PT87903B

PT87903B - Processo para a preparacao de derivados de acidos nucleicos e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT87903B
Application number: PT87903A
Authority: PT
Inventors: Junichi Yano; Tadaaki Ohgi
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1987-07-03
Filing date: 1988-07-01
Publication date: 1995-03-01
Also published as: GB2207138B; SE8802480L; HUT48272A; CN1024556C; ZA884698B; FR2617403A1; SE8802480D0; GB8815262D0; IT8848147A0; HU202250B; DE3822406A1; AU1864488A; IL86884A0; GB2207138A; DK369088D0; DK369088A; CN1030424A; NL8801664A; KR890002226A; AT397658B

Description

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de derivados de ácidos nucleicos e a um processo para a preparação de composições farmacêuticas que contenham esses derivados.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Os ácidos nucleicos são constituídos por anéis de purina ou anéis de pirimidina e por ribose ou açúca res semelhantes ligados a esses anéis, estando os referidos elementos constituintes ligados uns aos outros através de uma ponte de fosfato formando uma estrutura em cadeia.

Entre os ácidos nucleicos, o RNA (polímero de ribonucleótidos) ê um composto macromolecular de estru tura em cadeia em que o açúcar é a ribose, encontrando-se as meN.

tades açúcar ligadas umas ãs outras através de uma ponte de fosfato pela ligação diêster. Nos ácidos nucleicos de cadeia dupla os anéis de purina ou de pirimidina das bases constituintes dos ácidos nucleicos (por exemplo inosina, adenosina, citidina, uridina, etc.) encontram-se ligados pela chamada ponte de hidrogénio complementar originando uma estereo-estrutura em hélice dupla. Uma vez que os ácidos nucleicos de estrutura em cadeia dupla desempenham importantes funções fisiológicas, têm por isso sido efectuados numerosos estudos sobre esses ácidos nucleicos (Biochemical and Biophysical Research Communications, 58, 1974, etc.).

De entre os ácidos nucleicos deste t_i po, um RNA sintético de cadeia dupla derivado do ãcido poliinosí_ nico. ãcido policitidílico serã designado, no que se segue, como derivado poli-I.poli-C; e o ãcido poliinosínico, que ê a unidci de constitucional desse derivado, serã designado por poli-I e o ácido policitidílico por poli-C.

Recentemente têm-se descoberto vários RNA's de cadeia dupla, naturais e sintéticos, com capacidade para induzir interferões (Field et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S. 58, 1004, 1967; Field et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S., 58, 2102, 1967; Field et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S., 61, 340, 1968; Tytell et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S., 58, 1719, 1967; Field et al, J. Gen. Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et al, Methods in Enzymology, 78, 291, 19 81).

Apresentam-se a seguir alguns exemplos típicos de derivados de ácidos nucleicos sintéticos conheci dos.

Derivados de ácidos nucleicos sintéticos para a indução de inter ferões (I) Complexos de homopolímero.homopolimero (polímeros de ãcido nucleico de cadeia dupla tendo poli-I.poli-C como estrutura mãe) (1) Derivados modificados na base;

Acido poliinosínico.ácido poli(5-bromocitidílico); Ãcido polinosínico.ãcido poli(2-tiocitidílico);

Acido poli(7-desazainosínico).ãcido polieítidílico; Acido poli(7-desazainosínico).ácido poli(5-bromocitidílico).

(2) Derivados modificados no açúcar:

Acido poli(2'-azidoinosínico).ácido policitidílico.

(3) Derivados modificados no ácido fosfórico:

Acido poliinosínico.ácido poli (citidina-5 '-tiofosfór_i co) .

(II) Copolímeros intermodifiçados:

Acido poli(adenílico-uridílico).

(III) Complexos de homopolímero.copolimero:

Acido poliinosínico.ácido poli(citidílico, uridílico); Acido poliinosínico.ácido poli(citidílico, 4-tiouridílico).

(IV) Complexos de ácido sintético/policatião:

Acido poliinosínico.ácido policitidílico.poli-L-lisina (no que se segue referido como poli-ICLC).

(V) Outros:

Ácido poliinosínico.ácido poli(5-vinilcitidílico).

Como mencionado anteriormente, têm sido referidos nos últimos anos vários tipos de RNA's de cadeia dupla, em particular derivados contendo poli-I.poli-C como unidade mãe. Existe uma teoria estabelecida para uma série de deriva dos de ácidos nucleicos que os classifica com base na relação entre a estrutura dos derivados e as suas funções (De Clercq et al, Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982).

Os presentes inventores descobriram, com base na classificação anteriormente mencionada, que quando o poli-I.poli-C e vários derivados seus tendo poli-I.poli-C como unidade mãe estão dimensionados de modo que a distribuição de tamanho molecular total desses derivados se situe na gama de 4S a 13S como valor da constante de sedimentação (ou de cerca de 50 a 10 000 como número de bases dos derivados), os derivados assim dimensionados possuem uma toxicidade extremamente baixa, possuin do ainda a actividade fisiológica que se referirá a seguir. Por esta razão se fizeram pedidos de patente no registo de patente japonês (pedido de patente japonês n° 62-167433 e outro pedido de patente com a prioridade do referido registo ηδ. 62-167433).

- 3 Para além do estudo acima mencionado, os presentes inventores investigaram ainda vários métodos para a preparação efectiva dos produtos acima mencionados. Em particular, investigou-se extensivamente um processo para o dimensionamento de derivados de ácidos nucleicos de modo a obter-se uma distribuição de tamanho molecular de 50 a 10 000 aproximadamente, como número de bases, e um processo para a preparação de ãci dos nucleicos polimericos de cadeia dupla a partir de dois tipos de ácidos nucleicos polimericos de cadeia simples. Em relação ao primeiro processo, a operação de restringir a distribuição de ta manho molecular dos derivados de ácidos nucleicos numa determina da gama será aqui designado por dimensionamento. Uma vez que o dimensionamento ê acompanhado pela conversão em substâncias de menos peso molecular de acordo com o método da presente invenção o dimensionamento inclui encurtamento de cadeia. O segundo pro cesso será designado por complementação.

