JPH05202090A - 全体にわたりアミドリン酸塩のヌクレオチド間架橋を有する新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド類 - Google Patents

全体にわたりアミドリン酸塩のヌクレオチド間架橋を有する新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド類

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JPH05202090A
JPH05202090A JP4250401A JP25040192A JPH05202090A JP H05202090 A JPH05202090 A JP H05202090A JP 4250401 A JP4250401 A JP 4250401A JP 25040192 A JP25040192 A JP 25040192A JP H05202090 A JPH05202090 A JP H05202090A
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アントニウス・レベルデイング
Burkhard Mielke
ブルクハルト・ミールケ
Wolfgang Dr Springer
ボルフガング・スプリンガー
Udo Stropp
ウド・シユトロツプ
Joerg Dr Baumgarten
ユルグ・バウムガルテン
Helga Ruebsamen-Waigmann
ヘルガ・リユブザメン−バイクマン
Lothar Dr Biesert
ロター・ビーセルト
Haryadi Dr Suhartono
ハリアデイ・スハルトノ
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式 【化１】 で示されるオリゴヌクレオチド類（ここで、ＡはＮＨ又
はＮＲ2；Ｂは天然の又は修飾されたピリミジン又はプ
リン核酸塩基、或いはまたＯＨ、ＯＲ2又はＨ；Ｄは
Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲ2；ＥはＨ、ＯＨ、ＯＲ2、アジド
又はハロゲンである）。 【効果】 遺伝子関連疾病の処置及び外来性核酸に対す
る防御のための薬剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】いわゆるアンチセンスオリゴヌク
レオチド類（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅｓ）といわれる相補的核酸により望ましく
ない遺伝子発現を特異的に制御することは、化学療法に
おける偉大な発展の代表例であろう。それは遺伝子が関
係する病気の処置や、例えば細菌、カビ又はウィルスの
感染の後の如き外来核酸に対する防御のために重要であ
る。
【０００２】アンチセンスの原理は、いわゆるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドが阻止されるべきｍＲＮＡとハ
イブリダイズすることができる能力に基づいている。
【０００３】文献にアンチセンスオリゴヌクレオチドの
作用についての証拠がある。中でもこのように、例えば
ＨＩＶの如きレトロウィルスに対する抗ウィルス作用が
議論されている［ピー・シー・ホイル（Ｐ．Ｃ．Ｈｏｙ
ｌｅ）、イー・シー・クーパー（Ｅ．Ｃ．Ｃｏｏｐｅ
ｒ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｅ
ｒ．２、１９８９、３５］。
【０００４】天然と同一のリン酸ジエステルオリゴヌク
レオチド類は、内生の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）エンド
ー及びエクソヌクレアーゼ類による酵素的分解に対して
の感受性が非常に高いので、使用が困難である。
【０００５】本発明は、５’−アミノ−２’，５’−ジ
デオキシフラノース類から誘導され、その５’末端にお
いてリピッド残基で改変されていてもよい、アカイラル
な（ａｃｈｉｒａｌ：非鏡像対称性の）アミドリン酸塩
のヌクレオチド間架橋（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔ
ｅ ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇ
