CN1381590A - 单核苷酸多态性(snp)的简便快速的高温杂交芯片检测技术 - Google Patents

Abstract

本发明针对现有DNA寡核苷酸探针芯片检测基因组双链DNA单核苷酸多态性(SNP)的不足,对固定探针的设计、探针固定、DNA标记和杂交等过程进行了相应改进。1)使用高亲和力探针,并具有耐酸碱性、抗核酸酶和重复使用等优点;2)立体探针固定技术,增加探针的固定密度和被检DNA与探针的空间可近性;3)DNA直接标记技术,检测时将基因组DNA碎裂成50bp左右的片断,并应用生物素光化学直接标记技术;4)高温杂交技术,可以在比正常杂交温度高10度以上或较低离子强度的条件下进行杂交,避免靶DNA双链间的复性,显著提高杂交的效率。本发明使基因组DNA的多态性检测和突变检测更简便快速,可以在短至2小时内完成检测全过程。

Description

单核苷酸多态性(SNP)的简便快速的高温杂交芯片检测技术

本发明是一种涉及基因组DNA芯片高温杂交检测的技术，是指采用特殊高亲和力探针、探针立体网络化固定、目标DNA的直接标记以及高温杂交等技术，提高杂交温度，减少溶液中DNA复性，同时缩短检测时间。该技术可用于单核苷酸多态性和基因突变的检测分析。

人类基因组是一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列，基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物种的共同性和稳定性，然而人类基因组又是一个变异的体系。在长期进化的过程中，基因组的DNA序列不断地发生变异，这些变异可能是有害的、有益的或中性的，它们其中的一些被保存下来，导致了不同种族、群体和个体间基因组的差异或多态性。对基因组多态性的了解将有助于阐明基因表型、序列变异与疾病风险之间的关系。一种普遍的多态性是基因组中散在的单个碱基的不同，这种不同虽然也包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，即单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的这类多态性有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性、以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。

SNP是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1％。由于SNP是二等位基因态(biallelic)的，易于自动化批量检测，因而被认为是新一代的遗传标记。作为DNA序列中单个碱基的置换，理论上任何用于检测单碱基突变或多态的技术都可用于SNPs的识别或检出，例如，RFLP、等位基因特异的寡苷酸杂交、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异的PCR(ARMS)、DNA测序等都可分别用于已知或未知的SNPs的检测。这些方法大多需要电泳和荧光标记。无论为了大量发现新的SNPs，还是用已知SNPs作群体基因型分析，都需要同时检测大量的位点，而上述基于电泳和需标记DNA的方法则因其样本处理费时费力而效率有待提高。为此，近年来已发展了一些批量地、自动化地识别或检出SNPs的方法，如基因芯片技术——即在一块小硅片上进行微阵列分析，让目标DNA与密集的多重寡核苷酸阵列进行杂交以检出SNPs的有效方法。

基因芯片技术已经成为科学研究与临床诊断的重要手段。基因芯片技术是将互补的DNA片段作为探针固定在支撑物的表面，然后与被检测样本中的未知DNA杂交，样本中存在互补DNA序列，即在相应的探针位点产生阳性信号。在现阶段，用于基因突变或多态性检测DNA芯片是寡核苷酸芯片。寡核苷酸芯片是以寡核苷酸作为探针，固定于芯片表面，该寡核苷酸片段，多数为人工合成，用于检测基因突变的探针长度多在8～15个碱基左右。检测时，将相应的DNA片段用PCR进行扩增并标记，然后与芯片杂交，分析杂交位点的信号强度。

迄今为止，基因的点突变以及基因组的单核苷酸多态性的基因芯片检测，主要还是依靠一定长度的寡核苷酸探针对特定序列的识别，需要应用PCR将其特定基因片断扩增并标记，结果PCR扩增技术使被检测的突变位点或特定序列的数量大受限制。而且常规PCR技术将DNA的两条链一同扩增，其PCR产物是双螺旋结果的两条链的混合物，在杂交时由于长时间的杂交，PCR产物自身形成双螺旋结构，而影响了与芯片表面寡核苷酸探针的杂交效率。为了克服此种缺点，不少研究者采用的了不对称PCR技术，不对称性的将基因组DNA中一条链进行扩增，但同时也大大降低的PCR的扩增效率；也有人采用PCR引物标记和分离技术，将常规PCR扩增的产物，通过被标记引物的识别分离而去除互补链以增加杂交效率。这些均增加了操作的复杂性，并延长了检测时间。

因此，到目前为止，用于SNPs和已知基因点突变检测技术还不成熟，或者检测操作太复杂，影响了推广使用。

寡核苷酸芯片用于点突变和多态性的检测还存在以下问题：

1)检测基因组多态性受到很大的限制，由于被检测基因组DNA需要PCR进

  行扩增，因此PCR的操作使被检测基因的数量或突变位点的数量变的非常

  有限；现有的检测基因突变的芯片方法，其同时检测的基因数量不超过5

  个，突变位点的检测数量也在50个以下；

2)PCR操作烦琐，在现有方法检测基因突变的基因芯片方法中，均需要PCR

  对基因进行扩增，有时还需要进行线性(不对称性)PCR扩增，主要是为

  了减少杂交时DNA产物双链之间的退火复性，降低与芯片探针配对的效

  率。同时PCR操作也是DNA产物标记的需要；

3)由于PCR及标记的试剂昂贵，增加的检测成本。

4)费时，一般需要2天时间才能完成检测，不适合于临床检测。

本发明的目的是提供一种检测程序较简单，可快速进行单核苷酸多态性(SNP)和基因突变的芯片检测的方法。

为了克服现有技术的不足和缺陷，本发明采取一种新的高亲和力探针、探针立体固定和高温杂交的检测方法以达到本发明的目的。

本发明涉及DNA高温杂交检测的技术和方法，包括高亲和力探针阵列制作、探针立体固定、简化的DNA抽提和标记、高温杂交和信号分析等。本发明采用下列措施实现寡核苷酸芯片的快速高效检测。1.使用肽核酸(PNA)探针或核糖戊环2′位修饰的RNA寡核苷酸探针或正常DNA寡核苷酸探针

1)使用PNA探针

PNA是唯一的一种人工信息分子，它由中性的肽链样的骨架和与之相连的核苷碱基所组成，由肽链样骨架代替了DNA的磷酸骨架(图1)。PNA可以与互补的RNA或DNA杂交，并比常规寡核苷酸探针具有更强的亲和力和更高的特异性。这种新的特性提供了传统核苷探针所不能提供的优越性。

PNA分子的骨架由重复的N-2-氨基乙酰甘氨酸单位组成，类似于肽键，碱基通过亚甲基碳酰键与骨架相连，不含戊糖环和磷酸基团，因此不带电荷，同时PNA具有氨基末端和羧基末端。PNA有如下优点：①由于PNA的无电荷的骨架结构，使得PNA/DNA、PNA/RNA双螺旋结构的热稳定性好于DNA/DNA、DNA/RNA的双螺旋结构，PNA/DNA或PNA/RNA的双股结构的Tm值要高于相应的DNA/DNA、DNA/RNA的Tm值大约每个碱基1℃，这对于提高DNA杂交温度、增加探针的亲和力和分辨力具有特殊的作用；②PNA另一个特别的特性是PNA与DNA或RNA的结合不依赖于反应体系中的离子强度，在低离子强度条件和通常杂交温度下，PNA仍然能与DNA杂交，因此通过调节反应体系中的离子强度，可以维持DNA或RNA的二级结构在变性状态，有利于PNA探针与靶DNA或RNA的结合；③特异性增强，PNA与DNA的亲和力增高，可以增加PNA/DNA结构的稳定性，然而当发生错配时，它的去稳定效果又比DNA/DNA结构大，一个15碱基的PNA/DNA复合物当发生单碱基错配时，Tm值下降8-20℃(平均15℃)，而DNA/DNA发生单碱基错配的Tm值下降仅为4-16℃(平均11℃)，由于碱基错配的Tm值差距变大，可使分辨率增强；④抗核酸酶和蛋白酶，由于核酸酶和蛋白酶不能识别肽链样骨架，因而可以抵抗核酸酶和蛋白酶的水解，此外，PNA在较宽的pH范围内也很稳定。本发明选用PNA作为基因组DNA检测的探针，可以通过提高杂交温度、降低反应体系的离子强度来抑制双链DNA本身的复性，增加靶DNA与探针结合的机会，同时可以通过PNA本身的特性，来增加杂交的特异性和维持芯片的稳定性。