O par de bases (que se designará por bp) que se usa geralmente como unidade para representar o tama nho molecular dos ácidos nucleicos pode usar-se para representar o tamanho molecular dos ãcidos nucleicos como o numero de bases que constituem o ácido nucleico (por exemplo, 10 bp significa um polímero de cadeia dupla com 10 bases). Na presente especificação, referem-se também outros ãcidos nucleicos polimericos para além dos de cadeia dupla, e por isso o termo número de bases será usado em vez do termo bp para representar o tamanho molecular dos ácidos nucleicos (por exemplo, um ácido nucleico polimêrico com um número de bases de 10 significa que o polímero tem 10 bases).

Quando se pretende determinar ou iden tificar o tamanho molecular de um ácido nucleico, utiliza-se geralmente o chamado valor da constante de sedimentação (valor S). Contudo, os presentes inventores conseguiram obter o número de bases dos ãcidos nucleicos acima mencionado, por meio de cromatc grafia líquida de alta pressão (HPLC) usando uma coluna de filtração de gel ou electroforese (abaixo mencionada detalhadamente), em que se empregam DNA's de cadeia dupla (fragmentos de DNA-fago M13) de tamanhos moleculares conhecidos, como marcado4

res, calculando-se o numero de bases do ãcido nucleico a identificar com base no numero do controle.

Até agora, o valor da constante de se dimentação (valor S) tem sido largamente usado para a representa ção do peso molecular de ácidos nucleicos macromoleculares. Os ácidos nucleicos macromoleculares disponíveis no mercado caracte rizam-se pelo respectivo valor S. Contudo, devido ao progresso das técnicas experimentais mais recentes, estabeleceu-se um meto do para determinar mais precisamente o peso molecular de substân cias macromoleculares, usando electroforese de gel, cromatografia de filtração de gel, cromatografia de permuta iõnica ou seme lhantes, tendo-se tornado possível a determinação do comprimento da cadeia dos ácidos nucleicos macromoleculares. Nesta situação, a relação entre a representação pelo valor S e a representação pelo comprimento de cadeia seria problemática. Em particular, uma vez que as moléculas de ácidos nucleicos têm os seus valores intrínsecos no caso da representação pelo valor S, nem sempre hã o problema de saber se a representação pelo valor S e a represen tação pelo comprimento da cadeia correspondem ou não exactamente uma à outra, como meio de representação do peso molecular dos ácidos nucleicos.

Deste modo, para a representação do peso molecular dos ácidos nucleicos poliméricos da presente invenção, emprega-se também a representação pelo valor S na descr_i ção da presente especificação de acordo com o modo convencional na área da química dos ácidos nucleicos. Contudo, uma vez que o valor S'\. e obtido por um método de medição do peso molecular de ácidos nucleicos macromoleculares na forma de uma massa molecular como um todo (ou na forma de um estado molecular da substância) , será também mencionada com o valor S a representação com base na medida do comprimento da cadeia da substância (o numero de bases aqui referido). Isto deve-se especialmente ao facto de o limite na distribuição de peso molecular ter de ser representa do mais exactamente na corporificação da presente invenção.

De acordo com os métodos convencionais de dimensionamento de poli-I.poli-C ede vários derivados seus tendo o referido poli-I.poli-C como unidade mãe, de modo a

obterem-se ácidos nucleicos polimericos de cadeia dupla, os ácidos nucleicos polimericos de cadeia dupla jã existentes decompõem-se em compostos de menor peso molecular ou, em alternativa, hidrolizam-se ácidos nucleicos de cadeia simples em compostos de menor peso molecular, antes de se proceder ã complementação. Con tudo, os métodos convencionais são inconvenientes para a obtenção dos produtos desejados em escala industrial, uma vez que o dimensionamento requer muito tempo e não se pode executar o processo rapidamente. Além disso, os métodos convencionais nem sempre são satisfatórios do ponto de vista do rendimento dos produtos.

Por outro lado, se for necessário pro ceder à sulfurização dos ácidos nucleicos poliméricos de cadeia simples após o dimensionamento, efectua-se essa operação com sul fureto de hidrogénio evaporando-se depois o sulfureto de hidrogé nio do solvente, de acordo com um método convencional. Em particular, evapora-se a piridina da solução reaccional, após sulfuri zação, por exemplo, com uma bomba de vácuo, podendo assim remover-se o sulfureto de hidrogénio da solução reaccional juntamente com a piridina por evaporação. De acordo com este método, con tudo, o sulfureto de hidrogénio é evaporado para o ar e, por isso, a realização deste método ã escala industrial ê desvantajo sa do ponto de vista da poluição ambiental. Além disso, de acordo com este método, a fase aquosa separada após evaporação da pi ridina, é sujeita a diálise contra ãgua corrente de modo a obter -se o produto desejado. Contudo, o processo necessita pelo menos de 3 dias, para a operação estar completa e o rendimento do produ to ê quando muito de cerca de 80%. Deste modo, o método convencional referido tem vários problemas técnicos do ponto de vista do rendimento dos produtos, dos custos de produção e do tempo de operação.

Também não se pode dizer que a própria técnica de dimensionamento não tenha problemas, do modo como tem sido efectuada.

Neste âmbito técnico,ê usual aquecer um ãcido nucleico polimêrico na presença de formaldeido de modo a hidrolisá-lo em compostos de menor peso molecular. Por este mé

todo convencional obtêm-se os produtos com o comprimento de cadeia desejado controlando adequadamente o tempo e a temperatura da reacção, e sujeitando depois a solução reaccional a diálise de modo a remover os compostos demasiado degradados com um tamanho molecular demasiado baixo. De acordo com o método convencional, contudo, formar-se-iam por dimensionamento compostos com uma distribuição de peso molecular muito diversificada, mesmo mantendo constantes as condições reaccionais, conforme as propriedades dos ácidos nucleicos poliméricos utilizados. Existe por isso o problema da reproductibilidade do método. É de considerar esta razão porque, como as matérias primas a utilizar no método se preparam por reacção enzimãtica, não se pode definir como constante o tamanho dessas matérias primas. Além disso, pela diálise que se aplica neste método, é impossível em princípio remover os ácidos nucleicos poliméricos com um comprimento de ca deira maior do que o dos produtos formados. Nestas condições, ê de toda a conveniência conseguir um método para ultrapassar os problemas dos métodos convencionais anteriormente referidos.