ｅ）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド類縁体に
関する。これらのオリゴヌクレオチド類縁体はエンドー
及びエクソヌクレアーゼに対し耐性が増大し、また抗ウ
ィルス作用を発現する。
【０００６】１又はそれ以上のアミドリン酸塩のヌクレ
オチド間架橋を含有するオリゴヌクレオチド類縁体は既
に記載されている［ダブリュー・バンワース（Ｗ．Ｂａ
ｎｎｗａｒｔｈ）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ７１
（１９８８）、１５１７；エム・マグ（Ｍ．Ｍａｇ）、
ジェー・ダブリュー・エンゲルス（Ｊ．Ｗ．Ｅｎｇｅｌ
ｓ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１
９８９）、５９７３；エス・エム・グリヤズノフ（Ｓ．
Ｍ．Ｇｒｙａｚｎｏｖ）、エヌ・アイ・ソコロバ（Ｎ．
Ｉ．Ｓｏｋｏｌｏｖａ）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌ
ｅｔｔ．３１（１９９０）、３２０５］。
【０００７】これらの化合物は改変されていないリン酸
ジエステルオリゴヌクレオチド類と比較して特性が改良
されていない。これらの化合物については抗ウイルス活
性は記載されていない。
【０００８】全体にわたりアミドリン酸塩のヌクレオチ
ド間架橋を含有するオリゴヌクレオチド配列の合成方法
は未だ開示されていない。
【０００９】しかし、全体にわたりアミドリン酸塩のヌ
クレオチド間架橋を導入すると抗ウイルス作用を有し、
ヌクレアーゼに対しても十分安定な分子になる。これら
の構造を遺伝子プローブとして用いることも可能である
［レビュー：ジェー・エー・マテウス（Ｊ．Ａ．Ｍａｔ
ｔｈｅｗｓ）、エル・ジェー・クリッカ（Ｌ．Ｊ．Ｋｒ
ｉｃｋａ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ１６９（１９８８）、１］。
【００１０】本発明は、下記一般式Ｉ
【００１１】
【化２】
【００１２】で示されるオリゴヌクレオチド類に関す
る。ここでＡは全体にわたりＮＨ又はＮＲ2であること
ができ、Ｂは相互に独立に、天然の又は改変（修飾）さ
れたピリミジン又はプリン核酸塩基、或いはまたＯＨ、
ＯＲ2又はＨであることができ、ＤはＯ、Ｓ、ＮＨ又は
ＮＲ2であることができ、Ｅは相互に独立にＨ、ＯＨ、
ＯＲ2、アジド又はハロゲンであることができ、Ｘは−
Ｏ-、Ｓ-、−ＯＲ2、−ＳＲ2又はアルキルであることが
でき、Ｒ2はアルキル、アリール、アラルキル又はシク
ロアルキルであることができる。
【００１３】アルキルという用語は、ここでは１〜２０
個のＣ原子を有する分岐状又は非分岐状のアルキル基を
意味する。１〜１０個のＣ原子を有するアルキル基が好
ましく、特にメチル、エチル、プロピル、アリル、２，
２−ジメチルアリル、ベンジルが好ましい。
【００１４】アリールという用語は、ここでは、例えば
ハロゲンやニトロなどにより置換されていてもよいフェ
ニル、ナフチルを意味する。
【００１５】アラルキルという用語は、ここでは直鎖状
又は分岐鎖状のアルキル部分に１〜１８個の炭素原子及
びアリール部分に６〜１２個の炭素原子を有するアラル
キル基を意味し、ここでアリールはフェニル又はナフチ
ルを表わす。
【００１６】シクロアルキルという用語は、ここでは３
〜８個の炭素原子、好ましくは３〜６個の炭素原子を有
する環状アルキル基を意味し、特に好ましくはシクロペ
ンチル及びシクロヘキシルである。
【００１７】
【００１８】 Ｒ1はアルキル、アリール、ヘタリール（ｈｅｔａｒｙ
ｌ）、アラルキル、シクロアルキル、リピド（ｌｉｐｉ
ｄ）であることができる。
【００１９】アルキルとは、ここでは１〜３０個のＣ原
子を有する分岐状又は非分岐状のアルキル基を意味す
る。１〜１８個のＣ原子を有するアルキル基が好まし
く、６〜１８個Ｃ原子を有するアルキル基がとりわけ特
に好ましい。アリールとは、ここでは例えばフェニル又
はナフチルを意味し、それは例えばハロゲン又はニトロ
で置換されていてもよい。
【００２０】ヘタリール（ｈｅｔａｒｙｌ）とは、例え
ばピリジル、アクリジニル又はカルバゾリルを意味す
る。
【００２１】アラルキルとは、直鎖状もしくは分岐鎖状
のアルキル部分に１〜１８個のＣ原子を、アリール部分
に６〜１２個のＣ原子を有するアラルキル基を意味し、
ここでアリールとはフェニル又はナフチルを表わす。シ
