CN102071219B

CN102071219B - 改腺载体及其在艾滋病预防和治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN102071219B
Application number: CN201010534229.5A
Authority: CN
Inventors: 冯小荣; 彭千芮; 周江艳
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2030-11-05
Also published as: CN102071219A

Abstract

本发明涉及治疗艾滋病的基因药物，具体是冯氏载体——一种腺卫星病毒载体。该药物由包含以下步骤的方法制备：A.确定CCR5基因和CXCR4基因的修饰位点；B.确定能够识别选定的脱氧核糖核酸序列的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些氨基酸序列编进锌指核酸酶的编码筐，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物；C.把带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物克隆到腺卫星病毒II克隆质粒中，产生冯氏质粒；D.用pAAV-RC质粒、pHelper质粒和冯氏质粒来共同转染HEK293细胞，得到新的病毒载体即冯氏载体；E.冯氏载体的纯化；F.冯氏载体浓缩。该药物能在人和动物体内表达的锌指核酸酶能在特定位点修饰CXCR4和CCR5基因，破坏它的功能，因而可以在艾滋病治疗中应用。

Description

改腺载体及其在艾滋病预防和治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及治疗艾滋病(AIDS)的基因药物，具体是冯氏载体——一种腺卫星病毒载体。

背景技术

艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficency virus，HIV)感染而引起的传染性疾病，近20年来艾滋病在全球呈迅速蔓延趋势。到目前为止，还没有非常有效的治疗艾滋病的药物，因而寻找预防和治疗艾滋病药物的研究显得日益迫切。中国的人体免疫缺损病毒HIV/艾滋病AIDS扩散传染已经变得严重了。其发展已经历了两个过程(‘登录’，1985-88‘散布’1989-94)，目前发展到了第三阶段‘扩张’。据联合国估计，2010年大约有1千万中国人感染艾滋病病毒。

据初步推测，感染艾滋病毒进入人体有两种机制：有些病毒直接融入细胞膜，有些病毒则由受体导入细胞。在1986年所做的一项研究清楚表明，艾滋病病毒感染的发生是由于与细胞表面T4的分子与病毒分子相互作用的直接结果。T4基因测序后，接着发现了这个现象。

HIV病毒进入人体常作用于某些靶细胞，这是因为在细胞上，病毒壳与细胞膜边沿蛋白质之间的结合功能。在辅助细胞表面发现的蛋白质，即CD4，是艾滋病毒的受体蛋白质。CD4本身不足以诱发艾滋病毒的结合，但已证明艾滋病毒的结合机制中，CD4是必不可少的。已经发现，CD4，以及人趋化因子受体5(CCR5)或人趋化因子受体4(CXCR4)都是病毒结合所必需的物质。人体T细胞是白细胞之一。最重要的用于抗艾滋病毒的T细胞叫“CD4T细胞”。CCR5蛋白作用于普通HIV感染者以进入感染的T细胞。有些人的T细胞先天缺乏CCR5。这些人能抵抗艾滋病感染。一些人的T细胞只有少量CCR5，他们感染艾滋病后的发病状态要轻得多。因此，只要去除T细胞内的CCR5，就能治疗艾滋病。

锌指核酸酶(ZFN)是一工程化的DNA结合蛋白质的集合体，在基因特定的部位造成DNA的双链断裂，以对其基因作修饰。每个锌指核酸酶(ZFN)由两个功能区组成：1)DNA结合区，由两指模块链组成，每个都是独特的六聚体(6bp)DNA序列。两指模块连在一起形成锌指蛋白，每个的特化≥24碱基对(bp)。2)DNA裂解区，由FokI的核酸区组成。当DNA结合区和DNA裂解区融合在一起时，产生一种高度特化的基因剪刀组合。ZEN可用于诱导特定DBA序列的双链断裂，从而促进特定部位的同源重组和各种不同形式细胞的基因位点的靶定操作。双链断裂对于特定位置的基因突变非常重要，因其刺激了细胞的自然DNA修复过程，此过程称为同源重组及非同源末端连接(NHEJ)。经过已建立的区域验证法，此一过程被用于精确产生靶定的基因编辑，从而产生靶定基因删除，重组，修饰后的细胞株。