SUMÃRIO da invenção

Os autores da presente invenção fizeram investigações exaustivas para atingir os seguintes objectivos:

(1) Obtenção de ácidos nucleicos poliméricos de cadeia dupla, co mo produtos de um processo rápido.

(2) Rendimento elevado destes produtos.

(3) Mesmo quando o processo se leva a cabo em escala industrial, este não cause problemas de poluição ambiental ou outros.

(4) As operações em série do processo serem suficientemente quantitativas e reproductíveis.

Deste modo, conseguiram-se atingir na presente invenção os seguintes objectivos:

(1) Um processo para a preparação de derivados de ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo RNA como substância mãe, cuja distribuição de tamanho molecular total se situa na gama de

4S a 13S como valor da respectiva constante de sedimentação, dimensionando-se os ácidos nucleicos poliméricos antes de se

submeterem à complementação; e (2) um processo para a preparação de derivados de ácidos nucleicos de cadeia dupla, contendo RNA como substância mãe, em que as moléculas para a distribuição máxima na distribuição de tamanho molecular total dos derivados, tenham um numero de bases dentro da gama de 50 a 10 000, dimensionando-se os ácidos nucleicos polimêricos antes de se submeterem ã comple mentação.

Especificamente, o espírito da presen te invenção assenta nos seguintes pontos:

(1) Dimensionam-se os ácidos nucleicos polimêricos de cadeia sim pies antes de se proceder à complementação.

(2) Para o dimensionamento no passo (1) utiliza-se HPLC (cromato grafia líquida de alta pressão por filtração de gel) em vez da electroforese convencional, de modo a definir numericamen te a distribuição de tamanho molecular dos produtos. Deste modo, pode testar-se facilmente a flutuação da distribuição de tamanho molecular, de modo a obterem-se rapidamente os produtos que tenham a distribuição desejada de tamanho molecular na gama de 4S a 13S como valor da constante de sedimen tação (ou de 50 a 10 000 como número de bases). 0 processo rápido e exacto de selecção de produtos com o comprimento de cadeia desejado foi estabelecido na presente invenção.

(3) Após o dimensionamento, pode adicionar-se um álcool de baixo peso molecular à solução reaccional para isolar os produtos (nos métodos convencionais os produtos obtêm-se por diálise) A presente invenção estabeleceu um processo de isolamento ex tremamente simples para aumentar o rendimento dos produtos.

(4) Apõs o dimensionamento, se se pretender os ácidos nucleicos polimêricos de cadeia simples jã dimensionados, sulfurizam-se primeiro os polímeros com sulfureto de hidrogénio e depois, apõs adição de um álcool arílico ã solução reaccional de sulfurização, sujeita-se a solução resultante a uma centrifugação de modo a remover o sulfureto de hidrogénio (nos métodos convencionais evapora-se directamente o sulfureto de hidrogénio a partir do solvente. Deste‘modo, a presente invenção estabeleceu um método extremamente simples para remo8

ver o sulfureto de hidrogénio, aumentando o rendimento dos produtos.

(5) Como método de controle e de restrição da distribuição de pe so molecular dos ãcidos nucleicos poliméricos de cadeia simples dimensionados, utiliza-se uma resina de permuta iõnica (esta operação serã aqui referida como restrição de tamanho ) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Apresentar-se-ã em seguida uma descrição detalhada da invenção.

A complementação ê um processo de Li gar ãcidos nucleicos poliméricos de cadeia simples complementares de modo a obter um polímero de cadeia dupla, operação esta que pode ser naturalmente efectuada com facilidade. Se o dimensionamento se efectuar após a complementação, o grau de sulfurização poderã flutuar erroneamente tornando-se difícil obter o produto quantitativamente. Deste modo, os presentes inventores tentaram efectuar a operação de dimensionamento antes do passo de complementação obtendo, em consequência disso, um excelente resultado. 0 aspecto (1) acima mencionado tem uma relação estre_i ta com o aspecto (2). De acordo com os métodos convencionais para a determinação de um peso molecular por electroforese, é necessário pelo menos uma noite inteira para os passos de migração, revelação ou outros, sendo por isso difícil um processo rãpido. De acordo com a presente invenção, pelo contrário, usa-se HPLC de filtração de gel para a determinação do peso molecular dos de rivados de ãcidos nucleicos, em que se pode encurtar apreciavelmente o tempo de reacção antes da eluição dos derivados com uma distribuição de tamanho molecular desejada (isto ê, na gama de 4Ξ a 13S como valor da constante de sedimentação ou de 50 a 10 000 aproximadamente como número de bases).

De acordo com a presente invenção, interrompe-se a reacção após se detectar que o dimensionamento estã completo, adicionando-se então um álcool de baixo peso mole ' cular para se tratar posteriormente a solução reaccional. De en• tre estes álcoois, prefere-se em especial o etanol.

No caso da precipitação com etanol na presente invenção, por exemplo, o rendimento do L-poli-C (poli-C dimensionado)(o prefixo L- significa dimensionado, de aqui em diante) a partir de poli-C é de 93% e o rendimento do L-poli-I a partir de poli-I ê de 78%. Verifica-se assim que o ren dimento dos produtos dimensionados ê elevado.

Pelo contrário, segundo o método con vencional é necessário efectuar a diálise da solução reaccional num tubo apropriado. Neste caso, a recuperação é apenas de cerca de 60% e o rendimento de L-poli-I a partir de poli-I é de esperar ser apenas de 40%. Além disso, a operação de diálise requer cerca de 3 dias.

Contudo, segundo o método da precipi tação com etanol, de acordo com a presente invenção, em que se adiciona o etanol à solução reaccional numa quantidade de duas vezes a da solução reaccional e se agita de modo a precipitar o produto desejado, recolhendo-se depois o precipitado obtido por centrifugação, seguido de lavagem e secagem, o processo completa -se no decorrer de uma hora.

O aspecto (3) acima mencionado é o mais importante para o objectivo essencial da presente invenção.