クロアルキルとは、３〜８個の炭素原子、好ましくは３
〜６個の炭素原子を有する環状アルキル基を意味し、特
に好ましくはシクロペンチル及びシクロヘキシルであ
る。
【００２２】ｎは３〜５０であることができる。
【００２３】ｎは好ましくは１０〜３０、特に好ましく
は１８〜２８である。
【００２４】活性化されたモノマーは公知の方法で合成
される［エム・マッグ（Ｍ．Ｍａｇ）、ジェー・ダブリ
ュー・エンゲルス（Ｊ．Ｗ．Ｅｎｇｅｌｓ）、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１９８９）、５９
７９）。
【００２５】
【化３】
【００２６】チミジンを、ジメチルホルムアミド中でリ
チウムアジド、テトラブロモメタン及びトリフェニルホ
スフィンと反応させる。アジド基をピリジン中でトリフ
ェニルホスフィンで還元してアミノ基とし、ひきつづき
該アミノ基をモノメトキシトリチル基で保護する。活性
化された誘導体６ａはシアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトライソプロピル−ホスホロジアミダイト（ｃｙａ
ｎｏｅｔｈｙｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｉｓ
ｏｐｒｏｐｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔ
ｅ）を用いて５ａから得ることができる。
【００２７】
【化４】
【００２８】Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシシチジ
ン１ｂ、Ｎ4−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン
１ｃ、Ｎ2−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン
１ｄ及びＮ2−フェニルアセチル−２’−デオキシグア
ノシン１ｅは一時的保護法により製造される［ジー・エ
ス・チー（Ｇ．Ｓ．Ｔｉ．）、ビー・エル・ガフニィー
（Ｂ．Ｌ．Ｇａｆｆｎｅｙ）、アール・エー・ジョーン
ズ（Ｒ．Ａ．Ｊｏｎｅｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１０４（１９８２）、１３１６；エフ・ベンセラー
（Ｆ．Ｂｅｎｓｅｌｅｒ）、エル・ダブリュー・マクロ
ーリン（Ｌ．Ｗ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ）、Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ１９８６、４５］。
【００２９】モノトシレート２（ｂ−ｅ）は構造物（ｂ
ｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）１（ｂ−ｅ）から得ら
れ、リチウムアジドとの反応で５’−アジド化合物３
（ｂ−ｅ）に転化される。
【００３０】チミジン誘導体について記載された合成経
路はひきつづく反応工程に用いられる。
【００３１】リピド残基例えばウンデカノールは、同様
に、シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロ
ピル−ホスホロジアミダイトと反応させて、例えば７と
することにより活性化される。
【００３２】
【化５】
【００３３】５’−デオキシアミノヌクレオチド構造物
（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）の架橋によるオリ
ゴヌクレオチドの形成オリゴヌクレオチドを与えるモノ
マー構造物の架橋は、好ましくは既述の方法に基づいた
固相合成法の条件下で実施される［エム・マッグ（Ｍ．
Ｍａｇ）、ジェー・ダブリュー・エンゲルス（Ｊ．Ｗ．
Ｅｎｇｅｌｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
７、５９７３（１９８９）；ダブリュー・バンワース
（Ｗ．Ｂａｎｎｗａｒｔｈ）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａ
ｃｔａ７１、１５１７（１９８８）］。
【００３４】本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は最終
反応工程において、例えばホスホルアミダイト試薬７と