腺卫星病毒(AAV2)是相当小的DNA病毒，但却综合了反转录病毒会嵌入宿主染色体的特性，及腺病毒载体会感染不分裂的细胞的特性，而成为目前遗传性疾病基因疗法的新宠。在使用这个病毒载体时，基本上病毒本身的蛋白基因部份均已被剔除，故在宿主内也不会造成强烈的免疫反应，而可维持较长时段的基因表现。而先前制备该病毒之步骤较繁琐，且病毒力价偏低，目前也已一一克服，其力价也可高达10¹⁰～10¹³cfu/mL，故非常适合用于活体内。

发明内容

本发明的目的是提供一种改造过的腺卫星病毒载体——冯氏载体，是在腺卫星病毒载体(AAV2病毒载体)的基础上改造而成，主要用于治疗艾滋病。它能表达两种锌指核酸酶，其中一种能专一性的修改艾滋病毒辅助受体CCR5基因，另一种能专一性的修改艾滋病毒辅助受体CXCR4基因。它的其它各方面与典型的腺卫星病毒载体无异。

冯氏载体，由包含以下步骤的方法制备：

A确定CCR5基因和CXCR4基因的修饰位点；

B确定能够识别选定的脱氧核糖核酸序列的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些氨基酸序列编进锌指核酸酶的编码筐，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物；

C把带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物克隆到腺卫星病毒II克隆质粒中，产生冯氏质粒；

D用pAAV-RC质粒、pHelper质粒和冯氏质粒来共同转染HEK293细胞，得到新的病毒载体即冯氏载体；

E冯氏载体的纯化；

F冯氏载体浓缩。

我们利用基因工程的技能和软件筛选有关的修饰位点(Xiaorong Feng，et al Nature 2002Jul 18；418(6895)：320-3.Morgan L Maeder，et al Nature Protocols 20094，-1471-1501)。CCR5基因和CXCR4基因的序列可以从美国国立卫生研究院网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/查到。CCR5的基因编号是NM_001100168。CXCR的基因编号是NM_001008540。

锌指联盟(http://www.zincfingers.org)也发布了网络工具，以帮助设计锌指核酸酶。下面列出的位点是我们经过许多测试选中的最好的修饰位点。

CCR5基因修饰位点为：

263 aCTATGCTGCCGCCCAG

g 289

263 t

GCGGGTCACCCTGAAAc 289

CXCR4基因修饰位点为：

427 aacagtcagaggccaag

g 453

427 t

ccggttccttcgacaac 453。

上述黑体表示的是关键的位点。

我们应用上述的相关信息，确定能够识别选定的脱氧核糖核酸序列的锌指核酸酶的安基酸序列。把这些安基酸序列编进锌指核酸酶的编码筐，我们利用合成长引物的策略来建造新的锌指核酸酶的编码的序列。具体步骤包括下列过程：

1)选定能够识别CCR5基因和CXCR4基因的的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些序列插入到相应的锌指核酸酶编码筐当中；

2)为锌指核酸酶的区段设计脱氧核糖核酸编码序列；

3)合成带有锌指核酸酶编码序列的低聚核苷酸；

4)用3)合成的低聚核苷酸作为引物进行聚合酶链反应，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的产物。