A reacção de substituição dos átomos de azoto na metade de ãcido nucleico num ãcido nucleico poliméri co de cadeia simples dimensionado, por ãtomos de enxofre (por exemplo, substituição do grupo amino no grupo citidina do poli—C, por um grupo mercapto numa certa proporção) de modo a conver ter a referida metade ãcido nucleico num ãcido nucleico diferente (referindo-se aqui a reacção como sulfurização), utiliza-se frequentemente na síntese de copolimeros. Um outro aspecto carac teristico da presente invenção ê o de se adicionar um álcool arí lico aos ácidos nucleicos poliméricos de cadeia simples dimensio nados para o isolamento dos copolimeros sulfurizados. Este é o aspecto (4) acima mencionado.

Como álcool arilico para este fim po de utilizar-se, por exemplo, o fenol.

Por exemplo, adiciona-se em primeiro lugar metade da quantidade do fenol à solução reaccional conten10 —

do piridina, ãgua e sulfureto de hidrogénio misturados, agita-se e centrifuga-se, separando-se a camada aquosa completamente da camada de fenol e transferindo-se o agente corante da solução re accional bem como o produto secundário enxofre e análogos para a fase de fenol. Isola-se depois a fase aquosa e precipita-se o produto desejado por tratamento com uma solução salina aquosa e com um alccol. Isola-se por fim o produto assim precipitado, por centrifugação, e lava-se com um álcool para o purificar.

De acordo com o processo referido, quase todo o sulfureto de hidrogénio passa para a fase sobrenadante na forma de uma solução de sulfureto de hidrogénio podendo assim remover-se facilmente do produto da reacção.

Por exemplo, de acordo com o processo da presente invenção, usando fenol, pode completar-se a opera ção no decurso de uma hora, sendo o rendimento de quase 100%. Além disso, o produto pode isolar-se quantitativamente.

Os aspectos característicos (2) a (4) da presente invenção, acima mencionados, são importantes para o dimensionamento antes da complementação. Nomeadamente, eles são extremamente importantes para efectuar eficientemente o processo de dimensionamento antes da complementação.

O aspecto (5) acima mencionado é ainda uma outra característica da presente invenção, o qual se refere a um passo de definição de tamanho, levado a cabo entre os passos de dimensionamento e de complementação, como se explicará a seguir.

Neste passo utiliza-se uma resina de permuta iónica. Como exemplo da aplicação de uma resina de permu ta iónica a ãcidos nucleicos macromoleculares, refere-se a aplicação de DEAE-celulose, DEAE-Sephadex, DEAE-celulose benzoilada ou análogos ao t-RNA (BBA, 47, 193, 1961; BBRC, 10, 200, 1963; Biochem. , 6^, 3043 , 1967). No exemplo, contudo, a resina de permu ta iónica aplica-se apenas â purificação de ãcidos nucleicos de baixo peso molecular com um número de bases de atê cerca de 80.

Os presentes inventores investigaram exaustivamente o modo como a propriedade intrínseca da adsorbabi lidade de carga das resinas de permuta iónica se pode aplicar â

purificação de ácidos nucleicos poliméricos macromoleculares, com base no índice do número de bases dos polímeros e, em consequência disso, estabeleceram a presente invenção. Uma vez que os produtos finais a obter, de acordo com a presente invenção, são extremamente úteis como medicamentos, pensa-se que a definição de tamanho a efectuar pelo uso de uma resina de permuta iõnica (que será aqui referido como processo de permuta iõnica) tem particularmente um extraordinário aspecto inventivo no método da presente invenção.

No processo de permuta iõnica da pre sente invenção, pode colocar-se uma resina de permuta iõnica num recipiente com um ãcido nucleico polimérico a processar, de modo a atingir-se o objectivo (processo descontínuo), mas, em geral, utiliza-se a cromatografia em coluna para o fraccionamento (processo em coluna). Em particular, coloca-se uma resina de permuta iõnica numa coluna e introduz-se uma solução do ãcido nucleico polimérico na coluna de modo a absorver-se o polímero na resina de permuta iõnica. Em seguida, passa-se pela coluna um eluente tal como tampão salino Tris ou semelhante, linearmente ou em pa_s sos, variando a concentração de sal de modo a obter uma quantida de constante de eluido. 0 número de bases do ácido nucleico poli mérico contido em cada fracção detecta-se também por HPLC de fil. tração de gel como indicado anteriormente, usando um marcador co mo referência, podendo assim recolher-se as fracções que contêm o produto final desejado.

Para se atingir o objectivo da presente inv.enção pelo método de permuta iõnica acima referido, o tipo de resina de permuta iõnica a colocar na coluna bem como o tipo de eluente a utilizar na eluição são factores de extrema im portãncia.

Por exemplo, quando se dissolveu poli-I em tampão Tris-HCl e se adsorveu em QAE (aminoetilo quaternário) usado para definição de tamanho do poli-I, para permuta iõnica, não se conseguiu obter o produto desejado, mesmo mantendo extremamente elevada a concentração de sal no eluente. Isto deveu-se ao facto de o próprio poli-I se ter insolubilizado por a concentração de sal no eluente ser maior do que a do próprio

eluente do poli-I na resina QAE. Este resultado ê óbvio uma vez que o ãcido inosínico, que ê a unidade constituicional do poli-I é estruturalmente mais hidrofóbico. Neste caso, a concentração de sal num eluente adequado para o poli-I pode determinar-se em comparação com o caso do poli-C.

Numa outra experiência efectuada pelos autores da presente invenção, observou-se que uma solução de poli-I se tornava branca e turva formando um precipitado, num tampão com uma concentração de sal adequada para o eluente de po li-I numa resina QAE. Por isso, no processo de permuta iõnica da presente invenção, a selecção do tipo de resina de permuta iõnica a utilizar bem como a selecção da concentração de sal no eluente são factores de extrema importância.

Por exemplo, no caso do poli-I, a re sina DEAE deu um excelente resultado. No caso do poli-C, observou-se que tanto a resina QAE como a resina DEAE davam resultados favoráveis. Para a eluição pode utilizar-se a eluição com um gradiante linear salino ou a eluição com um gradiante descontínuo (passo a passo) salino, podendo fraccionar-se e eluir-se os polímeros por ordem de comprimento das cadeias respectivas.