結合させる。保護基を取り去り、塩基処理により固相か
ら配列を切りはなした後、反応生成物を好ましくは調製
用ＨＰＬＣにより単離する。クロマトグラフィーでの挙
動は副生成物からの分別を容易にするリピド残基によ
り、各々の場合できまる。
【００３５】
【化６】
【００３６】対応する薬学的処方物は、アミドリン酸塩
オリゴヌクレオチド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）の他に、例えば
緩衝剤及び／又は安定化剤又はリポソーム処方物の如き
非経口的処方物用の慣用の助剤を含有する。局所（ｔｏ
ｐｉｃａｌ）適用も考えられる。この目的のために採用
することができる処方物の具体例としては、軟膏、クリ
ーム、液剤、又は膏薬があり、それらは活性化合物の他
にこの用途に適する薬学的助剤を含有する。
【００３７】
【実施例】
合成実施例 実施例１５’−Ｏ−（４−トルエンスルホニル）−Ｎ2−フェニ
ルアセチル−２’−デオキシグアノシン Ｎ2−フェニルアセチル−２’−デオキシグアノシン
（１３．９ｇ；３６ｍｍｏｌ）及び４−トルエンスルホ
ニルクロライド（２１．０ｇ；１０８ｍｍｏｌ）を室温
で７０分無水ピリジン（１４０ｍｌ）中で撹拌する。こ
の後水（５ｍｌ）を０℃で添加し、混合物を室温で２０
分間撹拌し、高真空下濃縮し、数回トルエンと共蒸留
し、残渣を酢酸エチル（１５０ｍｌ）に採取し、それぞ
れ５％のＮａＨＣＯ3溶液とＮａＣｌ溶液（各々５０ｍ
ｌ）で１回洗浄し、そして有機相を乾燥（ＭｇＳＯ4）
し、濃縮する。粗生成物をクロマトグラフィー（ジクロ
ロメタン／メタノール１５：１）で精製する。
【００３８】収率：１１．３ｇ（５８％）。
【００３９】実施例２５’−アジド−Ｎ2−フェニルアセチル−２’，５’−
ジデオキシグアノシン リチウムアジド（５．０ｇ；１００ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（１２０ｍｌ）中の５’−Ｏ−
（４−トルエンスルホニル）−Ｎ2−フェニルアセチル
−２’−デオキシグアノシン（１１．０ｇ；２０ｍｍｏ
ｌ）の溶液に添加し、その溶液を５０℃で７．５時間撹
拌する。それを冷却し、高真空下で濃縮し、数回トルエ
ンと共蒸留し、残渣を酢酸エチル（５００ｍｌ）中に採
取し、ＮａＨＣＯ3溶液（各、６０ｍｌ）とＮａＣｌ溶
液（各１００ｍｌ）で各々２回振盪して抽出する。水相
を合体して酢酸エチルで数回逆抽出する。合体した有機
相を乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濃縮する。粗生成物をクロ
マトグラフィーで精製する（ジクロロメタン／メタノー
ル１３：１→１０：１）。
【００４０】収率：８．０ｇ（９５％）。
【００４１】実施例３５’−アミノ−Ｎ2−フェニルアセチル−２’，５’−
ジデオキシグアノシン ５’−アジド−Ｎ2−フェニルアセチル−２’，５’−
ジデオキシグアノシン（８．２ｇ；２９ｍｍｏｌ）とト
リフェニルホスフィン（７．９ｇ；３０ｍｍｏｌ）をピ
リジン（１５０ｍｌ）中に溶かし、室温に１６時間放置
する。水（２５ｍｌ）を添加し、混合物を２時間撹拌す
る。反応溶液を水（２００ｍｌ）に注ぎ入れ、濾過し、
水相を酢酸エチル（各１００ｍｌ）で２回抽出する。合
体した有機相を水（各１００ｍｌ）で５回抽出する。水
相を合体して凍結乾燥し、黄色っぽい粉末の粗生成物が
得られ、それを直ちに更なる反応に供する。
【００４２】収率：７．１ｇ（９２％）。
【００４３】実施例４５’−（４−メトキシトリフェニルメチル）アミノ−Ｎ
2−フェニルアセチル−２’，５’−ジデオキシグアノ
シン ５’−アミノ−Ｎ2−フェニルアセチル−２’，５’−
ジデオキシグアノシン（７．１ｇ；１８．５ｍｍｏｌ）
をピリジン（２００ｍｌ）に溶かし、クロロ（４−メト
キシ）トリフェニルメタン（１７．０ｇ；５５．５ｍｍ
ｏｌ）、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（４
９０ｍｇ；３．８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン
（２．７ｍｌ；１９ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温
で２．５時間撹拌する。そしてそれを高真空下濃縮し、
数回トルエンと共蒸留し、残渣をジクロロメタン（５０