其中，为锌指核酸酶的区段设计的脱氧核糖核酸编码序列为：

识别CCR5基因锌指核酸酶结合区编码序列为

Cggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacttct

M E P Y A C P V E S C D R R F S

ggtaatttggttcgtcacatccggatccacacgggccagaagcctttccagtgtcgaata

H I R I H T G Q K P F Q C R I

tgcatgcgtaacttcagtcgcaccgataccttacgcgatcatatacgaacacatacaggt

C M R N F S D H I R T H T G

gagaagccttttgcctgtgacatttgtgggaggaagttttcccgaaccgatacccttcga

E K P F A C D I C G R K F S

Gatcataccaaaatccatttaagacagaagcaaagctt

D H T K I H L R Q K Q S

上述黑体表示的是关键的位点。

识别CXCR4基因锌指核酸酶结合区编码序列为

cggatccatggagccctatgcttgccctgtcgagtcctgcgatcgccgcttttctacatcg

M E P Y A C P V E S C D R R F S

ggagcactcacacggcacatccggatccacacgggccagaagcctttccagtgtcgaata

H T R I H T G Q K P F Q C R I

tgcatgcgtaacttcagtcagagtag tgacctaacaagacatatacgaacacatacaggt

C M R N F S

H I R T H T G

gagaagccttttgcctgtgacatttgtgggaggaagttttcccaatcaggcaatcttgcc

E K P F A C D I C G R K F S

cgacataccaaaatcca tttaagacagaagcaaagctt

H T K I H L R Q K Q S

上述黑体表示的是关键的位点。

上述的聚合酶链反应是普通的聚合酶链反应(PCR)方法，见冯小荣等(Xiaorong Feng，etal)，美国科学院院报Proc Natl Acad Sci U S A.2003 July 8；100(14)：8502-8507. “Single-Nucleotide Polymorphisms&Genome Diversity in Plasmodium viva.x”。

其中，步骤C包括下列过程：

1)在一个干净的管子消化1微克的腺卫星病毒11克隆质粒和1微克步骤B所得的聚合酶链反应的产物；

2)纯化所需要的片段，包括大的片段即载体片段和插入片段中的小片段即插入片段；

3)连接：把100-200纳克载体片段和300-600纳克的插入片段放入一个20微升的反应中，用脱氧核糖核酸连接酶T4在室温中反应2-4个小时；

4)用洒精沉淀法纯化连接好的脱氧核糖核酸；

5)用2微升纯化了的连接物转化到大肠感菌细胞DH5a中，用含有青霉素的培养皿筛选；

6)从培养皿中挑选菌落，放入50毫升含青霉素100微克/毫升的普通培养液LB中，培养16-18个小时；

7)从6)得到的大肠感DH5a细胞中，提取，纯化质粒，得到腺卫星病毒II-锌指核酸酶质粒，即冯氏质粒。

本发明中，步骤D包括下列过程：

1).使用已传代2-3次的HEK293细胞，培养这些细胞直到单层已经70-80％密度；

2).用pAAV-RC质粒、pHelper质粒和冯氏质粒来共同转染上述细胞；

3).经过48-72小时培养，用锥形管来收获转染细胞和其培养液，在2500--3000转/分钟的条件下分离5-10分钟，丢弃上清液，使转染细胞分离出来，然后用无血清的细胞培养液混合；

4).将锥形管交替放到干冰乙醇和36～38℃的温水中，使这些细胞悬浮液经过4轮冷冻/解冻循环交替的过程；

5).将4)中经最后解冻的的锥形管在10,000g离心力的条件下进行离心10-15分钟来收集上清液；然后，

6).在55～57℃的条件下放置30-40分钟；

7).通过一个0.45微米的低蛋白结合滤器来过滤，得到所需的病毒清液。这病毒清液可以贮存在-80℃的温度下或即时纯化来进行储存。

冯氏载体的纯化是介绍如何纯化和压缩25毫升病毒清液的。如果样本少于25毫升，添加无血清培养液直到25毫升。纯化步骤E包括下列过程：

1).添加0.25毫升AAV结合试剂A到25毫升步骤D所得的病毒上清液中，并搅拌均匀；

2).在36～38℃下静放30-40分钟；

3).在5000g离心力的条件下离心15-20分钟；

4).收集3)的上清液并转移到一个新试管中；

5).将1.25毫升AAV结合试剂B加到4)的上清液中，搅拌均匀；

6).在36～38℃下静放30-40分钟；

7).用0.45微米低蛋白结合过滤器来过滤6)的上清液，并用干净试管收集液体；

8).加3毫升AAV纯化基质到7)的试管中；

9).将试管放到定轨振荡器中在4～8℃的温度下，振荡30分钟--60分钟；

10).将净化柱底部的小部件移除，然后将净化柱放到到一个空着的50毫升锥形管中；

11).搅拌9)所得试管中的上清液/基质悬浮液，并将其倒入净化柱中，并用试管收集流出的液体；试管收集的液体再倒回净化柱中，用10毫升1X PBS缓冲液清洗试管，并将清洗液也倒入净化柱中；