Por exemplo, quando se adsorveu poli —C (38 mg, S^q, 8,6) em DEAE-Toyoperal 650 C (0 10 x 130 mm) e se eluiu depois por eluição de gradiante linear, usando os seguintes eluentes (A) e (Β), cada um em quantidades de 100 ml.

(A) = 0 M Nacl/10 mM Tris-HCl(pH 7,0) (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) gradiante linear para (B) foi de 0% a 100% e as condições de eluição foram as seguintes:

Velocidade de fluxo linear : 1,32 cm/min.

Velocidade de eluição : 175 gotas/fracção.

Como resultado, eluiram-se por ordem as seguintes fracções, cada uma com o comprimento de cadeia indi cado.

Fracçao

b.p. (pares de bases)

33	340
34	470
35	740
36	1000
37	1500

Além disso, eluiu-se a mesma amostra por eluição de gradiante descontínuo, eluindo-se primeiro uma fracção inferior a 500 b.p., com 0,3 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)(50 m) e depois uma fracção de 500 a 1500 b.p. com 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)(50 ml).

Do mesmo modo, eluiu-se poli-I (7,8 mg, 7,3) por eluição de gradiante linear nas mesmas condições acima referidas. Como resultado, obtiveram-se por ordem as seguintes fracções.

Fracção

b.p. (pares de bases)

140

230

350

460

540

Além disso, eluiu-se a mesma amostra por eluição de gradiante descontínuo, eluindo-se em primeiro lugar uma fracção inferior a 300 b.p. com 0,3 M NaCl/10 mM Tris-HC1 (pH 7,0)(50 ml) e depois uma fracção de 300 a 600 b.p. com 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)(50 ml).

Como referido acima, mesmo os ácidos nucleicos macromoleculares se puderam fraccionar pelo método da presente invenção, obtendo-se fracções de ácidos nucleicos de comprimento de cadeia definido (definição de tamanho), seleccionando adequadamente a concentração de sal durante a eluição.

Como se ilustrou nos dois exemplos acima referidos, as fracções (componentes principais) com uma distribuição de comprimento de cadeia adequada para utilização farmacêutica como medicamentos, podem fraccionar-se livremente a partir de uma mistura que contenha vários ácidos nucleicos macro moleculares com diferentes distribuições de comprimento de cadeia, podendo efectuar-se o fraccionamento numa escala industrial de produção em massa. O aspecto do fraccionamento ê o mais im portante no processo de permuta iónica de acordo com a presente invenção.

Quando se prepara uma composição far macêutica na forma de injecção, sabe-se que é inevitável a opera ção de remoção de agentes pirogénicos. Os pirogénicos são compo£ tos por lipopolissacãridos que não devem ser incorporados em com posições farmacêuticas. Se se utilizarem os derivados de ãcidos nucleicos da presente invenção em injecções para administração a seres humanos, é essencial proceder à remoção dos agentes pirogé nicos.

Felizmente, descobriu-se que a aplicação do processo de permuta iónica acima mencionado aos derivados de ãcidos nucleicos da presente invenção, é também eficiente para a remoção dos agentes pirogénicos desses derivados.

Por isso, os autores da presente invenção fizeram vãrias outras experiências de modo a investigar mais profundamente o fenómeno favorável acima referido, que fora descoberto por acaso, tendo-se descoberto que os agentes pirogénicos se podem remover de qualquer derivado de ãcido nucleico de cadeia simples, independentemente do seu comprimento de cadeia, pelo processo de permuta iónica da presente invenção. Este érnais um dos aspectos característicos da presente invenção.

Deste modo, a presente invenção refe re-se também a um método de processamento dos derivados de ãcidos nucleicos da presente invenção com uma resina de permuta iõnica, de modo.a separã-los dos agentes pirogénicos para a preparação de injecções que contenham esses derivados.

Os resultados obtidos por meio de um teste para a determinaç_ao da quantidade de endotoxinas em vários

RNA's de cadeia simples (poli-C comercial e derivados seus de ca deia mais curta) apresentam-se na Tabela abaixo.

Na Tabela EU(unidade de endotoxina)

significa uma unidade num teste de febre em coelhos com a referência USP como endotoxina padrão (E. coli 0113).(1) indica ãgua destilada para injecções (ensaio em branco); (2) indica poli-C (produto comercial 1); (3) indica poli-C (produto comercial 2);

e (4) indica o produto obtido no exemplo 5-4 seguinte.

Substância Antes ou Concentração testada depois

	ug/ml	EU/ml	pg/mg	EU/mg
(1)	-	29.92	0.0868
(2)	Antes	308.29	0.8941	548.07	1.5895
	Depois	18.68	0.0542	33.96	0.0985
(3)	Antes	93.89	0.2723	166.18	0.4891
	Depois	19.45	0.0564	34.12	0.0989
(4)	Antes	89.63	0.2599	155.98	0.4520
	Depois	57.45	0.1666	114.90	0.3332

Pelos resultados da Tabela acima é evidente o efeito de remoção dos agentes pirogénicos por permuta iónica.

A actividade fisiológica dos derivados de ácidos nucleicos da presente invenção é extremamente útil para fins médicos. Os derivados de ácidos nucleicos da presente invenção têm uma acentuada acção carcinostática que se referirá de seguida em detalhe. A actividade ê meramente uma de entre várias outras actividades fisiológicas dos derivados de ácidos nucleicos da presente invenção.

Como outras actividades fisiológicas dos derivados de ácidos nucleicos da presente invenção, que têm poli-I. poli-C como unidade mãe, podem referir-se ainda a capaci. dade de produção de TNF, capacidade de produção de interferão, capacidade de produção de interleucina 2, capacidade de activação de macrofagos, capacidade de activação de células NK, activi dade de inibição da proliferação de células de tumores, activida de de inibição da proliferação de células de tumores em ratos pe lados portadores de células de tumor humanas, actividade de inibição de metastases das células de tumor no pulmão, etc..

