换算，即可求得上述的碱基数。
以往，在表示核酸高分子的分子量时，广泛地使用S值。现在市售的核酸高分子也以S值表示。但是，由于近年来实验技术的进步，采用了凝胶电泳、凝胶过滤色谱、离子交换色谱等方法，建立了更为 精确地测定分子量的手段，现在已经可以对其链长进行测定。这里有一个S值表示与链长表示的关系问题，由于用S值表示时，各核酸分子选用固有值，因而作为表示核酸分子量的方法，S值表示和链长表示是否能正确地相对应，从这个角度上看，并非没有问题。
在本发明的说明书中，当表示分子量时，本发明人按照至今的核酸化学的惯例，也记载了S值表示。但是，由于S值是将核酸高分子作为整个分子团（或者分子形态）来进行测定的方法，鉴于今后有必要更明确他表现分子量分布的界限，故将基于链长（在本说明书中为“碱基数”）测定的表示方法也一并加以记载。
上面是从poly    I·polyC及以其作为基体的各种衍生物的所谓分级的观点出发，在制备分级的双链核酸聚合物时，或采用使已存在的双链核酸聚合物低分子化的方法，亦即采用在单链核酸聚合物退火后使其低分子化的方法。但是，在以往的方法中，分级需花费时间，因而不能快速地处理，故对于以工业规模来制备目的物方面有其不足之处。而且从收率角度上看也未必能使人满足。
一方面，分级后，有必要使单链核酸聚合物进行硫化时，以往是用硫化氢硫化后，使硫化氢从溶剂中挥发逸出。亦即用真空泵从硫化后的反应液中抽出吡啶的同时，也将硫化氢一起除去，但这种方法由于硫化氢的挥发性，以工业规模实施这样的反应将会带来公害对策上的问题。此外，除去吡啶后的水层则进入渗析器，流水渗析，由此得到目的物，但这种方法的全部操作过程至少需要三天，而且收率至多达80%左右，因而在收率、费用和所需时间的诸多方面存在技术上的困难。
此外，分级技术的本身也未必没有问题。
在该技术领域内，核酸聚合物的低分子化历来是采用与甲酰胺共存加热的方法，通过调节这一反应的时间和温度而获得链长更为合适 的目的物，此后，借助于使反应溶液进行渗析等手段，除去低分子化过度的不需要物质。然而，在以往这种方法中，由于作为原料的核酸聚合物的性质关系，即使在相同的反应条件下，有时也会引起具有不同分子量分布的分级现象，因而在重现性方面尚存在问题。据认为这是因为用酶反应来调制，原料分子的大小往往不能保持恒定的缘故。另外，适用于此处的渗析工艺，从原理上看，不能除去比目的物的链更长的核酸聚合物，人们期待着根本的解决办法。
本发明人继续作各种研讨，以①能以迅速操作取得作为目的物的经分级的双链核酸聚合物，②其收率要高，③可工业化且不产生公害等污染，④能定量地实现一系列操作且再现性高等作为目的不断研究结果，才好不容易完成了本发明。
本发明的目的在于：
①在退火之前，先要使各自的单链核酸聚合物分级，
②当上述（1）的分级时，通过使用HPLC（凝胶过滤高效液相色谱）替代目前的电泳法，使分子大小分布数值化，并利用由此容易知道分子大小分布的变化，进而要确定能迅速取得4S～13S（碱基数约为50～10，000）这一分子大小分布范围内的目的物的方法，
③确立以下方法，即在分级后的处理中，把以前用渗析取得目的物的做法，通过添加低级醇类等进行处理的这一极其单纯的操作来提高收率，
④确立以下方法，即当分级后有必要使单链核酸聚合物硫化时，把以前用硫化氢硫化后使硫化氢直接从溶剂中挥发的做法，通过添加芳香醇进行离心处理这一极其单纯的操作来提高收率，
⑤作为调整分级后的单链核酸聚合物的分子量分布，并进一步使其分布集中的方法，适用了离子交换树脂。
以下将对上述的各点作详细地说明。
退火是一种使彼此互补的单链核酸聚合物成双链的过程，是本来就容易进行的操作。若在退火后进行分级，则会产生硫化度波动等误差，建以定量取得。故而，想到分级要在退火之前进行，并这样执行的结果获得了极其良好的结果。
上述的（1）与（2）有密切关系。用由电泳法测知其分子量的目前的手段，最低需要一夜（泳动及染色），难以做到迅速处理。本发明人通过把HPLC凝胶过滤法用于其中，就能够极其迅速地知道产生作为目的的分子大小分布的物质（即，为4S～13S，碱基数约为50～10，000的物质）的反应时间。
本发明中，当测知分级反应终止后即使反应停止，之后，加低级醇类进行处理。低级醇类中最好用乙醇。
当使用乙醇沉淀法时，例如由polyC获得L-poly    C（经分级的polyC，以下“L-”的意义相同）的反应中，可以以93%的高收率得到目的物，在由poly    I获得L-poly    I的反应中，可以以78%的高收率得到目的物。
以前，是把反应溶液送入渗析管作渗析处理的，但这时的收率约为60%，在由poly    Ⅰ获得L-poly    I的反应溶液只能期望达到大约40%，而且操作要求大约三天。采用乙醇沉淀法（在反应溶液中添加其两倍数量的乙醇，经搅拌使目的物析出，之后离心分离，收集沉淀物，洗净且干燥的方法），则可以在1小时之内处理。