2)使用核糖戊环2′位修饰的RNA寡核苷酸探针

以核糖戊环2′位修饰的RNA寡核苷酸代替DNA寡核苷酸探针。DNA寡核苷酸探针虽然对核酸酶有一定的抗性，但由于DNA寡核苷酸的Tm值较低，当与双链DNA杂交时，双链DNA的双链的复性退火，干扰了靶DNA与寡核苷酸探针的复性，使杂交效率和稳定性大为降低。RNA具有比DNA高约15℃的Tm值，在较高温度与DNA杂交时可以避免DNA双链复性的干扰，但是RNA探针相当不稳定，极易被环境中的RNA酶降解，几乎使以RNA探针为基础的检测成为不可能。本发明采用2′修饰的RNA寡核苷酸探针代替DNA探针或RNA探针，具有至少三大优点：1、抗核酸酶，2′位修饰的RNA寡核苷酸探针，如2′-O-alkyl(2′氧烷基)RNA寡核苷酸、2′-O-methyl(2′氧甲基)RNA寡核苷酸、2′-O-Allyl(2′烯丙基)RNA寡核苷酸、2′-fluoro-U与2′-fluoro-C掺入的RNA寡核苷酸以及末端磷巯基(phosphorothioate)修饰的RNA等的热稳定性高于DNA，与DNA形成的双螺旋结构不能被RNAse H水解，特别是2′-O-Allyl(氧烯丙基)修饰的RNA探针比其他类型修饰更具RNAse H的抗性。2、高亲和性这些经修饰的RNA探针保留了RNA高亲和性的特点，可以在高温下杂交，可以提高杂交温度(比正常高15℃左右)，这样可以避免DNA双螺旋结构复性对杂交的影响；同时因杂交温度的提高，增加了靶DNA的布郎运动，因而可以增加靶DNA与芯片表面探针碰撞的机会，增加杂交效率。与2′-O-methyl RNA相比，2′-fluoro修饰的RNA寡核苷酸可以与DNA形成更稳定的双螺旋结构，只是它的抗RNA酶的能力不如2′-O-Methyl RNA。3、三螺旋结构的形成，2′-O-Methyl修饰的RNA还可以与具有对应序列的DNA双螺旋杂交形成三螺旋结构，而且具有很高的稳定性。2.探针的网络立体固定

末端修饰的寡核苷酸探针直接借助末端活性基团与芯片表面形成共价连接，这样所带来的问题就是由于探针与芯片表面太近形成显著的位阻效应，阻碍靶DNA与探针的接近，影响杂交效率。由于空间位阻效应，靶DNA不能有效接近固定探针，即使有机会接近，也由于空间位阻效应不容易形成碱基配对。当用于SNP和基因点突变检测时，探针必需是适当长度(～15个碱基)的寡核苷酸探针。

本发明利用活性高分子聚合物将探针远离芯片表面，形成立体的空间探针网络。本发明所采用的活性高分子物质为醛基活化的葡聚糖或者酰肼活化的葡聚糖，这些被活化的葡聚糖是葡聚糖分子中部分单体葡萄糖(α-D葡萄糖)带有活化醛基或酰肼，分子量40kD的葡聚糖中约有1/4的单体被活化带有活性基团。当活性基团为醛基时，可以与寡核苷酸探针的末端修饰的氨基反应形成共价连接，同时醛基基团也与芯片表面的氨基反应并形成共价连接，同时通过还原剂将不稳定的Shiff′s键还原成稳定的共价键，再将游离的醛基基团用硼氢化钠还原或用阻断剂将醛基阻断。当活性基团为酰肼时，由于酰肼可以直接与DNA分子中胞嘧啶碱基环中的酮基反应并形成共价连接，因此用于作探针的DNA不需要进行标记或其他处理，但是由于标记效率的问题，DNA链的长度不能少于40个碱基，因而不太适合于寡核苷酸探针的固定。当酰肼活化的葡聚糖与DNA中胞嘧啶反应时，酰肼也与玻片上的醛基基团反应形成共价连接，于是可以形成高分子的网络探针阵列，并固定于玻片表面。已形成的共价键可以被还原剂还原成稳定的连接，为被连接的游离活性基团可以被硼氢化钠还原或被封闭。

通过高分子聚合物形成的立体阵列，具有较好的空间活动度和可近性，与液体中的DNA接触的机会大增，同时由于空间位阻减小，杂交效率也会显著增加。3.靶基因组DNA的快速简便光敏化学标记

DNA的抽提、纯化、扩增、标记和杂交等操作一直是DNA检测费时最长的步骤，传统的DNA杂交检测费时一般需要2天。本发明采用DNA抽提、DNA酶水解或超声破碎、铂—荧光素标记直接进行杂交检测，或psoralen-生物素标记和胶体金或酶反应进行非荧光检测。传统酚氯仿抽提的基因组DNA，进行适当DNA酶I水解，是将DNA链的长度控制在50～100bp以下，加热变性后直接进行标记和检测。

直接标记方法有两种。一种是铂—荧光素的标记，铂原子可以直接与DNA分子中的鸟嘌呤和腺嘌呤共价结合，同时由于标记是在85℃高温条件下标记，在杂交温度较低时，游离的铂—荧光素化合物较少与探针DNA进行反应，因此可以免去游离荧光素的分离的步骤，缩短时间。另一种方法是psoralen—生物素或ASA—生物素的光化学标记，psoralen和ASA基团具有与DNA分子中的嘧啶环反应，生成共价键，这种反应也较少受到反应体系中存在的物质如蛋白质、氨基小分子物质等的影响，因此也不需要DNA有很高的纯度，这将简化DNA的抽提和纯化过程，psoralen的标记反应需要在365nm的长紫外照射下才能与DNA交联，因此标记的DNA一般也不需要进行游离物质的去除，就可以直接用于层析杂交检测，检测试剂选用相应的亲和素包被的胶体金和银还原加强技术。虽然不经纯化的标记DNA对杂交的背景有一定的加深，但可以使操作简便，利于检测技术的推广。4.高温杂交检测

选用PNA探针或戊糖修饰的RNA探针，其目的是利用这种探针的高亲和性，实行高温杂交，从而避免被检测DNA双链之间的复性。为了避免杂交时靶DNA双螺旋复性以及靶DNA本身所形成的二级结构对靶DNA与探针DNA复性的影响，采用高温杂交技术，以保持靶DNA的变性状态和DNA二级结构的变性状态，同时又不影响靶DNA与探针的结合。15个碱基的PNA/DNA杂交体的Tm值比天然DNA/DNA的Tm值高出15℃，因此可以保持靶DNA处于变性的温度范围，同时由于PNA探针或戊糖环2位修饰的RNA探针与DNA具有较高的亲和力，在靶DNA变性的温度仍然可以与靶DNA复性形成稳定的双螺旋结构。另一方面，由于PNA和RNA探针的高亲和力，可以与双股的DNA复性形成三股的DNA复合体，并具有识别特异DNA序列的作用。