12).待液体完全流过，净化柱停止滴液的时候，再加10毫升净化缓冲剂到净化柱内来冲洗收集的基质，之后再重复冲洗一遍；

13).将净化柱转到一个空着的50毫升的锥形管中；

14).将3毫升提洗缓冲液慢慢地加入净化柱，收集流出的液体；

上述：

AAV结合试剂A的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314001；

AAV结合试剂B的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314002；

AAV纯化基质的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314003；

净化柱的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314107；

提洗缓冲液的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314106；

净化缓冲剂的牌号是ViraBind^TM，商品号是PartNo.314105。

最后，冯氏载体的浓缩方法，步骤F包括下列过程：

1).组装一个腺卫星病毒浓缩装置；

2).将0.5毫升步骤E最后收集的部分放入到浓缩装置的样品贮器中，在2000g离心力下离心5-8分钟，滤过的部分可以丢弃；

3).继续浓缩，直到样本贮器里达到100微升为止；

4).加300-400微升1X PBS缓冲液，然后继续离心，直到100微升；

5).用一个干净的离心管，通过倒转样本贮器将浓缩物收集到试管中；

6).再离心并收集所有的液体。

本发明还提供所述的冯氏载体治疗爱滋病的应用。

冯氏载体治疗艾滋病基本原理：

冯氏载体是根据仿生原理，设计，应用锌指核酸酶修改CGR5和CXCR4基因，于是打断艾滋病毒进入人体免疫细胞的通道。

该载体能表达特殊的锌指核酸酶。这些锌指核酸酶能用于编辑或剔除CCR5和/或CCR4。

冯氏载体是通过阻断艾滋病毒进入人体的免疫细胞(CD4)或它的干细胞达到治疗艾滋病。

冯氏载体通过移植已经修饰的，扩增过的免疫细胞(CD4)或它的干细胞到患者体内来治疗艾滋病。

冯氏载体治疗艾滋病基本步骤：

1)，分离出若干的T细胞(CD4)或它的干细胞。

来源可以是：

A，患者或患者亲属血液细胞；

B，患者或患者亲属脐带血细胞；

C，患者或患者亲属骨髓细胞；

2)，应用冯氏载体修饰T细胞(CD4)或它的干细胞的CCR5和CXCR4基因。

3)，扩增已经修饰的T细胞或它的干细胞(10--100亿)。

4)，移植已经修饰的T细胞或它的干细胞到患者体内。

5)，检测患者血液，每月一次，直至血液里的HIV病毒转阴为止。(三个月到半年)。

为了清除T细胞里的CCR5，我们将从艾滋病患者体内分离出大量的T细胞，然后使用我们的特殊系统将冯氏载体从分子水平送入T细胞。冯氏载体进入T细胞后便开始清除T细胞里的CCR5蛋白。当这些T细胞再回到患者体内，其CD4T细胞已经没有CCR5蛋白。

我们的试验已经表明，当CD4T细胞经技术修饰后，可以预防HIV的感染，治疗艾滋病。

附图说明

图1：冯氏质粒I(修饰CCR5基因)；

图2：冯氏质粒II(修饰CXCR4基因)；

图3：冯氏质粒III(修饰CXCR4和CCR5基因)；

图4：冯氏质粒III插入片段设计图；

图5：用多聚组氨酸(His)抗体来检查锌指核酸酶；

图6：切割质粒来检查锌指核酸酶活力；

图7：动物实验结果。

具体实施方式

冯氏质粒设计

参考冯氏质粒示意图图1、图2和图3。冯氏质粒是在腺卫星病毒II(AAV2)的基础上发展而成；腺卫星病毒II(AAV2)克隆质粒装上特别的锌指核酸酶编码框之后构建成冯氏质粒。修饰CXCR4或CCR5的锌指核酸酶编码框由两个功能区组成：1)DNA结合区，由两指模块链组成，每个都是独特的六聚体(6bp)DNA序列。两指模块连在一起形成锌指蛋白，每个的特化≥24bp。2)DNA裂解区，由Fokl的核酸区组成。当DNA结合区和DNA裂解区融合在一起时，产生一种高度特化的基因剪刀组合。