上述（3）是构成本发明的要旨的重点。分级后由硫原子置换单链核酸聚合物中的核酸中的氮原子（例如，以一定的比例由巯基置换polyC中胞苷残基的氨基）而变成其他的核酸的反应（本说明书中称之“硫化”），是合成共聚物时常常使用的方法。另外，本发明的目的还在于在所说的硫化共聚物的合成中，添加芳香醇并加以处理来达到目的[上述（4）]。
可以使用诸如苯酚作为芳香醇。
使用苯酚时，例如在混有吡啶、水和硫化氢气体的反应溶液中，添加一半数量的苯酚，经搅拌及离心分离，水层和苯酚层清楚地分开，使反应溶液的颜包和副产物硫等也迁移到苯酚层。之后，分离水层，由盐水、醇处理使目的物析出再离心分离，通过洗净醇，可以获得纯的目的物。
如果采用这种方法，由于硫化氢大部分包含在溶液的沉淀上的清液中，故而可以容易地去除。
例如，采用使用苯酚的本发明的方法，操作在1小时之内完毕，收率几乎为100，而且可以定量地获得目的物。
上述的本发明中的独特的方法（2）～（4）为实现在退火之前进行分级是重要的，并且是为了能充分地应用所谓退火前分级的手法上，能应用自如的方法。
以下是本发明的另一特征，将说明分级与退火之间的大小限定的方法与[上述（5）]。
该方法中，利用离子交换树脂。作为核酸系高分子中适用了离子交换树脂的实例有在t-RNA施用的DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、苯酰化DEAE-纤维素等[BBA，47，193（1961）、BBRC    10，200（1963）、Biochem.6，3043（1967）]。该例中，至多不过在碱基数约为80的低分子核酸的精制中施用离子交换树脂。
本发明人对在以高分子核酸聚合物的碱基数作为指标的精制时是否可能应用离子交换树脂所具有的吸附电荷的本性，进行了各种研讨结果，确立了本发明。本发明，由于其目的物质作药物是极其有用的，故而确信应用该离子交换树脂的大小限定（本说明书中还称之“离子交换法”）具有显著的进步性。
在本发明离子交换法中，离子交换树脂仅与核酸聚合物共处同一 容器内就可达到目的（分批法），而通常应用柱色谱进行分界（柱法）。把离子交换树脂装入柱等中，使溶解了核酸聚合物的液体流入，一旦使其吸附在离子交换树脂中，其后一边使食盐-三羟甲基氨基甲烷缓冲液等的洗脱液通过柱，一边使其食盐浓度变成线性或者分段，得到一定量流出液，然后与以前同样地用HPLC凝胶过滤法把含有各种馏分的核酸聚合物的碱基数，以指示器为指标测知，从而可以获得目的物的经洗脱的馏分。
为了用上述的离子交换法达到目的，柱中填充的离子交换树脂的种类和洗脱液的种类成为极重要的因素。
例如，把poly    I溶解于盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，再使其吸附在用于poly    I的大小限定的QAE（第四级氨基乙基）载体中而进行离子交换法的结果，即使洗脱液的盐浓度极浓，也未能得到目的物。这是因为只要在QAE载体中的poly    I适中洗脱液盐浓度状态中，poly    I本身不溶。可以由作为poly    I的构成单位的肌苷酸，在结构上更具有疏水性来说明。这里，适中洗脱液盐浓度是与poly    C比较而定的。
在本发明人所作的其他实验中，在QAE载体中poly    I的适中洗脱液食盐浓度的缓冲液中，溶解的poly    I呈白浊状，可以观察到产生沉淀的现象。因此，本发明离子交换法中，选择离子交换树脂的种类以及洗脱盐浓度成为极其重要的要素。
也就是说，在poly    I的情况下，使用DEAE载体，得到非常良好的结果。在poly    I情况下，不管QAE载体，不管DEAE载体都能获得良好的结果。洗脱可以通过采用食盐的线性浓度梯度或者分段的浓度梯度，以链长的顺序使聚合物分界洗脱。
例如，用poly C（38毫克，S208.6），吸附在DEAE-Toyopearl 650C（φ10×130毫米）中，以线流速1.32厘米/ 分，175滴/馏分洗脱、A＝OM    Na    Cl/10m    M盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0）B＝0.5M    Na    Cl/10m    M盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0）各用100毫升，以B%0→100，采用线性浓度梯度结果，按下列的链长的顺序可清楚地洗脱。
馏分    碱基数
33    340
34    470
35    740
36    1000
37    1500