检测时，应用适宜浓度的DNA酶I或超声破碎技术将靶DNA酶解成50～100bp长度的DNA片断，然后进行DNA的光敏化学生物素标记，标记后的DNA可以直接与芯片高温杂交(避光)，再经过适宜盐浓度的缓冲液洗去游离未杂交的靶DNA和游离生物素，再与亲和素—FITC或亲和素包被的胶体金溶液孵育，最后观察在探针位点的荧光或胶体金颗粒的量，判断杂交信号的强弱。

本发明与现有的检测技术相比，本发明具有以下优点：

本发明针对现有寡核苷酸DNA芯片检测的不足，对DNA寡核苷酸探针的设计进行重大改进，利用肽核酸(PNA)或核糖骨架修饰过的RNA作为探针并对探针进行化学修饰，使其对DNA的亲和力显著增加，并耐RNA酶，可以在比正常杂交温度高15度以上的温度下进行杂交，本发明的优点主要在于：1.  PNA探针和化学修饰RNA探针，具有高的亲和力、耐酸、抗核酸酶的降解和芯

片的重复使用性；

a)高亲和力  双股DNA形成依赖于温度、离子强度、酸碱度、DNA结构的复

  杂性等因素，当DNA的双链具有高亲和力时，可以在较高的温度、较低的

  离子强度等条件形成DNA双链结构，因此可以通过提高DNA探针的亲和力

  提高杂交温度，或者通过降低DNA杂交时的离子强度，或者通过增加杂交

  体系中的甲酰铵的比例，减少DNA自身双链的复性，提高靶DNA与芯片探

  针的杂交效率；

b)耐酸碱性  芯片表面固定的探针要求具有较高的稳定性，包括对温度的稳

  定性、对酸碱度的稳定性等，这样既可使芯片保存变得容易，同时也增加

  了DNA杂交条件优化的范围；

c)抗核酸酶  DNA和RNA被相应的水解酶水解一直是核酸产品面临的课题，

  本发明对固定探针进行末端化学修饰，使探针具有抗核酸酶的作用，另一

  方面，PNA为人工合成的信息分子，还没有发现能水解PNA的核酸酶类，

  因此具有很高的抗核酸特性；

d)稳定性高  由于对固定探针进行了化学修饰，不易被酶学水解，稳定性

  提高，从而使芯片的重复使用成为可能。2.  采用高温杂交，可以避免双股DNA的复性和DNA二级结构的形成以及对杂交所

带来的影响，提高探针与靶DNA复性的效率；3.  PNA探针或修饰过的RNA探针可以直接与天然双股DNA杂交形成三股结构，避

免了杂交双股DNA复性对杂交效率的影响；4.  本发明免去PCR的扩增、标记操作，使DNA标记更加简便，甚至可以免除DNA

的纯化过程；本发明采用直接标记技术代替PCR标记过程，使检测标记更简便

快速、容易操作、成本更低；靶DNA的标记、纯化更加简便，操作时间也大为

缩短；5.  由于修饰RNA探针具有高亲和力的特性，从而是高温杂交成为可能，检测杂交

的温度比正常杂交温度高10度以上，从而可以避免双链DNA的自身配对复性，

提高杂交效率；6.  本发明去除了PCR对特定DNA片断扩增的制约，从而使芯片上探针的固定数目

不受PCR操作的限制，可以将所有遗传性疾病的基因的检测制作在一张芯片之

上；7.  由于采用了高分子聚合物作为探针固定的支撑物，能使探针固定立体化，增加

了靶DNA与探针碰撞的机会，提高杂交效率；本发明主要的技术制作及操作玻片寡核苷酸芯片高温杂交检测技术方法包括以下步骤：

a.使用PNA探针或戊糖环2′修饰的RNA探针作为寡核苷酸芯片阵列探针；

b.探针5′端氨基修饰，并通过高分子立体固定技术，固定探针；

c.靶组织DNA抽提和纯化；

d.酶学破碎或超声破碎DNA成50～100bp片段；

e.靶DNA光化学生物标记或直接铂—荧光素DNA标记；

f.微型离心分离柱DNA纯化去除游离标记物质(可选项操作)；

g.将DNA加到芯片上，65℃杂交1～10小时；

h.芯片荧光扫描，图象分析。以下详细描述玻片芯片检测中所使用的技术。1.  基因突变位点的收集或SNP探针的设计

1)基因点突变探针的设计

检测基因突变的芯片产品，所固定的探针多选择突变位点上游6-8个碱基和下游6-8个碱基，探针长度一般多选择15个碱基左右，例如β-地中海贫血的珠蛋白基因的突变约有40个常见突变位点，加上野生性对应的突变位点，约有80个检测探针，加上阴性、阳性对照探针，用于β-地中海贫血的诊断芯片包含有100个检测寡核苷酸探针。

2)SNP探针的设计

SNP探针设计规则与基因点突变的检测探针设计相似，根据现有资料，收集相应研究领域的SNP探针资料，如高血压病相关的SNP资料，或与司法鉴定相关的SNP资料，探针的长度，一般也是以15个碱基为最佳，变异的碱基位于探针的中间位置，这样可提供最为敏感的分辨效果。2.  PNA探针和2′-修饰的RNA寡核苷酸探针的设计、合成

1)PNA探针的合成

PNA的合成主要是根据Fmoc固相肽合成技术，仪器可选用Ecosyn D-3000 DNA合成仪(Eppendorf Biotronik Maintal)或Expedite 8909核酸合成系统(AppliedBiosystem)，使用这些仪器合成，操作非常简单，只要在将试剂加到机器之前将溶剂加到PNA单体和激活体即可。在商用系统中，这些试剂均包装成试剂盒，按照操作说明操作即可。DNA合成与PNA合成的唯一区别是PNA合成需要稍长的循环时间(16.5分钟)PNA合成后的分离与通用肽的分离一样。

PNA单体使用fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)保护N末端单体的氨基基团，benzhydryloxycarbonyl(Bhoc)保护A、C、G单体的氨基基团。PNA单体的合成是HATU偶联剂偶联在Fmoc-XAL-PEG聚苯乙烯树脂上，这样可以增加得率。以下是合成用到的试剂：激活剂溶液：0.3M HATU(DMF<二甲基甲酰胺>配制)；0.3M NEM(DMF配制)；Fmoc-Lys(Boc)-OH：0.3M(DMF配制)Fmoc清除液：20％piperidine(DMF配制)；Fmoc-Aeg(T)-OH：0.3M(DMF配制)；Fmoc-Aeg(A.sup.Mmt)-OH：0.3M(DMF配制)；Fmoc-Aeg(C.sup.Mmt)-OH：0.3M(DMF配制)；Fmoc-Aeg(G.sup.Mmt)-OH：0.3M(DMF配制)。

Fmoc用piperidine灭活后，分别用DMF、激活溶液洗，然后将Fmoc衍生物和碱基加到去保护的反应体系中进行偶联反应，偶联时间16.5～20分钟。偶联反应完成后，反应产物—树脂结合物干燥，最后将反应产物从树脂上解离下来。