０ｍｌ）中に採取し、ＮａＨＣＯ3溶液とＮａＣｌ溶液
でそれぞれ２回振盪して抽出し、そして有機相を乾燥
（ＭｇＳＯ4）し、濃縮する。次いでクロマトグラフィ
ーにより精製する（ジクロロメタン／メタノール２０：
１→１０：１）。
【００４４】収率：２．４ｇ（２０％）。
【００４５】実施例５５’−（４−メトキシトリフェニルメチル）アミノ−Ｎ
2−フェニルアセチル−２’，５’−ジデオキシグアノ
シン ３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ −ジイソ
プロピルアミノ）ホスファイト ５’−（４−メトキシトリフェニルメチル）アミノ−Ｎ
2−フェニルアセチル−２’，５’−ジデオキシグアノ
シン（２．２ｇ；３．３ｍｍｏｌ）及びテトラゾール
（１７６ｍｇ；２．５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン
／アセトニトリル（１：１；７０ｍｌ）に、空気と湿気
を厳重に排除しながら溶かし、２−シアノエチルＮ，
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピル−ホスホロジアミ
ダィト（１．６５ｍｌ；５．３ｍｍｏｌ）を添加し、混
合物を室温で１．５時間撹拌する。反応完結後、ブタノ
ール（３ｍｌ）を添加し、混合物を１０分間撹拌し、ジ
クロロメタン（５００ｍｌ）で稀釈し、５％ＮａＨＣＯ
3溶液（１５０ｍｌ）及びＮａＣｌ溶液（２５０ｍｌ）
で各々一回急いで抽出し、乾燥（ＭｇＳＯ4）し、濃縮
する。粗生成物をジクロロメタン／エーテル（１：１、
１４ｍｌ）に溶かし、ドライアイス中で冷却したｎ−ペ
ンタン（４５０ｍｌ）中で沈澱させる。
【００４６】収率：１．６７ｇ（５９％）。
【００４７】実施例６ウンデカン １−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノ）ホスファイト ウンデカノール（１．７２ｇ、１０ｍｍｏｌ）、ジイソ
プロピルアミン（０．５ｇ、５ｍｍｏｌ）及びテトラゾ
ール（３５０ｍｇ、５ｍｍｏｌ）の３０ｍｌジクロロメ
タン溶液に、アルゴン雰囲気で撹拌下、２０分間かけて
ビス−（ジイソプロピルアミノ）−（２−シアノエトキ
シ）−ホスフィン（３．３ｇ、１１ｍｍｏｌ）を添加す
る。
【００４８】反応完結後、混合物を１０％強度の冷炭酸
ナトリウム溶液で振盪抽出する。有機相を蒸発し、生成
物をシリカゲルでクロマトグラフにかける。
【００４９】収率：３．３ｇ（７３％）。
【００５０】実施例７下記代表的配列の合成
【００５１】
【化７】
【００５２】合成はアプライドバイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０Ｂ自動ＤＮ
Ａ合成機中で実施した。固相として用いられたのは、
４，４’−ジメトキシトリチル−保護２−デオキシシチ
ジンが３’−ヒドロキシル基を介して結合した、商業的
に入手可能（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
な１０μｍｏｌ（又は１μｍｏｌ）の制御された孔を有
するガラス支持体であった。４，４’−ジメトキシトリ
チル保護基はメチレンクロライド中で２．５％強度のジ
クロロ酢酸で処理することにより除去し、次いで過剰の
酸と保護基をアセトニトリルで洗浄する。鎖の伸長は、
テトラゾールの存在下アセトニトリル中で５’−ＮＨ−
モノメトキシトリチル−保護ヌクレオチド構造物６ａの
０．１Ｍ溶液を添加することにより実施する。次の５価
リンへの酸化は、ピリジン／Ｈ2ＯＴＨＦ／１：１：８
中の０．２Ｍヨウ素溶液で処理することにより実施す
る。誤った配列を避けるため、次いで未反応の５’−ヒ
ドロキシル又は５’−アミノ基（次のサイク中で）をピ
リジン／アセトニトリル中の無水酢酸／ジメチルアミノ
ピリジンで処理してブロックする。
【００５３】次の反応サイクルは、２．５％強度のジク
ロロ酢酸で処理してモノメトキシトリチル保護基を除去
することにより開始する。次の５’−アミノヌクレオチ
ド構造物６との反応は、上記説明と類似の方法で実施す
る。
【００５４】最終反応工程では、最後のモノメトキシト
リチル保護基を酸除去した後、テトラゾールの存在下
に、アセトニトリル中のウンデカノールβ−シアノエチ
ルホスホルアミダイト（ｕｎｄｅｃａｎｏｌ β−ｃｙ
ａｎｏｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）