另外，若把同样的试样以分段的浓度梯度进行，则在0.3M    Na    Cl/10m    M盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0）（50毫升）时，可以分界出500碱基数以下的，接着在0.5M    Na    Cl/100mM盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0）（50毫升），可以分界出500～1500碱基数的。
同样，在同一条件下以线性浓度进行，则可按下列的顺序洗脱poly I（7.8毫克1，S207.3）。
馏分    碱基数
35    30
36    140
37    230
38    350
39    460
40    540
另外，若同样的试样以分段的浓度梯度进行，则在0.3M Na    Cl/10mM盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0）（50毫升）可以分界出3000碱基数以下的，接着在0.5M    Na    Cl/10mM盐酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH0.7）（50毫升），分界出300～600碱基数的。
这样，通过选择任意的食盐浓度，连高分子的核酸都可分界出链长被限定的核酸。
如上述的两例所示，本发明的离子交换法的最大目的在于以任意地且大规模地从由各种链长构成的核酸高分子混合物中分出具有在药效上适合作药物的性质的链长分布的物质（主要成分）。
可是，在制备作为注射剂的药物时，业已知道，不可缺少所谓去除在剂中不可以混入的热原（发热物质，已知它由多糖构成）的操作。在与本发明有关的核酸衍生物中，当把它作为注射剂给药于人时，这也必然成为必须要解决的问题。
本发明人通过采用上述的离子交换法，幸运地发现了去除这种热原的方法。
本发明人继续进行实验，目在在于更仔细地验证上述偶然发现的现象，结果发现，对单链核酸衍生物，不管其链长如何，都可用离子交换法去除热源，从而完成本发明。
因此，这也是本发明的重要目的之一。
把由单链RNA（市售poly    C以及使其短链化的物质）的试验的内毒素的定量试验的结果示于下表。
表中：EU代表家免发热性试验的单位[内毒素单位：USP    reference    standard    endotoxin（E.coli    0113）]。
①代表注射用蒸馏水（空白），②代表poly（市售商品-1），③代表polyC（市售商品-2），④代表下述实施例（5-4）中的物质。
检    离子交换    浓度
体    柱前后    μg/ml    EU/ml    pg/mg    EU/mg
①    ……    29.92    0.0868
②    前    308.29    0.8941    548.07    1.5895
后    18.68    0.0542    33.96    0.0985
③    前    93.89    0.2723    166.18    0.4819
后    19.45    0.0564    34.12    0.0989
④    前    89.63    0.2599    155.88    0.4520
后    57.45    0.1666    114.90    0.3332
由上可见，离子交换法的去除热原的效果是明显的。
作为药品，本发明的核酸衍生物的生理活性是极其有用的，如以下所述，本发明核酸衍生物具有强的抗癌作用。这种作用不过是本发明核酸衍生物所持有的几种生理活性中的一种。
除了以poly    I·polyC为基体的本发明核酸衍生物的生理活性之外，还可列举TNF产生能、干扰素产生能、间白细胞素产生能、巨噬菌体活化能、对NK细胞的活化作用、肿瘤细胞增殖阻止作用、人肿瘤细胞在输癌裸鼠中的增殖阻止作用、肿瘤细胞的肺转移抑制作用等。
本发明核酸衍生物与之前的poly    I·polyC等的干扰素·衍导物相比，具有极高的安全性。因此，本发明的化合物可以作抗病素剂、抗肿瘤剂等。
上述的本发明核酸衍生物的生理作用在上述的专利申请（特愿昭62-1676433号及基于它的要求国内优先权的申请）的说明书中已作详细叙述。
以下揭示了有关本发明的核酸衍生物制备方法的实施例，以对本发明作更为详细的说明。
实施例
（1）L-poly    I（分级化的poly    I）的制备及提纯
在市售的10克poly    I中，加入200毫升蒸馏水、250毫升甲酰胺，以及500毫升的5M食盐水，在80℃下加热4小时。
采用具有TSK凝胶G-DNA-PW柱（7.88毫米（直径）×300毫米）的高效液相色谱法[洗脱液为50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（pH7.5）、0.3M食盐、2mM    ETDA，流速为0.5毫升/分]，凝胶过滤，保留时间达到最大值21.86±0.2（分）时，终止反应。