PNA可由生物服务公司代为合成。

2)戊糖环修饰的RNA寡核苷酸探针

2′-O-氧甲基(2′-O-methyl)、2′-氟(2′-fluoro)和2′-氨基(2′-amine)RNA寡核苷酸探针的合成有两种方式，都具有相似的效果。

采用预先合成的方法，将核糖环2′甲氧基修饰、或2′-氟或氨基修饰的核糖核苷合成寡核苷酸探针，该探针带有末端活性基团标记(如氨基标记、羧基标记、巯基标记)，然后件这些寡核苷酸探针共价连接到芯片表面。寡核苷酸的合成、标记和纯化过程可采用标准的合成方法。2′-O-methyl RNA合成时的去保护、分离和处理都与正常RNA合成一样，唯一的区别在于在固相合成时偶联时间(延伸时间)稍长而已。

固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分DNA自动合成仪所使用的方法，合成的原理及步骤：首先将欲合成的寡核苷酸链3′末端核苷(N1)以其3′OH通过1个长的烷基臂与固相载体(不溶性的高分子物质，常用的有硅胶S、交联的聚苯乙烯、特殊孔径的多孔玻璃珠等)耦联、N1的5′OH以二甲氧基三苯甲基(DMTr)保护。然后从N1开始逐步地接长寡核苷酸酸链。1个合成循环包括4步。第一步为去保护，以苯磺酸(或三氯醋酸)处理带有保护基的核苷，去除5′末端的DMTr，暴露出5′OH，经洗涤后进行下步反应。第二步为耦联反应；加入经四唑作用(激活)的核苷N2，使之与核苷N1上的5′OH起耦联反应，乙腈洗涤。第三步为加帽反应；加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未参加反应的寡核苷酸链(2％以下)乙酰下，乙酰化的链不参加下一步反应，如此有利于纯化所需全长的DNA片段。第四步为氧化反应；加入经四唑作用(激活)的核苷N2，使之与核苷N1上的5′OH起耦联反应，乙腈洗涤。第三步为加帽反应；加入醋酐及二甲基氨基吡啶，使未参加反应的寡核苷酸链(2％以下)乙酰化，乙酰化的链不参加下一步反应，如此有利于纯化所需全长的DNA片段。第四步为氧化反应，加入碘，使三价的亚磷酸转变为更稳定的五价磷酸。上述循环完成之后进行第二个合成循环。每经历一轮循环，接长1个核苷酸。接长的链始终被固定在不溶的固相载体上，过量的未反应物或分解物则通过过滤或洗涤除去。当整个链达到预定的长度后，从固相载体上切下，脱去保护基(氨解)，并经过分离纯化得到所需要析最后产物。

与DNA化学合成有所区别的是，DNA应用A、T、C、G四种脱氧核苷，而合成2′修饰的RNA的合成原料是核糖2′位修饰的A、U、C、G四种核苷衍生物。

至今，已有不少商家提供2′修饰的RNA寡核苷酸探针合成服务，如美国的TriLink公司。3.  玻片芯片立体探针阵列的制作

PNA探针或2′-O-methyl修饰的RNA寡核苷酸探针合成以后，应用芯片制作三维机器人控制系统，将PNA探针或RNA探针传递到芯片表面指定的位置。所使用的探针数量可依照芯片的需要而定，从几个到几千个探针不等，每个芯片均设一定数量的阳性、阴性和空白对照系统，主要选用各种看家(house keeping)基因作为阳性对照，选择随机序列探针或植物DNA序列探针作为阴性对照系统。每个探针的点样量可根据所采用的点样机械而定，一般10pl到0.1μl不等，例如点样于膜，所需样本量由于点较大的缘故可以多一些。

这里把DNA探针通过三维机器人送到芯片指定的位置的过程称为点样，点样时，将末端氨基标记的寡核苷酸探针1μl(100μM)与1μl醛基活化的葡聚糖(50μg/ml)(Aldehyde-Activated Dextran，PIERCE，Cat#20890)、0.5μl 5mg/ml氰硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)溶液，混合，进行点样，点样量的多少取决于点样机械，点样所用玻片为氨基修饰的玻片(silanated slides，SIGMA)，点样完成后，将玻片置于室温下过夜(＞12小时)，然后将玻片置于1％的硼氢化钠溶液(10mM PBS新鲜配制)以消除游离未被结合的醛基基团。含有探针的芯片置于干燥器内，4℃保存。另一种方法是，将氨基修饰的玻片(silanated slides，SIGMA)先用醛基活化的葡聚糖(50μg/ml)(Aldehyde-Activated Dextran，PIERCE，Cat#20890)、0.5μl 5mg/ml氰硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)溶液处理，使玻片表面预先构成高分子立体网络，再氨基修饰的寡核苷酸探针的点样，探针可以共价结合于高分子葡聚糖上，其为止与玻片表面有较远的距离，可以加快被检DNA分子与固定探针的接触和杂交。4.  基因组DNA的常规分离、纯化

对于培养细胞或经过分离的组织细胞的DNA抽提，一般采用匀浆法破碎、酚氯仿抽提获得100～200kb的DNA片断。如培养细胞HL-60白血病细胞的DNA抽提，可以先离心(1500g 10分钟)收集细胞，将细胞悬浮在冷PBS缓冲液或生理盐水中，漂洗一次，离心收集细胞，将细胞悬浮于DNA抽提缓冲液(10mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，0.1mmol/L EDTA，20μg/ml胰RNA酶，0.5％SDS)10～15ml中，37℃保温1小时，加入20mg/ml的蛋白酶K至终浓度100μg/ml，边加边用玻璃棒轻轻搅拌，使溶液呈粘稠状，50℃保温3小时使之裂解细胞水解蛋白。将反应液冷却，加入等体积已饱和的酚溶液，反复转动离心管直至水相与酚混匀呈乳状液，离心(5000g，15分钟)，将上清水相移至另一试管，加入0.2倍体积的10mmol/L乙酸铵和2倍体积的95％乙醇，室温下慢慢摇动混匀，离心沉淀出DNA。

基因组DNA的抽提也可以采用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提组织DNA，去除样品中的蛋白质，然后再用氯仿去除核酸制品中的残留的痕量酚。也可以采用商用DNA抽提试剂盒，如Qiagen、Life Technology等公司DNA抽提试剂盒均能胜任。常用DNA提取方法的主要分为：将组织切碎称重；溶于TE提取液(500mmol/L；20mmol/L EDTA Tris；10mmol/L NaCl；1％SDS；500μg/ml蛋白酶K；pH8.0)高速混悬2～3分钟，于48℃放置24h。再次混悬组织，加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml，SDS至2％，孵育40小时；用等体积酚—氯仿溶液抽提3次；2.5倍体积乙醇沉淀DNA；-70℃放置2～4小时；9000×g离心1小时；沉淀物用70％乙醇洗1次；干燥，TE缓冲液(pH7.2)溶解。样品DNA抽提可以用经典的苯酚/氯仿抽提方法，也可以用市场上的基因组DNA抽提试剂盒(如GenomicDNA Purification Kit，Promega，Cat#A1120；QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGEN，Cat#51104)。5.  DNA分子破碎

1)酶学破碎

标记前要进行相应的限制性内切酶消化。一般可采用四核苷酸的限制性内切酶消化基因组DNA，使DNA的长度不大于200bp；选用四核苷酶切位点的限制性内切酶，如Alul、NlaIII、HaeIII的不同组合等，一般反应步骤为：调整抽提的DNA盐浓度为1～3mol/L，加入所用内切酶，37℃反应1小时，终止反应，进行生物素的直接标记。酶切主要将DNA片断的长度控制在50～150bp之间。也可以采用超声波振荡断裂DNA分子。

DNA酶I消化也可产生50～150bp长度的DNA片断。消化时，将1μg DNA(10μl的10mM TE缓冲液溶解)加2.5μl 10×DNA酶I反应缓冲液、3μl的0.2ng/μl DNA酶I母液和9.5μl无核酸酶的水，37℃反应10分钟，冰浴停止反应。