冯氏载体的制备

1、冯氏质粒制备

1)在一个干净的管子消化1微克的腺卫星病毒II克隆质粒和1微克聚合酶链反应的产物；

3)连接：把100纳克载体片段和300纳克的插入片段放入一个20微升的反应中，用脱氧核糖核酸连接酶T4在室温中反应3个小时；

4)用洒精沉淀法纯化连接好的脱氧核糖核酸；

6)从培养皿中挑选菌落，放入50毫升含青霉素100微克/毫升的普通培养液LB中，培养16 个小时；

2、冯氏质粒扩增

将冯氏质粒转化到大肠杆菌细胞DH5中，再将大肠杆菌转移到200毫升的LB细菌培养液(含青霉素100微克/毫升)培养16个小时。

3、冯氏质粒纯化

从上述得到的大肠感DH5a细胞中，提取，纯化质粒。用Qiagen公司质粒纯化盒(见QIAGEN公司，

Plasmid Purification Handbook，商品号是12143)纯化质粒，方法参照公司的产品说明书。用两个纯化柱可以得到150微克的冯氏质粒。

4、冯氏载体的制备

1)培养细胞。

一天前，每个细胞培养皿种下2×10⁵HEK-293细胞，用10个直径15厘米的细胞培养皿培养HEK-293细胞。

2)冯氏载体的产生

第二天，细胞的密度为70％至80％时，将冯氏质粒、pHelper质粒和pAAV-RC质粒一起同时转化到HEK-293细胞中。每个细胞培养皿共转化25.2微克质粒(冯氏质粒8.4微克，pHelper8.4微克，pAAV-RC质粒8.4微克)。到48个小时用锥形管收集转化过的HEK-293细胞(含冯氏载体)。在3000转/分钟的条件下分离10分钟，丢弃上清液，使转染细胞分离出来，然后用无血清的细胞培养液混合；将锥形管交替放到干冰乙醇和37℃的温水中，使这些细胞悬浮液经过4轮冷冻/解冻循环交替的过程；将经最后解冻的的锥形管在10,000g离心力的条件下进行离心15分钟来收集上清液；然后，在56℃的条件下放置30分种；通过一个0.45微米的低蛋白结合滤器来过滤，得到所需的病毒清液。这病毒清液可以贮存在-80℃的温度下或即时纯化来进行储存。

3)冯氏载体的纯化和浓缩

添加0.25毫升AAV结合试剂A到25毫升上述所得的病毒上清液中，并

搅拌均匀；在37℃下静放30-40分种；在5000g离心力的条件下离心15分种；

收集上清液并转移到一个新试管中；将1.25毫升AAV结合试剂B加到新试管中，搅拌均匀；在37℃下静放30分种；用0.45微米低蛋白结合过滤器来过滤上清液，并用干净试管收集液体；加3毫升AAV纯化基质到试管中；

将试管放到定轨振荡器中在4℃的温度下，振荡45分钟；另外，将净化柱底部的小部件移除，然后将净化柱放到到一个空着的50毫升锥形管中；搅拌振荡后的试管中的上清液/基质悬浮液，并将其倒入净化柱中，并用试管收集流出的液体；试管收集的液体再倒回净化柱中，用10毫升1XPBS缓冲液清洗试管，并将清洗液也倒入净化柱中；待液体完全流过，净化柱停止滴液的时候，再加10毫升净化缓冲剂到净化柱内来冲洗收集的基质，之后再重复冲洗一遍；将净化柱转到一个空着的50毫升的锥形管中；将3毫升提洗缓冲液慢慢地加入净化柱，收集流出的液体；