向反应液加入2倍量的乙醇，用离心分离（3000转/分，4℃）收集所生成的沉淀物，经70%乙醇洗净后，真空干燥，由此得到102克L-poly    I。
另外，本实施例中全部使用灭菌状态的水和水溶液，以下实施例同。
（2）L-poly    C（规格化的polyC）的制备和提纯
在10克polyC中，加入200毫升蒸馏水、250毫升甲酰胺、50毫升5M的食盐水，在80℃下加热4小时左右。采用与上述（1）相同的高效液相色谱凝胶过滤手段，确认反应的终点（当保留时为21.33±0.2分时）。
向反应液加入2倍量的乙醇，通过离心分离（3000转/分，4℃）收集沉淀物，经70%乙醇洗净后，进行真空干燥，由此即得9.5克的L-poly    C。
（3）L-poly    C的硫化
将上述（2）所得的8.0克L-poly    C溶解在240毫升水中，然后 置于500毫升蒸馏釜内，在冰冷却下，加入硫化氢的吡啶溶液（12克/120毫升），封管后，在50℃下加热10小时左右。冷却后，加入TE饱和酚（200毫升），搅拌后，离心分离（3000转/分，15℃，5分钟），在水层中加入1/10（水层量的1/10）量的5M食盐水及2倍（水层量的2倍）量的乙醇，随即产生沉淀。离心分离（3000转/分，4℃，10分钟）后，用70%乙醇洗净，再经真空干燥，即得到8.0克L-poly（C20S4U）（系指在分级的poly C中，每20个胞苷酸中有一个被4-硫代赖氨酸置换）。
此外，上述所谓的TE，系在10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.5）中加入EDTA，使后者浓度达到1mM，由此所配制成的溶液称为TE。
（4）退火一例
从上述（3）中所得到L-poly（C20，S4U）中取出6.00克，而上述（1）中所得的poly I中取出6.44克，分别将它们溶解在由10m M三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.5）和50m M食盐水所组成的300毫升溶液中，然后进行混合。将所得的混合液在水浴中加热至70℃，保温10分钟后，原封不动地冷却过夜。经酚处理和用乙醇沉淀后，在所生成的沉淀物中加水（约200毫升），使其溶解，在水中渗析，温度为4℃，将渗析液浓缩至干，即得12.4克退火的化合物。
（5）用离子交换法的大小限定
以下的离子交换法可通过分级洗脱或线性梯度洗脱而进行。若正确地选择洗脱条件，则在任何情况下，收率及作为目标的链长几乎可以保持不定。L-poly C和L-poly（C，S4U）的分级洗脱均用0.15M Na Cl/10m M三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）、10MNa Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）连续地进行。
L-poly    I的分级洗脱可参照下述实施例（5-1）。
L-poly    I的线性梯度洗脱
用A[0M Na Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）]，B[0.5M Na Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）为洗脱液，并在B液的百分数为0至100%的梯度条件下进行洗脱。L-poly C及L-poly（C，S4U）的线性梯度洗脱可参照实施例（5-2）及（5-4）。
（5-1）L-poly    I的大小限定
将上述（1）所得的210毫克L-poly    I溶解在5毫升的10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）中，然后使其吸附在DEAE-Toyopearl（登记商标）650C（φ100mm×130mm）上，接着用盐浓度为0.03M    Na    Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH    7.0（50毫升）和0.5M    Na    Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）（80毫升）的洗脱液，以1.30厘米/分的线速度和分级洗脱的方式进行洗脱。收集用0.5M    Na    Cl洗脱时的级分，并用与上述（1）相同的高效液相色谱凝胶过滤法测定保留时间，所得的值为21.90±0.2分。
在91%的高收率下，得到一种L-poly    I化合物，其中作为目标的碱基数限定在100-1000的范围内。
（5-2）L-poly    C的大小限定