2)超声波破碎

由于DNA分子较大，不能直接与芯片上寡核苷酸探针杂交，必需将DNA分子破碎，最佳片断为50bp，然后通过光化学方法将光敏生物素标记到DNA分子上，标记方法和标记试剂的选择至关重要，需选择不受变性剂干扰和氨基物质干扰的标记物质。

将上述DNA溶液，加等量6×SSC溶液，于冰浴中经超声破碎(100w/10s×6，间隔30秒)后，具体超声破碎时间可经过调节不同功率和不同破碎时间，使基因组DNA的破碎达到50bp左右即可(可通过电泳验证)。DNA破碎后，85℃加热并持续20分钟，其目的是降解混杂的RNA，同时使DNA变性。最后将变性后的DNA溶液试管置于冰水中以抑制DNA的复性。6.  DNA标记

1)DNA铂—荧光素直接标记法：

铂—荧光素物质包括有platium Alexa Fluor 488，Platium ethylenediamine-ε-(6-fluorescein-5-carboxamido)hexanolyl)-L-lysine，Platium-cascadeblue cadaverine nitrate，platium ethylenediamine-dansyl lysine nitrate，platium ethylenediamine-5-aminoeosin，platium ethylenediamine-IRD-40-nitrate等多种荧光物质。由于铂荧光素本身疏水的缘故，标记的DNA长度大于1000bp的DNA时，标记产物可能会出现凝集，影响杂交效果。因此标记前应线将DNA进行酶切割，一般进行DNA酶I的消化即可。

将DNA酶I消化获得的DNA产物(1μg DNA)溶液，加1/10容积的3M pH5.2的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，-70℃30分钟，12000g离心15分钟沉淀DNA，然后溶于无氨离子的10mM PBS，95℃变性5分钟，并随即置于冰水中，用于标记。标记时，加入5μl铂—荧光素物质(1mg/ml)到DNA溶液中，80℃水浴15分钟，将标记试管置于冰水中停止标记反应，并进行微型离心凝胶柱过滤去除游离非标记荧光物质，管底液体可为已被标记的DNA，可经过离子强度调整后用于杂交反应。

2)DNA的psoralen—生物素光化学直接标记法

psoralen-生物素包括psoralen—生物素及psoralen分子与生物素分子之间有不同长度连接臂的化合物，如psoralen-PEO-生物素(Psoralen-PEO-Biotin，Pierce，Cat#29986)，中间有一个长36.86的连接臂，可以减少生物素分子与Avidin等亲和素结合的空间位阻。光反应性的psoralen基团具有比苯-叠氮基团更强的共价交联作用。

标记时将DNA或RNA用TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 7.4)调节到1mg/ml，95℃变性5分钟，并随即置于冰水中，加入20mM的psoralen-PEO-生物素到DNA溶液中，使psoralen-PEO-生物素的最终浓度约为200μM，混合，将试管盖打开，置于20W 365长波长的紫外等下照射约15～30分钟，照射30分钟的psoralen掺入率约为20％。生物素化的DNA加入0.2M醋酸钾和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用少量的杂交缓冲液稀释，用于杂交。

3)基因组DNA光敏生物素直接标记法

光敏生物素直接标记：光敏生物素(PhotoBiotin，SIGMA Cat#A1935)是光敏化合物，化合物中间是一条多碳链连接臂，其一端与生物素相连，另一端与一个芳香叠氮基团相连。在可见强光的照射下，芳香叠氮基团中的N₃基团光解放出氮气N₂，生成活泼的N基团，后者易与DNA或RNA中的伯胺基团放生结合反应，从而完成共价标记。此反应主要发生在腺嘌呤上。在待标记核酸与两倍过量的光敏生物素的条件下，大约有1/50的碱基被标记，因此被标记的DNA长度不应小于100bp。

标记时，在一试管中加入核酸片断1～25μg(0.5～1.0μg/μl)，2～50μg的光敏生物素，补水至50μl，将标记管放入冰裕槽中，置于卤钨灯下10cm，强光照射25分钟；加100μl 100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，加100μl仲丁醇，抽提2次，去上层仲丁醇，在剩余的水溶液中加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠，-20℃放置，离心沉淀，DNA，将标记的DNA溶于一定的杂交溶液中。标记完成后，采用凝胶离心过滤法去除游离的游离光敏生物素，核酸部分可以直接用于杂交检测。1.  芯片杂交过程

由寡核苷酸探针组成的DNA阵列，为了能使寡核苷酸阵列可以鉴别DNA序列中一个碱基的差别，寡核苷酸探针的长度受到一定限制，一般认为15个碱基长度的探针最适合于鉴别单个碱基的差别。然而由于寡核苷酸探针碱基组成的不同，使得探针的变性、复性以及Tm值都不一致，使杂交信号难以得到真实的表现。因此寡核苷酸阵列的杂交的条件与方法与通常的Southern blot技术有很大的不同。在杂交缓冲液中将引入“等离子稳定”试剂，即在杂交体系中加入2.3M～3M的氯化四甲胺(tetremethylammonium chloride，TMACl)，氯化四甲胺可选择性的与A∶T对结合，并使稳定性升高，Tm值升高，使A∶T对的解链温度趋同于G∶C对，达到寡核苷酸探针的Tm值只与探针长度有关而其碱基组成无关。另一种Betaine(N，N，N，-trimethylglycine)也具有很好的稳定作用。

杂交缓冲液的组成：

a)3M TMACl，50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，0.1％SDS；

b)4.5M Betaine，0.5M LiCl，pH8.0；

玻片芯片的杂交温度为20～70℃，通常37～65℃。杂交时将芯片封好浸于适宜的温度的水中孵育2～14小时。然后将玻片在含有0.2％SDS的1×SSC室温洗5分钟去除未杂交的DNA，然后再在含有0.2％SDS的0.1×SSC溶液中洗5分钟，最后用0.1×SSC溶液洗去残余的SDS。玻片干燥后进行激光扫描检测。2.  杂交后处理

显色和分析测定方法主要为荧光法，主要的检测手段是芯片专用扫描仪或激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5-35倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。3.  图象分析

由于正常的Watson-Crick配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性。所以，如果探针与样品分子的部分位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。当然，由于检测原理及目的不同，样品及数据的处理也自然有所不同，甚至由于每种方法的优缺点各异以至于分析结果不尽一致。以下结合实施例阐述本发明的操作

图1.DNA、PNA和2′-修饰的核糖核苷酸探针结构图2. 2′-修饰的寡核苷酸，其Tm值明显高于正常DNA

实施例1：高密度老年性痴呆预测芯片(SNP检测芯片)1.老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)是一种于老年发作并呈进行性的痴呆症，伴有大脑组织弥散性的萎缩，最常见的形式就是痴呆，但只有不到5％的老年痴呆家族会在65岁之前发病。老年性痴呆的诊断主要依赖于组织学上有淀粉样斑块和神经纤维的缠结，到目前为止还没有确认AD的实验室诊断。有三个基因与老年性痴呆相关，即β-淀粉样A4蛋白、早老性蛋白I和早老性蛋白II。这些基因的突变可使发生老年性痴呆的风险上升，有老年性痴呆的家族，其后代发生老年性痴呆的机率是50％。因此通过检测这三个基因的突变的情况可以预测老年性痴呆的发生的机会。2.与老年性痴呆相关的基因表1.老年性痴呆的分子遗传及受累的蛋白分子疾病名称    基因代号      染色体定位       正常基因产物AD3         PSEN1         14q24            早老蛋白I(Presenilin 1)AD1         APP           21q21.3-q22      AD淀粉样A4蛋白(amyloid A4 protein)AD4         PSEN2         1q31-q42         早老蛋白II(Presenilin 2)3.探针设计