Os derivados de ácidos nucleicos da presente invenção têm uma segurança extremamente maior do que os indutores de interferão convencionais poli-I. poli-C e semelhantes. Por isso, os compostos da presente invenção são úteis como agentes antivirais, agentes antitumor, etc..

As actividades fisiológicas dos der/ vados de ácidos nucleicos da presente invenção acima mencionadas encontram-se descritas em pormenor nas especificações de patente referidas (registo de patente japonês n9. 62-167433 e outro registo de patente com a prioridade do registo referido n9. 62-157433).

exemplo seguinte destina-se a ilu£ trar a preparação dos derivados de ácidos nucleicos da presente ί! invenção em mais detalhe, sem no entanto limitarem o seu âmbito.

EXEMPLO (1) Preparação e purificação de L-poli-I (poli-I dimensionado):

I Adicionaram-se 200 ml de ãgua destililada, 250 ml de formamida e 500 ml de uma solução 5M de NaCl a li í 10 g de poli-I comercial e aqueceu-se a 809 C durante 4 horas. Sujeitou-se a solução reaccional a filtração de gel por HPLC usando uma coluna G-DNA-PW de gel TSK (7,8 mm ID x 300 mm)(eluen te: tampão Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), solução 0,3M de NaCl, 2 mM EDTA; velocidade de fluxo: 0,5 ml/min), tendo-se terminado a reacção quando se obteve uma fracção com um pico mãximo para um tempo de retenção de 21,86 + 0,2 minutos.

Adicionou-se uma quantidade dupla de etanol à solução reaccional e recolheu-se o precipitado formado por centrifugação (3000 rpm, 49C). Lavou-se este com etanol a i

I ;70% e secou-se sob vácuo, obtendo-se 10,2 g de L-poli-I.

A ãgua e as soluções usadas neste processo eram esterilizadas. O mesmo se verifica nos processos seguintes.

(2) Preparação e purificação de L-poli-C (poli-C dimensionado):

Adicionaram-se 200 ml de ãgua desti17

lada, 250 ml de formamida e 50 ml de uma solução 5M de NaCl a 10 g de poli-C e aqueceu-se a 809 C durante cerca de 4 horas. Por meio de MPLC por filtração de gel, como indicado acima, determinou-se o ponto final da reacção (tempo de retenção: 21,3 + 0,2 min) .

Adicionou-se uma quantidade dupla de etanol à solução reaccional e recolheu-se o precipitado formado por centrifugação (3000 rpm, 49C). Lavou-se este com etanol a 70% e secou-se sob vãcuo obtendo-se 9,5 g de L-poli-C.

(3) Sulfurização de L-poli-C:

Dissolveram-se 8,0 g do L-poli-C obtido no passo anterior (2) em 240 ml de ãgua e colocou-se numa autoclave de aço de 500 ml. Adicionou-se uma solução de piridina contendo sulfureto de hidrogénio (12 g/120 ml) com arrefecimento em gelo. Após se fechar, aqueceu-se a autoclave a 509 C durante cerca de 10 horas. Após arrefecimento, adicionou-se fenol satura do em TE (200 ml), agitou-se e centrifugou-se 13000 rpm, 159 C, minutos). Adicionaram-se uma quantidade de 1/10 de uma solução 5M de NaCl e uma quantidade dupla de etanol à fase aquosa obtida para provocar a precipitação. Recolheu-se o precipitado por centrifugação (3000 rpm, 49 C, 10 minutos), lavou-se com etanol a

70% e secou-se em vacuo obtendo-se 8,0 g de L-poli(C2Q,S U)(isto é, derivado de poli-C dimensionado em que os ãcidos citidilicos se encontram substituídos pelo ácido 4-tiouridílico numa pro porção de um ãcido 4-tiouridilico para 20 ãcidos citidílicos).

O TE acima mencionado significa tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) contendo EDTA 1 mil.

(4) Realização da complementação:

I i Dissolveram-se 6,00 g de L-poli(C„_n, zu

Is U), obtido no passo anterior (3) e 6,44 g de poli-I, obtido I no passo anterior (1), em 300 ml de tampão Tris-HCl 10 mM (pH j7,5)/50 ml de solução 50 mM de NaCl e misturaram-se. Aqueceu-se ja solução resultante até 709 C em banho maria e manteve-se a essa temperatura durante 10 minutos. Deixou-se depois arrefecer duran 1 te a noite. Após tratamento com fenol e precipitação com etanol, adicionou-se ãgua (cerca de 200 ml) ao precipitado formado de mo

do a dissolvê-lo. Efectuou-se então a diálise da solução resulítante com ãgua a 49 C. Concentrou-se o dialisado atê â secura ob tendo-se 12,4 g de um composto complementado.

(5) Definição de tamanho por permuta iõnica:

Efectuou-se a permuta iõnica por elu;.

ção descontínua ou por eluição de gradiante linear. Em ambos os casos, o rendimento e o comprimento de cadeia dos produtos foram quase idênticos, desde que as condições de eluição tivessem sido adequadamente seleccionadas. Para a eluição descontínua de L-po4 li-C e L-poli-(C, S U) utilizou-se 0,15 M NaCl/10 mM Tris-MCl (pH 7,0) e para a eluição contínua utilizou-se NaCl 1,0 M/10 mM Tris-HCl (pH 7,0).

Em relação ã eluição descontínua de L-poli-I veja-se o exemplo (5-1) seguinte.

Para a eluição por gradiante linear ide L-poli-I, utilizaram-se as condições (A) e (B) seguintes, e conduziu-se a eluição no gradiante da solução (B) de 0 a 100%.

(A) = 0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0).

Em relação ã eluição por gradiante 4 linear de L-poli-C e L-poli(C. S U) vejam-se os exemplos (5-2) e (5-4) seguintes.

(5-1) Definição de tamanho de L-poli-I:

Dissolveram-se 210 mg do L-poli-I ob tido no passo anterior (1) em 5 ml de tampão Tris-HCl 10 mM (pH RTM

7,0) e adsorveu-se em DEAE-Toyopear1 650 C (010 mm x 130 mm).