将前述（2）所得的610毫克L-poly    C溶解在10毫升的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0）中，然后使之吸附在QAE-Toyopearl（登记商标）550C（φ10mm×130mm）上，接着在1.30厘米/分的线速度下，分别用100毫升的A[浓度为0.0M    Na    Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）]、B[浓度为1.0M    Na    Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）]洗脱液，并在B液 的百分数为0至100的线性梯度洗脱条件下进行洗脱。收集主峰洗脱过程中的级分，用高效液相色谱凝胶过滤法测定保留时间，所得的值为21.35±0.2分。在93%高收率下，得到一种L-poly    C化合物，其中作为目标的碱基数限定在100-1000的范围内。
（5-3）L-poly（C12，U）的大小限定
将19毫克L-poly（C12，U）（系指每12个胞苷酸中有一个被尿苷酸置换）（采用同上的高效液相色谱法，测得的保留时间为18.67分）溶解在5毫升三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）中，然后使之吸附在DEAE-Toyopaerl（登记商标）650C（φ10mm×130mm）中，接着分别用100毫升的A[浓度为0.0M Na Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）]、B[浓度为0.5M Na Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）]洗脱液，从1.30厘米/分的线速度，并在B液的百分数为0-100的线性梯度洗脱的条件下，进行洗脱。收集主峰洗脱过程中的级分，并用高效液相色谱凝胶过滤法测定保留时间，所得的数值为18.97±0.2分。在87%的高收率下，得到一种L-poly（C12，U），其中作为目标的碱基数限定在100-1000的范围内。
（5-4）L-poly（C20，S4U）的大小限定
将前述（3）所得的600毫克L-poly（C20，S4U）溶解在10毫升三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）中，然后使之吸附在QAE-Toyopearl（登记商标）550C（φ10mm×130mm）上，接着分别用100毫升A[浓度为0.0M Na Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）]、B[1.0M Na Ca Cl/10mM三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.0）]洗脱液，以1.30厘米/分的线速度，并在B液在百分数为0-100的线性梯度洗脱条件下进行洗脱。按照与上述（5-2）中所述的相同的高效液相色谱凝胶过滤法测定保留时间，所得 的数值为21.35±0.2分。
在90%的高收率下，得到一种L-poly（C20，S4U），其中作为目标的碱基数限定的100-1000的范围内。
（6）退火
（6-1）L-poly    I和L-poly    C
将前述（5-2）中所得的大小限定的L-poly    C3.0克和在（5-1）中所得的大小限定的L-poly    I3.2克分别溶解在150毫升由三羟甲基氨基甲烷·盐酸缓冲液（pH7.5）和50mM食盐水所组成的溶液中，然后进行混合。将所得的混合物在水浴中加热至70℃，保温10分钟后，在原封不动的状态下冷却过夜。经酚处理后，用乙醇沉淀，在所生成的沉淀物中约加入400毫升水，使之溶解，然后在水中渗析，温度为4℃。将渗析液浓缩至干后，即得到6.2克退火化合物。
（6-2）L-poly I和L-poly（C20，S4U）
按上述（6-1）中的所述的同样方法处理在前述（5-4）中所得的大小限定的L-poly（C20，S4U）1.46克和前述（5-1）中所得的大小限定的poly I1.57克，由此得到3.0克退火化合物。

Claims (3)

1、一种核酸衍生物的制备方法，其特征是在制备以RNA作为基体的，且在全部分子大小分布中分布量最大的分子以其碱基数范围为50-10，000的双链核酸衍生物过程中，使各核酸聚合物在退火前经由热分解法分级。
2、如权利要求1所述的方法，其特征是，在分级后和退火前对构成单链核酸聚合物的核酸进行硫化的过程中，添加芳基醇进行处理。
3、如权利要求1所述的方法，其特征是用离子交换树脂处理分级后和退火前的单链核酸聚合物，使其分子大小的分布集中在一定范围内，从而对其大小进行限定。
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