当探针位点决定以后，选取突变位点上游和下游的个7个碱基范围的序列作为探针序列，再根据探针的熔点温度适当调整探针的长度。探针采用合成法，将2′修饰过的核糖核苷掺入到探针中去，在探针的一端(多在5′端)标记活性基团，如5′-C6-氨基标记。表2～4显示与老年性痴呆相关的三个基因突变与多态性的的突变探针序列(所有碱基均为PNA探针或2′位修饰过的寡核糖核苷探针)：表2.早老蛋白I基因突变及探针序列

探针编号	位置	密码子	氨基酸	正常序列探针	突变序列探针
						CM981649	79	GCC-GTC	Ala-Val	TAT GGC GCC AAG CAT	TAT GGC GTC AAG CAT
CM951065	82	tGTG-CTG	Val-Leu	AAG CAT GTG ATC ATG	AAG CAT CTG ATC ATG
						CM961198	96	gGTC-TTC	Val-Phe	GTG GTG GTC GTG GCT	GTG GTG TTC GTG GCT
CM000202	105	TTTt-TTG	Phe-Leu	GTC AGC TTT TAT ACC	GTC AGC TTG TAT ACC
						CM981650	115	TAT-TGT	Tyr-Cys	CTA ATC TAT ACC CCA	CTA ATC TGT ACC CCA
CM951066	115	cTAT-CAT	Tyr-His		CTA ATC CAT ACC CCA
						CM992204	116	ACC-AAC	Thr-Asn	ATC TAT ACC CCA TTC	ATC TAT AAC CCA TTC
CM981651	117	CCA-CTA	Pro-Leu	TAT ACC CCA TTC ACA	TAT ACC CTA TTC ACA
						CM981652	120	GAAg-GAC	Glu-Asp	TTC ACA GAA GAT ACC	TTC ACA GAC GAT ACC
CM961199	120	GAAg-GAT	Glu-Asp		TTC ACA GAT GAT ACC
						CM961200	120	aGAA-AAA	Glu-Lys		TTC ACA AAA GAT ACC
CM993458	123	cGAG-AAG	Glu-Lys	GAT ACC GAG ACT GTG	GAT ACC AAG ACT GTG
						CM971251	135	gAAT-GAT	Asn-Asp	ATT CTG AAT GCT GCC	ATT CTG GAT GCT GCC
CM961201	139	ATGa-ATA	Met-Ile	GCC ATC ATG ATC AGT	GCC ATC ATA ATC AGT
						CM981653	139	ATG-AAG	Met-Lys		GCC ATC AAG ATC AGT
CM951067	139	ATG-ACG	Met-Thr		GCC ATC ACG ATC AGT
						CM951068	139	cATG-GTG	Met-Val		GCC ATC GTG ATC AGT
CM961202	143	cATT-TTT	Ile-Phe	AGT GTC ATT GTT GTC	AGT GTC TTT GTT GTC
						CM951069	143	ATT-ACT	Ile-Thr		AGT GTC ACT GTT GTC
CM961203	146	ATGa-ATA	Met-Ile	GTT GTC ATG ACT ATC	GTT GTC ATG ACT ATC
						CM981654	146	ATGa-ATC	Met-Ile		GTT GTC ATC ACT ATC
CM951071	146	cATG-TTG	Met-Leu		GTT GTC TTG ACT ATC
						CM951070	146	cATG-GTG	Met-Val		GTT GTC GTG ACT ATC
CM991073	147	ACT-ATT	Thr-Ile	GTC ATG ACT ATC CTC	GTC ATG ATT ATC CTC
						CM951072	163	CAT-CGT	His-Arg	GTC ATC CAT GCC TGG	GTC ATC CGT GCC TGG
CM9510073	163	cCAT-TAT	His-Tyr		GTC ATC TAT GCC TGG
						CM991074	165	TGGc-TGC	Trp-Cys	CAT GCC TGG CTT ATT	CAT GCC TGC CTT ATT
CM981655	169	TCA-TTA	Ser-Leu	ATT ATA TCA TCT CTA	ATT ATA TTA TCT CTA

CM981656	171	CTA-CCA	Leu-Pro	TCA TCT CTA TTG TTG	TCA TCT CCA TTG TTG
						CM991075	173	TTG-TGG	Leu-Trp	CTA TTG TTG CTG TTC	CTA TTG TGG CTG TTC
CM972856	184	GAAg-GAC	Glu-Asp	TTG GGG GAA GTG TTT	TTG GGG GAC GTG TTT
						CM991076	209	gGGA-AGA	Gly-Arg	GTG GTG GGA ATG ATT	GTG GTG AGA ATG ATT
CM981657	209	GGA-GTA	Gly-Val		GTG GTG GTA ATG ATT
						CM961204	213	ATT-ACT	Ile-Thr	ATT TCC ATT CAC TGG	ATT TCC ACT CAC TGG
CM992963	219	CTT-CCT	Leu-Pro	GGT CCA CTT CGA CTC	GGT CCA CCT CGA CTC
						CM951074	231	tGCC-ACC	Ala-Thr	ATT AGT GCC CTC ATG	ATT AGT ACC CTC ATG
CM981658	231	GCC-GTC	Ala-Val		ATT AGT GTC CTC ATG
						CM971252	233	ATG-ACG	Met-Thr	GCC CTC ATG GCC CTG	GCC CTC ACG GCC CTG
CM961205	235	CTG-CCG	Leu-Pro	ATG GCC CTG GTG TTT	ATG GCC CCG GTG TTT
						CM951075	246	GCG-GAG	Ala-Glu	TGG ACT GCG TGG CTC	TGG ACT GAG TGG CTC
CM961206	250	TTG-TCG	Leu-Ser	CTC ATC TTG GCT GTG	CTC ATC TCG GCT GTG
						CM951076	260	GCT-GTT	Ala-Val	TTA GTG GCT GTT TTG	TTA GTG GTT GTT TTG
CM971253	262	TTGt-TTC	Leu-Phe	GCT GTT TTG TGT CCG	GCT GTT TTC TGT CCG
						CM951077	263	gTGT-CGT	Cys-Arg	GTT TTG TGT CCG AAA	GTT TTG CGT CCG AAA
CM951078	264	CCG-CTG	Pro-Leu	TTG TGT CCG AAA GGT	TTG TGT CTG AAA GGT
						CM951079	267	tCCA-TCA	Pro-Ser	AAA GGT CCA CTT CGT	AAA GGT TCA CTT CGT
CM961207	269	tCGT-GGT	Arg-Gly	CCA CTT CGT ATG CTG	CCA CTT GGT ATG CTG
						CM971254	269	CGT-CAT	Arg-His		CCA CTT CAT ATG CTG
CM971255	278	AGA-ACA	Arg-Thr	CAG GAG AGA AAT GAA	CAG GAG ACA AAT GAA
						CM951080	280	GAA-GCA	Glu-Ala	AGA AAT GAA ACG CTT	AGA AAT GCA ACG CTT
CM951081	280	GAA-GGA	Glu-Gly		AGA AAT GGA ACG CTT
						CM981659	282	CTT-CGT	Leu-Arg	GAA ACG CTT TTT CCA	GAA ACG CGT TTT CCA
CM951082	285	GCT-GTT	Ala-Val	TTT CCA GCT CTC ATT	TTT CCA GTT CTC ATT
						CM951083	286	tCTC-GTC	Leu-Val	CCA GCT CTC ATT TAC	CCA GCT GTC ATT TAC
CM961208	289	TCC-TGC	Ser-Cys	ATT TAC TCC TCA ACA	ATT TAC TGC TCA ACA
						CM000421	318	GAA-GGA	Glu-Gly	AAT GCA GAA AGC ACA	AAT GCA GGA AGC ACA
CM971256	378	GGA-GAA	Gly-Glu	GAA AGG GGA GTA AAA	GAA AGG GAA GTA AAA
						CM951084	384	GGA-GCA	Gly-Ala	GGA TTG GGA GAT TTC	GGA TTG GCA GAT TTC
CM991077	390	AGT-ATT	Ser-Ile	TTC TAC AGT GTT CTG	TTC TAC ATT GTT CTG
						CM951085	392	tCTG-GTG	Leu-Val	AGT GTT CTG GTT GGT	AGT GTT GTG GTT GGT
CM000422	405	AAC-AGC	Asn-Ser	GAC TGG AAC ACA ACC	GAC TGG AGC ACA ACC
						CM993459	409	aGCC-ACC	Ala-Thr	ACC ATA GCC TGT TTC	ACC ATA ACC TGT TTC
CM951086	410	TGT-TAT	Cys-Tyr	ATA GCC TGT TTC GTA	ATA GCC TAT TTC GTA
						CM981660	426	tGCC-CCC	Ala-Pro	CTC CTT GCC ATT TTC	CTC CTT CCC ATT TTC
CM981661	436	CCA-CAA	Pro-Gln	GCT CTT CCA ATC TCC	GCT CTT CAA ATC TCC
						CM991078	436	tCCA-TCA	Pro-Ser		GCT CTT TCA ATC TCC
CR000233	-280			ATGGCCATCGCTTGTAT	ATGGCCATGGCTTGTAT
						CR000234	-2818			GGGTCTTCAGCACCAAA	GGGTCTTCGGCACCAAA