Eluiu-se então passo a passo a uma velocidade de fluxo linear de 1,30 cm/min., com eluentes de 0,03 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH7,0) (50 ml) e de 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0)(80 ml). Recolheu -se a fracção eluida com 0,5 M NaCl e mediu-se o seu tempo de re tenção por HPLC de filtração de gel como referido no passo (1), tendo este sido de 21,90 + 0,2 min.

Obteve-se, com alto rendimento, o produto final desejado, L-poli-I (dimensionado), com um número de bases de 100 a 1000. O rendimento final foi de 91%.

^noS

(5-2) Definição de tamanho de L-poli-C:

Dissolveram-se 610 mg do L-poli-C ob tido no passo (2) anterior em 10 ml de tampão Tris-HCl (pH 7,0) RTM e adsorveu-se em QAE-Toyopearl 550 C (0 10 mm x 130 mm). Eluit -se depois por eluição de gradiante linear com uma velocidade de fluxo linear de 1,30 cm/min., tendo-se utilizado as soluções (A) e (B) seguintes, cada uma na quantidade de 100 ml, e efectuou-se a eluição num gradiante da solução (B) de 0 a 100%.

(A) = 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B) = 1,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0).

Recolheu-se a fracção eluida como pi co principal e mediu-se o respectivo tempo de retenção por HPLC de filtração de gel, que foi de 21,35 + 0,2 min. O produto final pretendido, L-poli-C (de tamanho definido), com um numero de bases de 100 a 1000, obteve-se com um elevado rendimento. O rendimento obtido foi de 93%.

(5-3) Definição de tamanho de L-poli(C^₂, U):

Dissolveram-se 19 mg de poli(C^₂, U) (no qual os ãcidos citidílicos se encontravam substituídos por ãcido uridílico na proporção de 1 ãcido uridílico para 12 ãcidos citidílicos)(com um tempo de retenção de 18,67 min. pelo processo de HPLC referido no passo (1) anterior) em 5 ml de tampão

RTM

Tris-HCl (pH 7,0) e adsorveu-se em DEAE-Toyopear1 650 C (0/ mm x 130 mm). Eluiu-se depois por eluição de gradiante linear a uma velocidade de fluxo linear de 1,30 cm/min., utilizando-se as soluções (A) e (B) seguintes, cada uma na quantidade de 100 ml, e efectuando-se a eluição com um gradiante da solução (B) de 0 a 100%.

(A) = 0,0 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) (B) = 0,5 M NaCl/10 mM Tris-HCl (pH 7,0) !!

Recolheu-se a fracção eluida como pi.

co principal e mediu-se o respectivo tempo de retenção por HPLC de filtração de gel, o qual foi de 18,37 + 0,2 min. 0 produto fi • nal pretendido, L-poli (Cj₂, U) (de tamanho'definido), com um nú. mero de bases de 100 a 1000, obteve-se com alto rendimento. 0

(5-4) Definição de tamanho de L-poli(C^θ, U):

Dissolveram-se 600 mg do L-poli(C_on, 4 40

S U) obtido no passo (3) acima mencionado em 10 ml de tampão RTM

Tris-HCl (pH 7,0) e adsorveu-se em QAE-Toyoperal 550 C (0 10 mm x 130 mm). Eluiu-se depois por eluição de gradiante linear a uma velocidade de fluxo linear de 1,30 cm/min., utilizando-se as soluções (A) e (B) seguintes, cada uma na quantidade de 100 ml, e efectuando-se a eluição com um gradiante da solução (B) de 0 a 100%.

Mediu-se o tempo de retenção por

HPLC de filtração de gel do modo mencionado acima no passo (5-2) o qual foi de 21,35 + 0,2 min produto final pretendido, L-poli4 (C2Q/ Ξ U)(de tamanho definido), com um numero de bases de 100 a 1000 obteve-se com um alto rendimento. O rendimento final foi de 90%.

(6) Complementação:

(6-1) L-poli-I e L-poli-C:

Dissolveram-se separadamente 3,0 g de L-poli-C de tamanho definido (obtido no passo (5-2) anterior) e 3,2 g de L-poli-I de tamanho definido (obtido no passo (5-1) anterior) em 150 ml de tampão Tris-HCl 10 mM (pH 7,5)/50 mM NaCl e misturaram-se. Aqueceu-se a solução resultante a 7 09C em banho maria e manteve-se a esta temperatura durante 10 minutos. Deixou -se depois arrefecer a solução durante a noite. Após tratamento ίcom fenol e precipitação com etanol, adicionou-se âgua (cerca de [400 ml) ao precipitado formado de modo a dissolvê-lo. Sujeitou-se então a solução resultante a diálise contra água a 49C. Concentrou-se o dialisado atê à secura, obtendo-se 6,2 g de um composto complementado.

(6-2) L-poli-I e L-poli-tC^Q, S⁴ U):

Processaram-se 1,46 g de L-poli-C ttâ&sS^LIiSSW*;

(C2Q, S U) de tamanho definido (obtido no passo (5-4) anterior) e l,57g de L-poli-I de tamanho definido (obtido no passo (5-1) anterior), de modo análogo ao indicado no passo (6-1) acima refe rido, tendo-se obtido 3,0g de um composto complementado.

Embora esta invenção tenha sido descrita em pormenor e referindo as suas características específicas, é evidente para o especialista da matéria que se poderão efectuar várias alterações e modificações sem ferir o espírito e o âmbito da invenção.

Para terminar, referem-se alguns derivados de ãcidos nucleicos de cadeia dupla, de acordo com a pre sente invenção, todos caracterizados por um valor de S entre 4 e 13, preferindo-se aqueles cujas moléculas para a mãxima distribuição molecular tenham um número de bases compreendido entre 100 e 600:

Acido poliinosínico. ácido poli(5-bromocitidílico),

Ácido poliinosínico. ãcido poli(2-tiocitidílico),

Ácido poli(7-desazainosico). ãcido policitidílico,

Ãcido poli(7-desazainosínico). ãcido poli(5-bromocitidílico), Ãcido poli(2¹-azidoinosínico). ãcido policitidílico,

Ãcido poliinosínico. ãcido poli(citidina-5'-tiofosfõrico),

Ãcido poliadenílico. ãcido poliuridilico,

Ãcido poliinosínico. ãcido poli(citidílico, uridílico),

Ãcido poliinosínico. ãcido poli(citidílico, 4-tiouridílico), Ãcido poliinosínico. ãcido policitidílico. poli-L-lisina,

Acido poliinosínico. ãcido poli(1-vinilcitidílico).