上述：

AAV结合试剂A的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314001；

AAV结合试剂B的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314002；

AAV纯化基质的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314003；

净化柱的牌号是ViraBind^TM，商品号是Part No.314107；

提洗缓冲液的牌号是ViraBind^TM，商品号是PartNo.314106；

净化缓冲剂的牌号是ViraBind^TM，商品号是PartNo.314105。

最后，冯氏载体的浓缩方法是：组装一个腺卫星病毒浓缩装置；将0.5毫升步骤E最后收集的部分放入到浓缩装置的样品贮器中，在2000g离心力下离心5分钟，滤过的部分可以丢弃；继续浓缩，直到样本贮器里达到100微升为止；加300微升1XPBS缓冲液，然后继续离心，直到100微升；

用一个干净的离心管，通过倒转样本贮器将浓缩物收集到试管中；再离心并收集所有的液体。

10个直径15厘米的细胞培养皿培养的细胞中提取载体。纯化和浓缩后，最后得到的总体积100微升，冯氏载体的总数为1×10¹²拷贝。

应用冯氏质粒在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达特定的锌指核酸酶

1)为测定锌指核酸酶的活性，设计一个酶底物。每一个新的一对锌指核酸酶可以一起测定也可以单独测定。为配对测定设计的酶底物可以是拥有理想天然靶序列或合成靶序列的质粒。为单独测定设计的酶底物是拥有每一个识别序列倒置副本的质料。各种消极控制包括：一个与自然靶基或合成靶基孵育的单一锌指核酸酶，这个不能被切割。事实上，质粒中的非靶序列构成一套完整的阴性对照。

2)从大肠感菌(DH5a)细胞中纯化腺卫星病毒II(AAV2)质粒(一个质粒表达一个新的锌指核酸酶，如图1图2分别表示的冯氏质粒I，II)。

3)将这些质粒分别转化到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。在培养细胞中表达锌指核酸酶。图3冯氏质粒III表达二个新的锌指核酸酶。

4)用His标记纯化试剂盒(HIS-tagged Protein Purification Kit)纯化锌指核酸酶，见图4。

用多聚组氨酸(His)抗体来检查锌指核酸酶。见图5。

图5中，用多聚组氨酸(His)抗体来检查锌指核酸酶，方法是免疫转印技术western-blot)。线1，2是冯氏质粒I(修饰CCR5基因)表达特定的锌指核酸酶。线3，4是冯氏质粒II(修饰CXCR4基因)表达的锌指核酸酶。线5，6是冯氏质粒III(修饰CXCR4基因和修饰CCR5基因)。

检查锌指核酸酶活力

1)准备如下反应混合物。脱氧核糖核酸(DNA)基板被假定为一个质粒包含一个可以为一对锌指核酸酶作用的靶基。共50纳克，20微升，相当于约1纳摩尔(nM)的浓度，取决于质粒的大小。每个锌指核酸酶的稀释液应当进行测定，最终浓度大约相当于相当于脱氧核糖核酸(DNA)靶基的摩尔浓度。

成份数量浓度

水 9微升

5倍锌指核酸酶反应缓冲剂 4微升 1倍

0.5摩尔盐水 2微升 50毫摩尔

20毫摩尔二硫代苏糖醇

(DTT) 1微升 1毫摩尔

2毫克/毫升核糖核酸 1微升 100微克/毫升

脱氧核糖核酸(50毫克/毫升) 1微升 50纳克

锌指核酸酶1(各种稀释) 1微升

锌指核酸酶2(各种稀释) 1微升

最后的体积： 20微升

2)加入1微升的0.2摩尔的氯化镁，并在室温下孵育1小时来开始反应。

3)用5微升的停止溶液来终止反应，并将每个样品加到1％琼脂糖凝胶中进行分析。如图6，4，7，8号样品是完全切割，1，5号对照组(阴性)，2，3，6号是不完全切断。