表3.β-淀粉样蛋白前体(A4)突变及探针序列探针编号     位置     密码子       氨基酸     正常探针序列        突变探针序列CM940077     665      GAGa-GAC     Glu-Asp    ACG GAG GAG ATC TCT ACG GAG GAC ATC TCTCM920065      692      GCA-GGA     Ala-Gly    TTC TTT GCA GAA GAT TTC TTT GGA GAA GATCM920067      693      aGAA-CAA    Glu-Gln    TTT GCA GAA GAT GTG TTT GCA CAA GAT GTGCM920066      693      GAA-GGA     Glu-Gly                        TTT GCA GGA GAT GTGCM930033      713      aGCG-ACG    Ala-Thr    GTC ATA GCG ACA GTG GTC ATA GCG ACA GTGCM920068      713      GCG-GTG     Ala-Val                        GTC ATA GTG ACA GTGCM990168      715      aGTG-ATG    Val-Met    GCG ACA GTG ATC GTC GCG ACA ATG ATC GTCCM970096      716      gATC-GTC    Ile-Val    ACA GTG ATC GTC ATC ACA GTG ATC GTC ATCCM910039      717      GTC-GGC     Val-Gly    GTG ATC GTC ATC ACC GTG ATC GGC ATC ACCCM910040      717      cGTC-ATC    Val-Ile                        GTG ATC ATC ATC ACCCM910041      717      cGTC-TTC    Val-Phe                        GTG ATC TTC ATC ACCCM000127      723      CTG-CCG     Leu-Pro    GTG ATG CTG AAG AAG GTG ATG CCG AAG AAG表4.早老蛋白II基因突变及探针探针编号    位置    密码子    氨基酸        正常探针序列           突变探针序列CM981662    62      CGC-CAC   Arg-His    CCT GAC CGC TAT GTC   CCT GAC CAC TAT GTCCM000203    122     cACG-CC   Thr-Pro    ATC TAC ACG CCA TTC   ATC TAC CCG CCA TTC

                GCM951087    141     AAC-ATC   Asn-Ile    GTG CTG AAC ACC CTC   GTG CTG ATC ACC CTCCM000204    239     ATGg-AT   Met-Ile    GCG CTC ATG GCC CTA   GCG CTC ATA GCC CTA

                ACM951088    239     cATG-GT   Met-Val                          GCG CTC GTG GCC CTA

                G4.探针点样

点样时，将末端氨基标记的寡核苷酸探针1μl(100μM)与1μl醛基活化的葡聚糖(50μg/ml)(Aldehyde-Activated Dextran，PIERCE，Cat#20890)、0.5ul50mg/ml氰硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)溶液，混合，进行点样，点样量的多少取决于点样机械，点样所用玻片为氨基修饰的玻片(silanated slides，SIGMA)，点样完成后，将玻片置于室温下过夜(＞12小时)，然后将玻片置于1％的硼氢化钠溶液(10mM PBS新鲜配制)以消除游离未被结合的醛基基团。含有探针的芯片置于干燥器内，4℃保存。5.DNA抽提与酶解

DNA抽提：可以采用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液抽提组织DNA，去除样品中的蛋白质，然后再用氯仿去除核酸制品中的残留的痕量酚。也可以采用商用DNA抽提试剂盒，如Qiagen、Life Technology等公司DNA抽提试剂盒均能胜任。。

DNA酶I消化可产生50～150bp长度的DNA片断。消化时，将1μg DNA(10μl的10mM TE缓冲液溶解)加2.5μl 10×DNA酶I反应缓冲液、3μl的0.2ng/μl DNA酶I母液和9.5μl无核酸酶的水，37℃反应10分钟，冰浴停止反应。6.DNA铂—荧光素直接标记法：

铂—荧光素物质如platium Alexa Fluor 488可以直接用于标记DNA片断。将DNA酶I消化获得的DNA产物(1μg DNA)溶液，加1/10容积的3M pH5.2的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，-70℃30分钟，12000g离心15分钟沉淀DNA，然后溶于无氨离子的10mM PBS，95℃变性5分钟，并随即置于冰水中，用于标记。标记时，加入5μl铂—荧光素物质(1mg/ml)到DNA溶液中，80℃水浴15分钟，将标记试管置于冰水中停止标记反应，并进行微型离心凝胶柱过滤去除游离非标记荧光物质，管底液体可为已被标记的DNA，可经过离子强度调整后用于杂交反应。7.芯片杂交和荧光检测

检测时，先将上述抽提并进行生物素标记的DNA样本用10μl含有0.2％的SDS的5×SSC溶解并稀释，将1μl亲和素连接的FITC，将到DNA溶液中，充分混匀，加到芯片的探针固定区域，盖上盖玻片，并用Hybri-Chamber(Sigma)封闭，置如65℃恒温水箱中(避光)，孵育过液。然后去除封闭和盖玻片，先用含有0.2％SDS的2×SSC洗片2次，在用1×SSC洗片一次，玻片低速(100rpm)离心1分钟去除残留液体，ScanArray 5000(GSI Company，USA)的488nm激光扫描获取芯片图象。8.数据处理

ScanArray 5000扫描所获取的图象，应用仪器本身所附带的图象分析软件，分析各个探针的信号强度，及与对照探针的比率。实施例2：地中海贫血珠蛋白基因突变位点(β地中海贫血)的检测1.β-地中海贫血基因突变的探针设计

基因突变可以导致遗传病，突变位点的检测有助于判断遗传病的严重程度和治疗方法。本发明可以将单基因的所有突变位点的探针(如β-地中海贫血的β-珠蛋白的突变的约有近200个，常见的有40-60个突变位点)按一定次序排列在芯片上，构成了不同突变位点的俘获位点。2.固定寡核苷酸探针的准备