Claims

Processo para a preparaçao de deriva dos de ácidos nucleicos de cadeia dupla, tendo RNA como substância mãe, cuja distribuição total de tamanho molecular se situe entre os valores da constante de sedimentação de 4S a 13S, caraç terizado por, (a) se proceder, em primeiro lugar, ao dimensionamento dos polímeros de ãcido nucleico de cadeia simples por meio de HPLC (filtração de gel em cromatografia líquida de alta pressão) , de modo a definir numericamente a distribuição de tamanho molecular dos produtos, (b) se adicionar em seguida um álcool de baixo peso molecular, à mistura reaccional, para isolar os produtos, (c) se proceder à sulfurização dos polímeros de ãcidos nucleicos de cadeia simples, seguida de centrifugação, (d) se 'submeter a mistura a uma resina de permuta iõnica para restrição de tamanho e, finalmente (e) se efectuar a complementação dos polímeros de ãcidos nucleicos de cadeia simples, hibridizando os polímeros complementares por dissolução num tampão de Tri£ -HCl (pH 7,5), aquecimento a 709C, tratamento cora fenol e precipitação com etanol, seguida por separação por diãlise, de modo a obterem-se polímeros de ãcidos nucleicos de cadeia dupla.

Processo para a preparaçao de deriva Ídos de ãcidos nucleicos de cadeia dupla, tendo RNA como substânicia mãe, caracterizado por se obterem, de acordo com o processo ídescrito na reivindicação 1, derivados cujas moléculas possuam juma distribuição máxima de tamanho molecular total situada na ga ima de número de bases entre 50 a 10 000.

-3-Processo de acordo com as reivindica ções 1 ou 2, caracterizado por se adicionar um álcool de baixo peso molecular à solução reaccional contendo o polímero de ácido nucleico dimensionado, antes de se proceder à complementação.

- 4- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o álcool de baixo peso molecular ser o etanol.

Processo de acordo com as reivindica ções 1 ou 2, caracterizado por se efectuar a sulfurização das me tades de ácido nucleico nos polímeros de ácido nucleico de cadeia simples dimensionados, seguida de adição de um álcool arili. co, antes de se proceder à complementação.

- 6- Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o álcool arílico ser o fenol.

Processo de acordo com as reivindica

- 7- 24 ções 1 ou 2, caracterizado por se processarem os polímeros de ãcido nucleico de cadeia simples dimensionados, com uma resina de permuta iõnica, antes de se proceder à complementação, de modo a recolher os polímeros com uma distribuição de tamanho molecular dentro de uma determinada gama, de modo a conseguir-se uma definição de tamanho dos polimeros dimensionados.

Processo de acordo com as reivindica ções 1 ou 2, caracterizado por se prepararem derivados de ãcido nucleico de cadeia dupla, seleccionados de entre o grupo constituído por: ãcido poliinosénico. ãcido poli(5-bromocitidilico) con. um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a máxima distribuição molecular tenham um número de bases entre 100 e 600; ãcido poliinosínico. ãcido poli (2-tiocitidí. lico) com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a máxima distribuição molecular tenham um número de bases entre 100 e 600; ácido poli(7-desazainosínico). ãci ί

do policitidílico com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a máxima distribuição molecular tenham um número de bases entre 100 e 600; ãcido poli(7-desazainosínico) . ãcido poli(5-bromocitidílico) com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a máxima distribuição^-molecular tenham um número de bases entre 100 e 6 00; ãcido poli(2'-azidoinosínico). ãcido policitidllico com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a mãxima distribuição molecular tenham um número de bases entre 100 e 600; ãcido poliinosínico. ãcido poli(citidina-5’-tiofosfõírico) com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a mãxima distribuição molecular tenham um número de bases entre 100 e 600; ãcido poli(adenílico-uridilico) :com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas mo! léculas para a mãxima distribuição molecular tenham um número de íbases entre 100 e 600; ãcido poliinosínico. ãcido poli(citidíli25 co, uridílico) com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a máxima distribuição molecular te nham um número de bases entre 100 e 600; ácido poliinosínico. ácido poli(citidílico), 4-tiouridílico) com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para máxima distribuição molecular tenham um número de bases entre 100 e 600; ácido poliinosínico. ácido policitidílico. poli-L-lisina com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a máxima distribuição de peso molecular tenham um número de bases entre 100 e 600; e ãcido poliinosínico. ãcido poli (5-vinilcitidílico) com um valor de S entre 4 e 13, de preferência aqueles cujas moléculas para a máxima distribuição molecular tenham um número de bases entre 100 e 600.

- 9§ Processo para a preparação de uma compo sição farmacêutica injectãvel, caracterizado por se efectuar uma mistura de derivados de ácidos nucleicos, quando preparados de acordo com as reivindicações 1 ou 2, e se removerem os agentes pirogénicos nela contidos (se for caso disso) por meio de uma resina de permuta iónica.

- 103 Processo para a preparaçao de uma compo sição farmacêutica de acção anti-tumoral, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um derivado de ãcido nucleico de cadeia dupla, quando preparado de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 8, com veículos e/ou aditivos farmacologicamente adequados.

- 11- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acção anti-tumoral, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se incorporar para além do derivado de ãcido nucleico de cadeia dupla, uma ou mais substâncias modificadoras da resposta biológica e/ou uma ou mais substâncias carcinostãticas.

12Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica de acção anti-viral, caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um derivado de ãcido nuclei co de cadeia dupla, quando preparado de acordo com as reivindica ções 1, 2 ou 8, com veículos e/ou aditivos farmacologicamente adequados.

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica de acção anti-viral, de acordo com a rei vindicação 12, caracterizado por se incorporar para além do derj.

j; vado de ãcido nucleico de cadeia dupla, uma ou mais substâncias modificadoras da resposta biológica e/ou uma ou mais substâncias )carcinostãticas.