图6切割质粒来检查锌指核酸酶活力。4，7，8号样品是完全切割；1，5号对照组(阴性)；2，3，6号是不完全切断。

应用实施例

1)方法

A.分离约0.75亿个人的CD4细胞。

B.在装有0.25亿个人的CD4细胞试管中，加入2.5X10¹⁰个冯氏载体。在另一个装有0.25亿个人的CD4细胞试管中，加入2.5X10¹⁰个AAV2克隆载体。在第三个装有0.25亿个人的CD4细胞试管中，加入等体积的生理盐水。

C.混均。在37度的细胞培养箱中摇4个小时。

D.给每个人化的小鼠移植(尾血管注射)500万个经冯氏载体处理过的CD4细胞。

F.二天前，给每只小鼠注射(腹腔注射)200微升的艾滋病病毒。

G.在移植CD4细胞前，取小量血样，检测小鼠体内艾滋病病毒含量。

H.在小鼠移植CD4细胞30天后，检测其血样，确定各个个体爱滋病病毒含量。

I.共15只人化小鼠，分三组，每组5只。第一组移植经冯氏载体处理过的CD4细胞。第二组移植AAV2克隆载体处理过的CD4细胞。第三组移植经生理盐水处理过的CD4细胞。

2)结果：

如图7所示，柱体1，4是冯氏载体治疗的小鼠，柱体2，5是AAV2克隆载体(空载体)治疗的小鼠，柱体3，6是盐水治疗的小鼠。每个组5只小鼠，治疗30天后，经冯氏载体治疗过的艾滋病小鼠艾滋病病毒量急剧下降，艾滋病病毒(HIV-1)含量降至0.05％。

Claims

1.冯氏载体，由包含以下步骤的方法制备：

A 确定CCR5基因和CXCR4基因的锌指核酸酶修饰位点，如下，

CCR5基因修饰位点为：

263 aCTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTg 289 CXCR4基因修饰位点为：

427 aacagtcagaggccaaggaagctgttg 453； B 确定能够识别CCR5基因和CXCR4基因的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些氨基酸序列编进锌指核酸酶的编码区，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的聚合酶链反应的产物；

其中：识别CCR5基因的锌指核酸酶结合区编码序列和氨基酸序列为：

，

识别CXCR4基因的锌指核酸酶结合区编码序列和氨基酸序列为:

；

D 用pAAV-RC质粒和冯氏质粒、或 pHelper质粒和冯氏质粒来共同转染HEK293细胞，得到新的病毒载体即冯氏载体；

E 冯氏载体的纯化；

F 冯氏载体浓缩；

其中，CCR5基因和CXCR4基因的序列从美国国立卫生研究院网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/查到, CCR5的基因编号是NM_001100168, CXCR4的基因编号是NM_001008540。