試薬７の０．１Ｍ溶液をカップリングさせる。ヨウ素酸
化の後ポリマー支持体を切りはなし、濃縮アンモニアで
５５℃１６時間処理して保護基を除く。
【００５５】反応生成物を、Ｏ、Ｍ酢酸トリエチルアン
モニウム中のアセトニトリルの直線上昇勾配（ｌｉｎｅ
ａｒ ｒｉｓｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ）でＲＰ１８カ
ラム上の調製用ＨＰＬＣにより単離する。収率：２．８
ｍｇ（４．８％）。
【００５６】オリゴヌクレオチド アミデート（ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｉｄｅ ａｍｉｄａｔｅｓ）のヌクレ
アーゼ安定性 鎖の長さ、配列及び細胞透過性に加えて、アンチセンス
オリゴヌクレオチドの生物学的作用について重要なのは
ヌクレアーゼ耐性である。ヌクレアーゼ安定性につい
て、５’−アミデートヌクレオチド間架橋を有する合成
オリゴヌクレオチドを天然のオリゴヌクレオチドジエス
テルと比較した。
【００５７】このために、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドジエステル及びアミデートを５’端で32Ｐ−ＡＴＰ
で放射線標識し、種々の特定のヌクレアーゼ及び細胞抽
出物による劣化をポリアクリルアミドゲル電気泳動と放
射能写真撮影により試験し、そしてゲルから劣化生成物
を単離してシンチレーションカウンターで定量した。天
然オリゴヌクレオチドジエステルは低いヌクレアーゼ安
定性しか有していない。それらは３０分〜１時間で完全
に劣化してしまう。反対にオリゴヌクレオチドアミデー
トは１０〜１００倍もヌクレアーゼに対して耐性があ
り、それ故抗ウィルスアンチセンスオリゴヌクレオチド
阻害剤としての用途に特に適している。 抗ウイルス作用： ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳分析 アミデートの抗ウイルス翻訳阻害活性を、無細胞ｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳分析（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で示し
た。このため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたＴＡＲ−ｔ
ａｔ ｍＲＮＡをウサギ網内皮細胞（ｒａｂｂｉｔ ｒ
ｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）翻訳系におき、ｔａｔ蛋白合
成をオリゴヌクレオチドの存在下、非存在下で定量的に
測定した。
【００５８】詳細に言えば、１μｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ
合成ＴＡＴ−ｔａｔ ｍＲＮＡを２．５μｌ容積中で所
望量のオリゴヌクレオチド（０．２−２μｇ）と混合す
る。翻訳のためにプレインキュベートした翻訳用混合物
（Ｐｒｏｍｅｇａから）１０μｌを放射性35Ｓ−システ
インと該２．５μｌに注入し、３０℃で９０分間インキ
ュベートする。混合物の小分割を取り出し、ＳＤＳ保有
バッファーと一緒に加熱し、６−２０％不連続ＳＤＳ
ＰＡＧＥ上で分画する。固定及び乾燥した後、ゲルを放
射能写真撮影し、得られたｔａｔ蛋白のバンドをデンシ
トメトリーで評価した。
【００５９】結果：分析に用いたアミデートによるｔａ
ｔ蛋白の翻訳阻害は、種々の濃度において同一配列のジ
エステルオリゴヌクレオチドのそれより３倍高い。
【００６０】培養細胞分析での抗ウイルス作用 ホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを下記詳細のウ
イルス単離分で試験した。
【００６１】ＨＩＶ−１D34 １９８５、フランクフル
ト・アム・マイン、ジョージ−スペイヤーハウス（Ｇｅ
ｏｒｇ−Ｓｐｅｙｅｒ−Ｈａｕｓ）、フォン・ブリーゼ
ン博士（Ｄｒ．ｖｏｎ Ｂｒｉｅｓｅｎ）及びエッチ・
リュブザメン−ワイグマン教授（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｈ．
Ｒｕｅｂｓａｍｅｎ−Ｗａｉｇｍａｎｎ）により単離さ
れたもの。
【００６２】ＨＩＶ−２ROD １９８６、パリ、パスツ
ール研究所により単離されたもの。
【００６３】分析系として用いられたのは、植物性赤血