当探针位点决定以后，选取突变位点上游和下游的个7个碱基范围的序列作为探针序列，再根据探针的熔点温度适当调整探针的长度。合成PNA探针。表内显示部分β-地中海贫血的突变探针序列(合成时以PNA代替)：位点                  野生型                       突变型β41-42(-TCTT)        CAG AGG T TC  TTT GAG T        CAG AGG   TTG   AGT CCT TIVS2-654(C-T)         GTT AAG G CA  ATA  GCA          GGT TAA   GG T AAT AGC AAβ17(A-T)             TGG GGC AAG   GTG  A            TGG GGC   TAG  GTG AA-28(A-G)              GGG CAT A AA  AGT  CAG          GGG CAT   A GA AGT CAGβ71-72(+A)           TGC CTT TAG    TGA  TGG          TGC CTT   T AA GTG ATGβ71-72(+T)                                            TGC CTT   T TA GTG ATGINS1-5(G-C)           CAG GTT G GT  ATC  AAG          CAG GTT   G CT ATC AAG-30(T-C)              CTG GGC A TA  AAA  GTC          CTG GGC   A CA AAA GTβ14-15(+G)           CCC TGT GGG    GCA  A            CCC TG G TGG   GGC AHBE²⁶(G-A)           GGT GGT GAG   GCC  C            GGT GGT   AAG  GCC CP(IVS1-1)             TGG GCA GGT    TGG  TAT          TGG GCA   GTT   TGG TATP(B27-28)             GTG AGG CCC    TGG  GCA          TGA GGC   CCC   TGG GCAP(IVS2-1)             CTT CAG GGT    GAG  TCT          CTT CAG   GAT   GAG TCTP(B1)                 GAC ACC ATG    GTG  CAC          GAC ACC   AGG   GTG CACP(B37)                TAC CCT TGG    ACC  CAG          TAC CCT   TAG   ACC CAGP(+40～43)            CAA CCT CAA    ACA  GAC          AGC AAC   CTC   AGA CACP(B14-15)             ACT GCC CTG    TGG  GGC AA       CTG CCC   TGG   TGG GGC AAP(CAP+1)              ATT GCT TAC    ATT  TGC          ATT GCT   TCC   ATT TGCP(B19)                AAG GTG AAC    GTG  GAT          AAG GTG   AGC   GTG GATP(B95+A)              CTG TGA CAA    GCT  GCA          TGT GAC   AAA   GCT GCAP(IVS2-5)             AGG GTG AGT    CTA  TGG          AGG GTG   ACT   CTA TGG3.探针点样    参见实例一步骤4。4.基因组DNA抽提与酶切    参见实例一步骤5。5.生物素直接标记基因组DNA

psoralen-PEO-生物素标记基因组DNA时，先将DNA或RNA用TE缓冲液(10mMTris，1mM EDTA，pH 7.4)调节到1mg/ml，95℃变性5分钟，并随即置于冰水中，加入20mM的psoralen-PEO-生物素(Psoralen-PEO-Biotin，Pierce，Cat#29986)到DNA溶液中，使psoralen-PEO-生物素的最终浓度约为200μM，混合，将试管盖打开，置于20W 365长波长的紫外等下照射约15～30分钟，照射30分钟的psoralen掺入率约为20％。生物素化的DNA加入0.2M醋酸钾和2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用少量的杂交缓冲液稀释，用于杂交。6.高温杂交反应

本实例在杂交缓冲液中引入“等离子稳定”试剂，即在杂交体系中加入2.3M～3M的氯化四甲胺(tetremethylammonium chloride，TMACl)，氯化四甲胺可选择性的与A∶T对结合，并使稳定性升高，Tm值升高，使A∶T对的解链温度趋同于G∶C对，达到寡核苷酸探针的Tm值只与探针长度有关而其碱基组成无关。杂交缓冲液的组成：3M TMACl，50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，0.1％SDS。

玻片芯片的杂交温度为20～65℃，通常37～45℃。杂交时将芯片封好浸于适宜的温度的水中孵育2～14小时。然后将玻片在含有0.2％SDS的1×SSC室温洗5分钟去除未杂交的DNA，然后再在含有0.2％SDS的0.1×SSC溶液中洗5分钟，最后用0.1×SSC溶液洗去残余的SDS。

生物素信号的显示，主要采用亲和素(streptavidin)连接的FITC(streptavidin-FITC)等荧光物质显示生物素信号，加10μl亲和素-FITC(1mg/ml)到芯片探针区域，盖上盖玻片，室温湿盒中放置15分钟，将玻片在含有0.2％SDS的1×SSC室温洗5分钟去除游离荧光素，最后用0.1×SSC溶液洗去残余的SDS。7.信号检测和分析  玻片干燥后进行激光扫描检测。参见实例一步骤7和8。

Claims (7)

1.本发明是一种涉及基因组DNA芯片高温杂交检测的技术，主要采用特殊高亲和力探针、探针立体固定、目标DNA的直接标记以及高温杂交等技术，提高杂交温度，减少溶液中DNA复性，同时缩短检测时间，本发明包括以下步骤：

a.以肽核酸(PNA)或核糖戊环2′位修饰的RNA寡核苷酸等高亲和力探针代替

  一般DNA寡核苷酸探针，并阵列于DNA芯片表面，以增加探针的变性温度

  (Tm)和对核酸酶的抗性；

b.探针立体固定技术，应用高分子交联物固定探针阵列，增加探针与目标DNA

  的空间可近性和探针固定密度；

c.目标DNA片断(50～100bp)的直接荧光标记或生物素标记，免去DNA分离、

  纯化等过程；

d.高温杂交和等离子杂交。

2.根据权利要求1所描述的高亲和力探针，其特征是使用肽核酸(PNA)探针和2′修饰的RNA探针，这两种探针具有与DNA的高亲和力；其中2′修饰的RNA探针包括2′-O-alkyl(2′氧烷基)RNA寡核苷酸、2′-O-methyl(2′氧甲基)RNA寡核苷酸、2′-O-Allyl(2′烯丙基)RNA寡核苷酸、2′-fluoro-U与2′-fluoro-C掺入的RNA寡核苷酸以及末端磷巯基(phosphorothioate)修饰的RNA。

3.根据权利要求1所描述的探针阵列，其特征是将所描述的PNA探针或修饰过的RNA探针按一定顺序排列在固体支撑物表面，固定支撑物可以是硅烷化的玻片、硅片、塑料片、硝酸纤维膜或尼龙膜等材料。

4.根据权利要求1所描述的探针立体固定，其特征是采用高分子交联剂固定寡核苷酸探针，这些高分子交联剂包括醛基活化的葡聚糖、肼活化的葡聚糖、NHS活化的分支PEG(聚乙二醇)、醛基活化的分支PEG以及其他类型基团活化的PEG；

5.根据权利要求1所描述的DNA直接标记方法，其特征是指基因组DNA不需经过PCR扩增，直接经过抽提、酶解、生物素光化学直接标记或铂—荧光素直接标记。

6.根据权利要求1所描述的DNA直接标记，其中的光化学标记物包括psoralen—PEO—生物素、叠氮类光敏生物素如Biotin-ASA、photobiotin等；铂—荧光素标记物是铂—荧光素类。

7.根据权利要求1所描述的高温杂交，其特征是PNA探针或2′修饰的RNA探针具有与DNA单链的高亲和性，可以在高温下杂交，可以提高杂交温度(比正常高5～15℃左右)，增加了杂交时靶DNA的布郎运动，因而可以增加靶DNA与芯片表面探针碰撞的机会，增加杂交效率，以避免DNA双螺旋结构复性对杂交效率的影响。

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