2.根据权利要求1所述的冯氏载体，其特征是：其制备方法步骤B包括下列过程：

1) 选定识别CCR5基因和CXCR4基因的锌指核酸酶的氨基酸序列，把这些序列插入到相应的锌指核酸酶编码区当中；

2) 为锌指核酸酶的区段设计脱氧核糖核酸编码序列；

3) 合成带有锌指核酸酶编码序列的低聚核苷酸；

4) 用3)合成的低聚核苷酸作为引物进行聚合酶链反应，得到带有锌指核酸酶的离解区和结合区的产物。

3.根据权利要求1所述的冯氏载体，其特征是：其制备方法步骤C包括下列过程：

1) 在一个干净的管子消化1微克的腺卫星病毒II克隆质粒和1微克步骤B所得的聚合酶链反应的产物；

2) 纯化所需要的片段，包括大的片段即载体片段和插入片段中的小片段即插入片段；

3) 连接：把100—200纳克载体片段和300—600纳克的插入片段放入一个20微升的反应中，用脱氧核糖核酸连接酶T4在室温中反应2- 4个小时；

4) 用酒精沉淀法纯化连接好的脱氧核糖核酸；

5) 用2微升纯化了的连接物转化到大肠杆菌DH5a细胞中，用含有青霉素的培养皿筛选；

6) 从培养皿中挑选菌落, 放入50毫升含青霉素100微克/毫升的普通培养液LB中，培养16 - 18个小时；

7) 从6) 得到的大肠杆菌DH5a细胞中, 提取, 纯化质粒, 得到腺卫星病毒II-锌指核酸酶质粒，即冯氏质粒。

4.根据权利要求1所述的冯氏载体，其特征是：其制备方法步骤D包括下列过程：

1). 使用已传代2-3次的HEK293细胞，培养这些细胞直到单层已经70-80%密度；

2). 用pAAV-RC质粒和冯氏质粒、或 pHelper质粒和冯氏质粒来共同转染上述

细胞；

3). 经过48-72小时培养，用锥形管来收获转染细胞和其培养液，在2500--3000转/分钟的条件下分离5-10分钟，丢弃上清液, 使转染细胞分离出来，然后用无血清的细胞培养液混合；

4). 将锥形管交替放到干冰乙醇和36~38°C的温水中，使这些细胞悬浮液经过4次冷冻/解冻循环交替的过程；

5). 将4)中经最后解冻的的锥形管在10,000g离心力的条件下进行离心10-15分钟来收集上清液；然后，

6).在55~57°C的条件下放置30-40分种；

7).通过一个0.45微米的低蛋白结合滤器来过滤，得到所需的病毒

清液。

5.根据权利要求1所述的冯氏载体，其特征是：其制备方法步骤E包括下列过程：

1). 添加0.25毫升AAV结合试剂A到25毫升步骤D所得物中，并搅拌均匀；

2). 在36~38°C下静放30-40分种；

3). 在5000g离心力的条件下离心15-20分种；

4). 收集3)的上清液并转移到一个新试管中；

5). 将1.25毫升AAV结合试剂B加到4)的上清液中，搅拌均匀；

6). 在36~38°C下静放30-40分种；

7). 用0.45微米低蛋白结合过滤器来过滤6)的上清液，并用干净试管收集液体；

8). 加3毫升AAV纯化基质到7)的试管中；

9). 将试管放到定轨振荡器中在4~8°C下振荡30分钟--60分钟；

10). 将净化柱底部的小部件移除，然后将净化柱放到到一个空着的50毫升锥形管中；

11). 搅拌9)所得试管中的上清液/基质悬浮液，并将其倒入净化柱中，并用试管收集流出的液体；试管收集的液体再倒回净化柱中，用10毫升1X PBS缓冲液清洗试管，并将清洗液也倒入净化柱中；

12). 待液体完全流过，净化柱停止滴液的时候，再加10毫升净化缓冲剂到净化柱内来冲洗收集的基质，之后再重复冲洗一遍；

13). 将净化柱转到一个空着的50毫升的锥形管中；

上述：

AAV结合试剂A的牌号是ViraBind ，商品号是Part No. 314001；

AAV结合试剂B的牌号是ViraBind ，商品号是Part No. 314002；

AAV纯化基质的牌号是ViraBind ，商品号是Part No. 314003；

净化柱的牌号是ViraBind ，商品号是Part No. 314107；

提洗缓冲液的牌号是ViraBind ，商品号是Part No. 314106；

净化缓冲剂的牌号是ViraBind ，商品号是Part No. 314105。

6.根据权利要求1所述的冯氏载体，其特征是：其制备方法步骤F包括下列过程：

1).组装一个腺卫星病毒浓缩装置；

2). 将0.5毫升步骤E最后收集的部分放入到浓缩装置的样品贮器中，在2000g离心力下离心5-8分钟，滤过的部分可以丢弃；

3). 继续浓缩，直到样本贮器里达到100微升为止；

4). 加300-400微升1X PBS缓冲液, 然后继续离心, 直到100微升；

5). 用一个干净的离心管，通过倒转样本贮器将浓缩物收集到试管中；

6). 再离心并收集所有的液体。

7.权利要求1所述的冯氏载体在制备治疗艾滋病药物的应用。