球凝集素でプレインキュベートされた、ＨＩＶ−セロネ
ガティブ（ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ：血清陰性）な提
供者からの末稍血リンパ球であった。感染直後に培養細
胞に該物質を添加した。細胞懸濁液をインキュベーター
中で種々の濃度の化合物と一緒に４−６日インキュベー
トした。ウイルスの複製は、光学顕微鏡下でのＨＩＶ誘
導による多核質（ｓｙｎｃｙｔｉａ）形成の評価により
検出した。
【００６４】
【表１】
【００６５】試験物質は２−５μｇ／ｍｌ、すなわち
０．４−０．９μｍｏｌ／ｌ以上の濃度で、ＨＩＶ−１
誘導多核質形成を顕著に阻害する。
【００６６】かくして本発明の主な特徴及び態様を要約
すれば次のとおりである。
【００６７】１．一般式Ｉ
【００６８】
【化８】
【００６９】式中、Ａは全体にわたりＮＨ又はＮＲ2で
あることができ、Ｂは互いに独立に、天然の又は修飾さ
れたピリミジン又はプリン核酸塩基、或いはまたＯＨ、
ＯＲ2又はＨであることができ、ＤはＯ、Ｓ、ＮＨ又は
ＮＲ2であることができ、Ｅは互いに独立にＨ、ＯＨ、
ＯＲ2、アジド又はハロゲンであることができ、Ｘは−
Ｏ-、Ｓ-、−ＯＲ2、ＳＲ2又はアルキルであることがで
き、Ｙは−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2 2又は Ｒ1はアルキル、アリール、ヘタリール（ｈｅｔａｒｙ
ｌ）、アラルキル、シクロアルキル、リピド（ｌｉｐｉ
ｄ）であることができ、Ｒ2はアルキル、アリール、ア
ラルキル又はシクロアルキルであることができ、ｎは３
〜５０であることができる、で示されるオリゴヌクレオ
チド類。
【００７０】２．ｎが１０〜３０である上記第１項のオ
リゴヌクレオチド類。
【００７１】３．ｎが１８〜２８である上記第１項のオ
リゴヌクレオチド類。
【００７２】４．上記第１項のオリゴヌクレオチド類の
１又はそれ以上を含有する薬剤。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボルフガング・スプリンガー ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル・カテルンベルガーシユルベーク31 (72)発明者 ウド・シユトロツプ ドイツ連邦共和国デー5657ハーン・ブライ デンホフアーシユトラーセ12 (72)発明者 ユルグ・バウムガルテン ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル・ヘンゼルベーク13 (72)発明者 ヘルガ・リユブザメン−バイクマン ドイツ連邦共和国デー6232バトゾーデン・ ケニングシユタイナーシユトラーセ113 (72)発明者 ロター・ビーセルト ドイツ連邦共和国デー6000フランクフルト アムマイン50・エシヤーシヤイマーラン トシユトラーセ576 (72)発明者 ハリアデイ・スハルトノ ドイツ連邦共和国デー6000フランクフルト アムマイン50・ゲルハルト−ハウプトマ ンリング262

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式Ｉ 【化１】 式中、Ａは全体にわたりＮＨ又はＮＲ2であることがで
    き、 Ｂは互いに独立に、天然の又は修飾されたピリミジン又
    はプリン核酸塩基、或いはまたＯＨ、ＯＲ2又はＨであ
    ることができ、 ＤはＯ、Ｓ、ＮＨ又はＮＲ2であることができ、 Ｅは互いに独立にＨ、ＯＨ、ＯＲ2、アジド又はハロゲ
    ンであることができ、 Ｘは−Ｏ-、Ｓ-、−ＯＲ2、ＳＲ2又はアルキルであるこ
    とができ、 Ｙは−ＮＨ2、−ＮＨＲ2、−ＮＲ2 2又は Ｒ1はアルキル、アリール、ヘタリール（ｈｅｔａｒｙ
    ｌ）、アラルキル、シクロアルキル、リピド（ｌｉｐｉ
    ｄ）であることができ、 Ｒ2はアルキル、アリール、アラルキル又はシクロアル
    キルであることができ、 ｎは３〜５０であることができる、で示されるオリゴヌ
    クレオチド類。
JP4250401A 1991-09-03 1992-08-27 全体にわたりアミドリン酸塩のヌクレオチド間架橋を有する新規なアンチセンスオリゴヌクレオチド類 Pending JPH05202090A (ja)

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